eniinar Na.vional Peternakan dan Veteriner 1999
PRODUKSI EMBRIO KAAlBING DENGAN TEKNOLOGI MATURASI, FERTILI SA S I DAN KULTUR IN VVITRO A.
BOEDIONO,
Y.
RusiYANIY.)NO, K. MOHAMAD,
1.
DnnvITA,
dan Y.
SuKRA
Laboratoriuni Brnbriologi, l3agian Anatond, Fakuhas Kedokteran Hewan IPB ,lalan 7antan Kc ncana 3, Bogor 16151
ABSTRAK Penelitian ini bertujuan mcneliti perkembangan oosit kambing setelah maturasi, fertilisasi dan kultur in vitro dalam upaya produksi embrio kambing. Ooosit dikoleksi melalui aspirasi ovarium yang memiliki atau tidak memiliki Corpus Luteum (CL). Keberadaan CL diamati dan dilihat pengandinya terhadap jumlah 1'olikel yang diaspirasi (diameter 2-5 mm), jumlah folikel dominan (diameter >5nun), bcrat scrta ukuran ovarium . Maturasi oosit hasil aspirasi dilakukan di dalam tissue culture tnedium (TCM) 199 yang disuplementasi dengan 10% serum kambing, 0,01 mghn1 Jbllicle stitnidating hormone (FSH) dan 50 pg/nil gentamicin sulfat . Oosit dimaturasi di dalaui inkubator 5% CO, pada suhu 38.5°C selama 18, 22, 26, atau 30 jam . Penelitian selanjutnya, oosit liasil maturasi diinscminasi dcngan spermatozoa ejakulat (konsentrasi akhir 5x106 spermatozoa/ml) yang telah mengalami kapasitasi in vitro. Delapan belas jam setelah inseminasi, sigot dikultur dalam media TCM-199 yang disuplementasi 10% serum kambing, 5 ~Lg/ml insulin dan 50 pg/ml gentamicin sulf-it . selanjutnya diamati perkembangannya mencapai tahap pembelahan. Keberadaan CL berkorelasi positif terhadap jumlah folikel berdiameter 2-5 mm sebagai sumber oosit. Jumlah folikel dcngan diameter 2-5 min lebih tinggi pada ovarium dengan CL (10,23 folikel per ovarium) dibandingkan dengan ovarium tanpa CL (7,92 folikel per ovarium) . Jumlah folikel dominan pada ovarium dengan CL (0,23 folikel per ovarium) lebih rendah dibandingkan dengan ovarium tanpa CL (0,64 folikel per ovarium) . Keberadaan CL pada ovarium juga berkorelasi positif dcngan bcral dan ukuran ovarium . Tingkat maturasi oosit yang mencapai taliap metafase 11 adalah 25.64%, : 78,26'% ; 80,56% ; dan 73,68% berturut-tuntt untuk periode maturasi 18, 22, 26, dan 30 jam . Dala inciuuijukkan periode maturasi terbaik adalah 22 sampai 26 jam . Kejadian partenogenesis spontan (2,63%) terlihat pada 30 jam maturasi in vitro sebagai akibat over inaturalion . Pcrkembangan oosit hasil maturasi, fertilisasi dan kultur in vitro menunjukkan tingkat pembelahan yang ticlak berbeda nyata untuk kedua maeam sumber oosit (20,00% dan 12,23% bcrturut-turut untuk oosit yang berasal dari ovarium dengan dan tanpa CL). Hasil ini menunjukkan bahwa cmbrio kambing dapat dihasilkan melalui maturasi, fertilisasi dan kultur in vitro dari oosit yang diperolch dari ovarium dengan atau tanpa CL. Kata kunci : Oosit kambing, maturasi. fcrtilisasi, kultur, in vitro PENDAHULUAN Salah satu dari banyak faktor peinbatas yang esensiil pada transfer embrio pada runiinansia kecil adalah biaya yang mahal karena masili diperlukan perasat bedah. Teknik fertilisasi in vitro merupakan alternatif untuk mcndapatkau produksi embrio dengan biaya relatif murah . Selain itu keberhasilan fcrtilisasi in vitro ini mcinungkinkan majunya perkembangan ilmu pengetahuan dibidang bioteknologi reproduksi misalnya produksi embrio identik atau klonnlng dan tranfer gen .
