IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Isolasi Promoter -Aktin Ikan Mas Promoter -Aktin dari ikan mas diisolasi dengan menggunakan metode PCR dengan primer yang dibuat berdasarkan data yang ada di Bank Gen. Panjang fragmen DNA hasil amplifikasi PCR adalah sekitar 1,5 kb (Gambar 8).
3,0 kb1,5 kb1,0 kb-
1,5 kb
Gambar 8. Elektroforesis hasil isolasi promoter -Aktin Ikan Mas (1) dan (M) marker ukuran fragmen DNA 2-log ladder (Biolabs, New England). Fragmen DNA target ditunjukkan dengan tanda panah. Panjang sekuen hasil sekuensing adalah 1528 bp (Gambar 9). Berdasarkan analisis sekuens diperoleh faktor transkripsi (transcription factor) yang merupakan elemen-elemen yang mempengaruhi aktivitas promoter. Elemen penting bagi promoter -aktin adalah boks TATA, motif CCAAT, motif CArG atau CC(A/T)6GG. Hubungan tingkat aktivitas promoter -aktin dengan sekuens CCAAT telah diteliti oleh Quitschke et al. (1989). Kegunaan motif CArG sebagai elemen responsif terhadap serum terletak antara CCAAT dan boks TATA, telah dijelaskan oleh Liu et al. (1990). Boks TATA merupakan elemen yang umum dijumpai pada sekuens promoter, sebagai tempat RNA polimerase melekat pada saat transkripsi RNA berlangsung (Glick & Pasternak, 2003). Kerja sama antara ketiga elemen tersebut menyebabkan promoter dapat aktif dan mengendalikan ekspresi transgen pada waktu dan tempat yang tepat. Hasil analisis menunjukkan bahwa ketiga elemen faktor transkripsi ini telah dilaporkan dijumpai pada promoter -aktin dari berbagai jenis ikan juga terdapat pada sekuens DNA hasil isolasi dari ikan mas. Sekuens CCAAT pada ikan mas terletak pada nukleotida 12-16, motif CArG terletak pada nukleotida 42 - 51, serta boks TATA terletak pada nukleotida 75-80 dihitung dari ujung terminal 5. Kandidat boks TATA lainnya untuk ikan mas terletak pada nukleotida 965-970
18
dari ujung terminal 5. Selain itu beberapa binding site lain yang potensial dalam transkripsi penting adalah GATA,TFIID, CBF, Sp1, TBP dan sebagainya juga ditemukan dalam sekuen ini. Elemen-elemen ini mungkin berfungsi sebagai regulasi transkripsi gen -aktin. Analisis pensejajaran (alignment) hasil sekuensing gen β-aktin ikan mas dengan data -aktin ikan mas dari bank gen (no. Aksesi Bank Gen: M24113) terdapat kemiripan yang tinggi, yaitu 97,52% (Gambar 9). Dari hasil analisis sekuen dan pensejajaran diduga bahwa sekuen hasil isolasi merupakan promoter -aktin ikan mas. Alignment hasil sekuensing promoter β-aktin ikan mas dengan ikan grass carp (no. Aksesi Bank Gen: M25013), ikan medaka (no. Aksesi Bank Gen: S74868) dan ikan megalobrama (no. Aksesi Bank Gen: AY170122) ditunjukkan pada Gambar 10. Berdasarkan hasil alignment diketahui bahwa posisi sekuen CCAAT, motif CArG dan boks TATA promoter β-aktin ikan mas relatif sama dengan ikan grass carp, ikan medaka dan megalobrama yang telah dilaporkan sebelumnya. Hal ini memperkuat dugaan bahwa hasil kloning merupakan promoter β-aktin ikan mas. 4.2 Konstruksi pccBA-EGFP Untuk mengetahui promoter β-aktin yang diisolasi dari ikan mas dapat aktif atau tidak, maka promoter tersebut disambungkan/ligasi dengan gen penanda GFP.
Keberhasilan ligasi dianalisis menggunakan metode “cracking” seperti
ditunjukkan pada Gambar 11.
