19
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Uji Sterilitas Penggunaan Iradiasi Sinar Gamma Co-60, Mesin Berkas Elektron dan Autoklaf terhadap Berbagai Bahan Pembawa Sterilisasi bahan pembawa sebelum inokulasi memiliki tujuan untuk menghindari pertumbuhan mikrob indigenus dalam bahan pembawa yang tidak diinginkan dan mematikan bakteri yang bersifat patogen. Banyaknya mikrob dalam berbagai bahan pembawa dapat dilihat di Tabel 1. Informasi dalam tabel sekaligus menunjukkan pentingnya mensterilkan bahan dari segala bentuk mikrob yang tidak diinginkan bahkan bersifat patogen. Tabel 1. Total Mikrob dalam Bahan Pembawa Sebelum dan Setelah Sterilisasi
Bahan Pembawa
Sebelum Sterilisasi ….spk/g….
Arang batok Zeolit Arang kayu Gambut Rw Pening
8
5.70 x 10 2.08 x 10
8
9.91 x 10
7 8
2.27 x 10
Metode Sterilisasi Iradiasi Sinar Mesin Berkas Gamma Co-60 Elektron
Autoklaf
……..……..……...spk/g……………..……..
1.66 x 101 0 0 0
2.16 x 102
0
1.66 x 10
1
0
1.66 x 10
1
0
2.16 x 10
2
0
Keterangan: Batas minimum terdeteksi 102 spk/g (McNamara et al., 2007) Ttd : tidak terdeteksi spk : satuan pembentuk koloni
Tabel 1 memperlihatkan efektivitas metode sterilisasi terhadap berbagai bahan pembawa yaitu penurunan total mikrob setelah disterilisasi. Metode sterilisasi iradiasi Sinar Gamma Co-60 pada dosis 50 kGy mampu mengurangi jumlah sel hingga 0 spk/g. Pada bahan arang batok masih memiliki jumlah sel 1.66 x 101 spk/g namun jumlah tersebut dinyatakan tidak terdeteksi karena batas minimum terdeteksi mikrob adalah 102 spk/g (McNamara et al., 2007). Menurut Nhan et al. (2004), penggunaan iradiasi Sinar Gamma Co-60 dosis 50 kGy terhadap bahan pembawa kompos mampu mengurangi jumlah sel bakteri hingga 102 spk/g dan fungi hingga 0 spk/g. Metode sterilisasi Mesin Berkas Elektron (MBE) mampu mengurangi jumlah sel hingga 102 spk/g pada bahan arang batok dan gambut Rawa Pening, sedangkan pada bahan zeolit dan arang kayu berkurang hingga 101 spk/g. Jumlah
20
tersebut juga dianggap tidak terdeteksi sehingga metode sterilisasi MBE sama efektifnya dengan iradiasi Sinar Gamma Co-60 dalam mensterilkan bahan pembawa. Autoklaf memberikan hasil pengurangan total mikrob hingga 0 spk/g pada semua bahan pembawa yang telah disterilisasi. Hal tersebut menunjukkan bahwa panas lembab dari autoklaf mampu mematikan semua mikrob yang ada dalam bahan pembawa arang batok, zeolit, arang kayu dan gambut Rawa Pening. Mekanisme dalam mematikan mikrob pada masing-masing metode sterilisasi berbeda. Autoklaf memanfaatkan panas lembab yang dapat merusak produksi rantai-tunggal DNA sehingga viabilitas selnya akan terganggu (Kusnadi, 2004). Selain itu proses autoklaf bahan yang dilakukan selama dua hari berurutan juga memberikan hasil yang maksimal dalam mematikan mikrob, karena adanya jeda waktu proses autoklaf hari pertama dan hari kedua yang bertujuan untuk membiarkan spora mikrob berkecambah. Setelah spora mikrob berkecambah maka dilakukan kembali proses sterilisasi di hari kedua sehingga dapat dipastikan semua mikrob dalam bahan pembawa terbunuh