MASARYKOVA UNIVERZITA Přírodovědecká fakulta
DIPLOMOVÁ PRÁCE
Brno, 2014
Kateřina Kratochvílová
MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA Ústav experimentální biologie Oddělení genetiky a molekulární biologie
Gen TUSC3 v rozvoji ovariálního karcinomu DIPLOMOVÁ PRÁCE Kateřina Kratochvílová
VEDOUCÍ PRÁCE: RNDR. PETR VAŇHARA, PHD.
Brno, 2014
Bibliografický záznam
Autor:
Kateřina Kratochvílová, Bc. Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav experimentální biologie
Název práce:
Gen TUSC3 v rozvoji ovariálního karcinomu
Studijní program:
Biologie
Studijní obor:
Molekulární biologie a genetika
Vedoucí práce:
RNDr. Petra Vaňhara, PhD.
Akademický rok:
2013/2014
Počet stran:
64
Klíčová slova:
TUSC3, ovariální karcinom, N-glykosylace, stres endoplazmatického retikula, odpověď nesbalených proteinů, epiteliálně-mezenchymální tranzice
Bibliografic entry Author:
Kateřina Kratochvílová, B. Sc. Faculty of Science, Masaryk University Department of Experimental Biology
Title of Thesis:
TUSC3 gene in ovarian cancer
Degree programme:
Biology
Field of Study:
Molecular Biology and Genetics
Supervisor:
Petr Vaňhara, RNDr., Ph.D.
Academic Year:
2012/2013
Number of Pages:
64
Keyword:
TUSC3, ovarian cancer, N-glycosylation, endoplasmic reticulum stress, unfolded protein response, epithelial-tomesenchymal transition
Abstrakt Ovariální karcinom patří k jednomu z nejzávažnějších nádorových onemocnění u žen a jeho léčba je komplikována především většinou pozdní diagnózou a jeho rezistencí k různým protinádorovým terapiím. Gen TUSC3 byl identifikován jako potenciální nádorový supresor a jeho exprese je ztracena nebo snížena u mnoha druhů epiteliálních nádorů, mezi něž patří také ovariální karcinom. TUSC3 se účastní N-glykosylace proteinů v endoplazmatickém retikulu (ER) jako součást oligosacharyltransferázového komlexu. Poruchy N-glykosylace mohou vést k akumulaci proteinů v ER a v důsledku toho k vyvolání stavu zvaného stres ER a následné odpovědi nesbalených proteinů (UPR). V této práci si kladu za cíl objasnit molekulární úlohu TUSC3 jako nádorového supresoru v rozvoji ovariálního karcinomu, ověřit jeho roli v indukci stresu ER a zjistit možnou korelaci narušení homeostázy ER a spuštění epiteliálně mezenchymálního přechodu u buněk s nízkou expresí TUSC3.
Abstract Ovarian cancer is one of the most serious cancers in women and its treatment is complicated becouse of late diagnosis and resistance to anticancer therapies. TUSC3 gene was identified as a potential tumor suppressor gene and its expression is often lost or downregulated in many epithelial cancers, including ovarian cancer. TUSC3 participates in protein
N-glycosylation
in
endoplasmic
reticulum
(ER)
as
a
subunit
of
an
oligosaccharyltransferase complex. Disturbances of N-glycosylation can lead to protein accumulation in ER and to a phenomenon called ER stress and subsequent unfolded protein response (UPR). In this thesis I aimed to clarify molecular function of TUSC3 as a tumor suppressor in ovarian cancer, to check its role in ER stress induction and find out a possible connection between disruption of ER homeostasis and initiation of epithelial-to-mesenchymal transition in cells with downregulated TUSC3.
Poděkování: Na tomto místě bych ráda poděkovala zejména vedoucímu své diplomové práce, RNDr. Petru Vaňharovi, PhD. za inspirativní vedení, ochotu a trpělivost při zpracovávání mé práce. Dále bych ráda poděkovala paní Dobromile Klemové, Doc. MUDr. Miroslavě Sedláčkové, CSc. a Ing. Ladislavu Ilkovicsovi za pomoc s přípravou, focením a hodnocením vzorků na elektronovou mikroskopii. Za umožnění realizace experimentu indukce nádoru pokusným myším děkuji Ing. Ivě Pipalové a Ing. Janu Vernerovi, PhD a PharmDr. Františkovi Drafimu, PhD. děkuji za pomoc s realizací tohoto experimentu a za pomoc s prací s ultrazvukovým systémem Vevo 2100. Dále bych chtěla poděkovat paní Daně Střítecké za pomoc s přípavou imunohistochemicky značených vzorků a v neposlední řadě bych ráda poděkovala Doc. MVDr. Aleši Hamplovi, CSc za umožnění práce v dobře fungující laboratoři a všem ostatním kolegům z Ústavu histologie a embryologie za vytvoření příjemného pracovního prostředí a ochotu pomoci. Za umožnění zajímavé zahraniční stáže na Medical University Wien děkuji Peteru Horakovi, M.D. a společnosti OrganoNET.
Prohlášení Prohlašuji, že jsem svou diplomovou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány
Brno, 15. května 2014
………………………….. Kateřina Kratochvílová
OBSAH 1.
Úvod ............................................................................................................................ 10 Nádory ovarií ............................................................................................................ 10
1.1.
Typy nádorů ovárií................................................................................................. 10
1.1.1. 1.1.1.1.
Nádory epiteliální ............................................................................................... 11
1.1.1.2.
Nádory z gonadálního mezodermu ..................................................................... 11
1.1.1.3.
Germinální nádory.............................................................................................. 11
1.1.1.4.
Klasifikace a rozdělení do stadií podle FIGO ...................................................... 12 Molekulární genetické markery .............................................................................. 12
1.1.2. 1.1.2.1.
Mutační spektrum ovariálního karcinomu ........................................................... 12
1.1.2.2.
Změna počtu kopií DNA a ztráta heterozygotnosti.............................................. 14
1.1.2.3.
Epigenetické změny vyskytující se u ovariálních tumorů .................................... 14
1.2.
TUSC3 - Tumor suppressor candidate 3 .................................................................... 15
1.2.1.
Struktura, lokalizace a funkce TUSC3 .................................................................... 15
1.2.2.
TUSC3 a nádorová onemocnění ............................................................................. 17
1.2.3.
TUSC3 a mentální retardace .................................................................................. 18
1.3.
N-Glykosylace .......................................................................................................... 19
1.3.1.
Průběh N-glykosylace ............................................................................................ 20
1.3.2.
Glykosylace a kancerogeneze................................................................................. 22 Stres endoplazmatického retikula .............................................................................. 23
1.4. 1.4.1.
Reakce nesbalených proteinů (UPR) ...................................................................... 24
1.4.2.
ER Stress a kancerogeneze ..................................................................................... 26 Epitelilálně mezenchymální tranzice.......................................................................... 27
1.5. 1.5.1.
Úloha EMT v kancerogenezi a tvorbě metastáz ...................................................... 28
2.
Cíle Diplomové práce .................................................................................................. 30
3.
Materiál a metody ....................................................................................................... 31
3.1.
Kultivace ovariálních nádorových linií ...................................................................... 31
3.2.
Indukce nádoru u imunodeficientních myších modelů ............................................... 32
3.3.
Kvantitativní RT-PCR ............................................................................................... 33
3.3.1.
Izolace celkové RNA z nádorové tkáně .................................................................. 33
3.3.2.
Izolace celkové RNA z buněčných kultur ............................................................... 33
3.3.3.
Reverzní transkripce a stanovení exprese pomocí qPCR ......................................... 34
3.3.4.
Stanovení exprese pomocí kvantitativní RT-PCR ................................................... 34
3.4.
Imunohistochemická analýza ..................................................................................... 35
3.5.
Příprava vzorků pro pozorování pod transmisním elektronovým mikroskopem......... 36 -8-
Analýza proteinové exprese pomocí Western blotingu ............................................... 37
3.6. 3.6.1.
Izolace a změření koncentrace proteinů .................................................................. 37
3.6.2.
Westernový přenos ................................................................................................ 38
3.6.3.
Složení pufrů a gelů ............................................................................................... 39
4.
Výsledky ...................................................................................................................... 40
4.1.
Ověření exprese TUSC3 u používaných nádorových buněčných linií........................ 40
4.2.
Snížená exprese nebo ztráta TUSC3 vede ke zvýšené formaci nádorů in vivo ........... 40
4.2.1.
Nádory indukované pomocí buněčné linie H134 .................................................... 41
4.2.2.
Nádory indukované pomocí buněčné linie SKOV3 ................................................ 42
4.2.3.
Nádory indukované pomocí buněčné linie TR-170 ................................................. 43
4.3. Porovnání ultrastruktury buněk s různou expresí TUSC3 pomocí transmisní elektronové mikroskopie ...................................................................................................... 45 4.4.
Exprese markerů stresu ER a UPR............................................................................. 49
4.5.
Exprese markerů EMT .............................................................................................. 51
5.
Diskuse ........................................................................................................................ 54
6.
Shrnutí......................................................................................................................... 57
7.
Summary ..................................................................................................................... 58
8.
Seznam použitých zkratek .......................................................................................... 59
9.
Literatura .................................................................................................................... 60
-9-
1.
Úvod
1.1.
Nádory ovarií Ovariální nádory jsou pátou nejčastější příčinou úmrtí na nádorové onemocnění u žen a
v počtu úmrtí jsou nejzávažnějším maligním onemocněním ženských reprodukčních orgánů (Siegel a kol., 2014). Hlavní příčinou vysoké úmrtnosti na nádory ovarií je nemožnost jejich detekce v raném stadiu bez vytvořených metastáz a jejich přirozená nebo získaná rezistence ke konvenční protinádorové terapii (Hiss, 2011). Optimální způsob léčby ovariálních nádorů zahrnuje histopatologickou diagnózu a určení stádia onemocnění, následuje chirurgické odstranění nádoru a několik cyklů intravenózní nebo intraperitoneální chemoterapie využívající carboplatinu a paclitaxel. Přestože současné zdokonalené postupy dosáhly určitých zlepšení, jako je prodloužení celkového přežití a prodloužení doby rekurence, u většiny pacientů nakonec stejně dojde k relapsu onemocnění. Přinejmenším 2/3 nádorů ovarií je diagnostikováno až v pokročilém stadiu onemocnění, kdy už je nádor rozšířen mimo vaječníky (Bast a kol., 2010). Pravděpodobnost 5-letého přežití od diagnózy má v tomto stadiu pouze přibližně 29 % pacientek, zatímco dokud se nádor nestihl rozšířit mimo ovaria, je tato pravděpodobnost téměř 90%. Zejména epiteliální ovariální karcinomy se vyznačují velmi nízkou úspěšností léčby kvůli svému sklonu podstupovat epiteliálně-mezenchymální tranzici - transdiferenciační proces, který je téměř nevyhnutelně asociován s progresí a invazivitou nádoru (Hiss, 2011).
1.1.1.
Typy nádorů ovárií
Nádory vaječníků jsou velmi rozmanitou skupinou nádorů, které se dělí podle jejich předpokládané histogeneze a způsobu diferenciace na tři hlavní skupiny: nádory epiteliální, nádory z gonadálního mezodermu a germinální nádory (Scully, 1987). Kromě jejich původu lze ovariální tumory rozdělit také podle stupně jejich diferenciace. Mezi nejpoužívanější způsoby patří rozdělení podle FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics – Mezinárodní federace gynekologie a porodnictví), WHO (World Helth Organization – Světová zdravotnická organizace) a GOG (Gynecologic Oncology Group – Skupina gynekologicko-onkologická) (Silverberg, 2000). Systém FIGO rozděluje nádory podle jejich stavby na tři stadia (viz níže). Rozdělení podle organizace WHO zahrnuje do architektonické i cytologické rysy, ale nepopisuje kvantitativní kritéria a proto může být toto rozdělení spíše subjektivní. Klasifikace stadií podle GOG se liší u různých histologických - 10 -
typů nádorů – např. endometroidnímu typu nádoru přiřazuje stadia podle kritérií FIGO, zatímco nádory ze světlých buněk nerozděluje do stadií vůbec. 1.1.1.1.
Nádory epiteliální
Ovariální nádory jsou pátou nejčastější příčinou úmrtí na nádorové onemocnění u žen a v počtu úmrtí jsou nejzávažnějším maligním onemocněním ženských reprodukčních orgánů (Siegel a kol., 2014). Hlavní příčinou vysoké úmrtnosti na nádory ovarií je nemožnost jejich detekce v raném stadiu bez vytvořených metastáz a jejich přirozená nebo získaná rezistence ke konvenční protinádorové terapii (Hiss, 2011). Optimální způsob léčby ovariálních nádorů zahrnuje histopatologickou diagnózu a určení stádia onemocnění, následuje chirurgické odstranění nádoru a několik cyklů intravenózní nebo intraperitoneální chemoterapie využívající carboplatinu a paclitaxel. Přestože současné zdokonalené postupy dosáhly určitých zlepšení, jako je prodloužení celkového přežití a prodloužení doby rekurence, u většiny pacientů nakonec stejně dojde k relapsu onemocnění. 1.1.1.2.
Nádory z gonadálního mezodermu
Nádory vyvinuté z gonadálního mezodermu se vyskytují asi v 6 % případů primárních ovariálních nádorů (Scully, 1987). Tyto nádory se mohou vyvinout z jednoho nebo z kombinace více následujících buněčných typů: granulózní buňky, thékální buňky, luteinové buňky, fibroblasty, Sertoliho a Leydigovy buňky. Nejčastější gonadální nádory jsou fibromy (celkově tvoří 4 % všech karcinomů vaječníků), které jsou složeny výhradně z fibroblastů tvořených kolagenem. Druhým nejvíce se vyskytujícím je nádor granulózní, který ovšem většinou obsahuje i thékální a luteinové buňky a fibroblasty. Nádory pouze ze Sertoliho buněk jsou vzácné, obvyklejší je spojení Sertoliho a Leydigových buněk a fibroblastů v různých kombinacích a stupních diferenciace. 1.1.1.3.
Germinální nádory
Jelikož zárodečné buňky jsou pluripotentní, není překvapující, že se z nich může rozvinout široké spektrum novotvarů, které se nazývají germinální nádory. Tvoří přibližně 2530 % ze všech ovariálních tumorů a nejběžnější z nich je dysgerminom – ženská obdoba nádoru varlete, který se skládá z buněk velmi podobných prvotním zárodečným buňkám embrya (Scully, 1987). Jedním z nejzhoubnějších germinálních karcinomů je endodermální nádor ze žloutkového váčku, jenž zpravidla obsahuje papilární spojení s krevními cévami tvořící síť mezer spojených prvotními nádorovými buňkami. Karcinomy z embryonálních - 11 -
tkání (teratomy) se vyskytují pouze vzácně a ještě vzácnější jsou choriokarcinomy (nádory z trofoblastů) a polyembryomy (nádory z více embryí). 1.1.1.4.
Klasifikace a rozdělení do stadií podle FIGO
Stadium I: Nádor je omezen pouze na ovária. (Prat, 2013) IA – nádor omezen na jeden vaječník, pouzdro je intaktní, zevní povrch ovária není postižen nádorovým růstem, není přítomen maligní ascites, v peritoneálním výplachu nejsou maligní buňky IB – nádor omezen na oba vaječníky, pouzdro je intaktní, žádné známky nádoru na povrchu vaječníků, v ascitu nebo peritoneálním výplachu nejsou maligní buňky IC – nádor ohraničen na jeden nebo oba vaječníky s čímkoliv následujícím: ruptura pouzdra, nádor na povrchu ovaria, maligní buňky v ascitu či peritoneálním výplachu Stadium II: Nádor postihuje jedno nebo obě ovária s pánevním šířením. IIA – šíření a/nebo implantace na dělohu a/nebo vejcovody, v ascitu/nebo peritoneálním výplachu nejsou maligní buňky IIB – karcinom ovária šířící se na další pánevní tkáně, v ascitu/nebo peritoneálním výplachu nejsou maligní buňky IIC – nádor stadia 2a nebo 2b, nádor na povrchu s maligními buňkami v ascitu nebo peritoneálním výplachu Stadium III: Nádor postihuje jeden nebo oba vaječníky s mikroskopicky prokázanými peritoneálními metastázami mimo pánev a/nebo metastázy v regionálních mízních uzlinách. IIIA – mikroskopické peritoneální metastázy mimo pánev. Uzliny negativní. IIIB – makroskopické peritoneální metastázy mimo pánev 2cm nebo méně v největším rozměru. Uzliny negativní. IIIC – peritoneální metastázy mimo pánev většími než 2 cm v největším rozměru a/nebo metastázy v regionálních mízních uzlinách Stadium IV: Vyskytují se vzdálené metastázy (vyjma peritoneálních metastáz).