Ukuran ccBA-GFP lebih besar dibandingkan
dengan plasmid pEGFP-N1 dan plasmid dari kontrol berupa bakteri biru. Hal ini menunjukkan bahwa konstruksi gen pccBA-EGFP berhasil dibuat dan koloni bakteri yang membawa plasmid ini berhasil diidentifikasi (no. 1-6 pada Gambar 11). 4.3 Pengujian Efektivitas Promoter Uji efektivitas promoter dilakukan dengan membandingkan promoter βaktin ikan mas hasil isolasi dengan promoter β-aktin yang berasal dari ikan medaka dan ikan nila. Pengujian dilakukan dengan melihat tingkat dan pola ekspresi baik secara kualitatif maupun secara kuantitatif. Sebagai data pendukung dilakukan juga analisis terhadap derajat kelangsungan hidup embrio (DKH-e),
19
derajat penetasan (DP), dan persentase embrio (PEMG) dan larva (PMLG) yang mengekspresikan gen GFP.
Gambar 9. Alignment hasil sekuensing promoter -aktin ikan mas dengan gen aktin ikan mas (no. Akses Bank Gen: M24113). Garis bawah merah lines 1 dan 2 merupakan sekuen primer forward yang digunakan untuk isolasi promoter maupun untuk pembuatan konstruksi gen. Lines 22 dan 23 merupakan sekuen primer reverse yang digunakan untuk pembuatan konstruksi, lines 26 dan 27 merupakan sekuen primer reverse yang digunakan untuk isolasi promoter.
20
Gambar 10. Alignment hasil sekuensing promoter β-aktin ikan mas, ikan grass carp (no. Akses Bank Gen: M25013), ikan medaka (no. Akses Bank Gen: S74868) dan ikan megalobrama (no. Akses Bank Gen: AY170122). Posisi sekuen CCAAT, motif CArG dan boks TATA ditunjukkan di atas sekuens. Posisi sekuen CCAAT, motif CArG dan boks TATA yang ada dalam sekuens primer F untuk ikan mas sama dengan ikan lainnya dilihat dari ujung terminal 5 (dilihat dari sebelah kiri). K 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1112
▬ ◄ <
▬ ◄
Gambar 11. Elektroforesis hasil cracking bakteri koloni berwarna biru (K) dan yang putih (no. 1-6). No. 1-5: bakteri yang membawa konstruksi gen pccBA-EGFP, no. 6: bakteri yang membawa plasmid pEGFP-N1. Tanda minus (▬) di sebelah kanan gambar menunjukkan ukuran DNA plasmid yang mengandung DNA insersi atau pccBA-EGFP, tanda kepala panah tertutup (◄) untuk plasmid DNA pEGFP-N1, sedangkan tanda kepala panah terbuka (<) untuk plasmid dari bakteri anti koloni biru putih.
21
Nilai DKH-e, DP, PEMG dan PLMG diperlihatkan pada Tabel 1. Nilai DKH-e pada ccBA-GFP(70%) lebih tinggi dibandingkan dengan mkBA-GFP (55%) dan tiBA-GFP (40%), tetapi nilai DP pada ccBA-GFP relatif sama dengan mkBA-GFP yaitu 45% dibandingkan dengan tiBA-GFP (11,67%). Hal ini menunjukkan bahwa dengan menggunakan ccBA-GFP ternyata tidak terlalu mempengaruhi perkembangan embrio. Namun, nilai DKH-e dan DP dari perlakuan masih lebih rendah jika dibandingkan kontrol.
Hal ini diduga
disebabkan adanya kerusakan sel akibat injeksi atau kemungkinan akibat tingginya volume larutan DNA yang diinjeksikan. Menurut Zbikwoska (2003) untuk memastikan material genetik masuk dalam pronukleus, konsentrasi larutan DNA yang tinggi
diinjeksikan ke dalam sitoplasma telur-telur yang telah
difertilisasi. Namun semakin tinggi konsentrasi larutan DNA yang diinjeksikan juga akan meningkatkan mutagenesis atau meningkatkan jumlah partikel asing yang dapat menyebabkan kematian pada embrio (Hackett, 1993). Sementara itu PEMG dan PLMG hanya ditemukan pada perlakuan. PEMG pada mkBA-GFP (35%) lebih tinggi dibandingkan dengan ccBA-GFP (20%) dan tiBA-GFP (8,3%). Selanjutnya, PLMG pada ccBA-GFP (16,67%) lebih tinggi dibandingkan dengan mkBA-GFP (11,67%), sedangkan pada tiBA-GFP tidak ada larva yang mengekspresikan GFP. Data keseluruhan disajikan pada Lampiran 1. Dengan jumlah dan jenis faktor transkripsi sama, dapat disimpulkan bahwa promoter homolog (ccBA) lebih efektif dalam mengatur ekspresi gen target dibandingkan dengan promoter heterolog (mkBA dan tiBA). Tabel 1. Derajat kelangsungan hidup embrio (DKH-e), derajat penetasan (DP), persentase embrio yang mengekspresikan gen GFP (PEMG) dan persentase larva yang mengekspresikan gen GFP pada ikan mas.
