43
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN Pada pelaksanaannya validasi dilakukan dengan 2 tahap, tahap pertama adalah uji pendahuluana dan tahap kedua adalah validasi metode analisis dan uji coba dilakukan terhadap susu bubuk skim lain dengan kadar IgG yang bervariasi.
4.1
Kurva baku dan kadar optimum kadar IgG dalam dalam sampel susu bubuk
4.1.1 Kurva baku dan Kalibrasi kurva baku Pada tahap pertama uji pendahuluan pada validasi metode analisis ELISA sebagai pengukuran kuantitatif memerlukan kurva baku, kurva baku yang digunakan pada validasi metode harus dikalibrasi atau distandardisasi terlebih dahulu karena kurva baku merupakan suatu fungsi dari rentang nilai analisis, yang akan berhubungan dengan respon analat (Chan 2004). Kurva baku yang valid diperoleh bila larutan baku bovine IgG menunjukkan nilai r ≥0,95. Pengukuran densitas optik larutan baku bovine IgG tercantum dalam lampiran 2 dan densitas optik (OD) larutan baku bovine IgG tercantum pada Tabel 4. Tabel 4. Densitas optik (OD) larutan baku bovine IgG Kadar baku IgG (ng/mL) 125 62,5 31,2 15,6 7,8 0 a (Intersep) b (Slope) r (Koefisien korelasi)
Densitas optik (OD) 1,82 ±0,006 1,17±0,004 0,66±0,000 0,37±0,000 0,21±0,000 0,08±0,000 0,07 0,02 0,99
44
Hasil
evaluasi
terhadap
kurva
baku
menunjukkan
koefisien korelasi (r) masih dalam nilai keberterimaan r ≥0,95, dimana nilai r perhitungan slope=0,02.
adalah
0.99 intersept= 0,07,
Nilai korelasi yang diperoleh diatas menunjukkan
bahwa setiap kenaikan konsentrasi larutan IgG yang diuji akan diikuti dengan kenaikan densitas optik (OD) yang sebanding pada rentang 0-125 ng/mL. Maka kurva baku dengan seri larutan baku IgG dengan kadar 0-125 ng/mL yang telah ditetapkan dapat digunakan untuk uji selanjutnya.
4.1.2 Kadar optimum IgG dalam sampel susu bubuk skim yang digunakan pada validasi Evaluasi hasil analisis terhadap kadar optimum sampel susububuk skim dengan pengenceran 1/10, 1/100, 1/500, dan 1/1000 larutan stok sampel dengan kadar 15 mg/10 mL, Densitas optik larutan baku bovine IgG yang tercantum pada Tabel 4 digunakan sebagai kurva baku, maka diperoleh kadar optimum IgG dalam sampel A seperti tercantum pada Tabel 5.
Tabel 5. Kadar optimum IgG dalam Sampel A Kadar IgG (ng/mL)
Pengenceran sampel (mg/mL)
1:10 1:100 1:500 1:1000
Sampel 1 40,73 19,66 12,33 4,86
Sampel 2 36,21 19,74 13,02 5,44
Sampel 3 38,30 20,88 12,99 5,01
Rata rata 38,42 20,01 12,78 5,10
Evaluasi terhadap kadar IgG dalam sampel, maka diperoleh kadar tiap sampel untuk pengenceran tertinggi (1/10) sebesar 5,1 ng/mL dan pengenceran terendah (1/1000) dengan kadar 38,4 ng/mL, maka kandungan
45
IgG dalam larutan sampel terletak dalam rentang antara 5,1 ng/mL dan 38,4 ng/mL. Dari hasil tersebut juga dapat dilihat bahwa pada pengenceran 1/10, memiliki kadar yang masih kecil karena kadar analat yang dimasukkan terlalu besar (pekat) sehingga tidak semua antigen dapat terikat oleh antibodi. Apabila dilihat pada pengenceran 1/100 dan 1/500 menunjukkan kadar yang hampir dekat yaitu 12,8 ng/mL dan 20,0 ng/mL IgG dalam sampel, sedangkan pengenceran dengan kadar 1/1000 terlihat sangat kecil 5,1 ng/mL.
Berdasarkan densitas optik yang dihasilkan dari beberapa kadar IgG pada optimasi percobaan dan dengan nilai yang diperoleh, maka dapat diambil suatu kondisi analisis yang paling optimum untuk analisis IgG dalam matriks susu bubuk skim. Dari kelima pengenceran sampel yang mengandung IgG maka kadar 1/500 memberikan hasil reaksi antigenantibodi terbaik karena memberikan reaksi lebih baik dari pengenceran 1/1000, tetapi sedikit dibawah pengenceran 1/100. Selanjutnya karena pertimbangan ekonomis dan tidak terlalu jauh dengan penggunaan pengenceran 1/100, maka pengenceran sampel 1/500 dari larutan stok dengan kadar 12,8 ng/mL yang akan digunakan untuk validasi metode analisis.
4.2 Validasi metode analisis penetapan kadar imunoglobulin G Tahap kedua adalah validasi metode analisis kadar imunoglobulin G (IgG) dalam susu bubuk skim menggunakan metode Sandwich ELISA. Pelaksanaan validasi dilakukan terhadap parameter, linieritas dan rentang, penetapan limit deteksi dan limit kuantitasi, uji presisi, uji akurasi, dan spesifisitas. Analisis dilakukan teradap susu bubuk skim yang beredar dengan kadar IgG yang berbeda yaitu sampel A: 150mg/15g, sampel B: 180mg/15g dan sampel C: 200mg/15g berdasarkan kadar yang tercantum pada label produk, dan terhadap sampel dilakukan uji keberulangan.