1.1.2.
Molekulární genetické markery
1.1.2.1.
Mutační spektrum ovariálního karcinomu
Je známo, že nádorová onemocnění se vyvíjejí jako důsledek nahromaděných molekulárně genetických, epigenetických nebo genomických změn jako jsou bodové mutace, delece, amplifikace genu apod. Studium těchto změn vedlo k identifikaci genů asociovaných - 12 -
s nádory – onkogenů, tumor supresorových genů a genů zapojených do reparací poškození DNA. Lidský tumor supresorový protein p53 nebo antionkogen TP53 je u různých druhů nádorů velmi často mutován. Jeho hlavní funkcí je regulace genů, jejichž produkty se podílejí na zastavení růstu buňky, apoptóze, opravě poškozené DNA a rozpoznání poškozených buněk (Brosh a Rotter, 2009). Mutace v genu TP53 je nejčastější genetickou abnormalitou vyskytující se u rakoviny vaječníků a byla detekována u přibližně 40-60 % případů všech typů rozvinutých ovariálních karcinomů (Havrilesky a kol., 2003). Významná byla také korelace výskytu mutace TP53 s krátkodobým přežitím pacientek a s rezistencí k chemoterapiím za použití cis-platiny (Hall a kol., 2004), protože protein p53 je nutný k vyvolání apoptózy indukované platinovým derivátem. Několik studií potvrdilo, že zvýšená exprese EGFR (epidermal growth factor receptor – receptor epidermálního růstového faktoru) se obvykle vyskytuje u případů se špatnou prognózou ovariálního karcinomu (Fisher-Colbrie a kol., 1997; Skirnisdóttir a kol., 2001). Na základě těchto studií se na pacientkách s rakovinou vaječníků testovaly inhibitory EGFR (gefitinib a erlotinib). Nemoc se stabilizovala u 11-44 % pacientek, ale ne všechny reagovaly na léčbu stejně dobře a k objektivnímu zlepšení došlo jen u 4-6 % z nich (Schilder a kol., 2005). U pacientů s rakovinou plic a s mutací domény EGFR pro tyrosinkinázu, která je kódována exony 18 až 21, došlo po aplikaci inhibitorů EGFR k výraznému zlepšení (Lassus a kol., 2006). Z toho vyplývá, že ovariální rakovinné buňky většinou neobsahují mutaci v těchto exonech. Dráha PI3K-Akt hraje významnou roli v regulaci mnoha procesů včetně apoptózy, metabolismu, angiogeneze apod. a je jednou z drah nejčastěji postižených genomovými aberacemi u různých typů nádorů. U karcinomu vaječníků je aktivována přibližně v 70 % případů (Yap a kol., 2008). Aktivaci dráhy PI3K-Akt může způsobit zesílení genové exprese PI3K katalytické podjednotky-α (PIK3CA) a AKT2 případně deaktivační mutace v homologu pro fosfatázu a tensin na chromozomu 10 nebo PTEN. Mutace u PIK3CA se objevují pouze v malé podmnožině endometroidních nádorů a nádorů ze světlých buněk (Campbell a kol., 2004), zatímco inaktivační mutace u PTEN jsou mnohem častější, přesněji se vyskytují u přibližně 3-8 % většinou endometroidních nádorů (Obata a kol., 1998). Mutace u BRCA1 (z angl. breast cancer susceptibility gene 1) a BRCA 2 v zárodečné sekvenci DNA přispívá k 10-15 % ovariálních karcinomů (Fasching a kol., 2009). Tyto dědičné případy nádorů vaječníků se vyvíjejí rychleji, ale zato mají příznivější prognózu díky zvýšené citlivosti k chemoterapii využívající cis-platinu (Chetrit a kol., 2008). Proteiny - 13 -
BRCA1 a BRCA2 jsou nutné pro opravu dvoušroubovicových zlomů DNA, proto nádorové buňky s mutací v BRCA1 nebo BRCA2 nemohou opravit poškození DNA vyvolané platinovou chemoterapií a je u nich indukována apoptóza. Různé histopatologické typy nádoru vaječníků mají odlišné mutační spektrum, což naznačuje, že každý typ nádoru má jiný původ a vyvíjí se různě. Kurman a Shih (2008) proto navrhli nový způsob rozlišení ovariálních tumorů na Typ I a Typ II. Typ I zahrnuje méně časté málo rozvinuté serózní, endometroidní, mucinózní karcinomy a karcinomy ze světlých buněk, pro které jsou charakteristické mutace v PTEN, PIK3CA, KRAS, BRAF a CTNNB1. Typ II obsahuje nejčastěji mutace TP53 a ztrátu BRCA1 a patří sem rozvinuté serózní karcinomy, smíšené maligní mezodermální tumory, karcinosarkomy a nediferencované tumory. 1.1.2.2.
Změna počtu kopií DNA a ztráta heterozygotnosti
Charakteristické změny v počtu kopií DNA u různých histologických typů popsali Gras a kol. (2001). Nadbytek FGF3/4 a CCNE1 byl pozorován u všech serózních tumorů, zatímco endometroidní karcinomy vykazovaly více kopií u JUNB (83 %), KRAS2 (67 %), MYCN (50 %), ESR (50 %) a CCND2 (50 %). Studie Wiley a kol. (2006) potvrdili amplifikaci u PIK3CA ve 40 % ovariálních karcinomů. Ztráta heterozygotnosti (LOH = loss of heterozygosity) způsobená homologní delecí byla u nádorů vaječníků pozorována v tumor supresorových genech CDKN2A, RB1 a PTEN (Goringe a kol., 2007) a často se také vyskytuje homozygotní ztráta krátkého raménka chromozomu 8 a to zejména v oblasti 8p22 (Horak a kol., 2005). 1.1.2.3.
Epigenetické změny vyskytující se u ovariálních tumorů
Epigenetické změny jsou definovány jako dědičné změny genetické exprese, které se objevují beze změny sekvence DNA. U karcinomů ovarií se často objevují epigenetické změny jako je abnormální metylace DNA nebo remodelace chromatinu pomocí histonů (Jones a Baylin, 2002). V normálních buňkách není DNA metylována rovnoměrně, ale obsahuje nemetylované oblasti s roztroušenými metylovanými úseky (Bird, 1986). Metylované regiony se obvykle nachází na tzv. CpG ostrovech (sekvence DNA bohatá na CG dinukleotidy) v promotorových oblastech genů a podílí se na regulaci jejich exprese pomocí histonů, které se na ně vážou (Clark a Melki, 2002). Kvůli jejich známé roli u dědičných forem ovariálních karcinomů byla nejvíce studována hypermetylace u genů BRCA1 a BRCA2. Hypermetylace BRCA1 byla detekována - 14 -
převážně u karcinomů se ztrátou heterozygotnosti na lokusu pro BRCA1 (Wilcox a kol., 2005). Z toho plyne, že hypermetylace v kombinaci se ztrátou heterozygotnosti vede ke kompletní inaktivaci genu BRCA1. Naproti tomu, hypermetylace promotoru BRCA2 se u karcinomů vaječníků vyskytuje jen zřídka (Gras a kol., 2001). Pils a kol. (2012) poprvé pozorovali také výskyt hypermetylace promotoru genu TUSC3 u zhruba 30 % zkoumaných ovariálních nádorů a souvislost umlčení tohoto genu s negativní prognózou pacientek. V této kapitole (Nádory ovarií) čerpám ze své Seminární práce (Kratochvílová, 2011).
1.2.
TUSC3 - Tumor suppressor candidate 3
1.2.1.
Struktura, lokalizace a funkce TUSC3 Gen pro TUSC3, který byl dříve nazývaný N33, je lokalizován na krátkém raménku
chromozomu 8 v oblasti 8p22, je tvořen 224 Kbp genomické DNA a zahrnuje 11 exonů (MacGrogan a kol., 1996). TUSC3 je exprimován ve formě tří různých transkriptů ve většině nelymfoidních tkání včetně mozku, srdce, placenty, plic, jater, slinivky, prostaty, vaječníků, varlat a střev (Khalid a kol., 2013). Větší dva transkripty (forma 1 a 2) jsou hojně exprimovány ve všech jmenovaných tkáních, zatímco nejmenší transkript (forma 3) je nejvzácnější a vyskytuje se zejména v placentě (MacGrogan a kol., 1996). Produkt formy 2 je tvořen 347 aminokyselinami a postrádá exon 10, u formy 3 chybí exony a 10 a je dlouhý pouze 314 aminokyselin. Nezralý produkt transkriptu 1 zahrnuje všech 11 exonů, je tvořen 348 aminokyselinami a obsahuje thioredoxinovou doménu s peptid-vazebným místem a pět potenciálních transmembránových domén, z nichž jedna je u zralého TUSC3 deletována (MacGrogan a kol., 1996). Předpovězené funkční domény TUSC3 jsou vyznačeny na Obr. 1.
Obrázek 1: Schématické zobrazení předpovězených funkčních domén produktu genu TUSC3 (Garashabi a kol., 2008; upraveno)
- 15 -
Obrázek znázorňuje 348 aminokyselin dlouhý produkt genu TUSC3 s naznačenými předpovězenými funkčními doménami. Různě barevné označení určuje jejich délku a pozici na proteinu. Delece zahrnující prvních 46 aminokyselin je vyznačena světle šedě.
TUSC
sdílí
přibližně
20%
sekvenční
homologii
s
podjednotkou
Ost3p
oligosacharyltransferázového komplexu u Saccharomyces cerevisiae (MacGrogan a kol., 1996). Tento enzym se u kvasinek účastní nezbytné fáze N-glykosylace proteinů v endoplazmatickém retikulu, konkrétně katalyzuje transfer 14-glukosového oligosacharidu z dolicholu k nascentnímu proteinu. Přesná molekulární funkce TUSC3 v N-glykosylaci zatím není zcela objasněna, ale byla prokázána jeho lokalizace v endoplazmatickém retikulu jako součást oligosacharyltransferázového (OST) komplexu, jeho interakce s katalytickou STT3B podjednotkou OST a také schopnost TUSC3 upravovat glykosylační vzorec ovariálních nádorových buněk (Vaňhara a kol., 2013). Lidský OST komplex je hetero-oligomer tvořený sedmi podjednotkami: ribophorin I, ribophorin II, OST48, Ost4, DAD1, STT3A nebo STT3B a N33/TUSC3 nebo IAP/MagT1 (Mohorko a kol., 2014). Podjednotky TUSC3 a MagT1 jsou paralogní proteiny, které spolu sdílí 66% sekvenční identitu. Jsou připojené k membráně endoplazmatického retikula přes své C-terminální transmembránové domény a obě obsahují N-terminální doménu v lumen ER s předpokládanou thioredoxinovou doménou s peptidvazebným místem. Současná data od Mohorko a kol. (2014) podporují teorii, ve které TUSC3 zvyšuje efektivitu N-glykosylace tím, že zpožďuje sbalování proteinů a tím zvyšuje pravděpodobnost rozpoznání sequonů na nezralýczh polypeptidových řetězcích, které mají být glykosylovány. K podobnému závěru dospěli také Fairuz a kol. (2011) při studiu homologního proteinu Ost3p u Saccharomyces cerevisiae. TUSC3 spolu se svým homologem MagT1 jsou základními transportními proteiny Mg2+ iontů a hrají centrální úlohu v embryonálním vývoji obratlovců, která nemůže být kompenzována dalšími možnými Mg2+ transportéry (Zhou a Clapham, 2009). Snížení exprese TUSC3 vede ke snížení celkového a volného intracelulárního Mg 2+ u savčích buněčných linií. Mg2+ slouží jako hlavní kofaktor mnoha enzymů a mezi jeho nejdůležitější funkci patří stabilizace ATP při většině ATP-dependentních enzymatických reakcí. Tudíž není překvapivé, že kolísání hladiny Mg2+ ovlivňuje mnoho enzymatických aktivit a buněčný metabolismus. Mg2+ je mimo jiné nezbytný pro aktivitu androgenních hormonů a proto Khalid a kol. (2013) zkoumali expresi TUSC3 ve vyvíjejích se samčích pohlavních orgánech u novorozených krysích samců in vivo. Zjistili, že vysoká exprese převládá v epiteliálních buňkách prostaty, Leydigových buňkách a spermatocytech, avšak je silnější ve spermatocytech než ve spermatidách. Slabá exprese byla detekována ve dvoutýdenních - 16 -
krysích varlatech a výrazně se zvýšila ve třetím týdnu věku. Z těchto dat vyplývá, že se TUSC3 významně podílí na spermatogenezi, indukuje diferenciaci a zrání spermií a hraje roli při normálním vývoji prostaty.
1.2.2.
TUSC3 a nádorová onemocnění Pro vyhledávání oblastí výskytu tumor supresorových genů se často využívají studie
ztráty heterozygotnosti neboli LOH ("loss of heterozygosity") u rozdílných nádorových onemocnění. Časté LOH v oblasti krátkého raménka chromozomu 8 byly zaznamenány u mnoha epiteliálních nádorů, mezi něž patří např. karcinom prsu (Cooke a kol., 2008), prostaty (Bova a kol., 1993), ovariální karcinom (Emi a kol., 1992), kolorektální karcinom, hepatocelulární karcinom nebo nemalobuněčný karcinom plic. Bova a kol. (1993) pomocí delečního mapování u prostatického karcinomu zúžili oblast výskytu jednoho nebo více tumor supresorových genů na 14 cM region v oblasti 8p22. Další studie potvrdily ztrátu této oblasti také u ovariálního karcinomu (Lassus a kol., 2001; Cooke a kol., 2008). Dále byla ztráta 8p22 nalezena u 80 % metastáz karcinomu prostaty v lymfatických uzlinách a u nádorů střev je ztráta 8p22 třetí nejčastější ztrátou (Bova a kol., 1996). Vše naznačuje, že v oblasti 8p22 se může nacházet více než jeden tumor supresorový gen. Pils a kol. (2005) ve snaze najít konkrétní tumor supresorové geny v oblasti 8p22 nejprve snížili seznam kandidátů z celkových 22 genů na 9 pomocí systematického screeningu in silico s využitím všech veřejně dostupných expresních dat. Z těchto 9 genů jich 5 vykazovalo významně sníženou expresi u ovariálních tumorů ve srovnání s benigní tkání ovarií a dva geny (TUSC3 a EFA6R) byly kompletně deletovány u několika ovariálních nádorových linií a jejich nízká exprese měla zřejmý negativní dopad na přežití pacientů. Také Cooke a kol. (2008) mapovali oblast 8p22 pomocí array CGH s vysokým rozlišením a jako nejpravděpodobnější tumor supresorový gen označili TUSC3, který vykazoval sníženou nebo žádnou expresi u 31 % karcinomů prsu a u dvou vzorků nalezli deleci, která zahrnovala pouze gen TUSC3. Podle genomických dat z cBio Cancer Genomics Portal je TUSC3 alterován ve 23,1 % případů uroteliálního karcinomu močového měchýře, 16,4 % prostatického adenokarcinomu, 13 % případů ovariálního serózního cystadenokarcinomu, 10,9 % karcinosarkomu dělohy, 9,6 % adenokarcinomu plic a s nižším výskytem i u mnoha dalších epiteliálních nádorů, přičemž nejčastějšími změnami jsou homozygotní delece a ztráty exprese mRNA. Li a kol. (1998) studovali epigenetické umlčení genů u glioblastomu multiforme (GBM), kde byl promotor genu TUSC3 metylován u 61 % studovaných glioblastomů a - 17 -
zároveň byla tato metylace častější u jedinců po 40. roku života. Navíc odhalili zajímavou korelaci mezi metylací promotoru TUSC3 a genu pro estrogenový receptor ER, které byly konkondartní v 81 % případů. Společná metylace těchto dvou genů u GBM může být výsledkem sdílených etiologických faktorů, což může být v tomto případě vyšší věk a vliv stárnutí mozkových buněk. Guervós a kol. (2007) prokázali výrazně častější ztráty tumorsupresorových genů TP53, STK11 a TUSC3 u nádorů spinocelulárního karcinomu hlavy a krku s vytvořenými metastázemi v lymfatických uzlinách než u nádorů bez metastáz. Ztráty genu TUSC3 jsou nejvíce prozkoumané u karcinomu ovarií a prostaty především díky časté prevalenci a závažnosti těchto onemocnění a také kvůli specifické expresi TUSC3 v reproduktivních orgánech. TUSC3 byl nedávno identifikován jako nezávislý prognostický faktor u ovariálního karcinomu, kdy byla hypermetylace jeho promotoru zaznamenána přibližně u 30 % případů a zároveň korelovala s kratší dobou přežití a horší prognózou pacientů (Pils a kol., 2013). Vaňhara a kol. (2013) zkoumali ovariální nádorové buněčné linie s epigeneticky sníženou expresí TUSC3 a pozorovali jejich zvýšenou proliferaci a migraci oproti nemodifikovaným buňkám. U podobně upravených buněčných linií karcinomu prostaty byla nízká exprese TUSC3 spojena s akumulací nesbalených proteinů v lumen endoplazmatického retikula (ER), indukcí stresu ER a následné spuštění reakce nesbalených proteinů (tzv. UPR - z angl. unfolded protein response) (Horak a kol., 2014). Zároveň byl prokázán vliv ztráty TUSC3 na zvýšenou formaci nádoru in vivo.
