LAMPIRAN
38
Lampiran 1 Prosedur Pembuatan Preparat Histologi Pembuatan preparat histologi terdiri dari beberapa proses yaitu dehidrasi (penarikan air dalam jaringan) dengan alkohol konsentrasi bertingkat, clearing dalam larutan xylol, infiltrasi parafin, dan dilanjutkan dengan embedding dalam parafin cair. Kemudian dilanjutkan dengan pembuatan blok jaringan dan pemotongan menggunakan mikrotom (sectioning). Adapun masing–masing proses adalah sebagai berikut: 1
Proses fiksasi yaitu organ/jaringan yang telah disimpan di dalam tissue basket dan direndam dalam alkohol 70% dan siap untuk proses dehidrasi.
2
Proses dehidrasi dimulai dengan perendaman jaringan dalam alkohol 80%, 90%, dan alkohol 95% masing–masing selama 24 jam. Proses perendaman dilanjutkan dengan alkohol 100% I dan II masing–masing selama 12 jam kemudian direndam dalam alkohol 100% III selama 6 jam.
3
Proses clearing yaitu perendaman jaringan dalam larutan xylol I, II, dan III. Perendaman jaringan dalam larutan xylol I dilakukan selama 1 jam, sedangkan perendaman dalam larutan xylol II dan III dilakukan masing–masing selama 30 menit. Perendaman dalam xylol III berada dalam inkubator dengan suhu 620C.
4
Infiltrasi dilakukan dalam parafin cair di dalam inkubator suhu 62ºC sebanyak tiga kali ulangan sebelum dilakukan penanaman jaringan. Perendaman selama 1 jam dalam parafin I dan 30 menit dalam parafin II dan III.
5
Proses embedding yaitu penanaman jaringan dalam parafin.
6
Proses
selanjutnya
adalah
pembuatan
blok
parafin
dengan
menggunakan pisau yang dipanaskan, parafin dan jaringan yang sudah ditanam, dikeluarkan dan dipotong berdasarkan besar jaringan dan menyisakan sedikit parafin pada sisi–sisi jaringan dan direkatkan pada blok kayu.
39
7
Blok yang siap dipotong, dimasukkan ke penjepit (block holder) mikrotom dan diatur kesejajaran permukaan yang akan dipotong dengan mata pisau mikrotom. Blok dipotong dengan menggunakan mikrotom. Ketebalan potongan diatur untuk mendapatkan ukuran ideal preparat histologi (3–5 µm).
8
Satu sampai dua hasil potongan dipindahkan dengan jarum, ke dalam air dingin untuk membuka lipatan yang mungkin terbentuk pada preparat. Kemudian dipindahkan ke dalam air hangat (37–40)0C di atas penangas untuk meluruskan kerutan halus.
9
Irisan yang telah terentang sempurna diambil dengan gelas objek kemudian dikeringkan dan diletakkan di atas hotplate (37–38)0C.
10 Selanjutnya preparat disimpan dalam inkubator dengan suhu 37 0 C selama 24 jam untuk menyempurnakan penempelan jaringan pada gelas objek dan siap untuk diwarnai dengan menggunakan pewarnaan HE.
40
Lampiran 2 Prosedur Pewarnaan Hematoksilin-Eosin Pewarnaan Hematoksilin-Eosin merupakan pewarnaan standar untuk mengetahui struktur umum sel maupun jaringan di dalam suatu organ. Tahapan pewarnaan Hematoksilin-Eosin adalah sebagai berikut: 1
Proses deparafinisasi dengan menggunakan larutan xylol I, II, dan III masing–masing selama 3–5 menit.
2
Proses rehidrasi dengan menggunakan alkohol bertingkat konsentrasi 100% (III, II, dan I), 95%, 90%, 80%, dan 70% masing–masing selama 3–5 menit.
3
Preparat direndam dalam air kran selama 10 menit kemudian direndam dalam aquades selama 5 menit.
4
Preparat diwarnai dengan hematoksilin selama 15–20 detik kemudian direndam dalam air kran selama beberapa saat.