46
4.2.1 Linieritas dan rentang Linearitas adalah kemampuan metode analisis yang menunjukkan bahwa larutan sampel yang berada dalam rentang kadar memiliki respon analat yang proporsional dengan kadar, secara langsung atau melalui transformasi matematika. Rentang adalah interval antara kadar analat terendah dan tertinggi. Linieritas kurva ditentukan dengan cara menghitung koefisien korelasi (r), linieritas memenuhi syarat bila r hitung ≥ 0,95. Densitas optik larutan baku bovine IgG yang tercantum pada Tabel 4 digunakan sebagai kurva baku, pembacaan densitas optik (OD) dan kadar larutan baku bovine IgG tercantum pada Tabel 6. Dari hasil analisis densitas optik dan perhitungan kadar baku, diperoleh nilai r = 0,99 yang telah memenuhi kriteria keberterimaan nilai r ≥ 0,95 dan rentang kadar 7,7 ng/mL dan kadar 33,7 ng/mL pada densitas optik 0,2 sampai 0,8. sehingga dapat disimpulkan bahwa kurva baku bovine IgG linier. Tabel 6 . Densitas optik dan kadar larutan baku bovine IgG Pengenceran baku IgG (ng/mL) 125 62,5 31,25 15,6 7,8 0 a (intersep) b (slope) r (Koef korelasi)
OD
Kadar baku IgG (ng/mL)
2,08 1,39 0,82 0,44 0,26 0,08
94,08 61,13 33,73 15,82 7,47 -1,29 0,11 0,02 0,99
47
4.2.2 Limit deteksi dan limit kuantitasi Limit deteksi (LOD) adalah kadar terendah dari analat dalam sampel yang dapat terdeteksi, akan tetapi tidak perlu terkuantisasi, dibawah kondisi pengujian yang disepakati. Limit kuantitasi (LOQ) adalah kadar terendah dari analat yang dapat ditentukan dengan tingkat presisi dan akurasi yang dapat diterima, dibawah kondisi pengujian yang disepakati. Limit deteksi merupakan hal yang penting karena akan menyebabkan penggunaan kadar yang tidak tepat pada saat melakukan validasi metode (Chan 2004). Densitas optik larutan baku bovine IgG yang tercantum pada Tabel 6 digunakan sebagai kurva baku, hasil uji keberulangan dan simpangan baku (SD) larutan bovine IgG pada kadar terendah (5,7 ng/mL) tercantum pada Tabel 7.
Tabel 7. Densitas optik (OD) dan konsentrasi larutan baku bovine IgG Konsentrasi baku Densitas optik Konsentrasi baku IgG IgG (ng/mL) (OD) (ng/mL) 119,36 125 1,82 72,93 62,5 1,17 36,5 31,25 0,66 15,78 15,6 0,37 5,37 7,8 0,21 0,00 0 0,07 a (Intersep) 0,07 b (Slope) 0,02 r (Koefisien korelasi) 0,99
48
Tabel 8 Uji keberulangan larutan baku bovine IgG pada kadar 5,37 Pengulangan 1 2 3 4 5 6 7 JumLah Rata-rata SD
Kadar IgG (ng) 4,75 5,73 5,39 5,50 5,24 5,56 5,45 37,62 5,37 0,31
(x - x )
(x - x )2
-0,62 0,36 0,02 0,13 -0,13 0,20 0,08
0,38 0,13 0,00 0,02 0,02 0,04 0,01 0,59 0,08
ng/mL
Dari hasil perhitungan keberulangan larutan baku bovine IgG dengan kadar 5,7 ng/mL dan perhitungan simpangan baku maka diperoleh limit deteksi sebesar 0,93 ng/mL dan limit kuantitasi sebesar 3,1 ng/mL. Dimana kadar ini mempunyai nilai lebih kecil dari kadar terendah larutan baku bovine IgG 7,5 ng/mL dan kadar optimum yang digunakan untuk validasi yaitu 12,8 ng/mL.
4.2.3 Presisi Presisi adalah adalah tingkat kesamaan antar hasil uji individual ketika metode tersebut diterapkan secara berulang dari suatu sampel homogenat, presisi suatu metode analisis biasanya ditunjukkan dengan simpangan baku relatif atau koefisien variasi dari suatu seri pengukuran. Presisi suatu metode ELISA akan memenuhi keberterimaan apabila RSD yang diperoleh ≤20% (Chan 2004). Pada percobaan ini dilaksanakan pengujian terhadap sampel yang diklaim mengandung IgG 150 mg /15g. Densitas optik larutan baku bovine IgG yang tercantum pada Tabel 3 digunakan sebagai kurva baku, dan data hasil uji presisi pada sampel A dapat dilihat pada Tabel 9.
49
Hasil pengujian yang diperoleh menunjukkan bahwa nilai RSD untuk sampel susu bubuk skim A adalah 3,87% untuk repitibilitas dan kriteria RSD ≤20%, sehingga hal ini menunjukkan bahwa sistem operasional instrumen dan prosedur metode sudah baik dengan respon.
Tabel 9. Uji presisi pada Sampel A Pengulangan 1 2 3 4 5 6 7 Jumlah Rata-rata ( x ) SD RSD (%)
Kadar IgG (ng/mL) 36,07 32,19 33,07 34,98 33,82 34,98 33,82 238,97 34,14 1,32 3,87
(x - x )
(x - x )2
1,97 1,95 1,07 0,84 0,32 0,84 0,32 8.13
3,88 3,80 1,14 0,71 0,10 0,71 1,10 10,44
4.2.4 Akurasi dengan Uji Rekoveri Akurasi adalah kemampuan suatu metode untuk mengukur suatu nilai yang aktual atau sebenarnya dari suatu analat, atau kedekatan hasil uji yang diperoleh atau menggunakan metode yang sedang divalidasi dengan nilai sebenarnya yang terdapat dalam sampel. Pada penelitian ini digunakan metode penambahan standar adisi dan menghitung persen perolehan kembali (persen rekoveri). Uji akurasi harus memenuhi keberterimaan RSD ≤15%
atau
persen rekoveri 85-115% (Chan 2004). Pada penelitian ini uji akurasi dilakukan dengan tingkat kadar 100% dan menggunakan spike larutan baku dan larutan sampel masing masing 50%, pengujian dilakukan 9 replikasi. Densitas optik larutan baku bovine IgG yang tercantum pada Tabel 3 digunakan sebagai kurva baku, dan data hasil uji akurasi dengan uji rekoveri tercantum pada Tabel 10.