1.2.3.
TUSC3 a mentální retardace Autozomálně recesivní mentální retardace jsou vysoce heterogenní skupinou
onemocnění s prevalencí přibližně 2 % (Garashabi a kol., 2008). Ačkoliv byla identifikována velká část X-vázaných genů zodpovědných za vznik mentální retardace, zatím byly identifikovány pouze čtyři geny zodpovědné za vznik autozomálně-recesivní mentální retardace, přestože jsou mnohem častější, než X-vázané mentální retardace. Autozygotní mapování rodiny s vrozeným výskytem nesyndromatické mentální retardace (NSMR) vedlo k identifikaci regionu na 8p22-p23.1 a genu TUSC3 (Molinari a kol., 2008). Screening X-vázaného paralogu TUSC3 - genu IAP/MagT1také odhalil missense mutaci u rodiny s X-vázanou NSMR. Garashabi a kol. (2008) objevili u jiné velké rodiny s NSMR homozygotní deleci genu TUSC3 a později pozorovali (Garashabi a kol., 2011) novou recesivní mutaci TUSC3 v další nezávislé rodině. Nyní jsou tedy známé tři nezávislé mutace TUSC3 způsobující vznik NSMR. Tato data mohou naznačovat, že defekty v N-glykosylaci mohou vést ke vzniku NSMR a rozšířit tak spektrum syndromů kongenitálních defektů - 18 -
glykosylace (onemocnění způsobené defekty glykosylace a projevující se mimo jiné také mentální retaradací), avšak glykosylační analýzy fibroblastů pacientů s NSMR ukázaly normální syntézu i transfer N-glykanů. TUSC3 proto může ovlivňovat vyšší nervovou činnost spíše skrze svou funkci Mg2+ transportéru, jelikož bylo nedávno prokázáno, že zvýšení koncentrace Mg2+ v mozku vedlo ke zlepšení schopnosti se učit a krátkodobé i dlouhodobé paměti u stárnoucích krys.
1.3.
N-Glykosylace Glykosylace je evolučně vysoce konzervovaný proces modifikace proteinů, lipidů,
oligosacharidů nebo jiných organických sloučenin a vyskytuje se u eukaryot, bakterií i archeí (Silberstein a Gilmore, 1996). Podílí se na mnoha fyziologických i patologických jevech v buňce, mezi něž patří např. transport proteinů, interakce buněk s patogeny, migrace a invazivita nádorových buněk, buněčná diferenciace a signalizace (Reis a kol., 2010). Jedná se o kovalentní připojení oligosacharidového řetězce, které probíhá v endoplazmatickém retikulu a následně v Golgiho aparátu (Dube a Bertozzi, 2005). Existují tři hlavní typy glykanových struktur: N-glykany, O-glykany a glukosaminoglykany (GAG). N-Glykany se připojují na asparaginové zbytky polypeptidového řetězce, O-glykany k serinovým nebo threoninovým zbytkům a glukosaminoglykany k serinovým zbytkům proteoglykanů (Dube a Bertozzi, 2005). Glykany mohou být vysoce větvené a komplexní (např. N-glykany a O-glykany) nebo lineární (např. GAG) (Stanley a kol, 2009). O-Glykosylace probíhá zejména v Golgiho aparátu, ale může být zahájena v endoplazmatickém retikulu (ER) a vyskytuje se velmi často zejména u glykoproteinů bohatých na serin a threonin (Reis a kol., 2010). N-Glykosylace je nejčastější posttranslační modifikací membránových a sekrečních glykoproteinů, je nezbytná pro uvedení proteinů do správné konformace, reguluje sekreci proteinů, inhibuje agregaci proteinů, chrání proteiny před degradací a ovlivňuje jejich funkci, rozpustnost a imunogenicitu (Mohorko a kol., 2011; Liwosz a kol., 2006). Počet N-glykanů je u různých glykoproteinů velmi variabilní a může regulovat obsazenost buněčného povrchu glykoproteiny a tím i interakci buňky s okolním prostředí a buněčnou adhezi. N-glykosylace zároveň funguje jako kontrola kvality proteinů (Parodi, 2000). Nesprávně sbaleným glykoproteinům je zabráněno opustit lumen ER a pokud jsou permanentně špatně sbalené, jsou transportovány do cytoplazmy a následně degradovány v proteazomech. Při narušení této dráhy a nadměrné akumulaci nesbalených proteinů v lumen ER, může dojít k indukci stresu endoplazmatického retikula a spuštění tzv. reakce - 19 -
nesbalených proteinů neboli UPR (z angl. unfolded protein response) (Schröder a Kaufman, 2005).
1.3.1.
Průběh N-glykosylace Během N-glykosylace dochází ke kovalentnímu navázání oligosacharidového řetězce
na asparaginové (Asn) zbytky nezralého proteinu pomocí N-glykosidické vazby (Stanley a kol., 2009). Existuje pět odlišných N-glykanových vazeb, z nichž nejčastější je vazba Nacetylglukosaminu k asparaginu (GlcNAcβ1-Asn). Bylo zjištěno, že pro navázání N-glykanu k Asn zbytku na proteinu, se Asn musí nacházet v aminokyselinové sekvenci Asn-X-Ser/Thr zvané sequon, kde X může být jakákoliv aminokyselina kromě prolinu, přičemž sequony AsnX-Thr jsou zhruba dvakrát častější než Asn-X-Ser. Méně typickým glykosylačním místem je sekvence Asn-X-Cys. Avšak ne všechna potenciální místa pro N-glykosylaci jsou nakonec modifikována. In vitro analýza prokázala, že místa se sekvencí Asn-X-Ser/Thr a s prolinem v pozici +3 od asparaginu nejsou glykosylována pravděpodobně kvůli jejich konformaci (Silberstein a Gilmore, 1996). Ostatní možné glykosylační sequony jsou glykosylovány přibližně v 90 % případů in vivo, ale může také dojít k nekompletní nebo pozměněné glykosylaci. Bylo zjištěno, že nejefektivněji využitá potenciální glykosylační místa se nachází v β-listech (Knauer a Lehle, 1999). Samotná N-glykosylace probíhá v ER jako dvoufázový proces. Nejprve dojde k sestavení oligosacharidového řetězce Glc3Man9GlcNAc2 na lipidovém nosiči a následně je tento řetězec transferován na vybraný Asn zbytek na nezralém polypeptidu (Aebi, 2013). Připojené N-glykany jsou dále modifikovány v Golgiho aparátu pomocí galaktosyltransferáz a terminální úpravou je připojení zbytku kyseliny sialové (N-acetylneuraminové) a fukózy pomocí sialyltransferáz a fukosyltransferáz (Stanley a kol., 2009). Všechny N-glykany sdílí společnou základní sacharidovou sekvenci Man3GlcNAc2-Asn a rozdělují se do tří typů: 1) oligomanózový typ, ve kterém jsou k základnímu řetězci připojeny pouze bohatě větvené manózové zbytky, 2) komplexní typ, který má k základní sekvenci připojené tzv. antény tvořené sekvencí obsahující N-acetylglukosamin, galaktózu, a fukózu (GlcNAcGalFuc) a 3) hybridní typ, ve kterém se vyskytují oba druhy připojených řetězců. Biosyntéza oligosacharidového řetězce Glc3 Man9GlcNAc2 začíná na cytoplazmatické straně ER, končí v lumen ER a vyžaduje aktivitu několika specifických glykosyltransferáz (Aebi, 2013). Nejprve je vytvořen dolichol pyrofosfát N-acetylglukosamin (Dol-P-P-GlcNac) transferem GlcNac-P z UDP-GlcNAc na lipidový prekurzor dolichol fosfát (Dol-P) (Stanley a kol., 2009). Tato reakce může být inhibována analogem acetylglukosaminu tunicamycinem. - 20 -
Druhý N-acetylglukosamin a pět manosových zbytků je postupně transferováno z UDPGlcNAc a GDP-Man, čímž se vytvoří Man5GlcNAc-P-P-Dol na cytoplazmatické straně ER a pomocí enzymu flipázy je translokován skrze membránu ER do lumen. Tam je dále upravován pomocí manosyltransferáz a glukosyltransferáz, až je vytvořen zralý 14sacharidový N-glykan - Glc3Man9GlcNAc2-P-P-Dol. Klíčovým krokem N-glykosylace je následný en bloc transfer vytvořeného řetězce na sequon nezralého polypeptidu, což
je katalyzováno enzymem oligosacharyltransferázou
(OST). Lidský OST je proteinový komplex tvořený sedmi podjednotkami (viz Obr. 2): ribophorin I, ribophorin II, OST48, Ost4, DAD1, STT3A nebo STT3B a N33/TUSC3 nebo IAP/MagT1 (Mohorko a kol., 2014). OST katalyzuje vytvoření N-glykosidické vazby mezi dusíkem asparaginu a uhlíkem N-acetylglukosaminu a pro svou funkci vyžaduje dvojmocné kovové ionty Mn2+, Mg2+, Ca2+ a Fe2+ (Silberstein a Gilmore, 1996). Samotné nezralé proteiny se do lumen ER dostanou pomocí translokonového póru Sec61 (Csala a kol., 2012). Po navázání připraveného N-glykanu na nezralý protein, dochází k sérii reakcí, které navázaný glykan dále upravují (Stanley a kol., 2009). Dochází k postupnému specifickému odštěpení glukózových zbytků pomocí glukosidáz I a II a manozového zbytku pomocí αmanosidázy I a poté je glykoprotein trasnlokován do Golgiho aparátu, kde je dále upravován štěpením i přidáváním oligosacharidů pomocí manosidáz a glukosyltransferáz. Konečnou úpravou
v
Golgiho
aparátu
je
přidání
kyseliny
sialové,
fukozy,
galaktozy,
N-acetylgalaktosaminu nebo sulfátu. Extrémní strukturní rozmanitost N-glykanů pochází právě z různých zpracovávacích reakcí v Golgiho aparátu (Parodi, 2000).
Obrázek 2: Schematické znázornění podjednotek lidského oligosacharyltransferázového komplexu (Mohorko a kol., 2014) Lidský OST komplex je složen ze sedmi různých podjednotek a existuje ve čtyřech alternativních izoformách. Transfer glykanu z dolicholového prekurzoru na asparagin glykosylačního sequonu je katalyzován jednou ze vzájemně se nahrazujících podjednotek Stt3A nebo Stt3B a do komplexu je zabudována buď podjednotka TUSC3 nebo její homolog IAP/MagT1.
- 21 -
1.3.2.
Glykosylace a kancerogeneze
Pozměněné glykosylační vzorce jsou znakem nádorového fenotypu a mezi změny glykosylace v kancerogenezi patří nadměrná i snížená exprese přirozeně se vyskytujících nebo abrnomálních glykanů (Dube a Bertozzi, 2005). Tyto struktury většinou vychází ze změn exprese glykosyltransferáz v ER a Golgiho aparátu nádorových buněk, které mohou vést k modifikacím ve struktuře N- a O-glykanů a jednou z nejčastějších změn v nádorových buňkách je zvětšení velikosti a bohatší větvení N-glykanů. Toto větvení se přičítá zvýšené aktivitě N-acetylglukosaminyltransferázy V (GlcNAc-TV) kódované genem Mgat5. Zvýšená exprese Mgat5, která byla objevena u mnoha druhů nádorů, vede ke ztrátě kontaktní inhibice buněk, jejich zvýšené pohyblivosti a tím také k vyšší tvorbě metastáz (Dennis a kol., 1999). Lidské nádory prsou, střev a melanomy ukazují zvýšené hladiny β1,6GlcNAc-větvených N-glykanů, které přímo přispívají k progresi nádoru, tvorbě metastáz a korelují s horší prognózou. Naopak exprese glykosyltransferázy β1-4 N-acetylglukosaminyltransferázy kódované genem GnT-III potlačuje tvorbu metastáz a zvyšují expresi E-cadherinu (Yoshimura a kol., 1996). Kromě změn v řetězové struktuře glykanů je s malignitou také spojena změna terminálních struktur. Glykosyltransferázy (zejména fukosyltransferázy a sialyltransferázy) podílející se na upravování koncových částí glykanů bývají v nádorových tkáních nadměrně exprimované (Dube a Bertozzi, 2005). Zvýšení aktivity těchto glyksoyltransferáz vede ke zvýšené expresi terminálních glykanů. Příklady terminálních glykanových epitopů často nalezených u transformovaných buněk zahrnují sialyl Lewis x, sialyl Tn, Globo H, Lewis y a polysialovou kyselinu. Mnoho z těchto epitopů bylo pozorováno v maligních tkáních mozku, prsou, střev a prostaty. Glykosylace však nejčastěji ovlivňuje tvorbu nádoru skrze různé glykoproteiny a jedním z nejdůležitějších glykoproteinů, jehož pozměněná glykosylace má vliv na vývoj nádorů je E-cadherin (Liwosz a kol., 2006). E-Cadherin se podílí na tvorbě adhezivních spojů mezi buňkami a zabraňuje buňkám v migraci a tím i tvorbě metastáz u nádorů. Hmotnost Ecadherinu je až ze 30 % tvořena glykanovými strukturami, které výrazně ovlivňují jeho aktivitu. Bylo zjištěno, že vysoce adhezivní buňky obsahují málo glykosylovaný E-cadherin s vysokomanosovými nebo hybridními N-glykany, zatímco málo adhezivní buňky schopné migrace mají intenzivně modifikovaný E-cadherin s komplexními N-glykany. Mezi další proteiny výrazně ovlivněné glykosylací patří receptorové tyrozinkinázy, jako jsou epidermální růstový faktor (EGFR) ErbB2, ErbB3 nebo IGF-1R, které se významně - 22 -
podílí na tvorbě mnoha typů nádorů a jejichž exprese je při inhibici N-glykosylace výrazně snížena (Contessa a kol., 2010).
1.4.
Stres endoplazmatického retikula Endoplazmatické retikulum (ER) je centrální buněčná organela zodpovědná za syntézu
sekrečních a membránových proteinů, za posttranslační modifikace těchto proteinů, uvádění proteinů do správné konformace (sbalování) a následný transport do Golgiho aparátu, sekrečních váčků a nakonec do jejich specifických míst určení (Sano a Reed, 2013). Tyto proteiny jsou většinou translatovány ribozomy připojenými k povrchu drsného ER a poté jsou kotranslačně transportovány do lumen nebo membrány ER podle jejich finální lokalizace (Csala a kol., 2012). Lumen ER lze přirovnat k extracelulárnímu prostoru uvnitř buňky, protože jeho vnitřní podmínky jsou výrazně odlišné od cytoplazmy a spíše připomínají podmínky vnějšího prostředí. Ke správné funkci ER je kromě zásoby ATP, chaperonů a glykosylačních enzymů, potřebná vysoká koncentrace vápníku a oxidativní prostředí (Lane a kol., 2014). Jakmile jsou sekreční nebo transmembránové proteiny uvnitř lumen nebo membrány ER, nemusí už projít žádnou další membránou a jsou vezikulárním transportem sekretovány nebo přemístěny do místa jejich určení (Csala a kol., 2012). Jakékoliv narušení sbalování proteinů v ER může mít za následek nadměrnou akumulaci nesbalených nebo špatně sbalených proteinů uvnitř ER a dojde k jevu zvanému stres endoplazmatického retikula (Nishitoh, 2012). ER stres může být indukován během mnoha buněčných dějů, mezi něž patří diferenciace a vývoj profesionálních sekrečních buněk, pozměněné metabolické podmínky, infekce některými patogeny, hypoglykemie, hypoxie, inhibice N-glykosylace, vyčerpání vápenatých iontů v ER, selhání sbalení, transportu nebo degradace proteinů nebo exprese mutantních sekrečních nebo transmembránových proteinů, které se sbalují v ER (Rutkowski a Kaufman, 2004). Pokud se buňka se stresem nevyrovná, může tento stav kompletně narušit funkci ER i celé buňky a nakonec může dojít i ke spuštění apoptózy (Lane a kol., 2014). K překonání těchto efektů stresu ER buňka aktivuje set adaptivních signálních drah známých jako reakce nesbalených proteinů neboli UPR (z angl. unfolded protein response), které slouží k obnovení homeostázy ER a obnovení jeho normální funkce. Avšak pokud původní stresový faktor není odstraněn nebo je vyvolaný stres příliš silný, nakonec dojde ke spuštění apoptózy.