semua. Autoklaf sangat efektif dalam mematikan mikrob namun terdapat kekurangan dalam mekanisme tersebut. Menurut Toharisman (1989) intensitas sterilisasi tanah menggunakan autoklaf dapat meningkatkan kelarutan Fe, Mn dan Zn yang tinggi sehingga dapat meracuni mikob yang ada di dalamnya. Hal tersebut dapat mempengaruhi ketahanan hidup inokulan yang diberikan ke dalam bahan sehingga viabilitas selama masa penyimpanan akan sulit dipertahankan. Berbeda dengan metode sterilisasi autoklaf yang memanfaatkan panas lembab, metode sterilisasi iradiasi Sinar Gamma Co-60 dan MBE disebut juga metode sterilisasi dingin karena memanfaatkan radiasi pengion dalam merusak DNA mikrob. Menurut Hilmy (1980), radiasi pengion akan memberikan dampak mikrob kehilangan kemampuan membelah diri dengan begitu kelangsungan hidupnya menjadi terhenti. Sebagian besar bakteri yang tidak membentuk spora, relatif sensitif terhadap radiasi pengion. Efektivitas metode sterilisasi iradiasi Sinar Gamma Co-60 dan MBE terhadap bahan pembawa tidak sama walaupun keduanya memiliki mekanisme yang relatif sama dalam mematikan mikrob. Menurut Kume (2005), daya
21
penetrasi iradiasi Sinar Gamma Co-60 terhadap bahan pembawa lebih tinggi jika dibandingkan dengan MBE sehingga daya mematikan mikrobnya lebih tinggi pula. Hal tersebut dapat dilihat pada Tabel 1 bahwa total mikrob dalam bahan pembawa setelah disterilisasi menggunakan MBE masih relatif lebih tinggi dibandingkan dengan metode sterilisasi iradiasi Sinar Gamma Co-60 walaupun jumlah tersebut dianggap tidak terdeteksi.
4.2. Uji Viabilitas Inokulan dalam Bahan Pembawa Steril Arang Batok dan Zeolit selama Masa Penyimpanan 70 Hari Hasil penetapan populasi inokulan Azospirillum, Azotobacter dan Fungi Pelarut Fosfat (FPF) dapat dilihat pada Tabel 2. Jumlah sel tersebut merupakan jumlah sel awal yang dimasukkan ke dalam bahan pembawa yang kemudian diuji viabilitas inokulannya dalam masing-masing bahan pembawa steril. Pengujian viabilitas masing-masing inokulan dilakukan seminggu setelah proses inokulasi atau masa penyimpanan hari ke-7.
Tabel 2. Jumlah Sel Inokulan Azospirillum, Azotobacter dan Fungi Pelarut Fosfat yang dimasukkan ke Bahan Pembawa Arang Batok dan Zeolit Mikrob
Media
Jumlah sel (spk/ml)
Azospirillum
NFB
4.50 x 105
Azotobacter
NFM
4.78 x 109
Fungi Pelarut Fosfat
Pikovskaya
3.44 x 108
Peraturan Menteri Pertanian No.28/Permentan/SR.130/5/2009 tentang Pupuk Organik, Pupuk Hayati dan Pembenah Tanah menyatakan bahwa syarat teknis minimal pupuk hayati tunggal adalah kepadatan populasi bakteri dan fungi dalam bahan pembawa bentuk granul masing-masing sebesar >106 spk/g dan >105spk/g. Jumlah sel inokulan Azotobacter dan FPF sudah memenuhi syarat tersebut namun untuk Azospirillum belum memenuhi syarat minimal untuk pupuk hayati tunggal. Masih rendahnya jumlah sel inokulan Azospirillum yang diperoleh disebabkan oleh kurang baiknya pertumbuhan Azospirillum pada saat produksi
22
inokulan sehingga kepadatan populasinya kurang tinggi dibandingkan dengan inokulan Azotobacter dan FPF.
