IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 PREPARASI SUBSTRAT DAN ISOLAT UNTUK PRODUKSI ENZIM PEKTINASE Tahap pengumpulan, pengeringan, penggilingan, dan homogenisasi kulit jeruk Siam, kulit jeruk Medan, kulit durian, dan daun teh tua menghasilkan substrat untuk pembuatan media fermentasi semi padat berupa tepung limbah berukuran 500 mesh. Substrat yang tersedia kemudian disimpan untuk produksi enzim pektinase. Data rendemen tepung limbah untuk masing-masing substrat dapat dilihat pada Tabel 3. di bawah ini. Tabel 3. Data rendemen limbah pertanian Jenis Limbah
Bobot Sampel (g) Awal (W1)
Kulit Jeruk Siam
Rendemen (%)
Akhir (W2) 428
141
32.49
Kulit Jeruk Medan
1404
309
22.01
Kulit Durian
1464
300
20.49
Daun teh tua
273
132
48.35
Keterangan : W1 W2 Rendemen
: bobot limbah sebelum pengeringan dan penggilingan (g) : bobot limbah setelah pengeringan dan penggilingan (g) : ( [W2 – W1]/ W1) x 100%
Substrat dalam bentuk tepung limbah berukuran 500 mesh dapat dilihat pada Gambar 9.
Gambar 9. Substrat untuk media fermentasi semi padat, dari kiri ke kanan : daun teh tua, kulit jeruk Siam, kulit jeruk Medan, dan kulit durian Selain preparasi substrat, dilakukan pula preparasi isolat yaitu penumbuhan Aspergillus ustus pada media agar sebagai isolat stock untuk keperluan produksi enzim pektinase. Isolat stock kemudian disimpan di dalam ruang penyimpanan (ruang kapang) pada suhu kamar (± 25oC) untuk menghindari kontaminasi. Isolat yang digunakan untuk produksi enzim pektinase adalah isolat segar yang berumur 5 hari. Isolat segar ini diperoleh dari proses peremajaan isolat stock.
23
4.2 ANALISIS SUBSTRAT 4.2.1 Kadar Pektin Substrat Analisis kadar pektin dilakukan terhadap keempat jenis substrat, hal ini bertujuan untuk mengetahui jumlah pektin yang tersedia untuk digunakan sebagai substrat bagi Aspergillus ustus sehingga dapat menghasilkan enzim pektinase. Persentase kadar pektin setiap jenis substrat dapat dilihat pada gambar 10. Kadar pektin untuk setiap jenis substrat terdapat pada Lampiran 5. 45
41.08
40
Kadar Pektin (%)
35 30 25 20 15 10
7.805 3.51
5 0
KJS
KJM
KDU
2.32 DTT
Jenis Substrat Gambar 10. Chart kadar pektin seluruh substrat Keterangan : KJS : kulit jeruk Siam KJM : kulit jeruk Medan KDU : kulit durian DTT : daun teh tua Berdasarkan hasil analisis kadar pektin pada keempat substrat, terlihat bahwa substrat kulit jeruk Medan memiliki kadar pektin tertinggi yaitu sebesar 41.08% kemudian diikuti oleh kulit jeruk Siam dengan nilai kadar pektin sebesar 7.80%, setelah itu kulit durian sebesar 3.51%, dan terakhir daun teh tua sebesar 2.31%. Penelitian yang dilakukan oleh Khule et al. (2012) menggunakan kulit jeruk lokal India menunjukkan hasil kadar pektin tertinggi yaitu sebesar 17.63% dan terendah sebesar 5.29%. Kadar pektin tertinggi didapat pada pengukuran kadar pektin menggunakan asam sitrat pada pH 2, sedangkan kadar pektin terendah didapat pada pengukuran menggunakan asam sitrat pH 1.2. Hasil ini jika dibandingkan dengan kadar pektin kulit jeruk Medan dan Siam menunjukkan hasil yang lebih rendah.
24
Perkiraan sementara dari hasil pengukuran kadar pektin keempat substrat adalah semakin banyak kandungan pektin yang tersedia pada substrat maka metabolisme dari Aspergillus ustus akan meningkat. Dengan demikian, enzim pektinase sebagai produk hasil metabolisme juga akan meningkat. Hasil ini akan dihubungkan dengan hasil dari analisis aktivitas enzim pektinase sehingga dapat diketahui bagaimana pengaruh ketersediaan pektin terhadap aktivitas enzim pektinase yang dihasilkan.