- 23 -
1.4.1.
Reakce nesbalených proteinů (UPR) Reakce nesbalených proteinů je primárně protektivní odpověď buněk na stres ER, ale
když nedojde k adaptaci buňky na daný stresový faktor, UPR potlačí dráhu pro přežití a místo toho spustí apoptickou dráhu (Chen a Brandizzi, 2013). U savců se UPR skládá z časné fáze, ve které je inhibována syntéza proteinů fosforylací eIF2 a pozdější fáze, kdy dochází k aktivaci transkripce genů zvyšujících kapacitu ER a efektivitu sbalování proteinů (Yan a kol., 2002). UPR může být spuštěna třemi různými transmembránovými senzorovými proteiny ER: 1) protein kinázou PERK (protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase), 2) aktivačním transkripčním faktorem ATF6 (activating transcription factor 6) a 3) IRE1 (inositol-requiring enzym 1) (Nishitoh, 2012). Za normálních nestresových podmínek jsou tyto receptory udržovány v inaktivním stavu vazbou molekulárního ER chaperonu BiP (binding imunoglobulin protein), který je také známý jako Grp78 (glucose-requiring protein) a patří do rodiny tzv. "heat-shock" proteinů. BiP je nejpočetnějším proteinem v lumen ER a za fyziologických podmínek přispívá ke sbalování a sestavování nezralých proteinů a váže se také na permanentně nesbalené proteiny určené k degradaci (Lane a kol., 2014). BiP a Grp94 jsou hlavní chaperony, které rozpoznávají hydrofobní postranní řetězce vystavené na částečně sbalených nebo špatně sbalených proteinech a zabraňují jejich agregaci (Csala a kol., 2012). Proto když dojde k nadměrné akumulaci nesbalených proteinů, jako při stresu ER, volný BiP v lumen ER je vyčerpán a dojde k disociaci BiP navázaného k transmembránovým receptorům PERK, ATF6 a IRE1 a následně k jejich aktivaci. Transmembránový receptor PERK je aktivován odpojením chaperonu BiP z jeho lumenální domény, některé studie ale naznačují, že může být aktivován i přímou interakcí s nesbalenými proteiny v lumen ER (Kimata a kol., 2010). Aktivovaná kináza PERK fosforyluje α podjednotku eukaryotického iniciačního faktoru 2 (eIF2α), což vede k inhibici syntézy proteinů a tím ke snížení obsahu nezralých proteinů vstupujících do ER (Lane a kol., 2014). Transkripce některých genů, jako je např. aktivační transkripční faktor4 (ATF4) je ale naopak fosforylovaným eIF2 aktivována. ATF4 poté aktivuje transkripci cílových proteinů, C/EBP homologní protein CHOP, jehož hlavní funkce je regulace rovnováhy mezi anti- a proapoptickými členy rodiny BCL-2 ve prospěch proaoptických členů. Další funkcí CHOP je transkripční aktivace ER oxidázy 1 α (ERO1α), která oxiduje lumen ER a tím katalyzuje reoxidaci protein disulfid izomerázy PDI, což vede ke zvýšení produkce peroxidu vodíku (Nishitoh, 2012). Aktivní ERO1α dále přes receptor IP3 uvolňuje Ca2+ ionty z ER a tím spouští apoptózu.
- 24 -
V případě ATF6 vede disociace BiP z domény v lumen ER k odhalení lokalizační sekvence a ATF6 je translokován do Golgiho aparátu, kde dojde k rozštěpení lumenální domény od transmembránové místními site-1 a site-2 proteázami (S1P a S2P) (Rutkowski a Kaufman, 2004). Tím se uvolní aktivní transkripční faktor v cytoplazmatické doméně, translokuje se do jádra a aktivuje transkripci navázáním se na "ER stress response elementy" (ERSE) cílových proteinů, jako jsou BiP, CHOP, calnexin, calreticulin a X-box binding protein 1 (XBP1) (Kober a kol., 2012). XBP1 je klíčovým regulátorem signalingu přes IRE1. Aktivace receptoru IRE1 je po odpojení chaperonu BiP indukována autofosforylací a oligomerizací (Chen a Brandizzi, 2013) avšak IRE-dependentní transkripce je opožděná vůči drahám PERK a ATF6, protože začíná odštěpením části mRNA transkripčního faktoru XBP1, který je transkribován až po aktivaci dráh PERK a ATF6 (Rutkowski a Kaufman, 2004). Toto štěpení vytvoří změnu translace této mRNA a produktem je aktivní transkripční faktor, mezi jehož cílové geny patří např. ER manosidáza EDEM, která ovlivňuje degradaci nezralých špatně sbalených proteinů. Štěpený XBP1 také zpětně negativně reguluje kinázu PERK. Průběh UPR je zjednodušeně zobrazen na Obrázku 3.
Obrázek 3: Schéma průběhu UPR (Rutkowski a Kaufman, 2004; upraveno) Diagram ukazuje přibližnou časovou posloupnost, se kterou se odehrávají děje aktivované jednotlivými senzorovými receptory ER PERK, ATF6 a IRE1. Např. plná aktivace dráhy IRE1 vyžaduje zvýšenou produkci mRNA XBP1 pomocí ATF6, což vede k dřívější indukci transkripce
- 25 -
cílových genů ATF6, než těch, které jsou cílové pro IRE1. Přerušované šipky zobrazují známé zpětnovazebné smyčky, pozitivní jsou zobrazeny zeleně a negativní červeně.
1.4.2.
ER Stress a kancerogeneze Protože rapidní růst nádorové tkáně vytváří stresové prostředí ve formě hypoxie,
hyperglykemie nebo akumulace nesbalených proteinů, je u nádorových buněk velmi často chronicky aktivována adaptivní odpověd UPR (Schöntal, 2013). Aktivované dráhy stresu ER, zvýšená produkce chaperonů a následná degradace proteinů a autofagie jsou pozitivní adaptivní dráhy a mohou významně přispět k přežití nádorových buněk a jejich rezistenci k protinádorovým terapiím (Schleicher a kol., 2010). Nadměrná exprese chaperonu BiP byla nalezena u nejméně deseti různých druhů nádorů, jako jsou nádory prsu, plic, střev nebo hepatocelulární karcinom (Moenner a kol., 2007). Mezi některé faktory UPR přispívající k růstu nádoru patří např. na ATF4 závislá aktivace proangiogenního glykoproteinu vaskulárního endoteliálního růstového faktoru a bylo prokázáno, že také protein XBP1 se pozitivně podílí na tumorigenezi (Lane a kol., 2014). Aktivace dráhy PERK přes fosforylaci eIF2α ovšem může způsobit inhibici syntézy cyklinu D a tím také zastavení buněčného cyklu, ovšem tato dormace může nádorové buňky ochránit před apoptózou. Signalizace ER stresu je však komplexnější a za určitých okolností a příliš silného působení stresových faktorů může dojít k indukci apoptózy a inhibici růstu nádorové tkáně. Zheng a kol. (2014) u nádoru prsu prokázali, že exprese chaperonu BiP souvisela s antiapoptickým chováním a přispívala k přežití nádoru, což mělo za následek horší prognózu pacientů, zatímco nadměrná exprese apoptického proteinu CHOP korelovala s lepší prognózou a nižším rizikem rekurence nádoru. Magyar a kol. (2009) ukázali, že indukce stresu ER a exprese proteinu CHOP může zvýšit efektivitu chemoterapie, avšak zacílení této terapie je nejisté vzhledem k adaptivním funkcím dalších drah aktivovaných během UPR. V závislosti na okolnostech může protinádorovou terapii vylepšit buď aktivace nebo inhibice stresu ER (Schleicher a kol., 2010). Nedávno byla popsána také asociace mezi indukcí stresu ER a spuštěním epiteliálně mezenchymální tranzice, která je během kancerogeneze nezbytná pro vytvoření metastáz (Zhong a kol., 2011).
- 26 -
1.5.
Epitelilálně mezenchymální tranzice Termín epiteliálně mezenchymální tranzice neboli EMT popisuje změnu, při které
epiteliální buňky ztrácí své typické epiteliální vlastnosti, jako je adhezivita a apikálně-bazální polarizace a místo toho získávají spíše mezenchymální fenotyp, tedy se stanou více pohyblivými a invazivními (Chua a kol., 2011). EMT je vysoce konzervovaný fyziologický děj uplatňující se zejména v embryogenezi, kdy umožní přeměnu jednovrstevného epitelia v trojrozměrné struktury všech tří zárodečných listů (Zhu a kol., 2013). V dospělém organismu je přeměna epiteliálních buněk na mezenchymální spuštěna pouze během hojení zranění a remodelace tkání, které se vyvíjí postnatálně, jako je prsní žláza, nebo u patologických stavů, mezi něž patří zánět, fibróza nebo kancerogeneze (Nisticò a kol., 2012). Avšak ve většině tkání je proces EMT vývojově omezen a plně diferencované epiteliální buňky už tranzicí neprochází a ponechávají si svůj epiteliální fenotyp. Epiteliální mezibuněčné spoje zajišťují integritu tkáně a podporují buněčnou apikálněbazální polaritu (Wheelock a kol., 2008). Komplex takovýchto spojů zahrnuje těsné spoje, adhezní spoje (neboli zonulla adherens) a desmozomy. Adhezní spoje hrají v komunikaci mezi buňkami nejdůležitější roli a jsou tvořeny cadheriny, především E-cadherinem, který je přes interakci s β-cateninem napojen na aktinová filamenta buněčného cytoskeletu. Klíčem k EMT je narušení mezibuněčných spojů a integrity tkání snížením exprese E-cadherinů pro narušení adhezních spojů, represí zonula occludens-1 (ZO-1) a klaudinů pro narušení těsných spojů a narušením desmozomů snížením exprese desmoplakinu (Mirantes a kol., 2013). Pro EMT je typická tzv. výměna cadherinů ("cadherin switching"), kdy je E-cadherin typický pro epiteliální buňky nahrazen N-cadherinem charakteristickým pro mezenchymální buňky (Wheelock a kol., 2008). Bylo definováno několik transkripčních faktorů, které potlačují expresi E-cadherinu a ostatních proteinů účastnících se mezibuněčných spojů a tím umožňují indukci EMT (Mirantes a kol., 2013). Tyto faktory zahrnují zejména transformující růstový faktor β (TGFβ), epidermální růstový faktor (EGF), insulinu podobný růstový faktor (IGF), interleukin, vaskulární endoteliální růstový faktor, interleukin, notch a signállní dráha Wnt/β-catenin. Většina těchto transkripčních faktorů snižuje expresi E-cadherinu přes aktivaci zinc-finger transkripčních represorů, mezi něž patří Snail a Slug, Twist, ZEB1 a ZEB2. Oproti tomu dochází při EMT k vyšší expresi proteinů typických pro mezenchymální buňky, jako je vimentin nebo fibronektin (Nisticò a kol., 2012). Bylo také zjištěno, že samotné transkripční represory E-cadherinu Snail a Slug jsou schopné vyvolat v epiteliálních buňkách EMT (Li a kol., 2014). - 27 -
1.5.1.
Úloha EMT v kancerogenezi a tvorbě metastáz Tvorba metastáz byla definována jako jeden z charakteristických znaků maligní
transformace (Hanahan a Weinberg, 2011) a EMT je pro tento proces naprosto nezbytným jevem (Ryu a kol., 2012). Indukce EMT a s ní spojená snížená exprese E-cadherinu byla prokázána u mnoha rozdílných závažných nádorových onemocnění, jako je pankreatický karcinom, karcinom prsu, karcinom prostaty, ovariální karcinom, karcinom žaludku, kolorektální karcinom nebo nemalobuněčný karcinom plic a většinou souvisela s invazivnějším fenotypem nádoru a horší prognózou (Shi a kol., 2013; Chua a kol., 2011). Tvorba metastáz je komplexní proces zahrnující sérii signálních drah, které umožní buňkám změnu fenotypu a chování (Lane a kol., 2014). Zjednodušeně je průběh vytvoření sekundárního nádorového ložiska popsán na Obrázku 4. U solidních nádorů nádorové buňky podstupující EMT nezískají pouze schopnost invadovat okolní tkáně a tvořit metastázy, ale také vykazují
vlastnosti nádorových
kmenových buněk a vykazují zvýšenou rezistenci ke konvenčním protinádorovým terapiím (Chua a kol., 2011). Nové přístupy cílené na buněčnou pohyblivost skrze dráhy EMT by mohly poskytnout lepší terapie pro léčbu nádorů a podobných onemocnění. Marijon a kol. (2011) pozorovali expresi markerů EMT u hepatocelulárního karcinomu nejen u migrujících buněk, které získaly mezenchymální fenotyp, ale také u dobře diferencovaných karcinomových buněk, které vykazovaly rezistenci k terapeutiku sutinibu.
- 28 -
Obrázek 4: Vývoj od normálního epitelu k metastatickému karcinomu (Lane a kol., 2014; upraveno) In situ karcinom derivovaný z normálních epiteliálních buněk podstupuje epiteliálně mesenchymální tranzici (EMT) a invaduje tkáně. Postupuje do krevního nebo lymfatického oběhu. Jakmile metastatické buňky kolonizují novou tkáň, podstoupí mesenchymálně epiteliální tranzici (MET) a změní se zpět na epiteliální buńky.
- 29 -
2.
Cíle Diplomové práce TUSC3 je potenciální nádorový supresor, který byl objeven při hledání tumor
supresorových genů na chromozomální oblasti 8p22, která bývá často deletována u mnoha druhů epitliálních nádorů včetně ovariálního karcinomu. Obecným cílem mé práce bylo zhodnotit konkrétní dopad snížené nebo zvýšené exprese TUSC3 na fenotyp buněčných linií ovariálního karcinomu. Původní cíle byly rozšířeny o pokusy in vivo a na základě nových publikovaných výsledků také o porvrzení účasti epiteliálně-mezenchymální tranzice na kancerogenezi buněk s nízkou nebo žádnou expresí TUSC3. Cíle diplomové práce:
1) Na myším modelu in vivo prokázat tumor supresorové působení genů TUSC3. 2) Pomocí elektronové mikroskopie charakterizovat ultrastrukuturu ovariálních nádorových buněk s normální nebo sníženou expresí TUSC3 se zaměřením na ultrastrukturu drsného endoplazmatického retikula. 3) Korelovat případné změny v ultrastruktuře endoplazmatického retikula s některými markery stresu ER nebo UPR pomocí western blotingu. 4) Na základě exprese příslušných markerů prokázat nebo vyvrátit teorii o spuštění procesu epiteliálně-mezenchymální tranzice u buněk s nízkou expresí TUSC3.
- 30 -
3.
Materiál a metody
3.1.
Kultivace ovariálních nádorových linií Pro studium ovariálního karcinomu byly pro všechny experimenty vybrány tři buněčné
linie pocházející z lidského adenokarcinomu vaječníků - linie SKOV3, H134 a TR-170. Linie SKOV3 byla získána z American Type Culture Collection (ATTC) a linie TR-170 a H134 byly laskavě poskytnuty prof. Thomasem Gruntem z AKH ve Vídni (Allgemeines Krankenhaus der Stadt Wien). Před započetím experimentů byla provedena autentizace těchto buněčných linií firmou Generi Biotech, která potvrdila identitu buněčné linie SKOV3 a čistotu linií TR-170 a H134. Linie SKOV3 a TR-170 byly dříve upraveny metodou lentivirové transdukce za využití plazmidového systému s vektorem pLKO.1puro obsahujícím TUSC3 shRNA nebo Scrambled shRNA pro vytvoření variant se sníženou expresí TUSC3 (SKOV3-TUSC3down, TR-170-TUSC3down) a kontrolních variant (SKOV3-Scrambled, TR-170-Scrambled) (Vaňhara a kol., 2013). Buněčná linie H134 neexprimuje TUSC3 kvůli hypermetylaci jeho promotoru
a
proto
byla
připravena
varianta
s
obnovenou
expresí
TUSC3
(H134-IRES-TUSC3) pomocí transfekce expresního vektoru pLP-IRESneo s fúzním proteinem TUSC3 lipofekcí za využití systému Lipofectamine 2000 (Invitrogen) (Pils a kol., 2005). Kontrolní varianta H134-IRES byla připravena lipofekcí prázdného vektoru pLPIRESneo. Linie TR-170 a H134 byly kultivovány v médiu DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium (GlutamaxTM, Gibco) a linie SKOV3 byla kultivována v médiu McCoy’s 5A Modified Medium (W/L-Glutamine, NaHCO2, Sigma-Aldrich) a obě média byla obohacená o 10 % FBS (fetální bovinní sérum) a 50 U/ml penicilinu G a 50 U/ml streptomycin sulfátu. Všechny buněčné kultury byly kultivovány v 10 cm2 kultivačních miskách v termostatu ve vzdušné atmosféře 5% CO2 při 95% relativní vlhkosti a 37 °C. Buňky byly pozorovány invertovaným mikroskopem Nikon ECLIPSE TS100 a pasážovány každý 2-3. den pomocí roztoku Trypsin-EDTA (Sigma-Aldrich). V případě potřeby byly buňky počítány pomocí Bürkerovy komůrky.