DKH-e (%)
DP (%)
PEMG (%)
PLMG (%)
ccBA
Embrio yang diinjeksi (butir) r=2* 30
70 ±14,1
45 ± 11,8
20 ± 0
16,7 ± 4,7
mkBA
30
55 ± 16,5
45 ± 7,1
35 ± 25,9
11,7 ± 2,4
tiBA
30
40 ± 9,4
11,7 ± 7,1
8,3 ± 2,4
0±0
Kontrol
30
78,3 ± 7,1
65 ± 2,4
0±0
0±0
Jenis Promoter
*r = Ulangan
22
4.3.1 Pola Ekspresi secara Kualitatif Tingkat ekspresi gen GFP yang dihasilkan dari perlakuan dibagi menjadi tiga kelompok yaitu pendaran hijau kurang terang, pendaran hijau terang dan pendaran hijau sangat terang. Perbandingan tingkat ekspresi antar konstruksi DNA diamati pada jam ke-30 untuk promoter dari ikan mas (ccBA) dan promoter dari ikan nila (tiBA), sedangkan promoter dari ikan medaka (mkBA) pada jam ke10 dan disajikan pada Tabel 2. Tabel 2. Tingkat ekspresi gen ccBA-GFP, mkBA-GFP dan tiBA-GFP pada embrio ikan mas.
Konstruksi Gen
Persentase embrio berdasarkan tingkatan ekspresi GFP
Total embrio yang mengekspresikan GFP (%)
ccBA-GFP
1 8,3±2,4
2 8,3±2,4
3 3,3±0,0
mkBA-GFP
13,3±9,4
13,3±9,4
8,3±7,1
35±25,9
tiBA-GFP
5±2,4
3,3±0,0
0,0±0,0
8,3±2,4
20±0
Keterangan : 1. Pendar hijau kurang terang. 2. Pendar hijau terang. 3. Pendar hijau sangat terang
Berdasarkan Tabel 2 terlihat bahwa pada ketiga klasifikasi tingkat ekspresi gen GFP, persentase embrio yang mengekspresikan GFP pada promoter mkBA lebih tinggi dibandingkan dengan promoter ccBA dan promoter tiBA. Selanjutnya, promoter ccBA lebih tinggi dibandingkan dengan promoter tiBA. Hal ini menunjukkan bahwa promoter homolog (ccBA) memiliki aktivitas lebih tinggi dibandingkan dengan yang heterolog (tiBA). Namun demikian, meskipun promoter mkBA heterolog bagi ikan mas, perbedaan panjang sekuen yang sangat signifikan antara promoter mkBA (3,7 kb) dan ccBA (1,3 kb) mungkin mempengaruhi ekspresi GFP. Tingkat ekspresi gen pada setiap promoter ada yang kuat dan ada yang lemah. Menurut Chou et al. (2001) jika fragmen DNA yang terdiri dari suatu gen target atau gen penanda homolog/heterolog ditransfer maka akan sangat umum untuk menemukan kejadian mosaik (mozaic), ekspresi sementara (transient expresion), dan ekspresi yang beranekaragam dari gen yang ditransfer dalam ikan transgenik. Hal ini disebabkan distribusi yang tidak sama dari transgen pada
23
embrio-embrio ikan yang diinjeksi. Ekspresi pada setiap embrio sebagian atau tidak tersebar dimana ada beberapa jaringan yang terekspresi kuat sementara yang lain tidak ada. Kebanyakan tingkat ekspresi diduga berhubungan kuat dengan jumlah copy transgen pada setiap sel (Hwang et al., 2003). Alimuddin et al. (2007b) menjelaskan bahwa ekspresi gen yang lemah atau bahkan tidak ada sama sekali bila terintegrasi di sentromer atau di telomer dimana DNA tidak aktif mengalami transkripsi dan diposisikan di heterokromatin. Selain itu, kemungkinan integrasi gen terjadi secara acak dalam kromosom, sehingga terjadi perbedaan tingkat ekspresi gen di jaringan yang berbeda. Pola ekspresi gen GFP yang diamati pada embrio hasil mikroinjeksi bersifat sementara (transient expression) dimana ekspresi yang dihasilkan
Jumlah embrio/larva yang mengekspresikan transgen
