MASARYKOVA UNIVERZITA ´ FAKULTA ˇ IRODOV ´ ˇ PR EDECK A STUDIJNI´ PROGRAM: BIOLOGIE
˚ SPECIFICKYCH ´ STUDIUM EXPRESE GENU ´ PRO BRAF MUTANTNI´ NADORY ˇ RUZN ˇ ASTMI ´ ˇ I´C ˚ ´ KOLOREKTA NAPR YMI C ˇ ´ ˇ ´ ˇU ˚ TLUSTEHO STREVA U CASN YCH STUPN ´ VYVOJE KARCINOMU
Barbora Han´akov´a Bakal´aˇrsk´a pr´ace
Vedouc´ı: Mgr. Eva Budinsk´a, Ph.D.
Brno
2012
Bibliografick´y z´aznam
Autor:
Han´akov´a Barbora Pˇr´ırodovˇedeck´a fakulta, Masarykova univerzita Institut biostatistiky a anal´yz Centrum pro v´yzkum toxick´ych l´atek v prostˇred´ı
N´azev pr´ace:
Studium exprese gen˚u specifick´ych pro BRAF mutantn´ı n´adory kolorekta napˇr´ıcˇ r˚uzn´ymi cˇ a´ stmi tlust´eho stˇreva u cˇ asn´ych stupˇnu˚ v´yvoje karcinomu.
Studijn´ı program:
Biologie
Studijn´ı obor:
Matematick´a biologie
Vedouc´ı pr´ace:
Mgr. Eva Budinsk´a, Ph.D.
Rok obhajoby:
2012
Poˇcet stran:
IX + 42
Kl´ıcˇ ov´a slova:
BRAF mutace, kolorekt´aln´ı karcinom, mnohon´asobn´y klasifik´ator top-sk´oruj´ıc´ıch p´ar˚u, genov´a signatura, genov´a exprese
Bibliographic entry
Author:
Han´akov´a Barbora Faculty of Science, Masaryk University Institute of Biostatistics and Analyses Research Centre for Toxic Compounds in the Environment
Title of thesis:
Study of expression of genes specific for BRAF mutated colon tumours across different parts of colon in early phases of tumor development.
Degree programme: Biology
Field of study:
Mathematical Biology
Supervisor:
Mgr. Eva Budinsk´a, Ph.D.
Year of defence:
2012
Number of Pages:
IX + 42
Key words:
BRAF mutation, colorectal cancer, multiple top-scoring pairs, gene signature, gene expression
Abstrakt Velk´ym probl´emem posledn´ı doby je kolorekt´aln´ı karcinom, na jehoˇz v´yzkum se vˇedci zamˇeˇruj´ı. Studium na molekul´arn´ı u´ rovni n´am m˚uzˇ e pomoci pochopit procesy prob´ıhaj´ıc´ı v buˇnk´ach n´adoru a k odhalen´ı heterogenity n´adoru, kter´a se nemus´ı projevit na histologick´e u´ rovni. Je zn´amo, zˇ e mutace protoonkogenu BRAF, d˚uleˇzit´eho cˇ lena MAPK/ERK sign´aln´ı dr´ahy reguluj´ıc´ı r˚ust a proliferaci bunˇek, se objevuje u n´ador˚u, kter´e jeˇstˇe nejsou agresivn´ı, cˇ ili nemetastazuj´ı. Konkr´etnˇe mutace V600E, kdy je valin na pozici 600 aminokyseliny zamˇenˇen za kyselinu glutamovou, vede ke st´al´e aktivaci BRAF proteinu a ten pak nereaguje na fyziologickou regulaci a ve vˇetˇsinˇe pˇr´ıpad˚u ani na l´ecˇ bu inhibitory EGFR. Pacienti s touto mutac´ı maj´ı horˇs´ı progn´ozu a vˇcasn´e odhalen´ı n´adoru s touto mutac´ı m˚uzˇ e zv´ysˇit dobu jejich pˇreˇzit´ı. A pr´avˇe studium zmˇen v expresi gen˚u u cˇ asn´ych st´adi´ı v´yvinu n´adoru by n´am mohlo pomoct pochopit pˇr´ıcˇ iny molekul´arn´ıch zmˇen vedouc´ıch k agresivitˇe n´adoru. C´ılem t´eto pr´ace je na dostupn´ych datov´ych souborech prostudovat dynamiku zmˇen v expresi gen˚u typick´ych pro BRAF mutantn´ı n´adory tlust´eho stˇreva v r˚uzn´ych st´adi´ıch v´yvoje n´adoru a stanovit, ve kter´em obdob´ı v´yvoje n´adoru a v kter´e cˇ a´ sti stˇreva doch´az´ı ke zmˇen´am exprese. Data, z´ıskan´a z veˇrejnˇe dostupn´ych datab´az´ı, obsahovala 303 pacient˚u, kter´ym byl odebr´an vzorek bud’ norm´aln´ı tk´anˇe, adenomu nebo karcinomu. V prvn´ı f´azi anal´yzy klasifik´ator jsem zaˇradila 7,9% pacient˚u do tˇr´ıdy s fenotypem BRAF-like. D´ale jsem definovala geny, kter´e by mohly b´yt specifick´e pro poˇca´ teˇcn´ı st´adia v´yvoje n´adoru. A v neposledn´ı ˇradˇe jsem pouˇzila testov´an´ı hypot´ez ke zjiˇstˇen´ı, zda existuje rozd´ıl v genov´e expresi mezi norm´aln´ı tk´an´ı, adenomem a karcinomem.
Kl´ıcˇ ov´a slova BRAF mutace, BRAF V600E, kolorekt´aln´ı karcinom, mnohon´asobn´y klasifik´ator topsk´oruj´ıc´ıch p´ar˚u, genov´a signatura, genov´a exprese
Abstract A big problem in recent years has been colorectal carcinoma and many scientists have focused on its research. Studies at a molecular level may help us understand the processes that are taking place in tumour cells. Also it may help us with the detection of heterogeneity in tumours, which may not occur at a histological level. As we know, the mutation of protooncogene BRAF appears in tumours that are not yet aggressive, which means that the cancer cells do not metastatize at that time. The protooncogene is an important part of the MAPK/ERK pathway, which regulates the growth and proliferation of cells. The mutation V600E in particular, where valin is in the position of 600 amino acid substituted by glutamic acid, leads to the permanent activation of the BRAF protein in the pathway. The cell does not respond to physiological regulation and in most cases neither to treatment by inhibitors of EGFR. Patients with this mutation have the worst overall survival rate and early detection of tumors with this mutation may increase their chances. The study of changes in gene expression in the early phases of tumour development can help us understand the causes of molecular changes that lead to aggressive tumours. The aim of this bachelor thesis is to demonstrate the dynamics of changes in the expression of genes that are typical for BRAF mutation in colorectal carcinomas. I will focus on the available datasets in the different phases of tumour development. After that, I will specify in which period of tumour development and in which part of the intestine the expression has been changed. Datasets that were obtained from the available database contained 303 patients from whom was taken a sample of normal tissue, adenom or carcinoma. Firstly in my analysis,I classified 7.9% of patients with the BRAF-like phenotype. Then, I defined genes that might be specific to the early phases of tumour development. Lastly, I used hypothesis testing to find if there are differences between normal tissue, adenoma and carcinoma in gene expression.