- 31 -
Indukce nádoru u imunodeficientních myších modelů
3.2.
Pro indukci nádorů z lidských ovariálních nádorových buněk bylo použito deset 8-týdenních myší kmenu NOD SCID Gamma Strain (NGS) pro každou testovanou buněčnou linii, celkem tedy bylo použito 30 myší. Pokusy na zvířatech byly provedeny s povolením Ministerstva školství, mládeže a tělovýchovy České republiky pod číslem projektu MSMT15876/2013-310 schváleného 12.4. 2013. Vedoucí pokusu Doc. MVDr. Aleš Hampl, CSc 0126/ 2000 – V3. Pokusy byly prováděny certifikovanými pracovníky (Kateřina Kratochvílová, CZ01159). 1)
Kultivace
nádorových
buněk
jednotlivých
linií
(SKOV3-Scrambled,
SKOV3-TUSC3down, TR-170-Scrambled, TR-170-TUSC3down, H134-IRES, H134IRES-
TUSC3) v příslušném médiu do subkonfluentního stavu (70-80 %).
2)
Odlepení buněk trypsinem, centrifugace, rozředění v médiu a spočítání buněk.
3)
Rozdělení buněk po 5x106 v 200 ml PBS do 1,5 ml eppendofrek a následná sterilizace v UV komoře a přenesení do zvířetníku v bariérovém chovu.
4)
Zafixování myši v ruce, dezinfekce místa injikace a subkutánní injekce 5x106 buněk kontrolní linie do levé zadní končetiny v oblasti slabin a injekce 5x10 6 buněk modifikované linie do pravé zadní končetiny v oblasti slabin pomocí inzulinové injekční stříkačky.
5)
Měření velikosti nádoru ve dvou na sebe kolmých rovinách posuvným měřidlem každý druhý/třetí den po dobu 6-8 týdnů.
6)
Objem nádoru byl vypočítán podle vzorce: V = 1/2 (šířka x délka) 2. Pokud nádor přesáhl velikost 1 cm3, bylo dané zvíře utraceno.
7)
Pro značnou nepřesnost měření posuvným měřidlem byly nádory před ukončením experimentu a před usmrcením pokusného zvířete kontrolně změřeny pomocí vysokofrekvenčního
ultrazvukového systému Vevo 2100 (Fujifilm Visual Sonic) při
30 MHz. 8)
Po usmrcení zvířete byly nádory vypreparovány a každý byl rozdělen na dvě části, z nichž jedna byla uložena do RNAlater RNA Stabilization Reagent (Qiagen) a druhá do 10%
formaldehydu pro pozdější určení exprese TUSC3 pomocí qPCR a
imunohistochemie.
- 32 -
3.3.
Kvantitativní RT-PCR
3.3.1.
Izolace celkové RNA z nádorové tkáně
1)
Z nádorové tkáně uchované v RNAlater RNA Stabilization Reagent bylo odděleno cca 30 mg, které byly v mikrozkumavce hluboce zmraženy v tekutém dusíku, rozdrceny a homogenizovány v 800 μl lyzačního pufru RLT (RNeasy Mini Kit, Qiagen; 74104).
2)
K lyzátu byla přidána proteináza K o finální koncentraci 100 μg/ml.
3)
Inkubace 10 min/56 °C.
4)
Centrifugace při 13 000 rpm/3 min, supernatant přenesen do čisté mikrozkumavky.
5)
K supernatantu byl přidán ekvivalentní objem 70% EtOH a lyzát s případným vytvořeným precipitátem byl nanesen na vazebnou kolonu a centrifugován (15 000 rpm/2 min)
6)
Kolona byla promyta postupně prvním a druhým promývacím pufrem (RW1 a RPE) a po posledním promytí byla kolona centrifugována bez přítomnosti promývacího pufru (15 000 rpm/1min).
7)
RNA z kolony byla eluována deionizovanou vodou, TE pH 8,0
8)
Koncentrace a čistota (A260/280, A260/230) získané RNA byla změřena na NanoDropu 3000 (Thermo Scientific) a vzorky byly uchovány při -80 °C.
3.3.2.
Izolace celkové RNA z buněčných kultur
Izolace RNA z kultivovaných buněčných linií byla izolována RNA pomocí kitu RNeasy Mini Kit (Qiagen; 74104) podle pokynů výrobce: 1)
Buňky byly lyzovány 600 µl pufru RLT, následně byl lyzát centrifugován (15 000 rpm/3 min) a k supernatantu bylo přidáno ekvivalentní množství 70% EtOH.
2)
Lyzát s EtOH byl přenesen na kolonu a centrifugován (15 000 rpm/2 min).
3)
Kolona byla postupně promyta prvním a druhým promývacím roztokem (RW1 a RPE) a po posledním promytí byla kolona centrifugována bez přítomnosti promývacího pufru (15 000 rpm/1 min).
4)
RNA byla eluována deionizovanou vodou, TE pH 8,0.
5)
Koncentrace a čistota (A260/280, A260/230) izolované RNA byla změřena na NanoDropu 3000 (Thermo Scientific a vzorky byly uchovány při -80 °C.
- 33 -
3.3.3.
Reverzní transkripce a stanovení exprese pomocí qPCR
Izolovaná RNA z nádorů a buněčných linií byla přepsána do cDNA reverzní transkripcí pomocí kitu Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, 04896866001) podle návodu dodaného výrobcem. Získaná cDNA byla uchovávána při -20 nebo -80 °C. Na ledu byla připravena reakční směs o celkovém objemu 13 µl a následujícím
1)
složením: 1 µg izolované RNA, 1µl Anchored Oligo dT primerů + doplnit vodou v PCR kvalitě. 2)
Připravená směs byla inkubována 10 min při 65°C a poté inhned přemístěna na led.
3)
Do reakční směsi bylo přidáno 7 µl připraveného roztoku: 4 µ pufru, 0,5 µl inhibitoru RNáz, 2 µl směsi nukleotidů a 0,5 µl reverzní transkriptázy. Reverzní transkripce probíhala v termocykleru při 50 °C/30 min a následně byla
4)
reverzní transkriptáza inaktivována inkubací při 85°C/5 min. Pro dlouhodobé uchování byla získaná cDNA uložena v -20 °C.
5)
3.3.4. 1)
Stanovení exprese pomocí kvantitativní RT-PCR Byla připravena reakční směs pro kvantitativní RT-PCR pomocí kitu LightCycler 480
Probes Master (Roche, 0887301001) v celkovém objemu 20 µl na reakci do 96-jamkové PCR destičky. Pro detekci TUSC3 byla použita sonda Hs00185147_m1 (TaqMan Gene Expression Assay, Life Technologies, Cat. # 4331182) v objemu 2 µl na 20 µl reakční směsi (1 µl cDNA, 7 µl PCR-vody, 10 µl Probes Master) a pro detekci referenčního genu GAPDH byla použita UPL sonda a primery navrhnuté pomocí internetové aplikace ProbeFinder (viz Tab. 1). Reakční směs pro GAPDH viz Tab. 2.
Tabulka 1: UPL primery a sonda pro GAPDH Primer GAPDH L GAPDH R
Sekvence 5´- 3´ ccccggtttctataaattgagc caccttccccatggtgtct
Tabulka 2: Složení reakční směsi pro RT-PCR
Reagent Probes Master Forward primer Reverse primer UPL sonda PCR-voda cDNA
Objem 10 µl 1,6 µl 1,6 µl 0,4 µl 19 µl 1 µl
Finální koncentrace 1x 0,4 µM 0,4 µM 0,2 µM −−− −−− - 34 -
UPL sonda 63
2)
96-jamková destička s reakční směsí byla zcentrifugována při 1200 g/2 min.
3)
Kvantitativní PCR probíhala v termocykleru Light Cycler 480 II (Roche) podle programu uvedeném v Tab. 3.
Tabulka 1: Nastavení programu v termocykleru
Proces Iniciace denaturace Denaturace Annealing Elongace
Čas 5 min 20 sek 30 sek 20 sek
Teplota 95 °C 95 °C 58 °C 72 °C
Počet cyklů 1x 40x
4) Relativní exprese TUSC3 byla stanovena pomocí metody delta delta Ct: R = 2–ΔΔCt, kde ΔΔ Ct = Δ Ct vzorek - Δ Ctkontrola; Δ Ct = Ctstudovaný gen - Ctreferenční gen
3.4. 1)
Imunohistochemická analýza Část nádorové tkáně odebrané z myších nádorových xenograftů byla fixována nejméně 24 hodin v 10% formaldehydu a poté byla zalita do parafinového bloku.
2)
Na mikrotomu byly ze zalité tkáně připraveny přibližně 5 μm silné řezy, které byly následně
zachyceny
na
podložní
sklíčko
a
na
něm
deparafinovány
několikasekundovým zahřátím na 60 °C. 3)
Řezy byly rehydrovány ponořením na 3x5 min v xylenu a následně po 1x po 5 min ve 100%, 85% a 70% EtOH.
4)
Poté byly řezy omyty několikerým opláchnutím v destilované vodě a ponechány na 10 min v roztoku PBS-Tween pH 7,2 (Tween 100 µl/l).
5)
Revitalizace antigenu byla provedena inkubací v roztoku Target Retrieval Solution, pH 9 (Dako, S236884) po dobu 40 min při 98 °C.
6)
Po zchladnutí roztoku (přibližně 15 min při pokojové teplotě) následoval oplach v PBS 3x5 min a 10min blokace v 30% H2O2 v PBS pro potlačení peroxidázové aktivity a 10min blokace v 1% BSA.
7)
Poté byly řezy inkubovány s primární protilátkou anti-TUSC3 (Rabbit polyclonal, ab65213, Abcam) ředěnou 1:100 v Antibody Diluent (Dako, S080981) po dobu 60 min ve vlhké komoře za pokojové teploty.
- 35 -
8)
Řezy byly opláchnuty 3x5 min v PBS a inkubovány s vazebným činidlem Biotinylated LINK (LSAB + System HRP, Dako, K067511) po 30 minut ve vlhké komoře za pokojové teploty.
9)
Opět následoval oplach 3x5 min v PBS a poté byly řezy inkubovány 30 min ve vlhké komoře se Streptavidin-HRP (LSAB + System HRP, Dako, K067511).
10)
Po oplachu 3x5 min v PBS byly řezy obarveny v substrátovém pufru DAB+ Substrate Buffer přidáním chromogenu DAB+ (obojí z kitu LSAB + System HRP, Dako, K067511) do vyvolání hnědého zbarvení.
11)
Jádra byla obarvena po oplachu v destilované vodě kontrastním roztokem Gill´s Hematoxylin (Sigma-Aldrich, GHS1128) a následoval opět oplach v destilované vodě na 5 min.
12)
Následovalo odvodnění vzestupnou alkoholovou řadou (1x5 min v 70%, 85% a 100% EtOH) a projasnění ponořením na 3x5 min v roztoku xylenu.
13)
Nakonec byly řezy zamontovány pod krycí sklíčko pomocí montovacího média Pertex a pozorovány a vyfoceny mikroskopem ImageXpress® Micro XL (Molecular Devices).
3.5.
1)
Příprava vzorků pro pozorování pod transmisním elektronovým mikroskopem Buňky všech buněčných linií a jejich variant byly rozděleny po dvou miskách na skupinu s indukovaným stresem ER pomocí 24hod inkubace s 0,2 μM tunicamycinem a kontrolní skupinu, která byla kultivována 24 hod v 10 ml média + 2,1 µl rozpouštědla DMSO.
2)
Poté byly buňky odebrány pomocí trypsinu, proprány v kakodylátovém pufru a fixovány 1 hod v roztoku 300 mM glutaraldehydu ve 100 mM kakodylátovém pufru.
3)
Po fixaci byly buňky opět 3x15 min proprány v kakodylátovém pufru.
4)
Postfixace probíhala 50 min ve 40 mmol OsO4 ve 100 mmol kakodylátovém pufru (v digestoři).
5)
Vypírání 3x15 minut v kakodylátovém pufru.
6)
Zalití do agaru - buňky v kakodylátovém pufru byly zcentrifugovány, byl odsát všechen pufr a poté
byly buňky opatrně zakápnuty rozpuštěným agarem a pod
preparačním mikroskopem z nich byly pomocí skalpelu připraveny bločky přibližně 1 mm3 velké s co nejvyšší koncentrací buněk.
- 36 -
7)
Odvodnění vzestupnou alkoholovou řadou - agarové bločky s buňkami byly postupně inkubovány po 3x10 minut v 50%, 70%, 96% a absolutním alkoholu a poté 3x10 minut v acetonu.
8)
Prosycení durcupanem - Bločky byly prosyceny ve směsi 1 díl abs. acetonu : 1 díl durcupanové směsi č. 1 (Fluka Durcupan, EMS, #14020) po dobu 40 minut, poté směs vyměněna za 1 díl abs. aceton : 3 díly durcupanové směsi č. 1 a přes noc byly bločky ponechány v exikátoru ve směsi durcupanu č. 1.
9)
Bločky v durcupanové směsi byly inkubovány 4 hod při 50 °C a poté v durcupanové směsi č. 2 po dobu 2 hod při 50 °C.
10)
Polymerace: Buňky v durucupanové směsi č. 2 byly postupně inkubovány 1 den při 60 °C, 1 den při 70 °C a 1 den při 80 °C.
11)
Kapslování - Do formiček byla nalita směs durcupanu č. 2 a bločky s buňkami byly opatrně umístěny (bez vzniku bublin) na dno a na okraj formičky pro snadné nakrájení.
12)
Nakonec byly na LKB 8802A ultramikrotomu připraveny přibližně 100-200 nm tenké řezy, (Krájení řezů na ultramikrotomu a kontrastování bylo provedeno odborně paní laborantkou Dobromilou Klemovou).
13)
Zhotovené a nakontrastované řezy byly umístěny na měděné síťky pro elektronovou mikroskopii a pozorovány na transmisním elektronovém mikroskopu Morgagni 286(D) (FEI).
3.6.
Analýza proteinové exprese pomocí Western blotingu
3.6.1.
Izolace a změření koncentrace proteinů
1)
Před izolací byly buňky kultivovány s inhibitorem N-glykosylace tunicamycinem o dvou různých koncentracích (0,2 μM a 0,5 µM) a dvou různých časech působení (12 a 24 hod) a jako kontrola byly použity buňky kultivovány 24 hod s 4,2 µl DMSO/10 ml příslušného média.
2)
Buňky byly dvakrát opláchnuty ledově vychlazeným PBS a poté byly lyzovány pufrem RIPA (50 mM Tris-Cl, pH 7,6; 150 mM NaCl; 1% Triton 100; 0,1% SDS) obsahujícím inhibitory fosfatáz a proteáz (cOmplete Protease Inhibitor Coctail Tablets, Roche Diagnostics; PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Coctail Tablets, Roche Diagnostics). - 37 -
3)
Buněčné lyzáty byly zcentrifugovány při 15 000 rpm/10 min při 4 °C a supernatant byl přenesen do čisté zkumavky.
4)
Koncentrace proteinů byla stanovena metodou Bradfordové s využitím DC protein assay kit (Bio-Rad) na prístroji Beckman Coulter DTX 880.
5)
Byly připraveny vzorky o stejné koncentraci proteinů (1 mg/ml) zředěním proteinových lyzátu pufrem RIPA a přidáním 5x koncentrovaného Laemliho pufru (1 ml glycerol; 1 g SDS; 6,25 ml Tris-HCl 0,5 M ph 6.8; 1 ml 0,5% bromphenol; 2,5 ml β-mercaptoetanol; doplnit do 10 ml dH20).
6)
Následně byly proteiny denaturovány povařením 5 min při 95 °C ve vodní lázni.
7)
Vzorky byly uchovávány při -80 °C.
3.6.2. 1)
Westernový přenos Proteiny (po 10 µg) byly rozděleny SDS gelovou elektroforézou v 10% SDSpolyakrylamidovém gelu a 5% separačního gelu při 150 V v elektroforetickém pufru.
2)
Z gelu byly proteiny přeneseny na PVDF membránu (Millipore) pomocí aparatury BIO-RAD s transferovým pufrem chlazeným na ledu, transfer probíhal při 100 V 1 hod.
3)
Membrána s imobilizovanými proteiny byla inkubována v 5% odtučněném mléku v TBS pro vyblokování neobsazených vazebných míst na membráně.