258
Seminar Atasionat Peternakan dam Veteriner 1999
Dengan kcniajuan bioleknologi clibidanb reproduksi, limbah nimah potong liewan klnistisnya liewan betina benlpa ovarium sebagai stunber sel gannet betina (oosit) melalui suatu rekayasa bioteknologi dapal dinianfiiatkan sehingga nienjadi suatu produk yang sangat berharga benlpa enibrio. Hal tersebut dinitlngkinkan dengan penerapan teknologi fertilisasi in vitro (FIV) yang dilaksanakan melalui proscs aspirasi clan maturasi sel telur, pembualian dengan spermatozoa clan perkembangan embrio di luar tubuli liewan (BOEDIONo clan DAMAYANTI, 1996) . Sainpai saat ini inforniasi keberhasilan produksi embrio secara in vitro pada kambing masih beltim banyak, sehingga untuk kondisi Indonesia yang mempunyai populasi kanibing yang cukup banyak masili perlu adanya penelitian yang nienyeluruh . Tujuan dari penelitian ini adalah untuk meneliti perkembangan oosit kambing setelali maturasi, fertilisasi clan kultur in vitro. MATERI DAN METODE Metode fertilisasi in vitro yang digunakan untuk produksi embrio sesuai dengan metode yang telah dilakukan sebcluninya oleli BtaEDI ( )No et al. (1994) dengan sedikit modifikasi . Koleksi clan maturasi posit Ovari kambing diambil dari rumah potong hewan dalam medium NaCl fisiologis pada sului 30°C clan dibcdakan bcrdasarkan kebcradaan korpus luteuni (CL) pacla ovaritun : ovarium dengan CL clan ovarium tanpa CL . Scbeluin dilakukan koleksi oosit dilakukan pengainatan terhadap niorfologi ovarium nieliputi junfah folikel benlkuran diameter 2-5 nini (folikel yang layak untuk fertilisasi in vitro) dan diameter >5 nun (folikel dominan), ukuran panjang clan lebar serta berat ovaium. Koleksi oosit dilakukan dengan cara : a) aspirasi oosit dari folikel, follikel benlkuran diameter antara 2-5 min dianibil clcngan cara aspirasi menggtinikan janim benlkuran 20G yang dihubungkan dengan spuit 5 nil yang scbcluinnya telah diisi 0,5 nil larutan modifikasi phosphate buffered saline (niPBS), dan b) mcncacah ovariuni, dengan menggiinakan pisau silet yang telah disterilisasi dilakukan sayatan berul;mg-ulang pada bagian korteks ovarium keniudian ovariuin dicuci pada larutan niPBS. Oosit hasil koleksi keniudian dicuci beberapa kali dan clikultur in vitro dalain niediuni maturasi yang terdiri dari Tissue Culture Medium 199 (TCM-199) ditanibalikan dengan senim kambing 10"/ , foliclc s6nuilating hornione (FSH) 0,01 mg/nil clan gentainicin sulfat 50 ltg/nil . Maturasi oosit secara in vitro dilakukan dalam inkubator COZ 5% dengan suliti 38,5°C dengan periode inkubasi yang bcrbeda (18, 22, 26, dan 30 jain) . Koleksi clan persiapan spermatozoa Spermatozoa segar diclapat clari pejantan dengan nienggunakan vagina buatan. Pencucian spermatozoa dilakukan dengan sentrifugasi sebanyak 2 kall masing-niasing dengan