awalnya rendah, kemudian meningkat dan akhirnya menurun (Gambar 12). 10 8 6 4 2 0
ccBA mkBA 4 10 18 26 34 40 48 56
tiBA
Jam ke-
Gambar 12. Pola ekspresi gen GFP pada ccBA-GFP, mKBA-GFP dan tiBA-GFP pada embrio/larva ikan mas Cyprinus carpio Pola ekspresi sementara gen GFP menggunakan ccBA-GFP mulai terlihat pada jam ke-6 setelah fertilisasi (fase blastula) kemudian mencapai puncak pada jam ke-30 setelah fertilisasi (fase perkembangan organogenesis) dan ekspresi ini pada larva masih tetap bertahan hingga larva berumur 1 minggu (Gambar 13). Pola ekspresi sementara pada mkBA-GFP mulai terlihat pada jam ke-6 setelah fertilisasi (fase blastula), meningkat pada jam ke-10 setelah fertilisasi (fase gastrula), dan menurun pada jam ke-56 (pada larva) (Gambar 14). Sedangkan pola ekspresi sementara pada tiBA-GFP muncul pada jam ke-6 setelah fertilisasi (fase blastula), meningkat pada jam ke-32 setelah fertilisasi (fase perkembangan organogenesis) hingga tidak terlihat lagi pada larva (Gambar 15). Ekspresi gen GFP yang tinggi dan bertahan lebih lama menunjukkan bahwa promoter β-aktin
24
dari ikan mas memiliki efektivitas yang lebih tinggi
dibandingkan dengan
promoter β-aktin dari ikan medaka dan ikan nila.
Gambar 13. Ekspresi gen GFP menggunakan ccBA-GFP pada embrio dan larva ikan mas. Inisiasi ekspresi pada jam ke-6 (A), Ekspresi gen pada jam ke-10 (B), Puncak ekspresi pada jam ke-30 (C) Ekspresi pada larva jam ke-34 (D), Ekspresi pada larva jam ke-56 (E), dan Ekspresi pada larva jam ke-192 (F).
Gambar 14. Ekspresi gen GFP menggunakan mkBA-GFP pada embrio dan larva ikan mas. Inisiasi ekspresi pada jam ke-6 (A), Puncak ekspresi gen pada jam ke-10 (B), Ekspresi pada larva jam ke-34 (C) dan ekspresi pada larva jam ke-56 (D).
25
Gambar 15. Ekspresi gen GFP menggunakan tiBA-GFP pada embrio ikan mas. Inisiasi ekspresi gen pada jam ke-6 (A), Ekspresi gen pada jam ke-10 (B), Puncak ekspresi gen pada jam ke-30 (C), Akhir ekspresi gen pada jam ke-32 (D) dan ekspresi gen tidak nampak lagi pada larva jam ke-34 (E). Pola ekspresi gen asing yang tinggi terjadi pada fase mid blastula transition (MBT) hingga fase gastrula sebagai hasil dari akumulasi DNA yang diinjeksikan akibat replikasi selama tahap pembelahan dan akumulasi enzim yang menyebabkan dimulainya proses transkripsi pada fase MBT (Iyengar et al., 1996). Ekspresi gen mulai menurun dengan waktu yang berbeda pada tiap promoter. Hal ini mungkin berhubungan dengan aktivitas enzim eksonuklease dan/atau endonuklease di dalam embrio dan larva. Aktivitas enzim tersebut dalam memotong konstruksi DNA asing diduga berbeda antara yang homolog dan heterolog, sehingga kecepatan turunnya ekspresi GFP menjadi berbeda. Setelah menetas, ekspresi transgen menggunakan ccBA-GFP dan mkBAGFP masih tetap terlihat pada larva. Posisi ekspresi gen GFP pada larva dengan menggunakan transgen ccBA-GFP terdapat pada kepala, kuning telur dan otot (Gambar 16), sementara dengan mkBA-GFP, posisi ekspresi GFP pada larva yang terlihat di kepala, otot dan ekor (Gambar 17).