Key words BRAF mutation, BRAF V600E, colorectal cancer, multiple top-scoring pairs, gene signature, gene expression
Prohl´asˇen´ı Prohlaˇsuji, zˇ e jsem tuto bakal´arˇskou pr´aci vypracovala samostatnˇe a vˇsechny pouˇzit´e zdroje jsou citovan´e v seznamu pouˇzit´e literatury a seznamu internetov´ych zdroj˚u. Datum: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Podpis: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Podˇekov´an´ı Na tomto m´ıstˇe bych chtˇela podˇekovat vedouc´ı sv´e bakal´aˇrsk´e pr´ace Mgr. Evˇe Budinsk´e, Ph.D. za odborn´e veden´ı, rady a konzultace, kter´e mi poskytla v pr˚ubˇehu vypracov´an´ı m´e bakal´aˇrsk´e pr´ace. R´ada bych tak´e podˇekovala sv´e rodinˇe za podporu a umoˇznˇen´ı studia na vysok´e sˇkole.
Institut biostatistiky a analýz Lékařské a Přírodovědecké fakulty Masarykovy univerzity spolupracuje na organizačním zajištění výuky studijního oboru Matematická biologie s Centrem pro výzkum toxických látek v prostředí Přírodovědecké fakulty MU.
Obsah Seznam obr´azku˚
2
Seznam tabulek
3
´ Uvod
4
1
Kolorekt´aln´ı karcinom 1.1 Diagnostika . . . . . . . . . . . . . . 1.2 L´ecˇ ba . . . . . . . . . . . . . . . . . 1.2.1 Biologick´a l´ecˇ ba . . . . . . . 1.3 Molekul´arn´ı determinanty . . . . . . 1.3.1 MSI . . . . . . . . . . . . . . 1.3.2 p53 . . . . . . . . . . . . . . 1.3.3 MAPK/ERK sign´aln´ı kask´ada 1.3.4 KRAS . . . . . . . . . . . . . 1.3.5 BRAF . . . . . . . . . . . . .
. . . . . . . . .
5 6 6 7 7 7 8 8 10 10
2
Datov´e soubory a pouˇzit´e metody 2.1 Robustn´ı v´ıcerozmˇern´y pr˚umˇer (RMA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2 Mnohon´asobn´y klasifik´ator top-sk´oruj´ıc´ıch p´ar˚u (mTSP) . . . . . . . . . . 2.3 Testov´an´ı hypot´ez a korekce mnohon´asobn´eho porovn´av´an´ı . . . . . . . . .
12 12 13 14
3
V´ysledky 3.1 Klasifikace BRAF mutant˚u . . . . . . . . . . . . . . 3.2 Lev´a vs. prav´a strana stˇreva . . . . . . . . . . . . . . 3.3 Pilovit´y adenom vs. nepilovit´e adenomy a karcinomy 3.4 Testov´an´ı sk´ore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
15 15 18 25 27
. . . . . . . . .
. . . . . . . . .
. . . . . . . . .
. . . . . . . . .
. . . . . . . . .
. . . . . . . . .
. . . . . . . . .
. . . . . . . . .
. . . . . . . . .
. . . .
. . . . . . . . .
. . . .
. . . . . . . . .
. . . .
. . . . . . . . .
. . . .
. . . . . . . . .
. . . .
. . . . . . . . .
. . . .
. . . . . . . . .
. . . .
. . . . . . . . .
. . . .
. . . . . . . . .
. . . .
. . . . . . . . .
. . . .
. . . . . . . . .
. . . .
. . . .
4
Biologicko - medic´ınsk´a interpretace v´ysledku˚
30
5
Diskuse
32
Z´avˇer
33
Slovn´ık z´akladn´ıch pojmu˚
35
Seznam zkratek
36
Seznam pouˇzit´e literatury
37
A Geny pouˇzit´e ke klasifikaci
40
Seznam obr´azku˚ 1 2 3 4 5 6 7 8 9
ˇ e Republice Incidence a mortalita v Cesk´ (www.svod.cz) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Z´akladn´ı sch´ema MAPK/ERK sign´aln´ı kask´ady (www.nature.com) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Graf ukazuj´ıc´ı rozd´ıly pˇreˇzit´ı u pacient˚u ve III. st´adiu rakoviny (Popovici et al., 2012) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Prouˇzkov´e grafy pro p´ary gen˚u u norm´aln´ı tk´anˇe, adenom˚u a karcinom˚u Prouˇzkov´e grafy pro p´ary gen˚u u norm´aln´ı tk´anˇe, adenom˚u a karcinom˚u Prouˇzkov´y graf pro p´ary gen˚u u pilovit´ych a nepilovit´ych polyp˚u . . . . Prouˇzkov´y graf pro p´ary gen˚u u pilovit´ych a nepilovit´ych polyp˚u . . . . Histogramy zn´azorˇnuj´ıc´ı rozloˇzen´ı sk´ore pro jednotliv´e populace . . . . Boxplot porovn´an´ı sk´ore pro jednotliv´e populace . . . . . . . . . . . .
. .
5
. .
9
. . . . . . .
. . . . . . .