4.2.1. Uji Viabiltas Azospirillum dalam Bahan Pembawa Steril Arang Batok dan Zeolit Tabel 3 memperlihatkan viabilitas Azospirillum dalam bahan pembawa arang batok dan zeolit yang telah disterilisasi menggunakan iradiasi Sinar Gamma C0-60, Mesin Berkas Elektron (MBE) dan autoklaf hingga masa penyimpanan 70 hari pada suhu kamar (250C). Jumlah sel Azospirillum dalam arang batok mulai mengalami penurunan pada hari ke-42 dan terus menurun dari jumlah awal 105 spk/ml menjadi 104 spk/g hingga hari ke 70. Hal tersebut sesuai dengan penelitian Fadhl (2010) yang menyatakan bahwa populasi Azospirillum dan Azotobacter dalam bahan pembawa gambut yang disterilisasi autoklaf mulai mengalami penurunan pada masa penyimpanan 30 hari. Tabel 3. Viabilitas Inokulan Azospirillum dalam Bahan Pembawa Arang Batok dan Zeolit Steril Menggunakan Iradiasi Sinar Gamma Co-60, MBE dan Autoklaf pada Suhu Kamar Selama Masa Penyimpanan 70 Hari Bahan Pembawa
Metode Sterilisasi
Masa Penyimpanan (hari) 7
21
42
Penurunan Jumlah Sel
70
……..………. spk/g bahan pembawa ………………. 1.50 x 10
5
2.00 x 10
5
4.00 x 10
5
3.50 x 10
6
7.50 x 10
4
1.10 x 10 Autoklaf 2.00 x 10 Keterangan : Jumlah sel awal 4.50 x 105 spk/ml (+) : kenaikan jumlah sel
5
MBE Arang Batok
Co-60 Autoklaf MBE
Zeolit
C0-60
4.00 x 10
5 5
3.00 x 10 3.50 x 10
6
3.50 x 10
6 6
1.10 x 10
5
1.50 x 10
4
7.00 x 10
4
1.10 x10
5
3.00 x 10
5
7.50 x 10
4
1.50 x 10
4
…%...
7.00 x 10
4
84.44
7.00 x 10
4
84.44
1.10 x 10
5
75.55
3.50 x 10
6
+
4.00 x 10
5
11.11
4.00 x 10
5
11.11
Jumlah sel Azospirillum pada hari ke-7 dalam bahan pembawa arang batok sterilisasi autoklaf lebih tinggi dibandingkan dalam arang batok sterilisasi iradiasi Sinar Gamma Co-60 dan MBE. Sebaliknya dengan zeolit, jumlah sel Azospirillum dalam zeolit steril iradiasi Sinar Gamma Co-60 dan MBE lebih tinggi dibandingkan dengan zeolit steril autoklaf. Hal tersebut dapat disebabkan oleh
23
adaptasi awal Azospirillum terhadap lingkungan bahan pembawa. Menurut Alexander (1977), Azospirillum hidup pada lingkungan dengan pH 6.8-7.9. Efek yang ditimbulkan dari penggunaan metode sterilisasi iradiasi Sinar Gamma Co-60 dan MBE adalah kenaikan pH terhadap bahan yang diradiasi. Kenaikan pH tersebut umumnya terjadi pada tanah terutama tanah yang lembab (Lotrario et al., 1995; Tuominen et al., 1994). Nilai pH arang batok dan zeolit masing-masing 8.4 dan 5.8 (Tabel Lampiran 1). Kenaikan nilai pH arang batok akibat sterilisasi iradiasi Sinar Gamma Co-60 dan MBE kurang mendukung ketahanan hidup Azospirillum sehingga jumlah sel pada hari ke-7 lebih rendah dibandingkan jumlah sel dalam arang batok steril autoklaf. Sebaliknya kenaikan nilai pH pada