II. MATERI DAN METODE 2.1 Materi, Lokasi, dan Waktu Penelitian 2.1.1 Materi Alat yang digunakan dalam penelitian adalah cawan petri, tabung reaksi, gelas ukur, pembakar spiritus, pipet, jarum ose, erlenmeyer, penggaris, pinset, gunting, pisau, sprayer (botol semprot), botol selai, plastik pembungkus, mikroskop, colony counter, timbangan, kompor, panci, blender, Laminar Air Flow (LAF), autoclave, oven, kertas label, kertas saring, plastik, tissue, baki, ember dan kapas. Bahan yang digunakan adalah Pupuk Hayati Majemuk Cair Bioextrim, isolat cendawan Fusarium oxysporum didapat dari koleksi Labolatorium Mikologi Fakultas Biologi UNSOED Purwokerto, media King's B, media TSA (Tryptic Soy Agar), Media Caceres, Media YEMA (Yeast Extract Mannitol Agar), Media Asbhy, media PDA (Potato Dextrose Agar), alkohol 70%, spirtus, aquades steril, tanah, pasir dan benih cabai. 2.1.2 Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Rumah Kaca (green house) Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman Purwokerto. Penelitian dilaksanakan dari bulan April sampai dengan bulan Juli 2014. 2.2 Metode Penelitian 2.2.1 Rancangan Percobaan Penelitian dilakukan secara eksperimental menggunakan rancangan acak lengkap (RAL). Perlakuan terdiri dari empat penginokulasian mikroba biofertilizer pada media carrier alami yang berbeda yaitu: (1) Media alami Air Kelapa (Ba); (2) Media alami Bonggol Pisang (Bb); (3) Media alami Cocopeat (Bc) dan (4) Media alami Campuran dari ketiga bahan (Bd). 2.2.2 Variabel yang diamati Variabel yang diamati dalam penelitian adalah variabel bebas dan variabel terikat. Variabel bebas dalam penelitian ini adalah macam media carrier alami. Variabel terikat dalam penelitian ini adalah viabilitas bakteri dalam media carrier alami dan kemampuan bakteri asal biofertilizer dalam menekan pertumbuhan F. oxysporum. Parameter yang diamati dalam penelitian ini adalah jumlah populasi 6
bakteri pada media carrier alami dan persentase indeks penyakit yang ditimbulkan oleh patogen F. oxysporum terhadap tanaman cabai. 2.3 Cara Kerja 2.3.1. Sterilisasi Alat (Hadioetomo. 1990) Sterilisasi alat dilakukan dengan membungkus semua peralatan dengan menggunakan kertas kemudian dimasukkan dalam autoclave pada suhu 1210 C dengan tekanan 2 atm selama 15 menit. 2.3.2.Isolasi dan Perhitungan Populasi Awal dari Bakteri yang Terkandung dalam Biofertilizer komersial Bakteri dalam biofertilizer komersial diisolasi kemudian dihitung jumlah populasinya. Bakteri diisolasi menggunakan media selektif, yaitu media King’s B untuk Pseudomonas spp., media Caceres untuk Azospirillum spp., media Asbhy untuk Azotobacter spp., media TSA untuk Bacillus spp. dan media YEMA untuk Rhizobium spp. Biofertilizer komersial diambil sebanyak 1 ml, kemudian diencerkan dalam 9 ml akuades steril, dikocok hingga homogen dan dilakukan pengenceran kembali hingga 6 kali seri pengenceran. Dua pengenceran seri terakhir diambil sebanyak 0,1 ml dan ditanam duplo pada masing-masing medium selektif. Perhitungan populasi sel dilakukan dengan metode TPC (Total Plate Count). Cawan-cawan kemudian diinkubasi selama 2x24jam pada suhu 300C, dan penghitungan koloni menggunakan colony counter. Jumlah sel = Jumlah koloni cawan 1,2,3,... dst x 1/fp Jumlah cawan
cfu
2.3.3. Penyiapan Media Carrier Alami Biofertilizer Media carrier alami terdiri dari air kelapa, bonggol pisang dan cocopeat. Air kelapa terlebih dahulu disaring dan cocopeat diayak kemudian dicampur dengan akuades steril hingga kandungan airnya menjadi 30-40% (ditandai dengan tidak menetesnya air bila bahan digenggam dan akan mekar bila genggaman dilepas), sedangkan bonggol pisang dipotong kecil-kecil dan dihaluskan dengan blender. Ketiga bahan ini dipisah sesuai dengan perlakuan. Media campuran terdiri dari 3 bahan media carrier alami (air kelapa, cocopeat dan bonggol) dengan perbandingan komposisi yang sama. pH media di buat sama yaitu 7 dan selanjutnya media disterilisasi dengan uap panas menggunakan autoclave. 7