11 17 21 25 26 28 29
Seznam tabulek 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Popisn´a statistika . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32 p´ar˚u gen˚u pro identifikaci BRAF mutant˚u . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Procento p´ar˚u gen˚u u jednotliv´ych typ˚u tk´an´ı splˇnuj´ıc´ıch pravidlo G1 < G2 . . . . Poˇcet pacient˚u v jednotliv´ych kategori´ıch . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Procento p´ar˚u gen˚u u jednotliv´ych typ˚u tk´an´ı z lev´e strany stˇreva splˇnuj´ıc´ıch pravidlo G1 < G2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Procento p´ar˚u gen˚u u jednotliv´ych typ˚u tk´an´ı z prav´e strany stˇreva splˇnuj´ıc´ıch pravidlo G1 < G2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Procento p´ar˚u gen˚u u norm´aln´ı tk´anˇe splˇnuj´ıc´ıch pravidlo G1 < G2 s ohledem na m´ısto v´yskytu (ˇrazeno dle p-hodnoty). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Procento p´ar˚u gen˚u u adenom˚u splˇnuj´ıc´ıch pravidlo G1 < G2 s ohledem na m´ısto v´yskytu (ˇrazeno dle p-hodnoty). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Procento p´ar˚u gen˚u u karcinom˚u splˇnuj´ıc´ıch pravidlo G1 < G2 s ohledem na m´ısto v´yskytu (ˇrazeno dle p-hodnoty). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Procento p´ar˚u gen˚u u pilovit´ych adenom˚u a karcinom˚u splˇnuj´ıc´ıch pravidlo G1 < G2. Tabulka 64 gen˚u klasifikuj´ıc´ıch BRAF mutaci, jejich Entrez GeneID, anglick´y n´azev a lokaci. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
12 14 16 18 19 20 22 23 24 27 42
´ Uvod Rakovina, v dneˇsn´ı dobˇe jedno z nejˇcastˇejˇs´ıch onemocnˇen´ı, vede mezi pˇr´ıcˇ inami u´ mrt´ı lid´ı na cel´em svˇetˇe. V´yskyt t´eto nemoci se kaˇzd´ym rokem zvyˇsuje. Dle statistiky Svˇetov´e zdravotnick´e organizace je kaˇzd´y rok diagnostikov´ano 12,7 mili´on˚u lid´ı a aˇz 7,6 milion˚u jich na rakovinu zemˇre. I pˇres velk´e pokroky ve v´yzkumu a l´ecˇ bˇe z˚ust´av´a jedn´ım z nejv´azˇ nˇejˇs´ıch ˇ probl´em˚u. Casn´ a diagn´oza a l´ecˇ ba zvyˇsuj´ı progn´ozu pˇreˇzit´ı a proto je d˚uleˇzit´e vyv´ıjet st´ale nov´e diagnostick´e metody a l´ecˇ ebn´e postupy, kter´e pom´ahaj´ı lidem v boji proti t´eto z´akeˇrn´e nemoci. Jak jiˇz n´azev t´eto pr´ace napov´ıd´a, zamˇeˇrila jsem se na studium mutace BRAF v kolorekt´aln´ım karcinomu, nebot’ pr´avˇe pacienti s touto mutac´ı maj´ı horˇs´ı progn´ozu pˇreˇzit´ı. Ta je zp˚usobena nejen t´ım, zˇ e n´adory kolorekta se mohou vyv´ıjet dlouho skrytˇe a projevit se aˇz v pokroˇcil´em st´adiu, ale tak´e t´ım, zˇ e n´adory s BRAF mutac´ı maj´ı sˇpatnou odezvu na l´ecˇ bu. Odhalen´ı n´adoru v rann´ych st´adi´ıch m˚uzˇ e zv´ysˇit sˇance na pˇreˇzit´ı pacient˚u. C´ılem m´e bakal´aˇrsk´e pr´ace tedy bylo na veˇrejnˇe dostupn´ych datov´ych souborech prostudovat dynamiku zmˇen v expresi gen˚u, kter´e byly stanoven´e jako dostaˇcuj´ıc´ı pro klasifikaci BRAF mutace v n´adorech tlust´eho stˇreva, v poˇca´ teˇcn´ıch st´adi´ıch v´yvoje n´adoru. D´ale jsem zkoumala, ve kter´em obdob´ı v´yvoje a v kter´e cˇ a´ sti stˇreva doch´az´ı ke zmˇen´am exprese. Tyto informace by v budoucnu mohly pomoci pochopit procesy, kter´e prob´ıhaj´ı v buˇnk´ach a pˇr´ıcˇ iny molekul´arn´ıch zmˇen vedouc´ıch k agresivitˇe n´ador˚u. Uveden´ı do problematiky a zd˚uvodnˇen´ı, proˇc je d˚uleˇzit´e se zab´yvat pr´avˇe studiem BRAF mutace v n´adorech tlust´eho stˇreva, je uvedeno v prvn´ı kapitole. Druh´a kapitola se vˇenuje v´ybˇeru vhodn´ych dat pro dalˇs´ı anal´yzy a jejich popisem. V podkapitol´ach jsou pak popsan´e metody, kter´e byly aplikovan´e na data. V´ysledky a jejich interpretace jsou pak uveden´e v ˇ ast´ı t´eto kapitoly je testov´an´ı hypot´ez, zda existuj´ı rozd´ıly v genov´e n´asleduj´ıc´ı kapitole. C´ expresi mezi norm´aln´ı tk´an´ı, adenomem a karcinomem. Ve cˇ tvrt´e kapitole pak interpretuji v´ysledky z biologicko-medic´ınsk´eho hlediska.
4
1
1
´ I´ KARCINOM KOLOREKTALN
Kolorekt´aln´ı karcinom
ˇ e republice Kolorekt´aln´ı karcinom pˇredstavuje druh´y nejvyskytovanˇejˇs´ı n´ador a Cesk´ patˇri prvn´ı m´ısto ve frekvenci v´yskytu tohoto n´adoru na svˇetˇe. Na n´asleduj´ıc´ım grafu (obr. 1) je moˇzn´e pozorovat v´yvoj incidence a mortality rakoviny tlust´eho stˇreva a koneˇcn´ıku v ˇ e republice v jednotliv´ych letech. Cesk´
ˇ e Republice (URL 1) Obr´azek 1: Incidence a mortalita v Cesk´
Tlust´e stˇrevo (intestinum crassum) je souˇca´ st´ı tr´avic´ıho u´ stroj´ı cˇ lovˇeka. Tlust´e stˇrevo o d´elce asi 1,5 metru a sˇ´ıˇrce 5-7 centimetru se skl´ad´a z pˇeti odd´ıl˚u. Zaˇc´ın´a jako slep´e stˇrevo (interstinum caecum), jehoˇz slep´ym v´ybˇezˇ kem je apendix, pokraˇcuje traˇcn´ıkem vzestupn´ym (colon ascendens), pˇr´ıcˇ n´ym (colon transversum) a sestupn´ym (colon descendens). Koneˇcn´ym odd´ılem je koneˇcn´ık (intestinum rectum). Tlust´e stˇrevo se pln´ı 4-8 hodin po poˇzit´ı potravy a neprodukuje zˇ a´ dn´e tr´av´ıc´ı enzymy. Hlavn´ı funkc´ı tlust´eho stˇreva je vstˇreb´av´an´ı sol´ı a vody. Zhoubn´e n´adory vznikaj´ı nekontrolovateln´ym mnoˇzen´ım abnorm´aln´ıch bunˇek. Za norm´aln´ıch okolnost´ı se jednotliv´e buˇnky mnoˇz´ı podle urˇcit´ych pravidel v momentˇe, kdy je tˇelo potˇrebuje, a nov´e buˇnky nahrazuj´ı star´e buˇnky. Rakovinotvorn´e buˇnky d´ale