50
Tabel 10. Uji Akurasi dengan Uji Rekoveri Pengu langan
1 2 3 4 5 6 7 8 9 Jumlah Rata rata
Dens. Optik (OD) 0,64 0,64 0,63 0,61 0,62 0,56 0,57 0,64 0,59
Kons IgG sampel (ng/mL)
% Reko veri
14,66
18,04
129,00
15,6
14,23
18,54
127,00
37,31
15,6
15,72
17,86
124,00
35,81
15,6
15,13
17,67
116,28
36,38
15,6
14,98
17,56
120,64
32,15
15,6
15,62
18,89
85,00
32,69
15,6
16,08
18,79
89,49
38,31
15,6
14,73
20,24
115,83
34,13
15,6
15,09
19,48
93,91
Kons. IgG total (ng/mL)
Kons. IgG baku (ng/mL)
Bobot sampel (mg)
38,19
15,6
38,42
1001,15 111,24 Evaluasi hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa nilai persen
rekoveri 111,24% yang memenuhi kriteria keberterimaan persen rekoveri yang terletak antara 85-115%. Hal ini menunjukkan bahwa sistem operasional instrumen dan prosedur metode sudah baik dengan respon.
4.2.4 Spesifisitas Spesifisitas adalah kemampuan metode untuk mendeteksi/ mengukur analat
secara
cermat
dan
seksama
dengan
adanya
analat
asing/bahan/matriks lain, matriks yang merupakan sampel blanko tanpa analat dan kemungkinan dapat mengandung analat lain yang dapat mempengaruhi/mengganggu penetapan
yang dicari. Sehingga perlu
diketahui apakah metode yang akan digunakan spesifik untuk analisis analat dan analat lain yang tidak diinginkan tidak mengganggu/ mempengaruhi hasil analisis (Chan 2004).
51
Dari hasil penetapan sampel matriks tanpa IgG (IgG negatif) dan sampel yang mengandung IgG (IgG positif) maka diperoleh densitas optik yang baik untuk sampel yang mengandung IgG pada perbandingan kadar dari pengenceran 1/10 sampai 1/1000 adalah 0,71 dan 0,10. Densitas optik larutan baku bovine IgG yang tercantum pada Tabel 4 digunakan sebagai kurva baku, dan data densitas optik larutan sampel dan larutan matriks dengan dan tanpa kandungan IgG tertera pada Tabel 11. Hasil analisis pada larutan
matriks sampel tanpa IgG terlihat
densitas optik pada kadar 1/10 sampai dengan 1/1000 adalah 0,07 ng/mL dan 0,07 ng/mL, yang menunjukkan nilai dibawah 0.200 atau nilai yang hampir sama dengan nilai densitas optik larutan baku bovine IgG pada kadar 0 ng/mL yaitu 0,08 ng/mL seperti yang tercantum pada Tabel 3, blanko assay diluent adalah 0,07 dan blanko substrat sebesar 0,06. Tabel 11. Densitas optik larutan sampel dan larutan matriks (1,5 mg/mL) dengan dan tanpa kandungan IgG Pengenceran OD sampel OD matriks sampel/matriks (IgG pos.) (IgG neg.) 1:10 0,71 0,07 1:100 0,38 0,07 1:500 0,26 0.07 1:1000 0,10 0,07 Hal ini menunjukkan tidak adanya kandungan bovine IgG dalam larutan matriks sehingga dapat disimpulkan bahwa matriks sampel yang terkandung dalam sampel susu bubuk skim tidak mengganggu dalam analisis dan spesifik untuk penetapan bovine IgG dalam sampel susu bubuk skim.
4.2.6 Penetapan kadar IgG pada susu bubuk skim dengan kadar Ig G bervariasi Penetapan kadar IgG pada susu bubuk skim dengan kadar selain 150 mg/15g adalah sampel susu bubuk skim A dengan kadar 180 mg/15g
52
serta sampel B dengan kadar 200mg/15g, dan terhadap sampel tersebut dilakukan uji keberulangan. Prosedur dilakukan dengan membuat suatu kurva baku dari satu seri larutan standar dan pembuatan larutan sampel susu bubuk skim dan dilakukan replikasi tujuh kali. Hasil pengujian sampel dibuat rata rata dan dihitung simpangan baku dan % RSD. Hasil uji keberulangan terhadap kedua sampel B dan sampel C tertera pada Tabel 12. Tabel 12. Uji keberulangan pada Sampel B dan sampel C Pengu langan 1 2 3 4 5 6 7 Jumlah Rata-rata SD RSD (%)
Sampel Kadar (ng/mL) 13,12 12,48 10,91 11,14 13,75 11,58 11,06 84,04 12,01 1,16 9,67
A (x - x ) 1,23 0,22 1,21 0,76 3,03 0,18 0,90 8.13
Sampel C Kadar (x - x )2 (ng/mL) 9.92 0,03 10.48 0.15 10.15 0.01 9.55 0.29 10.98 0.79 9.69 0,16 9.88 0.04 70,65 1.47 10,09 0.49 4,86
Dari hasil penetapan kadar bovine IgG dalam susu bubuk skim dengan kadar IgG yang bervariasi seperti tercantum pada labelnya selain dari susu bubuk skim A, menunjukkan uji keberulangan untuk kedua sampel susu bubuk skim lain diperoleh nilai RSD 9,67% untuk susu bubuk B dan RSD 4,86% untuk susu bubuk C. Hasil evaluasi nilai RSD dari kedua sampel menunjukkan nilai RSD memenuhi keberterimaan RSD≤ 20% sehingga dapat disimpulkan bahwa metode analisis dapat digunakan untuk analisis kadar IgG dalam susu bubuk skim.