4.2.2 Kadar Proksimat Substrat Tabel 4. Data Kadar Proksimat Seluruh Substrat Jenis
Kadar Proksimat
Substrat
Air (%)
Abu (%)
Lemak (%)
Protein (%)
Karbohidrat
Serat Kasar
(%)
(%)
KJS
8.87
4.73
4.12
9.18
73.10
17.13
KJM
9.54
3.49
2.85
5.59
78.53
10.30
KDU
9.47
5.11
1.08
6.83
77.51
31.99
DTN
8.40
5.01
1.95
22.95
61.69
12.70
Keterangan : KJS (kulit jeruk Siam); KJM (kulit jeruk Medan); KDU (kulit durian); DTN(Daun teh tua) Substrat-substrat yang diuji pada penelitian ini mengandung pektin sebagai penyusun utama karbohidratnya. Berdasarkan data proksimat diatas, terlihat bahwa kadar karbohidrat tertinggi dimiliki oleh substrat kulit jeruk Medan yaitu sebesar 78.53%. Hal ini menunjukkan hubungan yang positif dengan kadar pektin substrat yang telah diuji, yaitu semakin tinggi kadar karbohidrat maka semakin tinggi pula kadar pektin substrat.
4.3 ANALISIS AKTIVITAS ENZIM PEKTINASE SELURUH SUBSTRAT Analisis aktivitas enzim pektinase dari keempat substrat yang digunakan, dilakukan dengan menghitung nilai aktivitas enzim pektinase yang dihasilkan oleh Aspergillus ustus pada masing-masing media fermentasi semi padat. Berdasarkan hasil perhitungan aktivitas enzim pektinase diketahui bahwa aktivitas enzim pektinase tertinggi terdapat pada hasil fermentasi yang menggunakan kulit jeruk Medan (KJM) sebagai substrat, yaitu sebesar 1.2751 U/mL, kemudian yang kedua adalah substrat kulit jeruk Siam (KJS) sebesar 1.2223 U/mL, yang ketiga adalah substrat kulit durian (KDU) yaitu sebesar 0.8906 U/mL, dan aktivitas enzim pektinase terendah terdapat pada substrat daun teh tua (DTN) yaitu sebesar 0.3065 U/mL (Gambar 11).
25
1.6 1.2223
Aktivitas Enzim (U/mL)
1.4
1.27505
1.2
0.89065
1 0.8 0.6
0.30605
0.4 0.2 0 KJS
KJM
KDU
DTT
Jenis Substrat Gambar 11. Chart pengaruh jenis substrat terhadap aktivitas enzim pektinase Waktu fermentasi atau inkubasi optimum untuk menghasilkan enzim pektinase dengan aktivitas tertinggi pada masing-masing substrat adalah 2 hari, kecuali untuk substrat daun teh tua yaitu 1 hari. Waktu fermentasi atau inkubasi optimum ini menggambarkan waktu yang dibutuhkan Aspergillus ustus menggunakan substrat untuk menghasilkan enzim pektinase secara maksimal. Kurva produksi enzim pektinase oleh Aspergillus ustus oleh berbagai substrat selama fermentasi pada suhu ruang terdapat pada Gambar 12. 1.6
KJS
Aktivitas Enzim (U/mL)
1.4
KJM
1.2
KDU
1
DTT
0.8 0.6 0.4 0.2 0 0
1
2
3 4 Lama Fermentasi (Hari)
5
6
Gambar 12. Kurva aktivitas enzim pektinase oleh Aspergillus ustus pada berbagai substrat (suhu ruang) Mikroorganisme mempunyai masa pertumbuhan yang bervariasi atau biasa disebut dengan fase pertumbuhan. Fase-fase pertumbuhan tersebut sangat berpengaruh terhadap enzim yang dihasilkan oleh mikroorganisme untuk membantu pencernaan makanannya. Pada awal
26
pertumbuhan, fase yang dilalui adalah fase pertumbuhan kemudian aktivitas metabolisme akan menurun setelah mikroorganisme melewati fase puncak pertumbuhannya, fase penurunan ini disebut fase kematian (death phase). Hal ini dapat dilihat pada hasil produksi enzim pektinase oleh Aspergillus ustus pada penelitian ini, yaitu terjadinya fase pertumbuhan mulai dari hari ke-0 hingga mencapai fase puncak pertumbuhan yang menghasilkan aktivitas enzim tertinggi, kemudian mulai masuk ke fase kematian (death phase) yang ditandai dengan menurunnya aktivitas enzim pektinase. Penelitian mengenai produksi pektinase mengunakan media dari kulit jeruk telah banyak dilakukan, sedangkan produksi pekinase menggunakan media dari kulit durian dan daun teh tua belum pernah dilakukan. Penelitian yang dilakukan oleh Rangarajan et al. ( 2010) menunjukkan bahwa sumber karbon non-glukosa (kulit jeruk) dengan tambahan sumber nitrogen organik (bungkil kedelai) dapat digunakan sebagai substrat untuk produksi enzim pektinase yang dihasilkan oleh Aspergillus niger. Karbon yang digunakan tidak bersumber dari glukosa atau fruktosa melainkan dari kulit jeruk dikarenakan glukosa atau fruktosa