neodpov´ıdaj´ı na sign´aly, kter´e ˇr´ıd´ı r˚ust, dˇelen´ı a smrt bunˇek. N´adory m˚uzˇ ou b´yt benign´ı nebo malign´ı. Benign´ı n´adory, neboli nezhoubn´e, nepronikaj´ı do okoln´ı tk´anˇe a ani se neˇs´ıˇr´ı do jin´ych cˇ a´ st´ı tˇela. Vˇetˇsinou jsou odstranˇeny a nepˇredstavuj´ı ohroˇzen´ı zˇ ivota. Typick´ym benign´ım n´adorem tlust´eho stˇreva je polyp. Polyp je v´yr˚ustek z membr´any sliznice tlust´eho stˇreva, kter´y vyr˚ust´a nad u´ roveˇn stˇrevn´ı sliznice. Kolorekt´aln´ı polyp by mˇel b´yt odstranˇen, protoˇze se m˚uzˇ e promˇenit ve zhoubn´y n´ador. Dle mikroskopick´eho sloˇzen´ı se rozliˇsuj´ı cˇ tyˇri druhy polyp˚u – tzv. tubul´arn´ı adenom, vil´ozn´ı adenom, z nˇehoˇz vznik´a ve 30 % zhoubn´y n´ador, a hyperplastick´y polyp, kter´y je povaˇzovan´y za benign´ı l´eze. Avˇsak pilovit´y adenom, histologick´a varianta hyperplastick´eho polypu, pˇredstavuje riziko malign´ıho zvratu. Malign´ı, zhoubn´e, n´adory mohou postihovat i okoln´ı tk´anˇe a org´any a z´aroveˇn se mohou sˇ´ıˇrit krevn´ım obˇehem cˇ i lymfatick´ym syst´emem do jin´ych cˇ a´ st´ı organismu. Takhle vznikl´ym druhotn´ym n´adorov´ym loˇzisk˚um ˇr´ık´ame metast´aze. Mezi vlivy vzniku rakoviny tlust´eho stˇreva patˇr´ı pˇredevˇs´ım strava. Negativn´ı vliv m´a zv´ysˇen´y pod´ıl zˇ ivoˇciˇsn´ych tuk˚u v potravˇe, vysok´a spotˇreba cˇ erven´eho masa zpracovan´eho 5
1
´ I´ KARCINOM KOLOREKTALN
smaˇzen´ım a uzen´ım, n´ızk´y obsah vl´akniny a rostlinn´ych tuk˚u. Dalˇs´ımi rizikov´ymi faktory je pit´ı alkoholu a kouˇren´ı. Za urˇcit´ych podm´ınek mohou b´yt rizikov´e i klimatick´e podm´ınky a zneˇciˇstˇen´ı zˇ ivotn´ıho prostˇred´ı. Zhruba 75% kolorekt´aln´ıch n´ador˚u nen´ı dˇediˇcn´a a je zp˚usobena somatick´ymi mutacemi (URL 3). Mezi dˇediˇcn´e n´adory patˇr´ı famili´arn´ı adenomat´ozn´ı polyp´oza. Toto onemocnˇen´ı se vyskytuje jiˇz v pomˇernˇe n´ızk´em vˇeku. V tlust´em stˇrevˇe pacienta se objevuje velk´e mnoˇzstv´ı polyp˚u, kter´e se mohou zvrhnout v malign´ı karcinom. Jedin´ym moˇzn´ym ˇreˇsen´ım je pr˚ubˇezˇ n´e sledov´an´ı a odstraˇnov´an´ı polyp˚u. Onemocnˇen´ı je zp˚usobeno mutac´ı genu APC (z anglick´eho Adenomatous polyposis coli). Z´avaˇzn´ym dˇediˇcn´ym onemocnˇen´ım je tak´e Lynch˚uv syndrom. U nemocn´eho vznik´a kolorekt´aln´ı karcinom bez pˇredchoz´ıho vzniku polyp˚u. V pˇr´ıpadˇe Lynchova syndromu II se vyskytuj´ı i dalˇs´ı n´adory, jako napˇr´ıklad zˇ aludku, pankreatu a k˚uzˇ e. Nejˇcastˇejˇs´ı pˇr´ıcˇ inou vzniku tohoto syndromu jsou mutace gen˚u zp˚usobuj´ıc´ıch mikrosatelitn´ı nestabilitu. Kolorekt´aln´ı karcinom se m˚uzˇ e v tˇele vyv´ıjet nˇekolik mˇes´ıc˚u. Hlavn´ı nebezpeˇc´ı spoˇc´ıv´a v tom, zˇ e jeho v´yvoj m˚uzˇ e prob´ıhat pomˇernˇe dlouho skrytˇe a projev´ı se aˇz v pokroˇcil´em st´adiu. Pacienti, kteˇr´ı byli l´ecˇ eni z kolorekt´aln´ıho karcinomu, mus´ı pravidelnˇe doch´azet na kontroly. Progn´oza pˇreˇzit´ı v ran´ych st´adi´ıch karcinomu je dobr´a, pacienti se v 55-85% pˇr´ıpad˚u doˇz´ıvaj´ı 5 a v´ıce let (URL 13). Pˇri diagn´oze pokroˇcil´ych st´adi´ı je progn´oza velmi sˇpatn´a, medi´an pˇreˇzit´ı je 11 mˇes´ıc˚u (Yokota et al., 2011).
1.1
Diagnostika
Rentgenov´e vyˇsetˇren´ı a kolonoskopie jsou dvˇe metody, kter´e se pouˇz´ıvaj´ı pro diagnostiku rakoviny. V pˇr´ıpadˇe rentgenov´eho vyˇsetˇren´ı se pouˇz´ıv´a tzv. metoda dvojit´eho kontrastu. Kontrastn´ı l´atka s obsahem barya se vprav´ı do tlust´eho stˇreva. Ke zlepˇsen´ı pˇrehlednosti povrchu sliznice se prov´ad´ı rozˇs´ıˇren´ı stˇreva pomoc´ı vzduchu. L´ekaˇr pak m˚uzˇ e na rentgenov´ych sn´ımc´ıch pozorovat zmˇeny ve stˇrevˇe. Kolonoskopie je vyˇsetˇren´ı sliznice a vnitˇrn´ıch cˇ a´ st´ı tlust´eho stˇreva pomoc´ı endoskopick´eho pˇr´ıstroje. Nalezen´y polyp je pak moˇzn´e odstranit cel´y nebo jeho cˇ a´ st pomoc´ı rektoskopu nebo kolonoskopu. Odebran´a tk´anˇ se testuje na pˇr´ıtomnost malign´ıch n´ador˚u. Tento postup se naz´yv´a biopsie. V pˇr´ıpadˇe zjiˇstˇen´ı zhoubn´eho n´adoru se prov´ad´ı ultrazvuk nebo CT vyˇsetˇren´ı jater cˇ i plic za u´ cˇ elem zjiˇstˇen´ı metast´az´ı. D´ale se stanovuj´ı n´adorov´e markery CEA a CA 19-9 z krve. Tyto l´atky jsou vyluˇcovan´e do obˇehu n´adorovou tk´an´ı. L´ecˇ ba pak z´avis´ı na velikosti a lokalizaci n´adoru, st´adiu onemocnˇen´ı a celkov´em stavu pacienta.
1.2
L´ecˇ ba
Nejbˇezˇ nˇejˇs´ım zp˚usobem l´ecˇ by rakoviny traˇcn´ıku a koneˇcn´ıku je chirurgick´y z´akrok, kdy dojde k odnˇet´ı postiˇzen´e cˇ a´ sti stˇreva a tak´e okoln´ı lymfatick´e uzliny, jejichˇz histologick´e vyˇsetˇren´ı urˇc´ı st´adium nemoci. V pˇr´ıpadˇe zasaˇzen´ı uzlin n´adorov´ymi buˇnkami je nutn´a dalˇs´ı l´ecˇ ba, nebot’ riziko sˇ´ıˇren´ı n´adoru lymfatick´ym syst´emem je vysok´e. Tento stav vede k nasazen´ı chemoterapie, kdy jsou pacientovi vˇetˇsinou nitroˇzilnˇe pod´avan´e speci´aln´ı l´atky. Obvykle se pouˇz´ıv´a kombinace l´atek 5-fluorouracil a leukovorin. Dalˇs´ım l´ecˇ ebn´ym postupem je radioterapie. Principem radioterapie je oz´aˇren´ı tumoru paprsky s vysokou energi´ı, kter´e poˇskozuj´ı n´adorov´e buˇnky a zabraˇnuj´ı jejich r˚ustu a dˇelen´ı. Radioterapie se prov´ad´ı ojedinˇele, zpravidla pˇred chirurgick´ym z´akrokem, ke zmenˇsen´ı objemu tumoru a t´ım usnadˇnuje jeho odstranˇen´ı, protoˇze stˇrevo je pˇr´ıliˇs citliv´e na z´aˇren´ı.