26
Gambar 16. Posisi ekspresi gen GFP menggunakan ccBA-GFP pada larva ikan mas pada kepala (A), kuning telur (B), dan otot (C).
A
B
C
Gambar 17. Posisi ekspresi gen GFP menggunakan mkBA-GFP pada larva ikan mas pada kepala (A), otot (B), dan ekor (C). Ekspresi gen GFP yang dikendalikan oleh promoter ccBA-GFP dan promoter mkBA-GFP tidak spesifik pada suatu organ. Hal ini berkenaan dengan sifat ubiquitous (terdapat dimana-mana) dari promoter β-aktin yang artinya promoter ini dapat aktif pada semua jaringan otot. Menurut Iyengar et al. (1996), distribusi yang tidak sama dari copy transgen dalam jaringan poliploid seperti selsel otot atau sel-sel pada lapisan syncytial telur (YSL) mungkin menjelaskan tingginya variabilitas ekspresi transgen dalam jaringan. Lebih lanjut dijelaskan bahwa perbedaan ekspresi transgen mungkin berhubungan dengan posisi dimana transgen terintegrasi dalam kromosom yang mengaktifkan gen tersebut di otot. Ekspresi gen GFP menggunakan ccBA-GFP dan mkBA-GFP pada larva tergolong kuat. Hal ini terjadi diduga karena ekspresi dapat muncul dan menguat kembali pada saat dimana pertumbuhan berlangsung cepat sehingga banyak sel yang membelah dan kembali terjadi peningkatan replikasi atau dapat pula terjadi pada saat mulai terjadinya pembentukan otot-otot karena promoter β-aktin diisolasi dari otot dan dapat aktif pada semua jaringan otot (Winkler et al., 1991). Kejadian -
27
kejadian ini mungkin terjadi mengingat promoter β-aktin memiliki sifat housekeeping (dapat aktif kapan saja) dan constitutive (aktif tanpa faktor pemicu). Akan tetapi ekspresi ini kelihatan tidak nampak lagi pada waktu tertentu karena telah tertutup oleh warna kulit, daging dan sebagainya bergantung dari kemampuan masing-masing promoter dalam mengekspresikan gen GFP. Lain halnya dengan ekspresi gen menggunakan tiBA-GFP pada larva tidak nampak lagi. Ekspresi gen GFP ditemukan hanya sampai fase gastrula, sedangkan pada embrio yang sudah melewati fase tersebut (older embryos) DNA asing yang bertahan hanya dalam jumlah yang terbatas akibat adanya degradasi (Winkler et al., 1991). 4.3.2 Pola Ekspresi secara Kuantitatif Metode semi-kuantitatif Reverse Transcription PCR (RT-PCR) dilakukan untuk mengetahui tingkat ekspresi transgen GFP yang dikendalikan oleh promoter homolog dan heterolog dari setiap konstruksi gen yang diuji.
Gambar 18. Analisis ekspresi gen GFP menggunakan RT-PCR. (a) Kolom no 1, 2 dan 3, produk PCR dari embrio yang masing-masing telah diinjeksi dengan ccBA-GFP, mkBA-GFP dan tiBA-GFP. K- adalah produk PCR tanpa cetakan DNA, K+ adalah produk PCR dengan cetakan plasmid mengandung GFP, dan M adalah marker molekuler DNA. Panjang fragmen GFP yang diamplifikasi adalah sekitar 600 bp. (b) Produk PCR dengan primer gen β-aktin (200 bp). Berdasarkan ketebalan pita DNA hasil RT-PCR, promoter ccBA (Gambar 18a, kolom no. 1) dan promoter mkBA (Gambar 18a, kolom no. 2) memiliki efektivitas yang sama. Pita DNA untuk ekspresi GFP dengan promoter tiBA tidak nampak (Gambar 18a, kolom no.3), yang diduga karena ekspresi GFP sangat rendah. Selain itu, jumlah siklus amplifikasi PCR sebanyak 35 siklus pada tiBAGFP tidak dapat menghasilkan produk amplifikasi yang bisa terdeteksi.
28