4)
Poté byla membrána inkubována s příslušnou primární protilátkou ředěnou v poměru 1:1000 v 5% roztoku BSA v TBS při 4 °C přes noc (seznam primárních protilátek viz Tab. 4).
5)
Druhý den byla membrána promyta 3x15 min v TBS pro odstranění případně nespecificky navázané primární protilátky.
6)
Blokace s příslušnou sekundární protilátkou probíhala při pokojové teplotě po dobu 1 hod, sekundární protilátky byly ředěny v poměru 1:5000 v 5% odtučněném mléku v TBS a jsou popsány v Tab. 5.
7)
Membrána byla opět promyta v TBS 4x10 min.
8)
Pro chemiluminiscenční vizualizaci proteinů byla membrána inkubována s chemiluminiscenčním roztokem ECL plus (Amersham, GE Healthcare) po dobu 5 min.
9)
Proteiny byly vizualizovány na fotografický film, který byl následně manuálně vyvolán v temné komoře.
- 38 -
Tabulka 2: Seznam použitých primárních protilátek
Protilátka Actin β-katenin BiP/GRP78 Calnexin CHOP E-Cadherin EGFR Ero-1 IRE1α PDI PERK Slug TCF8/ZEB Vimentin ZO-1
Výrobce/katalogové číslo abcam, ab1801 Cell Signaling, #8480 Cell Signaling, #3177 Cell Signaling, #2679 abcam, ab11419 abcam, ab53033 Cell Signaling, #2232 Cell Signaling, #3264 Cell Signaling, #3294 Cell Signaling, #3501 Cell Signaling, #5683 Cell Signaling, #9585 Cell Signaling, #3396 Cell Signaling, #5741 Cell Signaling, #8193
Hostitel
Velikost
Rabbit Rabbit Rabbit Rabbit Mouse Rabbit Rabbit Rabbit Rabbit Rabbit Rabbit Rabbit Rabbit Rabbit Rabbit
42 kDa 97 kDa 78 kDa 90 kDa 30 kDa 135 kDa 134 kDa 60 kDa 130 kDa 57 kDa 140 kDa 29 kDa 200 kDa 57 kDa 220 kDa
Tabulka 3: Seznam použitých sekundárních protilátek
Specifita protilátky
Výrobce/Katalogové číslo
Anti-Mouse
Sigma Aldrich; PNIM0817
Anti-Mouse
Cell Signaling; #7076
Anti-Rabbit
Cell Signaling; #7074
3.6.3.
Složení pufrů a gelů
Zaostřovací 5% gel: 1,75 ml dH2O; 312,5 μl 1M TRIS-HCl pH 6,8; 417,5 μl 30% akrylamid; 12,5 μl 20% SDS; 2,5 μl TEMED; 12,5 μl 10% APS Separační 10% gel: 2,17 ml dH2O; 2,8 ml 1M TRIS-HCl pH 8,8; 2,5 ml 30% akrylamid; 37,5 μl 20% SDS; 5 μl TEMED; 20 μl 10% APS Elektroforetický pufr: 5 ml 20% SDS; 14,42 g Glycin; 3,03 g TRIS; doplnit dH2O do 1 l Transferový pufr: 14,42 g glycin; 3,03 g TRIS; 200 ml metanol; doplnit dH2O do 1 l TBS: 8 g NaCl; 2,4 g TRIS; 1 ml TWEEN; doplnit dH2O do 1 l; upravit pH na 7,6. (HCl)
- 39 -
4.
Výsledky
4.1.
Ověření exprese TUSC3 u používaných nádorových buněčných linií Pro všechny experimenty jsem používala nádorové buněčné linie SKOV3, TR-170 a
H134 odvozené z lidského ovariálního karcinomu, u kterých byla experimentálně snížena (SKOV3 a TR-170) nebo zvýšena (H134) exprese TUSC3 (Vaňhara a kol., 2013; Pils a kol., 2005). Před provedením dalších experimentů jsem pomocí kvantitativní RT-PCR ověřila expresi TUSC3 u jednotlivých variant (Obr. 5). Míra exprese byla vztažena k referenčnímu genu GAPDH. Exprese TUSC3 byla snížena u všech variant s experimentálně sníženou expresí TUSC3 a buněčná linie H134-IRES neexprimovala téměř žádný TUSC3 v důsledku metylace jeho promotoru.
Obrázek 5: Srovnání relativní exprese TUSC3 u použitých nádorových linií
4.2.
Snížená exprese nebo ztráta TUSC3 vede ke zvýšené formaci nádorů in vivo Pro ověření tumor supresorového působení TUSC3 byly indukovány nádory
imunosupresivním myším z kmene NGS subkutánní injekcí lidských nádorových linií. Modifikovaná a kontrolní linie byly vždy injikované na protilehlé strany u stejné myši. Růst nádorů byl měřen posuvným měřidlem a zaznamenáván přibližně každý 2.-3. den po dobu 6-8 týdnů a kvůli značné nepřesnosti měření pomocí posuvného měřidla byly vybrané - 40 -
reprezentativní nádory z každé linie před skončením pokusu přesně změřeny pomocí vysokofrekvenčního ultrazvukového systému Vevo 2100.
4.2.1.
Nádory indukované pomocí buněčné linie H134 Nejrychlejší růst nádorů v imunosuprimovaných myších projevovaly nádory odvozené
z buněk linie H134, u které byl nejvyšší rozdíl v expresi TUSC3 mezi variantami H134-IRES a H134-IRES-TUSC, přičemž varianta H134-IRES neexprimovala téměř žádný TUSC3. V závěru experimentu byla průměrná velikost nádorů indukovaných z varianty H134-IRES přibližně dvojnásobná než průměrná velikost nádorů indukovaných z varianty exprimující TUSC3 H134-IRES-TUSC3. Graf zobrazující křivky růstu nádorů z těchto linií a obrázky 3D modelů vybraných nádorů jsou ukázány na Obr. 6.
Obrázek 6: Srovnání velikosti a rychlosti růstu nádorů indukovaných z buněčných linií H134IRES a H134-IRES-TUSC3 Na obrázku je vidět porovnání růstových křivek dvou variant buněčné linie H134 s rozdílnou expresí TUSC3 (A) vedle jsou zobrazeny ultrazvukem pořízené záběry reprezentativních nádorů obou variant (B) s doplněním o 3D model nádoru (žlutě H134-IRES-TUSC3, červeně H134-IRES) a s vypočítaným objemem pomocí softwaru ultrazvukového systému Vevo.
Kvantitativní RT-PCR i imunohistochemická analýza potvrdily výrazný rozdíl v expresi TUSC3 mezi variantami H134-IRES a H134-IRES-TUSC3 (viz Obr. 7).
- 41 -
Obrázek 7: Analýza exprese TUSC3 u nádorů odvozených z buněčných linií H134-IRES a H134-IRES-TUSC3 Na obrázku je zobrazeno imunohistochemické značení proteinu Tusc3 (hnědé zbarvení) na řezu nádorové tkáně odvozené z buněk linie H134. Jádra buněk jsou zbarvena modře (A). Graf zobrazuje relativní expresi TUSC3 určenou pomocí kvantitativní RT-PCR (B).
4.2.2.
Nádory indukované pomocí buněčné linie SKOV3 Buněčná linie SKOV3 se ukázala být ze všech tří testovaných nádorových linií
nejméně tumorigenní a také rozdíly mezi modifikovanou a kontrolní variantou byly zpočátku spíše nevýrazné. Po 8 týdnech v době ukončení experimentu však byly nádory indukované z buněk s experimentálně sníženou expresí TUSC3 opět přibližně dvakrát větší než nádory indukované z kontrolní varianty s nezměněnou expresí TUSC3. Srovnání růstu nádorů linie SKOV3 je zobrazeno na Obr. 8.
Obrázek 8: Srovnání rychlosti růstu nádorů indukovaných z buněčných linií SKOV3shScrambled a SKOV3shTUSC3down Na obrázku je vidět porovnání růstových křivek dvou variant buněčné linie SKOV3 s rozdílnou expresí TUSC3 (A) vedle jsou zobrazeny ultrazvukem pořízené záběry reprezentativních nádorů obou variant (B) s doplněním o 3D model nádoru (žlutě SKOV3shScrambled, červeně SKOV3shTUSC3down) a s vypočítaným objemem pomocí softwaru ultrazvukového systému Vevo.
- 42 -
Imunohistochemická analýza a kvantitativní PCR potvrdily rapidní rozdíl v expresi TUSC3 mezi nádorovými xenografty odvozenými od varianty SKOV3shScrambled a SKOV3shTUSC3down (Obr. 9). Rozdíl zjištěný metodou RT-PCR byl dokonce ještě vyšší než u původních nádorových linií (viz Obr. 5), což může naznačovat získanou ztrátu exprese TUSC3 při vývoji nádoru.
Obrázek 9: Analýza exprese TUSC3 u SKOV3shScrambled a SKOV3shTUSC3down
nádorů
odvozených
z
buněčných
linií
Na obrázku je zobrazeno imunohistochemické značení proteinu Tusc3 (hnědé zbarvení) na řezu nádorové tkáně odvozené z buněk linie SKOV3. Jádra buněk jsou zbarvena modře (A). Graf zobrazuje relativní expresi TUSC3 určenou pomocí kvantitativní RT-PCR (B).
4.2.3.
Nádory indukované pomocí buněčné linie TR-170 Nakonec byly hodnoceny nádory odvozené z buněčné linie TR-170, u kterých byla
rapidní změna rychlosti růstu xenograftů viditelná již během prvních dvou týdnů po indukci (Obr. 10). V době ukončení experimentu byl již rozdíl mezi nádory odvozenými z varianty se sníženou expresí TUSC3 (TR-170shTUSC3down) a nádory odvozenými z kontrolní varianty více než 80%.
- 43 -
Obrázek 10: Srovnání rychlosti růstu TR-170shScrambled a TR-170shTUSC3down
nádorů
indukovaných
z
buněčných
linií
Na obrázku je vidět porovnání růstových křivek dvou variant buněčné linie TR-170 s rozdílnou expresí TUSC3 (A) vedle jsou zobrazeny ultrazvukem pořízené záběry reprezentativních nádorů obou variant (B) s doplněním o 3D model nádoru (žlutě TR-170shScrambled, červeně TR-170shTUSC3down) a s vypočítaným objemem pomocí softwaru ultrazvukového systému Vevo. .
Xenografty
odvozené
z
buněčné
linie
TR-170
byly
také
hodnoceny
imunohistochemicky a pomocí kvantitativní PCR, přičemž obě metody potvrdily významně nižší expresi TUSC3 u varianty TR-170shTUSC3down.
Obrázek 11: Analýza exprese TUSC3 u SKOV3shScrambled a SKOV3shTUSC3down
nádorů
odvozených
z
buněčných
linií
Na obrázku je zobrazeno imunohistochemické značení proteinu Tusc3 (hnědé zbarvení) na řezu nádorové tkáně odvozené z buněk linie TR-170. Jádra buněk jsou zbarvena modře (A). Graf zobrazuje relativní expresi TUSC3 určenou pomocí kvantitativní RT-PCR (B).
- 44 -
4.3.
Porovnání ultrastruktury buněk s různou expresí TUSC3 pomocí transmisní elektronové mikroskopie Jednou z funkcí TUSC3 je jeho účast na N-glykosylaci proteinů jako součást OST
komplexu v endoplazmatickém retikulu. Při abnormálně nízké expresi TUSC3 tedy lze očekávat narušení N-glykosylace a tím může dojít k hromadění nesbalených proteinů v lumen ER a indukci stresu ER. Stres ER indukovaný akumulací nesbalených proteinů se může projevit mimo jiné také dilatací cisteren ER pozorovatelných pod elektronovým mikroskopem. Při studiu ultrastrukturních změn endoplazmatického retikula bylo hodnoceno 100 buněk z každé varianty hodnocených buněčných linií (SKOV3shTUSC3, SKOV3Scrambled,
TR-170shTUSC3,
TR-170-Scrambled,
H134-IRES,
H134-IRES-TUSC3)
kultivovaných za normálních podmínek a po 24 hodinovém působení 0,2 µM tunicamycinu, celkem tedy 400 buněk pro každou buněčnou linii. Pro analýzu byly vybrány pouze buňky s neporušenou
membránou
a
jádrem,
s
viditelným
jadérkem,
mitochondriemi
a
endoplazmatickým retikulem. Bylo zjištěno, že u nádorových linií SKOV3 a H134 docházelo výrazně častěji k dilataci cisteren drsného ER u buněk s nízkou (nebo v případě H134 žádnou) expresí TUSC3 než u buněk s normální expresí přičemž při umělé inhibici N-glykosylace u buněk s normální expresí TUSC3 došlo i u nich k nadměrné dilataci cisteren. Působení tunicamycinem na buňky s nízkou expresí TUSC3 už strukturu ER u buněk nijak nezměnilo. Reprezentativní obrázky každé varianty buněčné linie SKOV3 jsou zobrazeny na Obr. 12 a na Obr. 13 je srovnání počtů buněk z celkových 100 buněk, které měly dilatované cisterny ER. Obdobně pro linii H134 jsou reprezenativní obrázky uvedeny na Obr. 16 a srovnání počtů buněk s dilatovaným ER je na Obr. 17. U buněčné linie TR-170 jsem nepozorovala výrazný rozdíl v počtu buněk s dilatovanými cisternami ER mezi variantami s normální a sníženou expresí TUSC3, avšak zajímavé bylo zjištění, že po 24hod působení 0,2 µM tunicamycinu došlo k rapidnímu zvýšení buněk s dilatovanými cisternami ER pouze u varianty s normální (vyšší) expresí TUSC3 a ne u varianty s experimentálně sníženou expresí TUSC3. Reprezentativní obrázky buněk TR-170 jsou na Obr. 14 a Obr 15. obsahuje srovnání počtu buněk (%) s dilatovaným ER u každé zkoumané varianty.
- 45 -
Obrázek 12: Srovnání ultrastruktury drsného ER u různých variant buněčné linie SKOV3 Srovnání reprezentativních obrázků získaných transmisní elektronovou mikroskopií buněk linie SKOV3, větší obrázek u každé varianty představuje výřez s viditelným drsným ER a v rohu je zobrazen náhled celé buňky s červeně vyznačenými cisternami ER. Obrázek SKOV3-Scrambled ukazuje normální uspořádání cisteren drsného ER, zatímco na ostatních variantách jsou cisterny ER výrazně rozšířené (dilatované).
Obrázek 13: Srovnání počtu buněk s pozměněnou strukturou ER u buněčné linie SKOV3
- 46 -
Obrázek 14: Srovnání ultrastruktury drsného ER u různých variant buněčné linie TR-170 Srovnání reprezentativních obrázků získaných transmisní elektronovou mikroskopií buněk linie TR-170, větší obrázek u každé varianty představuje výřez s viditelným drsným ER a v rohu je zobrazen náhled celé buňky s červeně vyznačenými cisternami ER. U varianty TR-170shScrambled, na kterou bylo působeno tunicamycinem můžeme sledovat výrazné rozšíření ER avšak ostatní varianty vykazují spíše normální fenotyp ER.
Obrázek 15: Srovnání počtu buněk s pozměněnou strukturou ER u buněčné linie TR-170
- 47 -
Obrázek 16: Srovnání ultrastruktury drsného ER u různých variant buněčné linie H134 Srovnání reprezentativních obrázků získaných transmisní elektronovou mikroskopií buněk linie H134, větší obrázek u každé varianty představuje výřez s viditelným drsným ER a v rohu je zobrazen náhled celé buňky s červeně vyznačenými cisternami ER. U variant H134-IRES, H134-IRES/Tun a H134IRES-TUSC3/Tun můžeme pozorovat až extrémně dilatované cisterny ER (H134-IRES/Tun), naopak varianta H134-IRES-TUSC3 s navozenou expresí TUSC3 a bez působení tunicamycinu, obsahuje normální ER.
- 48 -
Obrázek 17: Srovnání počtu buněk s pozměněnou strukturou ER u buněčné linie H134
4.4.
Exprese markerů stresu ER a UPR Pro analýzu exprese markerů stresu ER a UPR byly buňky kultivovány za normálních
podmínek a za různých koncentrací a dob působení inhibitoru N-glykosylace (a induktoru stresu ER) tunicamycinu. K analýze indukce stresu ER byly vybrány následující markery stresu ER: senzorová kináza PERK, molekulární ER chaperon BiP, induktor apoptózy CHOP, protein disulfid izomeráza (PDI) a chaperon Calnexin. Exprese těchto markerů u buněk SKOV3 je zobrazena na Obr. 18. Můžeme sledovat mírně vyšší expresi chaperonu BiP u SKOV3shTUSC3down bez působení tunicamycinu a naopak vyšší expresi BiP u SKOV3shScrambled již po 12 hod působení tunicamycinu. Exprese proteinu CHOP je značně více indukovaná po působení tunicamycinu u varianty se sníženou expresí TUSC3 a naopak proteiny IRE1 a Ero1 vykazují vyšší expresi u kontrolní varianty SKOV3shScrambled oproti SKOV3shTUSC3down. U ostatních markerů stresu ER není patrná výrazná změna exprese mezi variantami s nízkou a vysokou expresí TUSC3.