6
1
1.2.1
´ I´ KARCINOM KOLOREKTALN
Biologick´a l´ecˇ ba
Pomˇernˇe nov´ym druhem l´ecˇ by v onkologii je tzv. biologick´a l´ecˇ ba, zn´am´a tak´e jako c´ılen´a l´ecˇ ba.Vyj´ımeˇcnost vˇetˇsiny druh˚u biologick´e l´ecˇ by tkv´ı v podpoˇre imunitn´ıho syst´emu ´ cinek biologick´e l´ecˇ by lidsk´eho organismu tak, aby se s nemoc´ı co nejl´epe vypoˇra´ dal s´am. Uˇ je velmi specifick´y a tud´ızˇ v´yraznˇe omezuje jej´ı neˇza´ douc´ı u´ cˇ inky, kter´e jsou m´ırnˇejˇs´ı a m´enˇe cˇ ast´e neˇz v pˇr´ıpadˇe jin´ych l´ecˇ ebn´ych metod. Jako pˇr´ıklady bych jmenovala horeˇcku, zimnici, nevolnost cˇ i ztr´atu chuti. Biologick´a l´ecˇ ba br´an´ı n´adoru se sˇ´ıˇrit do dalˇs´ıch cˇ a´ st´ı tˇela, napom´ah´a imunitn´ımu syst´emu niˇcit n´adorov´e buˇnky a pˇredevˇs´ım blokuje nebo sniˇzuje u´ cˇ inek r˚ustov´ych faktor˚u podporuj´ıc´ıch r˚ust n´adorov´ych bunˇek. Avˇsak pˇresn´e mechanismy biologick´e l´ecˇ by, kter´a podporuje lidsk´y organismus v boji proti n´ador˚um, nejsou zn´amy. Pouˇz´ıvan´e l´atky se naz´yvaj´ı modifik´atory imunitn´ı odpovˇedi a ve vˇetˇsinˇe pˇr´ıpad˚u se jedn´a o l´atky, kter´e lidsk´e tˇelo norm´alnˇe vyr´ab´ı, ale u c´ılen´e l´ecˇ by n´ador˚u jsou tyto l´atky umˇele vyroben´e a tˇelu dod´avan´e. Nejvˇetˇs´ı pozornost v posledn´ı dobˇe smˇeˇruje na EGFR (receptor pro epiderm´aln´ı r˚ustov´y faktor), transmembr´anov´y receptor, kter´y je zahrnut´y v bunˇecˇ n´e proliferaci a r˚ustu. Nav´az´an´ı ligand˚u na extracelul´arn´ı dom´enu receprotu aktivuje dimerizaci receptoru a n´aslednou autofosforylaci a aktivaci sign´aln´ı dr´ahy vedouc´ı k synt´eze DNA a proliferaci buˇnky. Proto se nov´e zp˚usoby biologick´e l´ecˇ by zakl´adaj´ı na extracelul´arn´ı nebo intracelul´arn´ı blokaci tohoto receptoru. Jeho zablokov´an´ı vede k inhibici sign´aln´ı kask´ady a t´ım i k inhibici r˚ustu n´adorov´ych bunˇek. Intracelul´arn´ı n´ızkomolekul´arn´ı inhibitory proch´azej´ı bunˇecˇ nou membr´anou a n´aslednˇe doch´az´ı k vazbˇe s ATP vazebn´ym m´ıstem tyrozinkin´azov´e dom´eny. Tyrozinkin´azov´e inhibitory EGFR jsou m´enˇe specifick´e neˇz monoklon´aln´ı protil´atky vyuˇz´ıvan´e pˇri extracelul´arn´ı blokaci, jelikoˇz mohou inhibovat i jin´e tyrozinkin´azov´e cesty, kter´e ovlivˇnuj´ı norm´aln´ı bunˇecˇ n´e funkce. Monoklon´aln´ı protil´atky jsou vysokomolekul´arn´ı, a proto neproch´azej´ı bunˇecˇ nou membr´anou. Tyto protil´atky se sluˇcuj´ı s extracelul´arn´ı dom´enou EGFR, cˇ´ımˇz zabr´an´ı nav´az´an´ı ligandu a nasledn´ymi dˇeji doch´az´ı k degradaci EGFR. Monoklon´aln´ı protil´atky rovnˇezˇ dok´azˇ ou aktivovat na protil´atk´ach z´avislou schopnost bunˇek niˇcit n´adorov´e buˇnky.
1.3
Molekul´arn´ı determinanty
Z´aroveˇn s klasick´ymi klinick´ymi projevy se sleduj´ı dalˇs´ı specifick´e charakteristiky n´ador˚u tlust´eho stˇreva, kter´e l´ekaˇru˚ m pom´ahaj´ı s vhodn´ym zvolen´ım l´ecˇ by. Konkr´etnˇe se jedn´a o mutace, pˇredevˇs´ım protein˚u BRAF a KRAS, kter´e neodpov´ıdaj´ı na biologickou l´ecˇ bu inhibice EGFR. Tyto mutace se nikdy nevyskytuj´ı v n´adorech spoleˇcnˇe. Dalˇs´ım specifick´ym znakem je mutace tumor supresorov´eho proteinu p53, kter´y m´a za n´asledek vˇetˇsinu lidsk´ych n´ador˚u. Velmi d˚uleˇzit´ym faktorem v molekul´arn´ı identifikaci n´ador˚u tlust´eho stˇreva je anal´yza mikrosatelitn´ı nestability. Posledn´ı nem´enˇe d˚uleˇzitou charakteristikou je urˇcen´ı lokace stˇreva, na kter´e se n´ador objevil, protoˇze se v´yvojovˇe jedn´a o dva rozd´ıln´e typy tk´anˇe a je dok´azan´e, zˇ e lev´a a prav´e strana stˇreva m´a odliˇsnou genovou expresi. 1.3.1
MSI
Mikrosatelity jsou sekvence DNA, kter´e se skl´adaj´ı z polymorfn´ıch tandemov´ych repetic´ı dvou aˇz sˇesti nukleotidov´ych p´ar˚u. Tyto sekvence snadno podl´ehaj´ı mutac´ım pˇri replikaci DNA. Doch´az´ı k inzerc´ım nebo delec´ım vlivem snadnˇejˇs´ıho sklouz´av´an´ı DNA polymer´azy. Pokud se v n´adorov´e tk´ani jedince objev´ı delˇs´ı nebo kratˇs´ı sekvence mikrosatelitu, pak mluv´ıme o mikrosatelitn´ı nestabilitˇe. Nestabilita je zp˚usobena inaktivac´ı DNA opravn´ych mechanism˚u (MMR = mismatch repair proteins), kter´e opravuj´ı chyby vznikl´e pˇri replikaci.