5
Warna yang dihasilkan dikrontrol di bawah mikroskop. Jika warna ungu yang dihasilkan kurang kontras, maka preparat dicelupkan kembali ke dalam pewarna hematoksilin selama 3–5 detik. Namun jika warnanya terlalu ungu maka preparat dapat dicelupkan dalam pemucat haematoksilin 1–2 kali (HCl 0.5% dalam alkohol 70%).
6
Preparat kembali direndam dalam air kran selama 10 menit lalu direndam dalam aquades selama 5 menit untuk mendapatkan warna biru keunguan dan membersihkan kelebihan warna pada sitoplasma.
7
Preparat diwarnai dengan eosin selama 40–45 detik kemudian direndam dalam aquades selama 5 menit untuk membersihkan eosin yang tidak mewarnai jaringan.
8
Proses rehidrasi dengan alkohol bertingkat dimulai dengan konsentrasi 70%, 80%, 90%, 95%, dan 100% (I, II, dan III) masing–masing 2–3 kali celup.
9
Proses clearing dengan larutan xylol I, II, dan III masing–masing selama 5 menit.
10 Proses mounting dilakukan dengan penutupan preparat dengan gelas penutup menggunakan Entelan®.
41
Lampiran 3 Prosedur Pewarnaan Masson’s Trichrome Pewarnaan Masson’s Trichrome merupakan pewarnaan yang digunakan untuk melihat struktur jaringan ikat dalam suatu organ. Tahapan pewarnaan Masson’s Trichrome adalah sebagai berikut: 1
Proses deparafinisasi dengan menggunakan larutan xylol I, II, dan III masing–masing selama 3–5 menit.
2
Proses rehidrasi dengan menggunakan alkohol bertingkat konsentrasi 100% (III, II, dan I), 96%, 90%, 80%, dan 70% masing–masing selama 3–5 menit.
3
Preparat direndam dalam air keran selama 10 menit kemudian dibersihkan dengan cara direndam dalam aquadest selama 5 menit.
4
Preparat yang difiksasi dengan larutan selain larutan Bouin, harus melalui proses perendaman dalam larutan Bouin (campuran asam pikrat: formalin: asam asetat glasial = 15: 5: 1) selama satu jam dalam suhu 37ºC. Kemudian dibilas dengan air keran dan aquades masing– masing selama 15 menit dengan tiga kali pengulangan.
5
Preparat diwarnai dengan haematoksilin selama 30–45 detik kemudian direndam di dalam air keran selama beberapa saat.
6
Warna yang dihasilkan dikrontrol di bawah mikroskop. Jika warna ungu yang dihasilkan kurang kontras, maka preparat dicelupkan kembali ke dalam pewarna haematoksilin selama 3–5 detik. Namun jika warnanya terlalu ungu maka preparat dapat dicelupkan dalam pemucat haematoksilin 1–2 kali (0.5% HCl dalam 70% alkohol).
7
Preparat kembali direndam di dalam air keran selama 10 menit lalu direndam di dalam aquadest selama 5 menit.
8
Pewarnaan dilanjutkan dengan menggunakan larutan acid Fuchsin dan ponceau 2R selama 10–15 menit. Kemudian preparat direndam di dalam asam asetat 1% selama beberapa detik, kemudian dilakukan kontrol warna dengan mikroskop.
42
9
Pewarnaan
selanjutnya
adalah
menggunakan
orange
G
dan
phospotungstic selama 5 menit. Preparat kembali direndam di dalam asam asetat 1% dan dikontrol dengan mikroskop. 10 Pewarna terakhir yaitu light green selama beberapa detik hingga hitungan menit. Setelah itu preparat direndam di dalam asam asetat 1%. 11 Proses dehidrasi dilakukan dengan menggunakan alkohol 100% (absolut I dan II) masing–masing selama lima menit. 12 Preparat dijernihkan dengan larutan xylol I, II, dan III masing–masing selama 5 menit. 13 Proses mounting dilakukan dengan penutupan preparat dengan gelas penutup menggunakan Entelan®.