- 49 -
Obrázek 18: Exprese markerů stresu ER u různých variant buněčné linie SKOV3
Exprese markerů stresu ER u buněčné linie TR-170 je víceméně podobná expresi těchto markerů u buněčné linie SKOV3 (Obr. 19). Opět vidíme dřívější nárůst exprese proteinu CHOP u varianty se sníženou expresí TUSC3 oproti kontrole a chaperon BiP je naopak více exprimován u kontrolní varianty TR-170shScrambled. Kináza PERK, která patří mezi regulátory proteinu CHOP je více exprimována u TR-170shTUSC3down a to i bez indukce tunicamycinem a během působení tunicamycinu už se její exprese výrazně nemění. Proteiny Ero1, Calnexin a PDI vykazují mírně vyšší expresi u varianty TR170shTUSC3down.
Obrázek 19: Exprese markerů stresu ER u různých variant buněčné linie TR-170
- 50 -
U buněčné linie H134 nebyly pozorovány výraznější změny exprese markerů stresu ER kromě mírného zvýšení exprese PDI a CHOP u H134-IRES-TUSC3. Exprese jednotlivých markerů u H134 je zobrazena na Obr. 20.
Obrázek 20: Exprese markerů stresu ER u různých variant buněčné linie H134
4.5.
Exprese markerů EMT Klíčovým krokem pro zahájení epiteliálně-mezenchymální tranzice je snížení exprese
adhezivních molekul tvořících mezibuněčné spoje, z nichž nejvýznamnější je E-cadherin a mezi další patří např. protein zonula occludens 1 (ZO-1). Mezi další markery EMT patří zejména transkripční represory E-cadherinu Slug a ZEB, dále Vimentin typický pro mezenchymální buňky a β-catenin účastnící se tvorby adhezivních spojů. U buněčné linie SKOV3 můžeme sledovat výrazné snížení exprese E-cadherinu a ZO-1 u varianty s nízkou expresí TUSC3 a naopak vyšší expresi transkripčního faktoru ZEB a po indukci pomocí tunicamycinu také Slug (Obr. 21). Poněkud nižší expresi u SKOV3shTUSC3down vykazuje také β-catenin.
- 51 -
Obrázek 21: Exprese markerů EMT u různých variant buněčné linie SKOV3
Buněčná linie TR-170 také vykazuje nižší expresi E-cadherinu, ZO-1 a β-cateninu ve variantě se sníženou expresí TUSC3 oproti kontrolní variantě (Obr. 22). Exprese transkripčního faktoru Slug je u TR-170shTUSC3down vyšší než u TR-170shScrambled a exprese Vimentinu se zvyšuje při vyšších koncentracích a delší době působení tunicamycinu.
Obrázek 22: Exprese markerů EMT u různých variant buněčné linie TR-170
- 52 -
Obrázek 23: Exprese markerů EMT u různých variant buněčného linie H134
Poslední studovanou linií byla nádorová buněčná linie H134, která sice nevykazovala změnu v expresi E-cadherinu ani β-cateninu, ale poměrně významná je snížená exprese ZO-1 naopak zvýšená exprese ZEB a Vimentinu u H134-IRES oproti H134-IRES-TUSC3 (Obr. 23).
- 53 -
5. Diskuse Ovariální karcinomy patří mezi velmi agresivní nádorová onemocnění se špatnou prognózou a krátkou dobou přežití. Problémem je zejména pozdní doba diagnózy a přirozená nebo získaná rezistence k chemoterapiím. Lepší porozumění molekulární patogeneze ovariálního karcinomu může významně přispět k identifikaci vhodných biomarkerů pro včasnou detekci a zavedení nových léčebných postupů. Jednou z častých genetických změn u ovariálního karcinomu je ztráta chromozomální oblasti 8p22, která bývá často deletována i u mnoha jiných nádorů. Pomocí delečního mapování byl identifikován potenciální tumor supresorový gen nacházející se v této oblasti TUSC3. Nedávno bylo také zjištěno, že epigentické umlčení tohoto potenciálního nádorového supresoru vede ke kratšímu přežití a negativní prognóze pacientek a snížená exprese zároveň zvyšuje proliferaci a migraci buněk in vitro (Pils a kol., 2013). Přestože byla prokázána role TUSC3 v rozvoji ovariálního karcinomu, jeho přímé tumor supresorové působení na rozvoj ovariálního karcinomu na úrovni in vivo dosud prokázáno nebylo. V této práci byl stanoven dopad snížení exprese TUSC3 na kancerogenezi in vivo pomocí modelu imunosuprimovaných myší, kterým byly indukovány nádory z lidských ovariálních nádorových buněk s rozdílnou expresí TUSC3. Jelikož nádory indukované z buněk s nižší expresí TUSC3 vykazovaly u tří rozdílných ovariálních nádorových linií výrazně rychlejší a masivnější nárůst nádorové tkáně ve srovnání s nádory indukovanými z buněk s vyšší expresí TUSC3, lze na základě těchto výsledků potvrdit tumor supresorové působení TUSC3 u ovariálního karcinomu in vivo. Molekulární funkce TUSC3 byla donedávna určena pouze na základě jeho sekvenční homologie s podjednotkou Ost3p kvasinkového oligosacharyltransferázového (OST) komplexu, který hraje klíčovou roli v N-glykosylaci proteinů v endoplazmatickém retikulu. Později byla potvrzena lokalizace TUSC3 v endoplazmatickém retikulu jako součást lidského OST komplexu a byly pozorovány také změny v glykosylačním vzorci při změně exprese TUSC3 (Vaňhara a kol., 2013). Strukturní a kinetické studie naznačují možnou funkci TUSC3 v regulaci substrátové specifity OST komplexu a zvýšení efektivity glykosylace zpomalením průchodu proteinu OST (Mohorko a kol., 2014). Vaňhara a kol. (2013) ale pozorovali naopak snížení efektivity glykosylace u ovariálních nádorových buněk. Dále byla potvrzena také funkce TUSC3 jako Mg2+ transportéru a jeho role v embryonálním vývoji obratlovců (Zhou a kol., 2009).
- 54 -
N-Glykosylace zodpovídá za posttranslační modifikace proteinů, za jejich správné sbalení a významně se podílí také na jejich funkci. Pozměněné glykosylační vzorce glykoproteinů lze najít téměř ve všech nádorových onemocněních a poruchy glykosylace mohou vést k nadměrné akumulaci nesbalených nebo špatně sbalených proteinů v endoplazmatickém retikulu a tím způsobovat stres endoplazmatického retikula a následnou odpověď v podobě UPR. UPR je souhra signálních drah vedoucích k vyrovnání se s vyvolaným stresem a u nádorových buněk podporuje jejich adaptaci a přežití v nepříznivých podmínkách tkáňového mikroprostředí, jako je oxidativní stres nebo nedostatek živin. Avšak při přetrvávajícím nebo příliš silném stresu ER se signalizace UPR přepne z adaptivní na proapoptickou. Ve své diplomové práci jsem studovala ultrastrukturní změny endoplazmatického retikula vzniklé díky snížené expresi TUSC3. Dvě ze tří studovaných buněčných linií (SKOV3 a H134) vykazovaly u buněk se sníženou expresí TUSC3 nebo u buněk, na které bylo působeno inhibitorem glykosylace tunicamycinem, značně dilatované cisterny drsného endoplazmatického retikula svědčící o narušení jeho funkce a indukci stresu ER. U jedné buněčné linie (TR-170) však došlo k opačnému jevu, kdy snížená exprese TUSC3 po působení tunicamycinu zabránila dilataci cisteren. Při hodnocení exprese markerů stresu ER a UPR však bylo zjištěno, že i u této buněčné linie dochází ke stresu ER a ke spuštění UPR, přičemž nejvíce byly exprimovány markery proapoptické dráhy PERK/CHOP a naopak adaptivní signalizace přes BiP byla po indukci tunicamycinem silnější u variant s vyšší expresí TUSC3. Toto zjištění je poněkud překvapivé, vzhledem k tomu, že BiP je důležitý pro buněčnou proliferaci a únik před apoptózou a naopak CHOP funguje jako spouštěč apoptózy, což pro nádorové buňky většinou není výhodné. U buněčné linie H134 nebyly nalezeny žádné významné změny exprese markerů stresu ER nebo UPR mezi variantami s rozdílnou expresí TUSC3, přestože ultrastrukturní analýza odhalila silný vliv TUSC3 na homeostázu endoplazmatického retikula i u této linie. Tvorba metastáz je jedním ze základních znaků malignity nádorových onemocnění a zejména u ovariálního karcinomu významně přispívá k vysoké úmrtnosti na toto onemocnění. Nezbytným krokem pro vytvoření metastáz je schopnost buněk opustit své původní tkáňové prostředí a proto musí dojít k jevu zvanému epiteliálně-mezenchymální tranzice neboli EMT, při kterém buňka ztratí schopnost adheze a zvýší se její pohyblivost. Zhong a kol. (2011) popsali indukci EMT po vyvolání stresu ER u alveolárních epiteliálních buněk. Oproti tomu Zeindl-Eberhart a kol. (2014) popsali opačný proces u kolorektálního karcinomu, kdy vyvolání EMT indukuje stres ER a dráhu UPR. Oba tyto procesy jsou mezi sebou zřejmě - 55 -
velmi úzce propojeny a vzhledem k jejich fundamentální roli na vývoji nádorů by odhalení konkrétního mechanismu interakce těchto procesů mohlo vést k možnému vylepšení protinádorových cílených terapií. Dalším mým cílem tedy bylo stanovit, zda snížená exprese TUSC3 přispívá k indukci epiteliálně-mezenchymální tranzice. Indukci EMT jsem u buněčných linií ovariálního karcinomu stanovovala pomocí určení exprese některých nejdůležitějších markerů EMT, jako je E-cadherin, ZO-1 nebo Slug. U buněčných linií SKOV3 a TR-170 došlo při snížení exprese TUSC3 zároveň k výraznému snížení E-cadherinu a ZO-1 a naopak ke zvýšené expresi transkripčních faktorů suprimujících E-cadherin a aktivující mezenchymální fenotyp buněk. Linie H134 s nízkou expresí TUSC3 sice nevykazovala sníženou expresi E-cadherinu, ale některé další důležité markery (ZO-1, Vimentin, ZEB) potvrdily zvýšenou pohyblivost a sníženou adhezivitu. Lze tedy předpokládat, že snížení exprese TUSC3 vede u ovariálních nádorových buněk ke spuštění procesu EMT, ať už v důsledku aberantní glykosylace Ecadherinu případně jiných molekul nebo jako důsledek stresu ER a spuštěné UPR. EMT se kromě indukce metastatického potenciálu u kancerogeneze také výraně podílí na rezistenci k chemoterapiím (Zeingl-Eberhart a kol., 2014), angiogenezi (Collino a kol., 2009) a Chen a kol. (2013) nedávno popsali také asociaci mezi získáním vlastností EMT a vznikem nádorových kmenových buněk. V této práci můžu na úrovni morfologické i molekulární prokázat, že snížená hladina TUSC3 přispívá k
indukci stresu endoplazmatického
retikula
a UPR,
reguluje
epiteliálně-mezenchymální tranzici ovariálních nádorových buněk in vitro a zvyšuje tumorigenní potenciál u myších modelů in vivo.
- 56 -
6. Shrnutí TUSC3 byl identifikován jako potenciální nádorový supresor u prostatického a ovariálního karcinomu a jeho ztráta nebo epigenetické umlčení exprese byla nalezena u mnoha typů nádorů a byla spojena s horší prognózou a intenzivnější proliferací nádorových buněk. Jeho funkce byla stanovena na základě sekvenční homologie s podjednotkou oligosacharyltransferázového komplexu, který se podílí na dokončení N-glykosylace proteinů v endoplazmatickém retikulu. Bylo prokázáno, že TUSC3 je lokalizován v ER jako podjednotka OST a podílí se na efektivitě N-glykosylace proteinů. Změny glykosylačního vzorce proteinů v důsledku ztráty TUSC3 může vést k indukci stresu ER a následnému spuštění odpovědi nesbalených proteinů UPR. Pomocí transmisní elektronové mikroskopie bylo zjištěno narušení struktury ER u buněk s experimentálně sníženou expresí TUSC3. Vyšší výskyt dilatovaných cisteren drsného ER koreluje s předpokladem indukce stresu ER. Westernovým přenosem byla zhodnocena exprese markerů stresu ER a UPR a kromě linie H134, byla u variant s nižší expresí TUSC3 sledována vyšší exprese proapoptických molekul (PERK/CHOP) a nižší exprese adaptivních markerů UPR (BiP, IRE1) ve srovnání s variantami s vyšší expresí TUSC3. U ovariálních nádorových linií s nízkou expresí TUSC3 byla prokázána snížená exprese adhezivních molekul E-cadherinu a ZO-1 a naopak zvýšená exprese transkripčních represorů Slug a ZEB. Tím byla dosvědčena indukce EMT, což je proces podílející se na invazivitě nádoru, angiogenezi a rezistenci k chemoterapiím. Dále byla prokázána pozitivní korelace mezi nízkou expresí TUSC3 a tumorigenezí na
in
vivo
modelu
indukcí
nádorů
z
lidských
buněčných
nádorových
linií
imunosuprimovaným myším kmene NGS. Na základě výsledků této práce lze potvrdit tumor supresorové působení TUSC3 in vivo a jeho úlohu v zajišťování buněčné adheze a homeostázy ER.
- 57 -
7. Summary TUSC3 was identified as a potential tumor suppressor candidate in prostate and ovarian cancer and its loss or epigenetic silencing was found in many types of cancer and correlated with poor prognosis and increased cancer cell proliferation. TUSC3 function was determined from sequential homology with a subunit of oligosaccharyltransferase complex which participates in protein N-glycosylation effectivity. Glycosylation pattern changes due to loss of TUSC3 can result in induction of ER stress and consequent initiation of unfolded UPR protein response. Disturbance of ER structure in cells with experimentally downregulated TUSC3 expression was discovered using transmission electron microscopy. Higher occurence of dilated ER cisternae correlates with a prediction of ER stress induction. ER stress and UPR markers' expression was assessed by western bloting. Increased proaptotic markers' expression (PERK/CHOP) together with decreased adaptive markers' expression (BiP, IRE1) was observed in cells with downregulated TUSC3 excluding H134 cell line. Downregulated TUSC3 in ovarian cancer cell lines correlated with decreased expression of adhesion molecules such as E-cadherin and ZO-1 and conversely with increased expression of transcription repressors such as Slug and ZEB. These data proved induction of EMT, a process involved in cancer invasiveness, angiogenesis and resistence to chemotherapy. Additionally, positive correlation between low TUSC3 expression and increased tumorigenesis in vivo was proved in tumor induction in mice strain NGS with human cancer cell lines. On the basis of these results, tumor suppressor action of TUSC3 in vivo and its function in cell adhesion and ER homeostasis can be proved.