7
1
´ I´ KARCINOM KOLOREKTALN
Zn´ame tˇri typy stability mikrosatelitn´ıch sekvenc´ı: MSS – mikrosatelitn´ı stabilita MSI-L – s n´ızkou frekvenc´ı nestability mikrosatelit˚u, vyskytuje se jeden nestabiln´ı mikrosatelit MSI-H – s vysokou frekvenc´ı nestability mikrosatelit˚u, vyskytuje se dva a v´ıce nestabiln´ıch mikrosatelit˚u MSI se vyskytuje ve spojen´ı s dˇediˇcn´ym kolorekt´aln´ım karcinomem bez v´yskytu polyp˚u a u 12-15% ojedinˇel´ych karcinom˚u tlust´eho stˇreva (URL 3). Tumory s mikrosatelitn´ı nestabilitou se vyskytuj´ı pˇredevˇs´ım ve vzestupn´em traˇcn´ıku a ojedinˇele i v sestupn´em traˇcn´ıku. Tyto n´adory tak´e zˇr´ıdkakdy tvoˇr´ı metast´aze. Anal´yza MSI je velmi d˚uleˇzit´a v molekul´arn´ı diagnostice pacient˚u s onkologick´ym onemocnˇen´ım, protoˇze pacienti s kolorekt´aln´ım karcinomem a vysokou m´ırou MSI (MSI-H) maj´ı lepˇs´ı progn´ozu oproti pacient˚um s mikrosatelitnˇe stabiln´ım (MSS) n´adorem. 1.3.2
p53
Protein 53, zkr´acenˇe p53, je n´adorov´y supresorov´y protein, kter´y je k´odovan´y genem TP53. Tento gen se u cˇ lovˇeka nach´az´ı na 17 chromozomu a obsahuje 20 kb DNA a 11 exon˚u, z toho jeden nek´oduj´ıc´ı. Vrozen´e mutace tohoto genu jsou vz´acn´ym dominantn´ım onemocnˇen´ım naz´yvan´ym Li-Fraumeniho syndrom, d´ıky kter´emu se m˚uzˇ e vyvinout nˇekter´y z n´ador˚u. Inaktivac´ı obou kopi´ı genu TP53 vznikaj´ı somatick´e mutace, kter´e maj´ı za n´asledek vˇetˇsinu lidsk´ych n´ador˚u. Protein p53 m´a kl´ıcˇ ovou u´ lohu v bunˇecˇ n´e odpovˇedi na stres. V buˇnk´ach s poˇskozenou DNA hladina proteinu v´yraznˇe nar˚ust´a, zat´ımco v norm´aln´ıch buˇnk´ach je hladina n´ızk´a. P53 m´a tak´e d˚uleˇzitou roli ve spouˇstˇen´ı protirakovinn´ych mechanism˚u. Protein dok´azˇ e aktivovat proteiny opravuj´ıc´ı DNA v pˇr´ıpadˇe trval´eho poˇskozen´ı DNA, a tak´e dok´azˇ e zastavit r˚ust buˇnky v pr˚ubˇehu bunˇecˇ n´eho dˇelen´ı ve f´azi G1/S. D´ale p53 dok´azˇ e spustit programovanou smrt buˇnky, tzv. apopt´ozu, pokud je DNA v buˇnce nevratnˇe poˇskozena. P53 je dlouh´y transkripˇcn´ı faktor sloˇzen´y ze tˇr´ı dom´en. Prvn´ı dom´enou je N-koncov´a transkripˇcnˇe aktivaˇcn´ı dom´ena (TAD) dlouh´a 42 aminokyselin. Dalˇs´ı je centr´aln´ı DNAvazebn´a dom´ena (DBD) dlouh´a 177 aminokyselin, pro kterou jsou typick´e recesivn´ı mutace zp˚usobuj´ıc´ı ztr´atu funkce. Tyto mutace poˇskozuj´ı nebo dokonce odstraˇnuj´ı schopnost proteinu v´azat specifick´e sekvence DNA nach´azej´ıc´ı se v jeho c´ılov´ych genech a t´ım dojde k znemoˇznˇen´ı aktivace transkripce dan´ych gen˚u. Posledn´ı dom´enou je C-koncov´a homooligomerizaˇcn´ı dom´ena (OD) dlouh´a 30 aminokyselin. Molekuly p53 s dominantnˇe negativn´ı mutac´ı, kter´a je typick´a pro tento u´ sek, tvoˇr´ı tetramery se standardn´ımi polypeptidy p53, kter´e zabraˇnuj´ı standardn´ım polypeptid˚um fungovat jako transkripˇcn´ı aktiv´atory. U v´ıce jak 50% pˇr´ıpad˚u kolorekt´aln´ıho karcinomu se jedn´a o mutaci tohoto genu a koreluje s horˇs´ı progn´ozou (URL 3). 1.3.3
MAPK/ERK sign´aln´ı kask´ada
MAP kin´azov´a sign´aln´ı kask´ada se ˇrad´ı do protein kin´azov´ych kask´ad, kter´e hraj´ı d˚uleˇzitou roli v sign´aln´ım pˇrenosu ve vˇsech eukaryotick´ych buˇnk´ach z receptoru na povrchu buˇnky aˇz do j´adra buˇnky. Z´akladn´ı jednotkou t´eto cesty je skupina protein˚u serin/treonin kin´az naz´yvan´ych MAP kin´azy (mitogenem aktivovan´a protein kin´aza), kter´e jsou nejˇcastˇeji aktivov´any r˚ustov´ymi sign´aly nebo jin´ymi sign´aln´ımi molekulami. V buˇnk´ach cˇ lovˇeka jsou MAP 8
1
´ I´ KARCINOM KOLOREKTALN
kin´azy vˇsudypˇr´ıtomn´e regul´atory, kter´e mohou pˇrid´an´ım fosf´atov´e skupiny na sousedn´ı protein vyvolat zastaven´ı nebo sˇ´ıˇren´ı sign´alu ˇr´ıd´ıc´ıho r˚ust bunˇek a diferenciaci. Mutace jednoho z protein˚u v kask´adˇe m˚uzˇ e v´est k nekontrolovateln´emu dˇelen´ı bunˇek a tvorbˇe bunˇek n´adorov´ych. Nejl´epe popsan´a cˇ a´ st MAP kin´az v buˇnk´ach cˇ lovˇeka patˇr´ı do ERK skupiny (z anglick´eho extracellular signal-regulated kinase). Aktivace ERK m´a d˚uleˇzit´y v´yznam v signalizaci proliferace. Aktivace ERK je zprostˇredkovan´a dvˇema protein kin´azami Grb2 a SOS, kter´e jsou spojen´e k receptoru pro r˚ustov´y faktor. Fosforylac´ı receptoru se sign´al zaˇcne sˇ´ıˇrit pˇres Grb2 a SOS aˇz ke G proteinu Ras (napˇr´ıklad protein KRAS), kter´y vytvoˇr´ı vazbu s GTP (guanosintrifosf´at) a dojde k jeho aktivaci. Aktivace Ras d´ale vede k aktivaci Raf proteinu, kter´y fosforyluje a aktivuje dalˇs´ı protein kin´azu naz´yvanou MEK. MEK pomoc´ı fosforylace treoninov´eho a tyrozinov´eho zbytku aktivuje dalˇs´ı cˇ leny z ERK skupiny. Fosforylovan´y ERK vstupuje do j´adra a aktivuje transkripˇcn´ı faktory ˇr´ıd´ıc´ı r˚ust a diferenciaci buˇnky.