zeolit steri iradiasi Sinar Gamma Co-60 dan MBE menyebabkan lingkungan hidup Azospirillum semakin mendukung sehingga jumlah sel pada hari ke-7 lebih tinggi dibandingkan jumlah sel dalam zeolit steril autoklaf. Persentase penurunan jumlah sel dari jumlah sel awal Azospirillum hingga masa penyimpanan 70 hari dapat dilihat di Tabel 3. Persentase penurunan jumlah sel Azospirillum yang paling besar adalah pada bahan arang batok steril MBE dan iradiasi Sinar Gamma Co-60 yaitu 87.14 % dan yang paling kecil pada bahan zeolit steril iradiasi Sinar Gamma Co-60 dan autoklaf yaitu 11.11 %. Selain penurunan jumlah sel, terdapat juga kenaikan jumlah sel Azospirillum yaitu pada bahan zeolit steril MBE hingga akhir penyimpanan hari ke-70 yaitu dari 4.50 x 105 spk/g menjadi 3.50 x 106 spk/g. Hal ini diduga disebabkan oleh kondisi lingkungan pada bahan tersebut optimum untuk Azospirillum bertumbuh. Penurunan viabilitas Azospirillum dengan berbagai metode sterilisasi dalam arang batok dan zeolit dapat dilihat pada Gambar 4. Penggunaan sterilisasi iradiasi Sinar Gamma Co-60, MBE dan autoklaf menunjukkan viabilitas mikrob hingga hari ke-70 masih relatif tinggi dalam arang batok walaupun terjadi penurunan dari jumlah sel awal yang dimasukkan ke dalam bahan pembawa. Bahan pembawa zeolit steril MBE dan autoklaf memiliki pola penurunan dan peningkatan populasi yang kurang lebih sama yaitu meningkat pada hari ke-7 kemudian menurun pada hari ke-42 dan meningkat lagi hingga hari ke-70. Namun
24
walaupun demikian, zeolit lebihh mampu mempertahan m nkan viabiliitas Azospirrillum hingga maasa penyimppanan 70 haari dibandin ngkan dengaan arang battok.
Gambar 4. 4 Populasi Azospirillum dalam baahan pembaawa arang batok dan zeolit steril selam ma masa peenyimpanan n 70 hari 4.2.2. Uji Viabiltas Azotobacteer dalam Bahan B Pem mbawa Sterril Arang Batok B dan n Zeolit Viabilitas Azootobacter dalam d bahan n pembawa arang batokk dan zeolitt yang mengalam mi penurunaan hingga hari h ke-70 dapat d dilihaat pada Tabbel 4. Viab bilitas Azotobactter dalam kedua k bahann mengalam mi penurunaan dari jum mlah sel awaal 109 spk/ml menjadi m 108 spk/g dann 107 spk//g bahan pembawa. p Pada umumnya Azotobactter tumbuh optimum o paada keadaan n pH > 6.0 (Alexander, ( , 1977). Taabel 4 juga menunjukkkan persentaase penurunnan jumlah sel Azotob bacter dari jumlaah sel awall hingga masa m penyim mpanan 70 hari. Persenntase penurrunan jumlah seel Azotobacter yang paaling besar adalah padda bahan arrang batok steril iradiasi Siinar Gamm ma Co-60 yaaitu sebesarr 99.07 % dan d penuruunan paling kecil adalah padda bahan zeeolit steril MBE M yaitu 90.41 9 %.