4.3 BAHASAN UMUM Metode analisis yang valid memegang peranan yang sangat penting untuk mendapatkan data yang valid, dengan metode yang valid
53
akan dapat diketahui tingkat akurasi dan presisi dari suatu data hasil pengujian, sehingga metode analisis yang akan digunakan secara rutin sebelumnya harus divalidasi (Hadi 2007). Validasi metode adalah konfirmasi dengan cara menguji suatu metode dan melengkapi bukti bukti yang objektif apakah metode tersebut memenuhi persyaratan yang ditetapkan dan sesuai dengan suatu tujuan tertentu. Walaupun metode analisis IgG dalam produk sudah banyak yang dikembangkan oleh peneliti terdahulu baik dengan cara kimia maupun imunologi, namun masih terdapat kelemahannya seperti kerumitan ataupun spesifisitas dari metode tersebut. Dari penelitian yang dilakukan terhadap 3 jenis immunoassay yaitu Fluorescen Immunoassay (FIA) , Radio Immunoassay (RIA) dan ELISA (Daussant and Bureau 1984, dalam
Pomeranz 2000), untuk metode ELISA lebih baik dari FIA karena metode FIA sulit di standardisasi sedang metode RIA merupakan metode yang komplek dan sangat sensitif dan markernya adalah radioaktif sehingga sulit untuk ditangani serta memerlukan alat yang mahal. Untuk metode immunoassay
yaitu ELISA yang relatif tidak
berbahaya, dan mempunyai kadaluarsa yang lebih panjang, serta tidak memerlukan peralatan yang mahal sedangkan pengujian dapat dibuat lebih cepat dan dapat di otomatisasi dan pengujian secara simultan. Walaupun ada juga kelemahan metode ELISA terutama untuk yang produk yang mengandung analat yang dapat mempengaruhi reaksi enzimatisnya dan disamping itu reaksi enzimatis kadang kadang sulit dikontrol
serta
sensitifitasnya relatif rendah. Aplikasi metode ELISA ini sudah diterapkan pada identifikasi protein dari bermacam macam sumber (misalnya daging sapi, biri-biri, kanguru, babi dan unta), protein yang sudah diproses secara panas, dan protein spesifik dari roti gandum dan lektin serta glikoprotein (Pomeranz 2000). Pada penelitian ini telah dilakukan validasi metode analisis untuk penetapan kadar imunoglobulin G (IgG) dalam susu bubuk skim menggunakan metode Enzyme Link Immunosorbent Assay (ELISA) yaitu
54
Sandwich ELISA dan ELISA merupakan salah satu uji serologi yang
dapat digunakan untuk mendeteksi adanya antigen atau antibodi dalam suatu sampel. Metode analisis yang divalidasi oleh peneliti ini dipilih karena memiliki kelebihan, yaitu metodenya lebih spesifik, sederhana, dan dapat dilakukan terhadap jumlah sampel yang banyak dalam waktu relatif singkat.
4.3.1 Kurva baku dan Kalibrasi kurva baku dan Kadar optimum IgG dalam sampel susu bubuk skim yang digunakan pada validasi Kurva kalibrasi yang merupakan suatu fungsi dari rentang nilai analisis, yang akan berhubungan dengan respon analat (Chan 2004) yang dipeoleh harus merupakan kurva baku yang valid. Evaluasi densitas optik (OD) larutan baku bovine IgG tercantum pada Tabel 4 menunjukkan koefisien korelasi (r) masih dalam nilai keberterimaan r ≥0,95, dimana nilai r perhitungan adalah 0.99, intersep: 0,07 dan slope: 0,02 sehingga kurva baku dengan seri larutan baku IgG yang telah ditetapkan dapat digunakan untuk uji selanjutnya. Untuk analisis dengan ELISA belum ditemukan teori yang dapat menghubungkan secara pasti antara aktivitas dengan absorbansi secara memadai. Secara umum akan diperoleh kurva baku berbentuk sigmoid, namun demikian bentuk fungsionalnya tidak diketahui dengan pasti dan dapat digunakan model yang melibatkan 4 atau 5 parameter. Linialisasi model biasanya dilakukan, tetapi penyesuaian langsung dengan model non linier tetap lebih berarti. Pada analisis ELISA belum diketahui secara pasti pemahaman terhadap banyaknya proses yang terjadi antara aktifitas antibodi dan pembacaan densitas optik (absorbans) yang dihasilkannya sebagai respon, sehingga dilakukan pendekatan secara empirik.
55
Otomatisasi pembacaan data hasil ELISA sejauh mungkin dikendalikan, diklasifikasi dan kuantifikasi, sehingga sistem yang dipilih harus memuaskan keperluan pengguna, dan program pembuatan kurva harus dikendalikan. Untuk itu perangkat lunak yang digunakan misalnya harus dapat dijalankan baik dalam bentuk grafik atau bentuk numerik dan kriteria klasifikasi hendaknya dispesifikasi oleh pengguna. Densitas optik hendaknya dimasukkan ke dalam memori secara otomatis. Dalam software ELISA nilai densitas optik (OD) ditampilkan dalam Result Data, dimana nilai yang terdapat didalamnya merupakan hasil uji nilai sebenarnya, yaitu rata-rata nilai OD sampel dikurangi dengan rata-rata nilai OD blank. Dalam software dari intrumen terdapat berbagai macam pilihan tampilan untuk kurva standar, namun yang sering digunakan adalah tampilan linier dengan besaran misalnya y = 0,01909x + 0,07028. dimana r2 = 0.948. dan tampilan pada Gambar 7. atau tampilan untuk 5-parameter dengan tujuan meng-fit kan standar ke dalam kurva sigmoid yang dapat dilihat pada Gambar 8. Dari hasil kurva tersebut nilai r2 menjadi lebih baik yaitu sebesar 0.999. Dari persamaan y pada kurva standar, maka diketahui nilai konsentrasi tiap sampel.