2.3.4. Fermentasi Media Carrier Biofertilizer Media carrier alami yang telah disiapkan diinokulasikan secara aseptis dengan biofertilizer komersial. Inokulan biofertilizer diinokulasikan ke dalam media sebanyak 10 ml/1 lt bahan media cair atau 10 ml/1 kg bahan media padat dengan jumlah populasi per mililiter dapat diketahui dari hasil jumlah perhitungan populasi awal mikroba biofertiolizer. Setelah itu, media dimasukan ke dalam toples plastik dan difermentasi selama tujuh hari pada suhu kamar. 2.3.5. Uji Viabilitas Mikroba Hasil Fermentasi dengan Metode Total Plate Count (TPC) (Lay, 1994) Uji viabilitas inokulan dilakukan setelah 7 hari inkubasi dengan mengencerkan 1 gram hasil fermentasi biofertilizer dengan 9 ml aquades steril, dikocok hingga homogen dan dilakukan pengenceran kembali hingga 6 kali seri pengenceran. Dua pengenceran seri terakhir diambil sebanyak 0,1 ml dan ditanam duplo pada media selektif bakteri. Penghitungan populasi sel dilakukan dengan metode TPC. Cawan-cawan selanjutnya diinkubasi selama 2x24jam pada suhu 300C, dan penghitungan koloni menggunakan colony counter. Jumlah sel = Jumlah koloni cawan 1,2,3,... dst x 1/fp cfu Jumlah cawan Setelah didapat nilai jumlah populasi akhir selanjutnya dihitung persentase selisih jumlah populasi dengan rumus Jumlah koloni mikroba akhir- Mikroba awal (cfu/ml) Viabilitas (%) = ------------------------------------------------------------------------- x 100% Total Jumlah koloni (Mikroba awal+mikroba akhir) (cfu/ml) 2.3.6. Pembuatan Inokulum Fusarium oxysporum Perbanyakan isolat patogen F. oxysporum dilakukan dengan menggunakan medium PDA. Media PDA steril sebanyak 250 ml dimasukan ke dalam Erlenmeyer dan ditambah streptomycin 0.128 g/l, kemudian dituang dalam cawan petri sebanyak 10 ml/cawan. Setelah medium memadat, potongan miselium F. oxysporum dari biakan murni dipindah secara aseptis dan diinkubasi selama 7 hari atau hingga miselium memenuhi cawan petri. Untuk penularan pada tanaman, F. oxysporum diperbanyak pada media organik yaitu campuran gabah dan sekam. Bahan media dengan perbandingan gabah 70% dan sekam 30%, dicuci sampai bersih kemudian direbus (Kurrata, 2007). Diambil kurang lebih 150 gram dan dimasukkan dalam erlenmeyer 250 cc, ditambah dengan pepton 5% sebanyak 5 ml, selanjutnya disterilisasi dalam 8
autoclave. Setelah dingin, media tersebut diinokulasi dengan jamur F. oxysporum. Biakan sekam tersebut selanjutnya diinkubasikan selama 7 hari pada suhu kamar. Setelah media organik tersebut dipenuhi jamur, biakan siap diaplikasikan pada media tanam. 2.3.7. Uji Kemampuan Biofertilizer pada Media Carrier Alami Terhadap Pertumbuhan Tanaman Cabai (Capsicum annum) yang diinfeksi dengan F. oxysporum Pengujian kemampuan biofertilizer hasil fermentasi pada media carrier alami terhadap jamur patogen F. oxysporum dicobakan pada pembibitan tanaman cabai. Biji cabai disemai pada media semai. Media persemaian yang digunakan adalah campuran pasir dan tanah dengan perbandingan 1:1. Media persemaian ini disterilkan dengan cara memanaskan di dalam panci selama 1 jam dengan keadaan airnya mendidih, kemudian didinginkan selama 24 jam. Selanjutnya media semai disterilisasi lagi dengan cara yang sama. Sebanyak 0,5 kg media persemaian dimasukkan ke dalam baki kecambah. Media persemaian pada baki diinfeksi dengan patogen F. oxysporum dengan menambahkan media organik F. oxysporum sebanyak 15 g/baki dan diinkubasi selama 5 hari, selanjutnya biofertilizer hasil fermentasi dimasukkan ke dalam baki persemaian sebanyak 10 g/ tanaman untuk media carrier padat dan 10 ml/ tanaman untuk media carrier cair, kemudian diinkubasikan selama 3 hari. Biji cabai dengan ukuran seragam terlebih dahulu disucihamakan dengan larutan kalsium hipoklorit 1,85% selama 3 menit dan dicuci lagi dengan akuades steril sebanyak 4 kali. Biji cabe disemai pada media semai sebanyak 10 biji/baki. Penyiraman dilakukan dengan akuades steril untuk memantapkan struktur dan agregat tanah, dan tanaman dipelihara selama 3 minggu. Pemeliharaan tanaman meliputi penyiraman setiap hari sekali dengan air sesuai dengan kebutuhan. Penyiangan gulma dan pengendalian hama dilakukan bila perlu dengan cara mekanis. Pengamatan pertumbuhan tanaman dilakukan seminggu sekali mulai umur 7 hari sampai tanaman berumur 14 hari sesudah tanam. Persentase penyakit dihitung dengan menggunakan rumus yang diadaptasi dari Abadi (2003). Jumlah tanaman sakit P (Persentase Indeks Penyakit) = ---------------------------------- x 100% Jumlah seluruh tanaman 9
2.4 Metode Analisis Data yang diperoleh dari hasil pengamatan dianalisis dengan uji analisis varian tunggal (one way anova) F pada taraf 5%. Hasil data yang diperoleh tidak berbeda nyata antara perlakuan yang dicobakan, sehingga tidak dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Terkecil (BNT) pada taraf 5%.
10