- 58 -
8. Seznam použitých zkratek ATF4/6
activating transcription factor
BiP/Grp78
binding immunoglobulin protein (glucose-regulated protein)
BRAF
B-Raf; v-Raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1
BRCA1/2
breast cancer 1
CGH
comparative genome hybridization (komparativní genomová hybridizace)
CHOP
C/EBP homology protein
EGFR
epidermal growth factor (epidermální růstový faktor)
EMT
epiteliálně-mezenchymální tranzice
ER
endoplazmatické retikulum
Ero1
ER oxidoreductin
FGF4
fibroblast growth factor 4
FIGO
International Federation of Gynecology and Obstetrics
GOG
Gynecologic Onology Group
IGF
insulin-like growth factor
IRE1
iron-response element
LOH
loss of heterozygozity (ztráta heterozygotnosti)
KRAS
Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog
MET
mezenchymal-epithelial transition
OST
oligosacharyltransferáza
PBS
phosphate buffer saline
PDI
protein disulfid izomeráza
PERK
Pancreatic eIF2-alpha kinase
PIK3Ca
phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase
PTEN
phosphatase and tensin homolog
TBS
Triss-buffered saline
TGFβ
transforming growth factor β
TUSC3
tumor suppressor candidate 3
UPR
unfolded protein response (odpověď nesbalených proteinů)
WHO
world health organization
XNP
x-box binding protein
ZEB/TCF8
zinc-finger e-box binding protein
ZO-1
zonula occludens 1
- 59 -
9. Literatura Bast Jr RC, Hennessy B, Mills GB. 2009. The biology of ovarian cancer: new opportunities for translation. Nat Rev Cancer; 9(6): 415–428. Bell DA. 2005. Origins and molecular pathology of ovarian cancer. Mod Pathol; 18: 19–32. Bova SG, Carter BS, Bussemakers MJG, Emi M, Fujiwara Y, Kyprianou N, Jacobs SC, Robinson JC, Epstein JI, Walsh PC, Isaacs WB. 1993. Homozygous Deletion and Frequent Allelic Loss of Chromosome 8p22 Loci in Human Prostate Cancer. Cancer Res; 53: 38693873 Bova SG, MacGrogan D, Levy A, Pin LS, Bookstein R, Isaacs WB. 1996. Physical Mapping of Chromosome 8p22 Markers and Their Homozygous Deletion in a Metastatic Prostate Cancer. Genomics. 35: 46-54 Brosh R, Rotter V. 2009. When mutants gain new powers: news from the mutant p53 field. Nat Rev Cancer; 9(10): 701–713 Campbell IG, Russell SE, Choong DY, Montgomery KG, Ciavarella ML, Hooi CS, Cristiano BE, Pearson RB, Philips WA. 2004. Mutation of the PIK3CA gene in ovarian and breast cancer. Cancer Res;64 (21): 7678–81. Cianfrocca R, Tocci P, Spinella f, Di Castro V, Bagnato A, Rosanó L. 2012. The endothelin A receptor and epidermal growth factor receptor signaling converge on β-catenin to promote ovarian cancer metastasis. Life Sci; 91: 550-556 Chen X, Zhang J, Zhang Z, Li H, Cheng W, Liu J. 2013. Cancer stem cells, epithelialmesenchymal transition, and drug resistance in high-grade ovarian serous carcinoma. Human Pathol; 44: 2373–2384 Chen Y, Brandizzi F. 2013. IRE1: ER stress sensor and cell fate executor. Cell Press; 23: 547-555 Chetrit A, Hirsh-Yechezkel G, Ben-David Y, Lubin F, Friedman E, Sadetzki S. 2008. Effect of BRCA1/2 mutations on long-term survival of patients with invasive ovarian cancer: the national Israeli study of ovarian cancer. J Clin Oncol; 26(1): 20–5. Clark SJ, Melki J. 2002. DNA methylation and gene silencing in cancer: which is the guilty party? Oncogene; 21: 5380–5387. Collino F, Revelli A, Massobrio M, Katsaros D, Schmitt-Ney M, Camussi GG, Bussolati B. 2009. Epithelial–mesenchymal transition of ovarian tumor cells induces an angiogenic monocyte cell population. Exp Cell Res; 315: 2982 – 2994 Cooke SL, Pole JCM, Chin S-F, Ellis IO, Caldas C, Edwards PAW. 2008. High-resolution array CGH clarifies events occurring on 8p in carcinogenesis. BMC Cancer, 8: 288-303 Emi, M., Fujiwara, Y, Nakajima. T.. Tshuchiya. E., Tsuda, H., Hirohashi. S.. Maeda, Y. Tsuruta, K.. Miyaki. M., and Nakamura, Y. 1992. Frequent loss of heterozygosity for loci on chromosome 8p in hepatocellular carcinoma, colorectal cancer, and lung cancer. Cancer Res., 52.: 5368-5372. - 60 -
Fairuz M, Jamaluddin B, Bailey U-M, Tan NYJ, Stark AP, Schulz BL. 2011. Polypeptide binding specificities of Saccharomyces cerevisiae oligosaccharyltransferase accessory proteins Ost3p and Ost6p. Protein Sci; 20(5): 849-855. Fasching PA, Gayther S, Pearce L, Schildkraut JM, Goode E, Thiel F, Chenevix-Trench G, Chang-Claude J, Wang-Gohrke S, Ramus S, Pharoah P, Berchuck A. 2009. Role of genetic polymorphisms and ovarian cancer susceptibility. Mol Oncol; 3: 171-181. Gorringe KL, Jacobs S, Thompson ER, Sridhar A, Qiu W, Choong DY, Campbell IG. 2007. High-resolution single nucleotide polymorphism array analysis of epithelial ovarian cancer reveals numerous microdeletions and amplifications. Clin Cancer Res; 13(16): 4731– 4739. Prat J. 2013. Staging classification for cancer of the ovary, fallopian tube, and peritoneum, Int J Gynecol Obstet, http://dx.doi.org/10.1016/j.ijgo.2013.10.001 Garshasbi M, Hadavi V, Habibi H, Kahrizi K, Kariminejad R, Behjati F, Tzschach A, Najmabadi H, Ropers HH, Kuss AW. 2008. A Defect in the TUSC3 Gene Is Associated with Autosomal Recessive Mental Retardation. The American Journal of Human Genetics; 82: 1158–1164 Garshasbi M, Kahrizi K, Hosseini M, Nouri Vahid L, Falah M, Hemmati S, Hu H, Tzschach A, Ropers HH, Najmabadi H, Kuss AW. 2011. A novel nonsense mutation in TUSC3 is responsible for non-syndromic autosomal recessive mental retardation in a consanguineous Iranian family. Am J Med Genet Part A; 155: 1976–1980 Gates M, Rosner BA, Hecht JL, Tworoger SS. 2010. Risk factors for epithelial ovarian cancer by histologic subtype. Am J Epidemiol; 171: 45-53 Gras E, Cortes J, Diez O, Alonso C, Matias-Guiu X, Baiget M, Prat J. 2001. Loss of heterozygosity on chromosome 13q12-q14, BRCA-2 mutations and lack of BRCA-2 promoter hypermethylation in sporadic epithelial ovarian tumors. Cancer; 92: 787–795. Guervós MA, Marcos CA, Hermsen M, Nuño AS, Suárez C, Llorente JL. 2007. Deletions of N33, STK11 and TP53 are involved in the development of lymph node metastasis in larynx and pharynx carcinomas. Cellular Oncology 29: 327-334 Hall J, Paul J, Brown R. 2004. Critical evaluation of p53 as a prognostic marker in ovarian cancer. Exp Rev Mol Med; 12: 1–20 Havrilesky L, Darcy M, haman H, Priore RL, Leon J, Bell J, Berchuck A. 2003. Prognostic significance of p53 mutation and p53 overexpression in advanced epithelial ovarian cancer: a Gynecologic Oncology Group Study. J Clin Oncol; 21: 3814–3825 Hanahan D, Weinberg R. 2011. Hallmarks of Cancer: The Next Generation. Cell; 144 (5): 646-674 Hiss D. 2011. Optimizing molecular-targeted therapies in ovarian cancer: The renewed surge of interest in ovarian cancer biomarkers and cell signaling pathways. J Oncol; 2012; doi:10.1155/2012/737981 Horak P, Tomasich E, Vaňhara P, Kratochvílová K, Anees M, Marhold M, Lemberger CE, Gerschpacher M, Horvat R, Sibília M, Pils D, Krainer M. 2014. TUSC3 Loss Alters - 61 -
the ER Stress Response and Accelerates Prostate Cancer Growth in vivo. Scientific reports. 4: 3739 Jones PA, Baylin SB. 2002. The fundamental role of epigenetic events in cancer. Nat Rev, Genet; 3: 415–428. Khalid AM, Asano A, Hosaka YZ, Takeuchi T, Yamano Y. 2013. Tumor Suppressor Candidate TUSC3 Expression during Rat Testis Maturation. Biosci Biotechnol Biochem; 77: 2019-2024 Kimata Y, Ishiwata-Kimata Y, Tatsuhiko I, Hirata A, Suzuki T, Oikawa D, Takeuchi M, Kohno K. 2010. Two regulatory steps of ER-stress sensor Ire1 involving its cluster formation and interaction. J Cell Biol; 179: 75-86 Kober L, Zehe C, Bode J. 2012. Development of a Novel ER Stress Based Selection System for the Isolation of Highly Productive Clones. Biotechnol Bioeng; 109 (10): 2599-2611 Kratochvílová K. 2011. Rakovina vaječníků: seminární práce. Brno. Masarykova univerzita: Přírodovědecká fakulta Kurman RJ, Shih I-M. 2008. Pathogenesis of ovarian cancer: lessons from morphology and molecular biology and their clinical implications. Int J Gynecol Pathol; 27(2): 151–160. Lane JRL, Mills TM, Shafie NH, Merlot AM, Moussa RS, Kalinowski DS, Kovacevic Z, Richardson DR. 2014. Expanding horizons in iron chelation and the treatment of cancer: Role of iron in the regulation of ER stress and the epithelial–mesenchymal transition. Biochim Biophys Acta; 1845: 166-181 Lassus H, Laitinen MPE, Anttonen M, Heikinheimo M, Aaltonen LA, Ritvow O, Butzow R. 2001. Comparison of Serous and Mucinous Ovarian Carcinomas: Distinct Pattern of Allelic Loss at Distal 8p and Expression of Transcription Factor GATA-4. Lab Invest; 81: 517-26 Lassus H, Sihto H, Leminen A, Joensuu H, Isola J, Nupponen NN, Butzow R. 2006. Gene amplification, mutation and protein expression of EGFR and mutations in ERBB2 in serous ovarian carcinoma. J Mol Med; 84: 671–681. Li Q, Jedlicka A, Ahuja N, Gibbons MC, Baylin SB, Burger PC, Issa J-PJ. 1998. Concordant methylation of the ER and N33 genes in glioblastoma multiforme. Oncogene; 16: 3197-3202 MacGrogan D, Levy A, Bova S, Isaacs WB, Bookstein R. 1996. Structure and MethylationAssociated Silencing of a Gene within a Homozygously Deleted Region of Human Chromosome Band 8p22. Genomics 35: 55–65 Magyar JE, Gamberucci A, Konta L, Margittai É, Mandl J, MJ, Bánhegyi MG, Benedetti A, Csala M. 2009. Endoplasmic reticulum stress underlying the pro-apoptotic effect of epigallocatechin gallate in mouse hepatoma cells. Int J Biochem Cell B; 41 (3): 694-700 Moenner M, Pluquet O, Bouchecareilh M, Chevet E. 2007. Integrated endoplasmic reticulum stress responses in cancer. Cancer res; 67 (22): 10631-10634 - 62 -
Mohorko E, Owen RL, Maloj G, Brozzo MS, Aebi M, Glockshuber R. 2014. Structural Basis of Substrate Specificity of Human Oligosaccharyl Transferase Subunit N33/Tusc3 and Its Role in Regulating Protein N-Glycosylation. Structure, 22 (4): 590-601 Molinari F, Foulquier F, Tarpey PS, Morelle W, Boissel S, Teague J, Edkins S, Futreal PA, Stratton MR, Turner G Matthijs G, Gecz J, Munnich A, Colleaux L. 2008. Oligosaccharyltransferase-Subunit Mutations in Nonsyndromic Mental Retardation. The American Journal of Human Genetics, 82: 1150–1157 Nishitoh H. 2012. CHOP is a multifunctional transcription factor in the ER stress response. J Biochem; 151(3): 217-219 Obata K, Morland SJ, Watson RH, Hitchcock A, Chenevix-Trench G, Thomas EJ, Campbell IG. 1998. Frequent PTEN/MMAC mutations in endometrioid but not serous or mucinous epithelial ovarian tumors. Cancer Res; 58(10): 2095–2097. Pils D, Horak P, Gleiss A, Sax C, Fabjani G, Moebus VJ, Zielinski C, Reinthaller A, Zeillinger R, Krainer M. 2005. Five Genes from Chromosomal Band 8p22 Are Significantly Down-Regulated in Ovarian Carcinoma: N33 and EFA6R Have a Potential Impact on Overall Survival. Cancer; 104: 2417-2429 Pils D., Horak P, Vaňhara P, Anees M, Petz M, Alfanz A, Gugerell A, Wittinger M, Gleiss A, Auner V, Tong D, Zeillinger R, Braicu E-I, Sehouli J, Krainer M. 2013. Methylation status of TUSC3 is a prognostic factor in ovarian cancer. Cancer; 119: 946-954 Poola I, Abraham J, Marshalleck JJ, Yue Q, Fu SW, Viswanath L, Sharma N, Hill R, DeWitty RL, Bonney G. 2009. Molecular constitution of breast but not other reproductive tissues is rich in growth promoting molecules: A possible link to highest incidence of tumor growths. FEBBS Letters, 583: 3069-3075 Rutkowski DT, Kaufman RJ. 2004. A trip to the ER: coping with stress. Trends in Cell Biology; 14: 20-28 Sano R, Reed JC. 2013. ER stress-induced cell death mechanisms. Mol Cell Res; 1833 (12): 3460-3470 Schilder RJ, Sill MW, Chen X, Darcy KM, Decesare SL, Lewandowski G, Lee RB, Arciero CA, Wu H, Godwin AK. 2005. Phase II study of gefitinib in patients with relapsed or persistent ovarian or primary peritoneal carcinoma and evaluation of epidermal growth factor receptor mutations and immunohistochemical expression: a Gynecologic Oncology Group Study. Clin Cancer Res; 11: 5539–5548. Schönthal AH. 2013. Pharmacological targeting of endoplasmic reticulum stress signaling in cancer. Biochem Pharmacol; 85: 653-666 Scully RE. 1987. Classification of Human Ovarian Tumors. Environmental Health Perspectives; 78: 15-24 Shimizu Y, Kamoi S, Amada S, Akiyama F, Silverberg SG. 1998. Toward the development of a universal grading system for ovarian epithelial carcinoma: testing of a proposed system in a series of 461 patients with uniform treatment and follow-up. Cancer; 82: 893–901. - 63 -
Schleicher SM, Moretti L, Varki V, Lu B. 2010. Progress in the unraveling of the endoplasmic reticulum stress/autophagy pathway and cancer: Implications for future therapeutic approaches. Drug Resist Update; 13: 79-86 Siegel R, Ma J, Zou Z, Jemal A. 2014. Cancer Statistics. CA Cancer J Clin; 64: 9-29 Silverberg SG. 2000. Histopathologic grading of ovarian carcinoma: a review and proposal. Int J Gynecol Pathol; 19 :7–15. The cBio Cancer Genomics
Portal
[online]
[cit.
7.
května
2014]
Vaňhara P, Horak P, Pils D, Anees M, Petz M, Gregor W, Zeillinger R, Krainer M. 2013. Loss of the oligosaccharyl transferase subunit TUSC3 promotes proliferation and migration of ovarian cancer cells. Int J Oncol; 4: 1383-1389 Wilcox CB, Baysa BE, Gallion HH, Strange MA, DeLoia JA. 2005. High-resolution methylation analysis of the BRCA1 promoter in ovarian tumors. Cancer Genet Cytogenet; 159: 114–122. Wiley A, Katsaros D, Chen H, Rigault de la Longrais IA, Beeghly A, Puopolo M, Singal R, Zhanq Y, Amoako A, Zelterman D, Yu H. 2006. Aberrant promoter methylation of multiple genes in malignant ovarian tumors and in ovarian tumors with low malignant potential. Cancer; 107: 299–308. Yan W, Frank CL, Korth MJ, Sopher BL, Novoa BL, Ron I, Katze MG. 2002. Control of PERK eIF2 kinase activity by the endoplasmic reticulum stress-induced molecular chaperone p58IPK; 99 (25): 2-7 Yap TA, Garrett MD, Walton MI, Raynaud F, de Bono JS, Workman P. 2008. Targeting the PI3K–AKT–mTOR pathway: progress, pitfalls, and promises. Curr Opin Pharmacol; 8: 393–412. Zeindl-Eberhart E, Brandl L, Liebmann S, Ormanns S, Scheel SK, Brabletz T, Kirchner T, Jung A. 2014. Epithelial-mesenchymal transition induces endoplasmic reticulum stress response in human colorectal tumor cells. PLoS ONE 9(1): e87386. doi:10.1371/journal.pone.0087386 Zheng Y-Z, Cao Z-G, Hu X, Shao Z-M. 2014. The endoplasmic reticulum stress markers GRP78 and CHOP predict disease-free survival and responsiveness to chemotherapy in breast cancer Zhong Q, Zhou B, Ann DK, Minoo P, Liu Y, Banfalvi A, Krishnaveni MS, Dubourd M, Demaiol L, Willis BC, Kim K-J, duBois RM, Crandall eD, Beers MF, Borok Z. 2011. Role of endoplasmic reticulum stress in epithelial–mesenchymal transition of alveolar epithelial cells effects of misfolded surfactant protein. Am J Respir Cell Mol Biol; 45(3):498509 Zhou H, Clapham DE, 2009. Mammalian MagT1 and TUSC3 are required for cellular magnesium uptake and vertebrate embryonic development. PNAS; 106: 15750-15755
- 64 -