Gambar 7. Kurva Baku larutan standar dengan bentuk garis lurus
56
Gambar 8. Kurva Baku larutan standar dengan bentuk sigmoid
Menurut Lipton (2000) pada pengujian immunoassay secara kuantitatif maka kurva baku yang diperoleh dari densitas optik (OD) akan menghasilkan kurva berbentuk sigmoid, dan untuk memperoleh nilai yang akurat dan cermat secara kuantitatif maka OD larutan sampel harus berada pada bagian linier kurva baku. Daerah kerja kurva liner yang baik terletak pada densitas optik pada rentang 0,2-0,8 (USP 2011). Bila OD terlalu tinggi, maka larutan sampel harus diencerkan hingga OD berada diantara rentang kuantitatif pengujian. Konsentrasi analat dalam sampel dapat dihitung dengan membuat koreksi menggunakan faktor pengenceran yang diperoleh pada saat pembuatan larutan uji yang akan diteteskan pada microplate.
Menurut Burgess (1995) kinerja pengujian kuantitatif dengan cara sandwich ELISA dipengaruhi oleh beberapa faktor, misalnya kapasitas
penangkapan antibodi, karakteristik sistem deteksi, dan peralatan yang tersedia untuk melakukan prosedur ELISA. Penangkapan antibodi tergantung pada kapasitas adsorbsi microplate yang telah di coating dengan antigen atau antibodi spesifik. Karakteristik sistem deteksi termasuk kompleksitas, antibodi yang berlebihan, dan spesifisitas antibodi. Selanjutnya hasil yang terlihat sangat jelas pada antigen-spesifik ELISA
57
dimana ikatan aktual analat yang diukur tidak paralel dengan sinyal enzimatis yang dihasilkan. Immuno-Tek Bovine IgG ELISA kit merupakan gabungan bahan-
bahan yang diperlukan dalam pengerjaan ELISA untuk mendeteksi bovine IgG dalam kolostrum sapi, serum susu, plasma atau larutan biologis lainnya sehingga mudah digunakan serta lebih cepat dalam pengerjaan. Microplate pre coated with purified goat anti-bovine IgG (antibodi terhadap bovine IgG
yang berasal dari kambing) yang disediakan dalam kit oleh pabrik telah dioptimasi agar bereaksi seimbang dengan semua subklas dari bovine IgG, dan spesifik untuk bovine IgG. Metode sandwich ELISA disebut juga dengan ELISA penangkap antigen, menggunakan antibodi yang terikat pada fase padat untuk menangkap antigen secara spesifik, antibodi penangkap antigen dan sistem indikator dibuat konstan dan yang berubah adalah titer antibodi primer untuk antigen spesifik, fase padat yang digunakan adalah microplate (Kemeny 1989) Umumnya enzim yang digunakan pada metode ELISA adalah Horseradish peroxydase (HRP), alkaline phosphatase (AP) dan beta galactosidase. Setiap enzim mempunyai fitur yang unik sesuai dengan
kondisi
dimana enzim tersebut dapat digunakan secara optimum. Pada
analisis digunakan enzim HRP hal ini dipilih karena HRP lebih sensitif pada uji ELISA bila dibandingkan dengan enzim AP. Hal ini terjadi karena daya katalitik enzim HRP lebih cepat, sehingga lebih banyak produk yang digenerasi dalam waktu inkubasi yang lebih pendek, Pada metode ELISA tidak hanya berdasarkan pada jumlah antigen atau antibodi yang akan mengadsorbsi. Banyaknya adsorbsi harus dapat diulangi didalam microplate, dan jumlah protein yang teradsorbsi pada tiap sumuran harus pada batas tertentu. Substrat yang digunakan harus merupakan suatu bahan yang akan mengadsorbsi sampel yang dikehendaki dalam jumlah banyak namun dengan variasi minimal dari pengujian ke pengujian. Antigen atau antibodi dapat secara pasif teradsorbsi pada
58
permukaan padat dan keragaman dapat terjadi karena perbedaan pH, kekuatan ion dan komposisi penyangga sehingga akan mempengaruhi hasil pengujian. Proses metode ELISA memerlukan masa inkubasi selama 30 menit pada suhu 37oC sehingga suhu inkubasi dan lamanya masa inkubasi merupakan salah satu faktor yang perlu diperhatikan dimana pada peneitian ini penyimpangan suhu sudah ditetapkan yaitu lebih kurang 1oC. Perbedaan suhu akan berpengaruh pada pengikatan antigen atau antibodi, misalnya pada suhu tinggi pengikatan antigen atau antibodi dapat menyebabkan pengaruh pinggir yaitu terbentuknya warna yang
lebih
banyak pada pinggir sumuran microplate dan hal ini akan mempengaruhi pengukuran densitas optik. Sensitivitas kadang kadang dapat ditingkatkan dengan membuat masa inkubasi lebih lama, dimana terjadi reaksi yang lebih sempurna. Pada proses ELISA dilakukan pencucian dengan wash buffer (wash Buffer berisi campuran PBS, Tween 20@ dan 2-chloroacetamide), dengan
volume 300 µl tiap sumuran sebanyak 4x dan dikeringkan hingga tidak ada lagi droplet pada sumuran. Larutan pencuci diperlukan untuk menghilangkan semua materi dari luar dan ikatan yang longgar pada permukaan fase padat. Komponen larutan pencuci harus cukup kuat untuk menggusur ikatan tersebut. Larutan pencuci juga tidak boleh merusak ikatan kompleks antigen-antibodi. Larutan pencuci dari kit ELISA yang digunakan merupakan suatu campuran untuk menggantikan detergen tetapi bersifat sama seperti detergen yaitu mengurangi reaksi pengikatan nonspesifik yaitu pengikatan antigen dan antibodi yang spesifik. Pada tahap akhir prosedur ELISA, hal penting yang harus diperhatikan adalah waktu pengukuran warna yang terjadi, sehingga harus dihentikan pada masa periode tertentu yaitu setelah 30 menit, dengan penambahan stop solution dan selanjutnya dilakukan pembacaan densitas optik (OD) dari warna yang terbentuk menggunakan instrument (ELISA