kecepatan 5000 selania 5 mcnit dalani lanilan BIZACKEi-r clan OLIPHANT (BO ; BRACKETT clan OLIPHANT, 1975) yang telah ditanibalikan kafein 2 .5 niM (Kaf-BO) . Spermatozoa liasil pencucian diencerkan dengan media yang telah ditanibalikan BSA 0,3%, dan lieparin 20 pg/nil sehingga konsentrasinya incnjadi 5 x 10`'spcrniatozoa/inl. Fertilisasi in vitro Oosit yang telah niatang, dicuci dalani medium fertilisasi (Kaf-BO) sebanyak 3 kall keinudian dilakukan fertlisasi dalatn nieditun rlropltetes sebanyak 100 ltl berisi sebanyak 20-30 259
Seminar Ni,sioncil Peternakan dan Veteriner 1999
oosil per drop. Fertilisasi in vitro dilakukan selama 18 jam dalam inkubator COZ 5% dengan suhu 38 .5"C . Perkenibangan cntbrio in vitro Sigot hasil fertilisasi in vitro dicuci dari medium inseminasi untuk selanjutnya dilakukan kultur dalam medium kultur (TCM-199) dengan penambalian insulin 5 ltg/rnl, gentamicin sulfat 511 ltghnl dan scrum kambing sebanyak 10%,, Kultur in vitro dilakukan dengan sistem kumulus sel ko-kultur (Gtrrtl el ol., 1988). Pengamatan dilakukan pada hari kedua untuk menghitung tingkat perkembangan sampai tahap pembelahan. Perwartman pronukleus Pengamatan pronukleus dilakukan dengan metode pewamaan Aceto-Orcein seperti yang pernah dilakukan olch BUt?mO NO ei o/.. (1995b) . Oosit yang akan dievaluasi diambil dari medium maturasi sesum dengan periodc maturasi (IX . 22. 26, dan 30 jam). Sel kumulus yang mengelilingi uosit d1hilangkan dengan cara dipipcl berulang-ulang menggunakan pipet dengan diameter yang sestmi dengan diameter oosil atau dengan perendaman dalam medium yang mengandung hyaluronidasc 150 U/ml. Oosil yang lelali bcbas dari sel kumulus di fiksasi dalam asam asetatalkohol 25% selama 72 jam . diwarnai dengan aceto-orcein 1% selama 10 menit dan dibersiltkan dengan accto-glycerol . Pengamalan pronukleus dilakukan menggunakan mikroskop fase kontras . IIASIL DAN PEMBAHASAN Untuk mengelalmi gambaran makroskopis ovarium kambing telah dilakukan pengainatan terhadap 184 ovarium yang terdiri dari 100 ovarium dengan corpus luteum (CL) dan 84 ovarium tanpa CL (Tabel 1). Dari hasil pengamatan didapatkan bahwa jumlah folikel berukuran 2-5 mm (merupakan folikel yang Iayak mttuk fertilisasi in vitro) lebih banyak didapatkan pada ovarium dengan CL (rata-rala 10 .12 folikel pcr ovarium) daripada ovarium tanpa CL (rata-rata 7,92 folikel per ovarium) . Nantun dcmikian jumlah dominan folikel (folikel dengan diameter lebih dari 5 nun) lerdapal Icbih banyak pada ovarium tanpa CL (rata-rata 0,64 dominan folikel per ovarium) daripada ovarium dengan CL (rala-rala 0.23 dominan folikel per ovarium) . Hal tersebut sesuai dengan pcnelilian yang telalt dilakukan olch BOEDIONO et al . (1995a), kebcradaan CL akan memberikan korclasi posilif terhadap jumlah folikel . Tabel 1 .