Obr´azek 2: Z´akladn´ı sch´ema MAPK/ERK sign´aln´ı kask´ady (URL 5) Hlavn´ı roli v ERK sign´aln´ı kask´adˇe pln´ı Ras protein, kter´y jak uk´azaly studie, byl prvn´ım identifikovan´ym onkogenem tumorov´ych vir˚u (zkratka poch´az´ı z anglick´eho rat sarcoma virus). Experimenty ukazuj´ıc´ı d˚uleˇzitost Ras ve vnitrobunˇecˇ n´e signalizaci zjistily, zˇ e mal´e mnoˇzstv´ı aktivovan´eho Ras proteinu pˇr´ımo indukuje proliferaci bunˇek. Ras nen´ı pouze schopn´y navodit abnorm´aln´ı r˚ust typick´y pro n´adorov´e buˇnky, ale je tak´e potˇrebn´y pro odpovˇed’ zdrav´ych bunˇek na stimulaci r˚ustov´eho faktoru. Funkc´ı Ras protein˚u, spojen´ych guaninov´ymi nukleotidy, je stˇr´ıdavˇe inaktivovat GDP vazby a aktivovat GTP vazby. Aktivita Ras-GTP komplexu je ukonˇcena hydrol´yzou GTP, kter´a je podn´ıcena vz´ajemn´ym p˚usoben´ım Ras-GTP komplexu, proteinem aktivovan´ym enzymem GTP fosfohydrol´azou. Enzym hydrolyzuje guanosintrifosf´at (GTP) na guanosindifosf´at (GDP). D˚uleˇzit´e je zm´ınit, zˇ e mutace Ras gen˚u u n´ador˚u inhibuj´ı GTP hydrol´yzu. Tyto zmutovan´e Ras proteiny setrv´avaj´ı po celou dobu v aktivovan´e vazbˇe s GTP a ˇr´ıd´ı neregulovatelnou proliferaci rakovinn´ych bunˇek, i kdyˇz chyb´ı r˚ustov´y faktor.
9
1
1.3.4
´ I´ KARCINOM KOLOREKTALN
KRAS
KRAS (z anglick´eho Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) je protein s GTP´azovou aktivitou, kter´y se u´ cˇ astn´ı pˇrenosu sign´alu od aktivovan´eho receptoru pro r˚ustov´e faktory na bunˇecˇ n´em povrchu. Tento protein je k´odovan´y stejnojmenn´ym genem, kter´y se nach´az´ı na 12 chromozomu. Gen KRAS zab´ıraj´ıc´ı 35 kb je sloˇzen z 6 exon˚u. Substituce aminokyseliny nebo cˇ a´ steˇcn´a substituce nukleotid˚u je zodpovˇedn´a za mutace, kter´e vedou ke vznik˚um r˚uzn´ych n´adorov´ych onemocnˇen´ı. Mutace nejˇcastˇeji postihuj´ı 12 kod´on genu KRAS a d´ale i 13 a 61. Mutace kod´onu k´oduj´ıc´ıho aminokyselinu glycin, kter´a jako jedin´a aminokyselina nem´a postrann´ı ˇretˇezec, na dvan´act´e pozici vede k zaˇrazen´ı jin´e aminokyseliny s postrann´ım ˇretˇezcem. Na z´akladˇe studi´ı bylo zjiˇstˇeno, zˇ e pouze mutace glycinu za valin m´a v´yznamn´y dopad na v´yvoj kolorekt´aln´ıho karcinomu. Mutaci KRAS najdeme ve 25-50% v´yskytu rakoviny tlust´eho stˇreva (URL 3). 1.3.5
BRAF
Serin/treonin-protein kin´aza je protein, kter´y je v lidsk´em organismu k´odovan´y BRAF onkogenem nach´azej´ıc´ım se na 7 chromozomu. Tento protein je d˚uleˇzit´y v regulaci sign´aln´ı kask´ady MAPK/ERK, kter´a kontroluje d˚uleˇzit´e funkce buˇnky. Protein tedy pom´ah´a s chemick´ym sˇ´ıˇren´ım sign´al˚u z povrchu bunˇek do bunˇecˇ n´eho j´adra a je zapojen´y i do regulace r˚ustu bunˇek, proliferace a diferenciace. Mutace proteinu BRAF v sign´aln´ı kask´adˇe m´a horˇs´ı dopad na pacienta neˇz mutace KRAS proteinu, kter´y lze v sign´aln´ı kask´adˇe obej´ıt cˇ i nahradit. Mutace genu BRAF jsou spojov´any s ˇradou n´ador˚u. V´ıce neˇz 80 % mutac´ı je zp˚usobeno z´amˇenou aminokyseliny valinu za kyselinu glutamovou na pozici 600 aminokyseliny. Tato mutace nese oznaˇcen´ı V600E. Z´amˇena vede ke st´al´e aktivaci BRAF, protoˇze stimuluje fosforylaci na T599 nebo S602 v aktivaˇcn´ı dom´enˇe proteinu. Ten pak nereaguje na fyziologickou regulaci RAS. Tuto mutaci najdeme v 15 % pˇr´ıpadech kolorekt´aln´ıho karcinomu (Faris et al., 2012). Ve studii, na kterou m´a bakal´aˇrsk´a pr´ace navazuje, se Popovici et al. zab´yvali v´yvojem a stanoven´ım BRAF mutantn´ıch gen˚u v kolorekt´aln´ım karcinomu a studiem jejich d˚usledk˚u na progn´ozu. K dispozici mˇeli genov´e exprese 668 pacient˚u ve II. a III. st´adiu kolorekt´aln´ıho karcinomu. Vzorky tk´an´ı z vyoperovan´ych n´ador˚u pacient˚u, kteˇr´ı byli zaˇrazeni do klinick´e studie PETACC-3 (z anglick´eho Pan European Trial Adjuvant Colon Cancer-3), byly fixov´any formal´ınem a zalit´e parafinem pro fixaci na delˇs´ı dobu a purifikaci genetick´e informace. C´ılem t´eto pr´ace bylo stanovit rozd´ıly v genov´e expresi vzork˚u s BRAF mutac´ı V600E, bez BRAF mutace a bez KRAS mutace a vytvoˇren´ı klasifik´atoru BRAF mutace, kter´y je zaloˇzen´y na genov´e expresi. Na z´akladˇe tohoto klasifik´atoru, o kter´em se podrobnˇe zm´ın´ım pozdˇeji, bylo zjiˇstˇeno, zˇ e v´ıce neˇz 30% pacient˚u s mutac´ı KRAS bylo klasifikov´ano jako BRAF mutantn´ı, oznaˇcovan´ı jako BRAF-like. BRAF-like populace vykazovala podobn´e rysy jako BRAF mutanti v klinickopatologick´em obrazu, od vyˇssˇ´ı frekvence v´yskytu slizovit´ych n´ador˚u po status MSI. U tˇechto pacient˚u bylo tak´e zjiˇstˇeno horˇs´ı pˇreˇzit´ı neˇz u pacient˚u s KRAS mutac´ı, kteˇr´ı nebyli klasifikov´an´ı jako BRAF mutantn´ı. Na n´asleduj´ıc´ım grafu (obr. 3) jsou pomoc´ı Kaplan-Meierovy kˇrivky pˇreˇzit´ı vidˇet rozd´ıly jak v celkov´em pˇreˇzit´ı pacient˚u ve III st´adiu rakoviny, tak u pacient˚u po relapsu. Tento nov´y klasifikaˇcn´ı prostˇredek poskytuje biologick´e informace a m˚uzˇ e pomoci pˇri urˇcen´ı l´ecˇ ebn´ych strategi´ıch u pacient˚u, protoˇze jak jiˇz bylo zm´ınˇeno, BRAF mutace neodpov´ıd´a na klasickou l´ecˇ bu EGFR inhibitory.