59
reader). Hal ini disebabkan karena warna yang terbentuk akan menjadi
lebih gelap dibiarkan dalam waktu yang lama. Air suling merupakan salah satu problem pada standardisasi uji ELISA terutama diantara laboratorium yang berbeda bila dilakukan uji kolaborasi ataupun uji robustness, walaupun menggunakan reagen yang sama untuk pengujian. Sehingga bila air suling yang disertakan pada kit, minimal air suling digunakan untuk pengenceran awal larutan stok reagen. Walaupun sampai saat ini belum diketahui alasan mengapa air dapat mempengaruhi uji ELISA dan tidak ada satupun faktor yang ditemukan sebagai hal yang penting, sebaiknya disarankan air suling dan kontrol sera juga digunakan sebagai blanko pada prosedur ELISA, disamping itu air juga digunakan untuk mengencerkan larutan dapar. Menurut Burgess (1995) metode ELISA dengan antigen spesifik, maka peningkatan kompeleksitas berhubungan dengan peningkatan sensitivitas. Konsentrasi kerja optimal semua reagen harus dipastikan jumlahnya apakah sedikit atau berlebihan karena dapat berpengaruh atau mengganggu sensitiftas pengujian, sehingga konsentrasi optimum sampel merupakan hal yang penting. Umumnya
kisaran
kerja
sistem
ELISA
untuk
mendeteksi
imunoglobulin membutuhkan serum yang sangat encer (1/10.000 s/d 1/100.000 untuk serum) sebelum dimasukkan ke dalam sumuran yang dilapisi antibodi penangkap (Burgess, 1995). Pengenceran tinggi yang sesuai dengan serum tersebut biasanya setara dengan 1-500 ng/ml, dimaksudkan untuk mendeteksi batas maksimum dan minimum yang mampu dideteksi oleh ELISA reader. Pada manual kit ELISA telah direkomendasikan kadar minimum yang dapat digunakan dalam pengujian pada sampel susu yang mengandung kadar antibodi IgG sampai dengan 0,5 mg/ml, dan normalnya digunakan dengan pengenceran 1/10000. Untuk itu dilakukan pengenceran sampel susu bubuk skim dari 1/10 sampai dengan 1/1000 dari larutan stok sampel 15mg /10mL.
60
Evaluasi analisis terhadap kadar optimum sampel
dengan
pengenceran 1/10, 1/100, 1/500, dan 1/1000 seperti yang tercantum pada Tabel 5. Berdasarkan densitas optik yang dihasilkan dari beberapa konsentrasi larutan sampel pada optimasi percobaan, maka diperoleh suatu kondisi analisis yang optimum untuk analisis IgG dalam matriks susu bubuk skim.
4.3.2 Validasi metode analisis Validasi metode analisis diawali dengan linieritas dan rentang konsentrasi IgG, linearitas adalah kemampuan metode analisis yang menunjukkan bahwa larutan sampel yang berada dalam rentang konsentrasi memiliki respon analat yang proporsional dengan konsentrasi, secara langsung atau melalui transformasi matematika. Rentang adalah interval antara konsentrasi analat terendah dan tertinggi. Prosedur uji sama seperti prosedur ELISA seperti pada pembuatan kurva baku dan ditetapkan kurva linier: y=bx + a, dimana a adalah intersep (perpotongan garis dengan sumbu y) dan b adalah slope (kemiringan garis regresi), linieritas kurva ditentukan dengan cara menghitung koefisien korelasi (r). Linieritas memenuhi syarat bila r hitung ≥ 0,95. Hasil pembacaan densitas optik (OD) baku bovine IgG tercantum pada Tabel 5. Evaluasi hasil analisis densitas optik dan perhitungan konsentrasi baku, diperoleh nilai r = 0,99 yang telah memenuhi kriteria keberterimaan nilai r ≥ 0,95 dan rentang konsentrasi 7,7 ng/mL dan konsentrasi 33,7 ng/mL pada densitas optik dengan rentang kerja kurva linier 0,2 sampai 0,8 (USP 2011), sehingga dapat disimpulkan bahwa kurva baku larutan bovine IgG linier pada rentang konsntrasi tersebut. Menurut Horwitz (2003) aspek penting dari kurva kalibrasi, disamping linieritas adalah kestabilan dan keberulangan pada waktu berbeda di hari yang sama ataupun pada hari yang berbeda sehingga aspek ini merupakan hal yang kritikal. Perbedaan instrumen akan membuat kurva baku yang sangat berbeda, sehingga kurva baku yang diperoleh pada alat
61
yang digunakan tidak dapat diaplikasikan pada alat yang lain. Kurva baku harus disiapkan beberapa kali, menggunakan standar berbeda sebagai sumbernya, bila memungkinkan dilakukan pada waktu berbeda di hari yang sama atau pada hari yang berbeda. Limit deteksi merupakan hal yang penting karena akan menyebabkan penggunaan konsentrasi yang tidak tepat pada saat melakukan validasi metode (Chan 2004). Untuk mendapatkan suatu titer ELISA, ada tahap bahwa status positif atau negatif ditentukan oleh kadar sampel uji, sehingga perlu dilakukan pendekatan untuk menentukan nilai batasnya, cara yang paling umum misalnya dengan menentukan rata rata densitas optik ditambah dengan dua sampai empat simpangan baku.