Ovarium DenganCl . "fanpaCl, Keter
Gambaran makroskopis ovaritun kambing Jumlah ovarium 100 84
ngan: hund'yang
Jimlah folikel per ovarium 2-5 nun 10,12 4 7,92~'
Berat per ovarium
Ukuran ovaritun (an)
>; nun 0,23 4
(gr)
Panjang
Lebar
1,67 3
1,964
1,388
0,64~'
0,98~
1,607
1,114
tvrtkda pada kulmu yaw, sama menunjukkan
an yang nyata
P-- -0,05)
Pada ovarium dengan CL didapalkan jumlah folikel yang lebilt banyak dan mempunyai kualitas oosit yang lebilt baik dibandingkan dengan ovarium tanpa CL, walaupun pada individu yang sama (PiEatSON dan ANTHER . 19.87). Keberadaan CL yang menghasilkan progesteron dalam sirkulasi tubuh akan menyebabkan pengliambatan pertumbuhan dominan folikel mencapai ovulasi sehingga mengurangi pengaruh dominan folikel terhadap penumbuhan dan perkembangan folikel260
Semin
folikel lainnya yang Icbilt kecil . Hall ini inengakibatkan junllah folikel-folikel berikulnya akan Icbilt bany;tk dengan kualitas yang Icbili baik (T,wiA)R dan RAJAMAIIFNDRA :N, 1991 ; SAVIO et al ., 1993) . Dari hasil pengamatan terlihat balma pada ox -arium kambing bisa didapatkan donlinan folikel alau junilah CL antara 1 sampai 4 . Keberadaan dominan folikel atau CL yang lebih dari situ sesuai dengan keniatupuan kambing unluk ovulasi norinal lebih dari satu dan dapat mcnghasilkan anak antara 1 salupai 4 (RUMICII, 1967) . Ukuran paujang dan Icbar ovariurn mcmpunyai korelasi positif dengan berat ovarium . Berat rata-rata ovarium dengan CL (1,67 gr) Icbilt berat dibandingkan dengan ovarium tanpa CL (0,98 gr) . CL terbenluk segcra sclelah ovulasi sebagai akibat hipertrofi dan luteinisasi sel-sel graoulosa (HAFEZ, 1993) . CL akan bertalnbah beral secara cepat sampai sekitar pertengahan periode siklus berahi . Pada kambing, CL akan tcrus bcrtambah berat mulai hari ke-2 sampai ke-8 dan akan bertallan sampai hari ke-I 5 dimana proscs regrcsi mulai terjadi (ERB et al., 1971) . Koleksi oosit kambing pada ovaritun dengan CL menggunakan cara aspirasi rata-rata didapatkan sebanyak 10,12 oosit per ovariurn . Junilah tersebut lebih sedikit dibandingkan bila dilakukan dengan metode yang sama pada sapi (13,25 oosit per ovariurn) seperti dilaporkan oleh BOEDIONo dan SUZUKI (1996) . Usalia mcngoptinuunkan jumlah dapatan oosit dapat dilakukan dengan mencacall ovariurn setelah aspirasi . Dengan metode tersebut didapatkan tambahan ratarata sebanyak 8,19 oosit per ovariurn .
Untuk keberhasilan teknik fcrtilisasi in vitro diperlukan informasi mengenai waktu dan tingkat maturasi oosit hasil aspirasi yang mencapai taliap metafase lI (M 11) setelah dikultur secara in vitro. Tclah dikctalmi . fcrtilisasi h;mya bisa terjadi pada oosit yang telah mencapai tahap M 11 . Dari hasil pcngalnalan terlihat balma pada periode kultur 18 jam didapatkan oosit yang masih berada pada tallap germinal vesich, (GV. 15 .38%) ataupun germinal vesicle break down (GVBD, 25,64%) . Tingkat maturasi yang tinggi (M 11) didapatkan setelah dilakukan kultur in vitro selania 22 (78,26%), 26 (80,56%) dan 30 ja in (73,68"0) (Tabel 2) . Untsk mendapatkan tingkat fcrtilisasi yang tinggi, bcberapa penefli mclakukan inkubasi untuk maturasi oosit kambing secara in vitro selama 24 jaln (YOUNIS el al . . 1991 : PA%\'sm : el al., 1996) sampai 27 jam (DE SNIEDT et al ., 1992 ; CROZE'r et al., 1995 ; M ( x ; .~s el al . . 1997) . Hal menarik yang dapat dilihat dari proscs maturasi oosit katubing secara in vitro adalah kcjadian parienogenesis secara spontan yang bersifat haploid (2,63%) yang terjadi pada 30 jain inkubasi . Sepcrii dilaporkan pada sapi oleh BOEDIONO et al . (1995b), periode maturasi oosit yang lerlalu paujang (over nraturation) akan menyebabkan kejadian partenogencsis sccara slx)utan . Tabel2
Tingkat maturasi oosit kanthiiw setelah dikultur seeara in vitro pada periode waktit yang tx;rtx:da .