diindikasikan akan menyebabkan terjadinya represi katabolit, yaitu berlebihnya gula terlarut di dalam pertumbuhan sel yang dapat menekan produksi enzim. Penelitian yang dilakukan oleh Adeleke et al. (2012) menggunakan kulit jeruk lokal Nigeria dengan metode fermentasi semi padat oleh Penicillium atrovenetum, Aspergillus flavus, and Aspergillus oryzae menghasilkan aktivitas pektinase masing-masing sebesar 11.58 U/mL, 12.12 U/mL, dan 10.17 U/mL. Hasil ini menunjukkan aktivitas pektinase oleh ketiga isolat tersebut lebih tinggi dibandingkan dengan aktivitas pektinase oleh Aspergillus ustus pada media kulit jeruk Medan dan jeruk Siam. Perbedaan ini mungkin disebabkan oleh kemampuan isolat yang digunakan berbeda-beda dalam mendegradasi pektin dan menghasilkan pektinase. Berdasarkan hasil analisis produksi enzim pektinase pada keempat substrat, maka substrat yang akan digunakan untuk optimasi kondisi produksi enzim pektinase adalah kulit jeruk Medan yang menghasilkan enzim pektinase dengan aktivitas tertinggi dengan waktu inkubasi optimum 2 hari. Hasil ini juga menunjukkan hubungan positif antara kadar pektin dengan aktivitas enzim pektinase, yaitu semakin tinggi kadar pektin pada substrat maka aktivitas enzim pektinase yang dihasilkan juga semakin tinggi.
4.4 ANALISIS AKTIVITAS ENZIM PEKTINASE TAHAP OPTIMASI Optimasi bertujuan untuk mengetahui kondisi optimum produksi enzim pektinase. Ini dibagi menjadi tiga tahapan, yaitu optimasi konsentrasi susbtrat, optimasi pH media fermentasi semi padat, dan optimasi suhu fermentasi.
27
4.4.1 Optimasi Konsentrasi Substrat Konsentrasi substrat yang dianalisis adalah 5, 10, 15, 20, dan 25% padatan. Persentase tersebut menggambarkan perbandingan padatan (dalam hal ini adalah substrat yaitu kulit jeruk Medan) dengan cairan (dalam hal ini adalah buffer fosfat dan czapek’s nutrient medium). Komposisi bahan pembuatan media fermentasi semi padat untuk tahap optimasi konsentrasi substrat dapat dilihat pada lampiran 2. Pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas enzim
Aktivitas Enzim (U/mL)
pektinase dapat dilihat pada Gambar 13. 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0
1.1107
1.369 1.0265
5%
10%
15%
1.0939
1.11635
20%
25%
Konsenstrasi Substrat (%) Gambar 13. Chart pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas enzim pektinase Berdasarkan analisis aktivitas enzim pektinase pada tahap optimasi konsentrasi substrat, diperoleh nilai aktivitas enzim pektinase tertinggi yaitu pada konsentrasi substrat 10% sebesar 1.3690 U/mL. Konsentrasi substrat 10% merupakan konsentrasi optimum yang dapat menghasilkan enzim pektinase dengan aktivitas yang maksimal. Pada kosentrasi substrat di atas 10%, aktivitas enzim pektinase yang dihasilkan menunjukkan penurunan nilai aktivitas. Meskipun terjadi peningkatan nilai aktivitas enzim pektinase pada konsentrasi 15, 20, dan 25%, namun nilainya tidak terlalu besar. Dengan demikian, peningkatan konsentrasi substrat di atas 10% justru mengurangi efisiensi produksi enzim pektinase karena membutuhkan substrat yang lebih banyak namun tidak menghasilkan aktivitas enzim pektinase yang lebih tinggi. Konsentrasi substrat yang lebih kecil juga dapat menyebabkan produksi enzim menjadi tidak maksimal. Hal ini disebabkan karena substrat sebagai penyedia pektin dan penginaktif represor pada proses produksi enzim pektinase tidak cukup tersedia sehingga represor kembali aktif yang mengakibatkan produksi enzim menurun atau bahkan terhenti. Hasil yang berbeda ditunjukkan pada penelitian yang dilakukan oleh Baladhanyutham dan Thangavelu (2011), aktivitas pektinase tertinggi dihasilkan pada konsentrasi substrat 20% yaitu sebesar 88.65 U/mL. Pektinase ini dihasilkan oleh isolat Aspergillus awamori menggunakan media fermentasi padat yang tersusun dari rice brand dan sugar cane bagasse. Perbedaan hasil ini kemungkinan disebabkan oleh perbedaan isolat penghasil pektinase dan jenis substrat penyusun media fermentasi.