Masalah yang mendasar
terhadap pendekatan ini adalah asumsi bahwa kadar antibodi berbanding langsung dengan densitas optik sehingga akan diperoleh kurva linier, tetapi kenyataannya kurva berbentuk sigmoid. Pada analisis menggunakan instrumen limit deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon blanko beberapa kali lalu dihitung simpangan baku respon blanko. limit deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi linier dari kurva kalibrasi. Limit deteksi mempunyai nilai ekuivalen dengan rata-rata respon blanko plus 3 kali simpangan baku (SD), dan limit kuantitasi adalah rata-rata blanko plus 10 kali SD (Eurachem 2002). Perhitungan untuk nilai y dan x dilakukan dengan menggunakan kurva baku. Evaluasi hasil
penetapan sampel untuk limit deteksi dan limit
kuantitasi dengan konsentrasi terendah larutan baku bovine IgG diperoleh data hasil pengukuran dari
Tabel 8 dan data uji keberulangan dan
simpangan baku pada kadar bovine IgG pada kadar terendah (5,37 ng/ml) tercantum dalam Tabel 9.
Dari hasil perhitungan keberulangan larutan
baku bovine IgG dengan kadar 5,37 ng/ml dan perhitungan simpangan baku maka diperoleh limit deteksi sebesar 0,93 ng/ml dan limit kuantitasi sebesar 3,1 ng/ml. Dimana konsentrasi ini mempunyai nilai lebih kecil
62
dari kadar terendah larutan baku bovine IgG 7,5 ng/ml dan konsentrasi 12,8 ng/mL yang merupakan konsentrasi optimum yang digunakan pada valiidasi metode analisis. Presisi adalah adalah tingkat kesamaan antar hasil uji individual ketika metode tersebut diterapkan secara berulang dari suatu sampel homogenat, presisi suatu metode analisis biasanya ditunjukkan dengan simpangan baku relatif atau koefisien variasi dari suatu seri pengukuran. Presisi suatu metode akan memenuhi keberterimaan apabila RSD yang diperoleh ≤20% (Chan 2004). Uji presisi dilakukan dengan menganalisis sampel yang sama secara berulang minimal enam kali pengulangan. Kemudian dihitung standar deviasi (SD) dan Setelah diketahui nilai SD nya maka dapat dihitung standar deviasi relatif (RSD) atau koefisien variasi. Presisi suatu metode ELISA akan memenuhi keberterimaan apabila RSD yang diperoleh ≤20%. Hasil uji presisi pada sampel A yang tercantum pada Tabel 9, menunjukkan hasil presisi yang memenuhi
kriteria keberterimaan.
sehingga hal ini menunjukkan bahwa sistem operasional instrumen dan prosedur metode sudah baik dengan respon. Akurasi adalah kemampuan suatu metode untuk mengukur suatu nilai yang aktual atau sebenarnya dari suatu analat, dengan kata lain akurasi atau kecermatan adalah kedekatan hasil uji yang diperoleh atau menggunakan metode yang sedang divalidasi dengan nilai sebenarnya yang
terdapat
dalam
sampel.
Penentuan
akurasi
metode
untuk
membuktikan kedekatan hasil analisis dengan nilai benar. Akurasi dapat ditetapkan dengan 3 cara yaitu; penetapan dengan menggunakan bahan acuan
bersertifikat
atau
standard
reference
material
(SRM),
membandingkan menggunakan metode yang telah valid (metode resmi atau metode standar) dan menghitung uji perolehan kembali dengan menggunakan penambahan standar. Pada penelitian ini digunakan metode penambahan standar adisi dan menghitung persen perolehan kembali. Uji perolehan kembali
63
(rekoveri) dilakukan dengan cara menambahkan sejumlah larutan baku IgG ke dalam sampel yang sebelumnya telah ditentukan kadarnya (sampel yang telah ditentukan nilai presisinya). Selanjutnya sampel dianalisis hingga diperoleh nilai persen perolehan kembali. Nilai persen perolehan kembali yang mendekati 100 % menunjukkan bahwa metode tersebut memiliki ketepatan yang baik dalam menunjukkan tingkat kesesuaian dari rata-rata suatu pengukuran yang sebanding nilai sebesinarnya (true value). Untuk metode ELISA maka uji akurasi harus memenuhi keberterimaan RSD ≤15% atau persen rekoveri 85-115% (Chan 2004). Evaluasi hasil analisis dari uji akurasi yang tercantum pada Tabel 10, menunjukkan hasil yang diperoleh
persen rekoveri 111,24% yang
memenuhi kriteria keberterimaan yang terletak antara 85-115%. Hal ini menunjukkan bahwa sistem operasional instrumen dan prosedur metode sudah baik dengan respon. Spesifisitas
adalah
kemampuan
metode untuk
mendeteksi/
mengukur analat secara cermat dan seksama dengan adanya analat asing/bahan/matriks lain, matriks yang merupakan sampel blanko tanpa analat dan kemungkinan dapat mengandung analat lain yang dapat mempengaruhi/mengganggu penetapan analat yang dicari. Sehingga perlu diketahui apakah metode yang akan digunakan spesifik untuk analisis analat dan analat lain yang tidak diinginkan tidak mengganggu/ mempengaruhi hasil analisis (Chan 2004). Menurut De Silva (2003) idealnya antibodi yang digunakan harus spesifik dengan analat target, tanpa adanya gangguan dari bahan yang strukturnya hampir sama dengan analat yang ada dalam sampel ataupun bahan yang terdapat dalam matriks. Sehingga verifikasi untuk spesifitas perlu dilakukan untuk seleksi analat dari matriks yang komplek sehingga tidak diperoleh hasil positif atau negatif palsu. Spesifisitas pengujian dievaluasi menggunakan matriks sampel yang di spike, tetapi pada beberapa kasus dilakukan menggunakan matriks