Periode
T'
IVIVI
oosit
(iV
GVBD
MI
M II
18 jinn
39
6(15,38)
10(2 5M)
13(33,33)
22 jain
46
-
-
26 jam
36
-
30 jam
38
-
Keterangnn :
'1iugkat maturasi (%)
Cleavage
TI
10(25,64)
-
-
9(19,57)
36(78,26)
-
1(2,17)
-
3(8,33)
29(80,56)
-
4(11,11)
-
7(18,42)'
28(73,68)
1(2,63)
2(5,26)
IVAI : in vitro maturation; C)V: germinal vesicle; GVBD : germinal vesicle break down; M 1: Metafise 1; M 11 : Metalase 11,1'1 : tidak teridentiliknsi .
26 1
Sernimu Yusuon
Kebx:rhasilan perkembangan cmbno kambing melalui teknik maturasi, fertilisasi dan kultur dapal dililiat pada gambar 1 . Tingkal perkembangan embrio mencapai 2-sel yang berasal dari oosit hasil aspirasi dari ovarium dengan CL cendenmg lebih tinggi (20,00%, 75/375) daripada yang berasal dari ovarium lanpa CL (12,23'Y.,, 17/139) . Perkembangan embrio kambing tahap 2, 4 dan 8 scl didapalkan pada 48 jam sclclah ferlilisasi . Pada perkcmbangan embrio sapi telah dilaporkan bahwa kualitas dan viabililas oosit ycmg dikoleksi dari ovarium dengan CL untuk berkembang sampai tahap preimplawasi lebih baik jika dibandingkan dengan oosit yang berasal dari ovarium tanpa CL (B()I:DI()K() el ed. . 1995a) . in vitro
4-sel
2-scl
X-scl
Taltah hcrkembangan Ot)varimn dcn C,an CL Gumbur I.
Tingkat herkemb.m g an embrio kambing hasil ovarium dengan L11111 1,111pa CL
O0varium tanpa CL tertilisasi in vitro
oosit yang dipcrolch dari
KESIMPULAN Dari hasil penelilian cliclapatkan bahwa jumlah folikel yang diaspirasi (bentkuran 2-5 mm diame (er) lebilt banyak pada ovarium dengan CL daripada ovarium tanpa CL, sebaliknya jumlah folikel dominan (bcnikuran lebili dari 5 min diameter) terdapat lebih banyak pada ovarium tanpa CL daripada ovarium dengan CL. Dalam upaya produksi embrio kambing dengan teknologi in vitro didapatkan tingkat maturasi (mencapai tahap metafase 11) yang tinggi pada oosit setelah inkubasi in vitro pada medium maturasi selama 22 sampai 26 jam. Partenogenetik spontan terjadi pada oosit yang mengalami maturasi dalam waktu yang berlebihan (over maturation) yaitu setelah di inkubasi in vitro selama 30 jam . Sedangkan tingkat perkembangan embrio sampai tahap pembelahan (2, 4 dan 8 scl) pada program produksi embrio secara in vitro tidak berbeda nyata untuk oosit yang diperoleh dari ovarium dengan ataupun tanpa CL. 11CAPAN TERIMA KASIH Penelitian ini dibiayai olelt Proyck Peningkatan Penelitian dan Pengabdian pada Masyarakat dengan kontrak nomor : 61/P2IPT/DPPM/98/PHB/VIU1/V/1998, Direktorat Pembinaan Penelitian dan Pengabdian pada Masyarakat DirJen DIKTI DEPDIKBUD. 262
Sennrror A'asional Peternakan dan Veteriner 1999 DAFTAR PUSTAKA BOEDIONo A, TAhAci M, SAHA S, and Stj/tjKi S. 1994 . The influence of day 0 and day 7 superovulated cow senmi during development of bovine oocytes in
vitro. Reprod. Fertil. Dev.