25
Tabel 4. 4 Viabilitass Inokulan Azotobacter A r dalam Baahan Pembaawa Arang Batok B dan Zeollit Steril Menggunakan M n Iradiasi Sinar S Gamm ma Co-60, MBE dan Autooklaf pada Suhu S Kamarr Selama Maasa Penyim mpanan 70 Hari H Bahan Pembawa
Metode Sterilisasii
Masa Pen nyimpanan (h hari) 7
21
4 42
Penurunan Jumlah Sel
770
……..……..…. spk/g bahan pembaw wa ………………. 5.08 x 10
8
7.61 x 10
8
8.85 x 10
8
6.96 x 10
8
5.15 x 10
8
1.34 x 10 1.57 x 10 Autoklaff 9 Keteranggan : Jumlah sel s awal 4.78 x 10 spk/ml
9
MBE Arang Batok
Co-60 Autoklaff MBE
Zeolit
Co-60
2.12 x 10
9
2.18 x 10
9
8.91 x 10
8
2.45 x 10
9
2.36 x 10
9 9
3.33 x 10
8
3.22 x 10
8
2.42 x 10
8
7.42 x 10
8
3.12 x 10
8
9.11 x 10
8
…%... …
1.65 x 10
8
96 6.54
4.41 x 10
7
99 9.07
1.92 x 10
8
95 5.98
4.58 x 10
8
90 0.41
2.30 x 10
8
95 5.18
5.80 x 10
7
98 8.78
Viabilitas Azootobacter dalam d aran ng batok daan zeolit yyang disteriilisasi dengan beerbagai mettode menunnjukkan hassil yang haampir seragam (Gambaar 5). Hal tersebbut menunjjukkan bahhwa viabiliitas Azotobacter tidakk terlalu baanyak dipertahannkan melaluui berbagaii metode stterilisasi paada bahan pembawa arang batok dan zeolit.
A r dalam bahaan pembaw wa arang batook dan zeollit Gambar 5. Populasi Azotobacter steril selam ma masa peenyimpanan n 70 hari
26
4.2.3. Uji Viabiltas Fungi Pelarut Fosfat (FPF) dalam Bahan Pembawa Steril Arang Batok dan Zeolit Berdasarkan Tabel 5 dapat dilihat viabilitas FPF mulai mengalami penurunan pada hari ke-70. Penurunan viabilitas FPF yang terjadi pada arang batok dan zeolit dengan metode sterilisasi autoklaf mulai mengalami penurunan pada hari ke-21 dan terus menurun hingga hari ke-70 menjadi masing-masing sebesar 105 spk/g dan 106 spk/g bahan pembawa (Gambar 5). Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Kurniawan (2004) yang menyatakan bahwa populasi FPF dalam bahan pembawa steril autoklaf mulai mengalami penurunan pada masa penyimpanan 30 hari baik pada suhu penyimpanan 40C maupun 250C.
Tabel 5. Viabilitas Inokulan Fungi Pelarut Fosfat dalam Bahan Pembawa Arang Batok dan Zeolit Steril Menggunakan Iradiasi Sinar Gamma Co-60, MBE dan Autoklaf pada Suhu Kamar Selama Masa Penyimpanan 70 Hari Bahan Pembawa
Metode Sterilisasi
Masa Penyimpanan (hari) 7
21
42
Penurunan Jumlah Sel
70
……………... spk/g bahan pembawa ……………… 1.83 x 10
8
6.66 x 10
8
3.83 x 10
7
2.03 x 10
8
1.66 x 10
8
1.66 x 10 Autoklaf 1.49 x 10 Keterangan : Jumlah sel awal 3.44 x 108 spk/ml
7
MBE Arang Batok
Co-60 Autoklaf MBE
Zeolit
Co-60
7.77 x 10
8 9
3.64 x 10 2.52 x 10
9
3.17 x 10
8 8
7.30 x 10
9
1.83 x 10
8
1.66 x 10
8
3.30 x 10
6
1.68 x 10
8
2.05 x 10
8
1.21 x 10
7
…%...
5.61 x 10
7
83.69
3.33 x 10
7
90.31
8.33 x 10
5
99.75
2.83 x 10
7
91.77
8.00 x 10
7
76.74
6.66 x 10
6
98.06
Tabel 5 menunjukkan persentase penurunan jumlah sel FPF dari jumlah sel awal hingga masa penyimpanan 70 hari. Persentase penurunan jumlah sel FPF yang paling besar adalah pada bahan arang batok steril autoklaf yaitu sebesar 99.75 % dan penurunan paling kecil adalah pada bahan zeolit steril iradiasi Sinar Gamma Co-60 yaitu 76.74 %. Metode sterilisasi autoklaf mengakibatkan penurunan jumlah sel FPF yang paling besar pada kedua bahan pembawa. Hal tersebut diduga disebabkan oleh
27
keracunann dari kelaruutan unsur akibat a prosees autoklaf sehingga FPF tidak mampu mempertaahankan hiduupnya. Meenurut Wakksman dan Starkey (19 981), pertum mbuhan FPF F optimum pada keadaan masam m pH 5.0 5 – 5.5. Hal H tersebut dapat menjjelaskan meengapa viab bilitas FPF dalam m zeolit hinngga hari kee 70 tidak lebih l rendaah dibandinggkan pada arang batok. Zeolit memiliiki pH yanng lebih ren ndah bila dibandingka d an dengan arang batok (Tabbel Lampiraan 1).