28
Berdasarkan hasil optimasi konsentrasi substrat, maka besar konsentrasi substrat yang digunakan pada tahap optimasi pH media dan optimasi suhu fermentasi adalah konsentrasi substrat 10%.
4.4.2 Optimasi pH Media Fermentasi Semi padat Salah satu faktor yang memengaruhi aktivitas enzim adalah pH. Mayoritas enzim sangat sensitif terhadap pH dan memiliki kisaran aktivitas yang spesifik. Aktivitas enzim akan maksimal pada pH yang optimum. Nilai pH media fermentasi semi padat yang dianalisis pada penelitian ini adalah pH 4, 5, 6, 7, dan 8. Kisaran pH ini diuji karena dianggap mewakili seluruh daerah pH, yaitu daerah asam, netral, dan basa. Hasil dari optimasi ini akan menunjukkan kondisi pH yang optimum, baik untuk pertumbuhan Aspergillus ustus, maupun metabolismenya.
Aktivitas Enzim (U/mL)
3
2.8459
2.57075 2.3068
2.5
1.99795
1.77895
2 1.5 1 0.5 0 4
5
6 pH Media
7
8
Gambar 14. Chart pengaruh pH terhadap aktivitas enzim pektinase Berdasarkan hasil analisis aktivitas enzim pektinase pada pH media fermentasi semi padat yang diuji maka diperoleh nilai aktivitas enzim pektinase tertinggi yaitu sebesar 2.8459 U/mL. Aktivitas enzim pektinase tertinggi ini diperoleh pada media fermentasi semi padat pH 4. Hasil ini menunjukkan bahwa pH optimum untuk pertumbuhan dan metabolisme berupa enzim pektinase oleh Aspergillus ustus adalah pH 4 atau dengan kata lain kondisi optimum untuk produksi enzim pektinase oleh Aspergillus ustus adalah pada daerah yang cukup asam. Penelitian yang dilakukan oleh Baladhanyutham dan Thangavelu (2011) memberikan hasil yang serupa. Penelitian tersebut menggunakan Aspergillus awamori sebagai isolat dan menghasilkan aktivitas enzim pektinase yang meningkat pada kisaran pH 3-5, kemudian pada peningkatan pH media di atas pH 5, aktivitas enzim pektinase justru mengalami penurunan. Hasil yang sama juga ditunjukkan oleh aktivitas enzim pektinase yang diproduksi oleh Aspergillus niger (Baladhanyutham dan Thangavelu 2010). Aktivitas enzim pektinase meningkat pada pH 4-5 kemudian mengalami penurunan aktivitas pada pH media di atas pH 5.
29
4.4.3 Optimasi Suhu fermentasi Selain pH, faktor lain yang memengaruhi aktivitas enzim adalah suhu. Secara umum, peningkatan suhu akan meningkatkan laju reaksi, namun kenaikan suhu yang berlebih juga dapat menurunkan laju reaksi. Hal ini karena suhu tinggi dapat menyebabkan terjadinya denaturasi protein atau putusnya ikatan ion dan hidrogen, sedangkan suhu yang terlalu rendah dapat menyebabkan enzim menjadi tidak aktif. Besaran suhu yang diuji pada penelitian ini adalah 30, 40, dan 50oC. Pengaruh suhu terhadap aktivitas enzim pektinase dapat dilihat pada Gambar 15 di bawah ini.
Aktivitas Enzim (U/mL)
2.5 2
1.91935
1.8688
1.48695
1.5 1 0.5 0 30
40
50
Suhu Fermentasi (oC)
Gambar 15. Chart pengaruh suhu fermentasi terhadap aktivitas enzim pektinase Berdasarkan hasil pengujian terhadap aktivitas enzim pada beberapa suhu, terlihat bahwa o
suhu 40 C merupakan suhu yang menghasilkan aktivitas enzim pektinase tertinggi yaitu sebesar 1.9194 U/mL. Penurunan aktivitas enzim pektinase terjadi pada kenaikan suhu sebesar 10oC, hal ini mungkin terjadi akibat terputusnya ikatan sekunder enzim karena besarnya energi kinetika dari molekul enzim sehingga mengakibatkan hilangnya struktur sekunder dan tersier enzim yang disertai dengan hilangnya aktivitas enzim (Suhartono 1989).
30