6:261-264 .
BOEDIONo A, RAJAMAHENDRAN A, SAHA S, SO IMANTRI C, and SuzuKi T. 1995a. Elect of the presence of a CL in the ovary on oocyte rutmber, cleavage rate and blastocyst production in vitro in cattle .
Theriogenology 43 :169
(Abst)
BOEDIONo A, SAHA S, SUMANrRI C, and StIzrJKI T. 1995b. Development in parthenogenetic bovine embryos. Reprtxt Fertil. Dev. 7:1073-1079 . BOEDIONo A and Suzum T. 1996 .
Media Veteriner 3:3-15.
In vitro
vitro
and
in vivo
of aggregated
development of Holstein and Japanese Black breeds embryo .
BOEDIONo A den DAMAYANTI T. 1996 . Dari limbah nimah potong llewan bisa dihasilkan anak sapi . 10 :32-33 . BRACKETT BG and OLINGWT G. 1975 . Capacitation of rabbit spermatozoa in
vitro. Biol. Reprod.
Spektrum
12 :260-274 .
CROZETN, AHtwD-ALI M, and Demos MI'. 1995 . Developmental competence of goat oocytes from follicles of diferent size categories lblloxyin,u maturation, fertilization and culture 103 :293-298 .
in vitro. J. Rcprod. Fertil .
DE SMEDT V, CROzm' N, AtiNImt-Au M, MARTINO A, and COGNIE Y. 1992 . fertilization of goat oocytes.
77reriogerrologv
37 :1049-1060 .
In vitro
maturation' and
ERB RE, RANDEL RD, and CALLAI IAN C%I . 1')71 . Female sex steroid changes during the reproductive cycle. J. Anim. Sci. Suppl. 1,32 :81) . GOTo K, KAJmA2A Y, KoSAKA S, KciBA Ivl, NAKANISHI Y, and OGAWA K. 1988 . Pregnancies after co-cukture of cumulus cells with bovine embryos derived from in-vitro fertilization of in-vitro matured follicular oocytes. J.
HAFEz ESE. 193.
Reprod. Fertil.
83 :753-758 .
Reproduction irr hirrnr . lnimals.
Lea&Feberiger . Philadelphia . 573 pp .
MOGAS T, PALoN1c M.I, 1zouirim() MI), and I'AI :ANno MT . 1997 . Development capacity of in and tertilized oocytes f- cnn prcpuhcrtal and adult goats. Tlteriogenology 47 :1189-1203 .
vitro
matured
PAWSIE CH, PALANINAMI' A, TANFJA M. I ;\IN SK, and TOTEM SM . 1996 . Comparison of various maturation treatments on in vitro maturation of .-oat oocytes and their early embryonic development and cell numbers. 77teriogenolugv 46 :971-982 . PIERSON RA and 0INrRra; 0.1 . 1987 . Reliability of diagnostic ultrasonography for identification measurement of lollicles and dctectim= the corpus luteum in heifers. Theriogenology 28 :929-936 . RLJMICH B. 1967 .
The Goals ol7ndonecia, Regirntal ,-Inintal Production Officer FAO.
and
Bangkok. pp : l-19 .
SAV10 JD, THATCHER WW, MORRIS (ill, FNI'\VISILE K, DROST M, and MATTIACCI MR . 1993 . Effects of induction of low plasma progestcrenle concentrations with a progesterone-releasing intravaginal device on follicular turnover and lertility in cattlc . .J. Reprod. Fertil . 98 :77-84 . TAYLOR C and RAJAN-tAHENDR,%N It . 1991 . Follicular dynamics and corpus luteunl growth and fiinction in pregnant versus nonpregnant dairy co\\s. ./ . Daity Sci. 74 :115-123 . YouNls Al, ZuL'LKE KA, 1-IAZPra : KM, 1)I-I-yI?II :A MAL, and BRACKETT BG . 1991 . oocytes. Biol . Reprod . 44 :1177-1182 .
In vitro
fertilization of goat