64
sampel yang mengandung bahan yang mirip dengan analat target. Tetapi bila tidak diperoleh bahan yang sesuai dengan analat target, maka pada validasi metode dilakukan kuantifikasi analat dalam komponen matriks menggunakan konsentrasi dibawah konsentrasi yang mungkin merupakan gangguan pada waktu pengujian (De Silva 2003) Pada penelitian ini penetapan menggunakan matriks sampel tanpa analat target untuk melihat adanya gangguan komponen yang ada dalam matriks susu bubuk skim, walaupun sebenarnya matriks tersebut tidak sama dengan matriks dari sampel yang diuji. Hal ini terjadi karena matriks sampel yang akan dianalisis sulit diperoleh dan tidak ada di pasaran. Menurut DeSilva (2003), bila matriks yang dimaksudkan sulit diperoleh maka kurva baku dapat digunakan sebagai pengganti matriks. Dari hasil penetapan sampel seperti yang tertera Tabel 11 dan Densitas optik larutan sampel dan larutan matriks yang tertera pada Tabel 12. Maka densitas optik untuk
sampel tanpa IgG dan sampel yang
mengandung IgG diperoleh densitas optik yang baik untuk sampel yang mengandung IgG dimana pada perbandingan konsentrasi dari pengenceran 1/10 sampai 1/1000 adalah 0,7 dan 0,1. Hasil analisis pada larutan
matriks sampel tanpa IgG terlihat
densitas optik pada konsentrasi 1/10 sampai 1/1000 adalah 0,07 dan 0,07, dimana nilai ini menunjukkan nilai dibawah 0.200 atau nilai yang hampir sama dengan
nilai densitas optik larutan baku bovine IgG pada
konsentrasi 0 ng/ml (0,08), dan hamper sama dengan nilai densitas optik blanko assay diluent (0,07) dan blanko substrat (0,06). Hal ini menunjukkan tidak adanya kandungan bovine IgG dalam larutan matriks sehingga dapat disimpulkan bahwa matriks sampel yang terkandung dalam sampel susu bubuk skim tidak mengganggu dalam analisis dan spesifik untuk penetapan bovine IgG dalam sampel susu bubuk skim. Dari hasil penetapan kadar bovine IgG dalam susu bubuk skim yang beredar dengan kadar IgG yang bervariasi dan pada labelnya tercantum kadar bovine IgG selain dari susu bubuk skim A. Dari hasil uji
65
keberulangan untuk kedua sampel susu bubuk skim sampel B dan sampel C diperoleh nilai RSD 9,67% untuk susu bubuk B dan nilai RSD 4,86% untuk susu bubuk C yang memenuhi keberterimaan uji keberulangan nilai RSD ≤20%. Maka dapat disimpulkan bahwa metode analisis dapat digunakan untuk analisis kadar IgG dalam susu bubuk skim dengan kadar ber variasi.
4.3.3 Hasil validasi metode analisis Dari hasil validasi metode pengujian kadar immunoglobulin G dalam susu bubuk skim dengan metode Enzyme Link Immunosorbent Assay (ELISA) dengan parameter validasi yang telah ditetapkan, terlihat
hasil validasi yang memenuhi kriteria keberterimaan seperti tertera pada Tabel 13.
Tabel 13 Parameter validasi, kriteria keberterimaan dan hasil validasi No 1
Parameter validasi Linieritas dan rentang
Kriteria
Hasil validasi
r ≥ 0,95
r = 0,99 Sampel A: RSD 9,67 % Sampel B: RSD 4,86 % Sampel C: RSD 3,87 %
2 Presisi 3 4
5
Akurasi Limit deteksi (LOD) dan limit kuantitasi (LOQ) Spesifisits
RSD < 20% Persen rekoveri 85-115%
111,24%
LOD = 3 SD
LOD = 0,93
LOQ = 10 SD Spesifik
LOQ = 3,1 Spesifik
Dari hasil validasi ada 5 parameter validasi yang dilakukan dilakukan sedangkan parameter lain seperti Ruggedness dan Robustness belum dapat dilakukan disini karena diperlukan beberapa laboratorium yang berbeda untuk dilakukan uji kolabarasi untuk parameter tersebut.
66
Pada uji Uji akurasi pada penelitian ini digunakan sebagai baku pembanding adalah larutan standar bovine IgG dengan kadar maksimum 125ng/mL, dimana reagen tersebut
disertakan dalam reagen kit yang telah
disediakan. Pada pembuatan larutan rekoveri ditemukan kendala pada penyiapan pengenceran konsentrasi larutan baku, karena larutan baku stok yang harus disiapkan tidak akan dapat melebihi dari 125ng/mL. Untuk itu sebaiknya digunakan baku pembanding bovine IgG murni dengan konsentrasi lebih tinggi dari pada larutan stok yang ada pada kit. Pada peneliian ini untuk mengetahui spesifisitas metode maka dilakukan uji spesifisitas dan dalam hal ini digunakan sampel matriks susu bubuk skim yang pada labelnya diklaim tidak mengandung IgG, dalam hal ini komposisi sampel matriks tidak sama dengan komposisi dari sampel yang mengandung IgG. Hal ini disebabkan karena sampel matriks yang komposisinya sama seperti dengan sampel yang mengandung IgG tidak ditemukan dipasaran. Untuk lebih mendapatkan uji spesifisitas yang lebih meyakinkan maka sebaiknya komposisi matriks sampel susu bubukng mengandung dibuat sama seperti sampel susu bubuk yang mengandung IgG.