F Pelaruut Fosfat daalam bahan pembawa aarang batok k dan Gambar 6. Populasi Fungi zeolit steriil selama masa m penyim mpanan 70 hari h Jum mlah mikroob yang terkandung dalam sebbuah pupukk hayati sangat s menentukaan mutu daari pupuk haayati terseb but. Peraturaan Menteri Pertanian No.28 N tahun 2009 menyatakkan bahwa syarat s teknis minimal pupuk p hayatti tunggal adalah a g kepadatann populasi bakteri daan fungi daalam bahann pembawaa bentuk granul masing-m masing sebeesar >106 spk/g dan >105 spkk/g. Dengann begitu bahan b pembawa arang batook dan zeollit dengan inokulan Azotobacter A dan FPF sudah s memenuhii syarat seebagai pupuuk hayati tunggal jikka melihat dari kepaadatan populasinyya. Sedanggkan untuk bahan pem mbawa aranng batok daan zeolit deengan inokulan Azospirillum A m belum meemenuhi syaarat tersebutt.
28
Pemilihan bahan pembawa serta metode sterilisasi yang digunakan dapat mempengaruhi kelangsungan hidup mikrob inokulan. Bahan pembawa zeolit memberikan hasil yang lebih baik dalam mempertahankan viabilitas inokulan Azospirillum, Azotobacter dan FPF dibandingkan dengan arang batok hingga masa penyimpanan 70 hari. Sedangkan metode sterilisasi yang lebih baik dalam mempertahankan viabilitas inokulan adalah iradiasi Sinar Gamma Co-60. Bahan pembawa zeolit yang disterilkan dengan metode iradiasi Sinar Gamma Co-60 dan autoklaf dengan inokulan Azospirillum memberikan hasil yang terbaik dalam uji viabilitas dengan persentase penurunan jumlah sel sebesar 11.11%. Namun penggunaan metode sterilisasi autoklaf terhadap bahan pembawa arang batok menyebabkan penurunan jumlah sel inokulan FPF sebesar 99.75 % sehingga dapat dikatakan autoklaf bukanlah metode sterilisasi yang terbaik. Masing-masing inokulan memberikan hasil uji viabilitas yang berbeda terhadap metode sterilisasi yang digunakan terhadap bahan pembawa. Hal ini diduga disebabkan oleh perubahan kondisi bahan pembawa yang merupakan lingkungan hidup mikrob inokulan akibat proses sterilisasi. Penggunaan sterilisasi iradiasi Sinar Gamma Co-60 pada dosis 50 kGy mengubah sifat kimia tanah yaitu meningkatnya NH4 (Bowen dan Cawse, 1964; Tuominen et al., 1994), fosfor, mangan dan kalium (Bowen dan Cawse, 1964) serta kenaikan pH yang umumnya terjadi pada tanah lembab (Lotrario et al., 1995; Tuominen et al, 1994). Penggunaan
sterilisasi
autoklaf
dengan
intensitas
tertentu
dapat
meningkatkan kelarutan Fe, Mn dan Zn yang tinggi sehingga dapat meracuni mikob yang ada di dalamnya (Toharisman, 1989). Proses autoklaf juga dapat menyebabkan penurunan nilai pH hingga mencapai 0.2 unit (Skipper dan Westermann, 1973).