10
1
´ I´ KARCINOM KOLOREKTALN
Obr´azek 3: Graf ukazuj´ıc´ı rozd´ıly pˇreˇzit´ı u pacient˚u ve III. st´adiu rakoviny (Popovici et al., 2012)
11
2
2
ˇ E´ METODY DATOVE´ SOUBORY A POUZIT
Datov´e soubory a pouˇzit´e metody
Datov´e soubory obsahuj´ıc´ı z´aznamy z expresn´ıch mikroˇcip˚u byly z´ısk´any ze str´anek European Bioinformatics Institute (URL 9) a National Center for Biotechnology Information (URL 10). Pro dalˇs´ı anal´yzy je potˇreba vybrat ty soubory, kter´e obsahuj´ı z´aznamy z bunˇek norm´aln´ıch tk´an´ı, adenom˚u a cˇ asn´ych st´adi´ı n´ador˚u tlust´eho stˇreva. V n´asleduj´ıc´ı tabulce (tab. 1) je z´akladn´ı popis datov´ych soubor˚u, kter´e byly zvoleny jako vhodn´e pro dalˇs´ı zpracov´an´ı. Bohuˇzel k expresn´ım dat˚um se informace o pohlav´ı a o vˇeku cˇ asto neuvaˇzuj´ı, a proto reprezenatativnost populace nem˚uzˇ e b´yt ovˇeˇrena. V cˇ l´anku Popovici et al. je vˇsak uveden´e, zˇ e tyto promˇenn´e neovlivˇnuji vznik a v´yvoj mutace BRAF. Soubor GSE 12514 8761 10714 9254 4183 20916 4107 15960 4045
N 8 63 30 19 38 105 22 18 37
Pohlav´ı muˇzi zˇ eny 3 5 51 54 10 12 18 19
˚ ern´y Prumˇ vˇek 74 63 40 -
Typ tk´anˇe norm´aln´ı adenom karcinom 0 8 0 32 31 0 3 16 11 19 0 0 8 15 15 24 45 36 10 0 12 6 6 6 0 0 37
Poˇcet p´aru˚ genu˚ 10 28 28 28 28 28 28 28 16
Tabulka 1: Popisn´a statistika Celkem do dalˇs´ı anal´yzy vstupovalo 340 pacient˚u z nichˇz 102 pacient˚um byly odebr´any vzorky norm´aln´ı tk´anˇe, 121 vzork˚u bylo z´ısk´ano z adenomu a 117 z karcinomu. Vzorky byly odebr´any pˇri biopsii nebo laserov´e mikrodisekci. Vzorky, kter´e oznaˇcuji jako norm´aln´ı tk´anˇ se z´ısk´avaj´ı se souhlasem pacienta z okol´ı n´ador˚u nebo adenom˚u a nebo se jedn´a o tk´anˇ z´ıskanou u pacient˚u s jin´ym probl´emem jako je napˇr´ıklad chronick´y z´apal. Tato tk´anˇ z histologick´eho hlediska nevykazuje zˇ a´ dn´e zmˇeny. Datov´e soubory byly jiˇz znormalizovan´e a to sice metodou robustn´ıho v´ıcerozmˇern´eho pr˚umˇeru a d´ale jsem na nˇe aplikovala mnohon´asobn´y klasifik´ator top-sk´oruj´ıc´ıch p´ar˚u zalozˇ en´y na klasifikaci 64 gen˚u. Obˇema metod´am se budu v´ıce vˇenovat v n´asleduj´ıc´ıh odd´ılech t´eto pr´ace. Veˇsker´e anal´yzy budou prov´adˇeny pomoc´ı statistick´eho softwaru R, verze 2.13.2.
2.1
˚ er Robustn´ı v´ıcerozmˇern´y prumˇ
Robustn´ı v´ıcerozmˇern´y pr˚umˇer (Robust Multiarray Average, zkr´acenˇe RMA) je metoda bˇezˇ nˇe vyuˇz´ıvan´a k normalizaci genomick´ych dat z Affymetrix cˇ ip˚u (Irizarry et al., 2003). Proces normalizace prob´ıh´a ve tˇrech kl´ıcˇ ov´ych kroc´ıch: korekce pozad´ı, kvantilov´a normalizace a n´asledn´a sumarizace. Pˇri t´eto metodˇe dojde nejprve k odeˇcten´ı pozad´ı pˇredstavuj´ıc´ı sˇum, kter´y n´am m˚uzˇ e ovlivnit intenzity skuteˇcn´eho sign´alu. Tato hodnota je odhadnut´a ze vˇsech MM (z anglick´eho mismatch) sond. MM sondy maj´ı d´elku 25-ti oligonukleotidov´ych baz´ı. D´ale je potˇreba srovnat intenzity sign´alu mezi cˇ ipy pomoc´ı kvantilov´e normalizace bˇehem n´ızˇ doch´az´ı k transformaci dvou datov´ych soubor˚u tak, aby mˇely rozloˇzen´ı s identick´ymi statistick´ymi parametry. Poˇc´ıt´a pouze s PM hodnotami (z anglick´eho perfect match). PM 12
2
ˇ E´ METODY DATOVE´ SOUBORY A POUZIT
sondy jsou dokonale sp´arovan´e b´aze o d´elce 25 oligonukleotidov´ych b´az´ı komplement´arn´ıch s transkriptem a MM sondy se od nich liˇs´ı tak, zˇ e 13. b´aze je komplement´arn´ı k odpov´ıdaj´ıc´ı b´azi na PM sondˇe. C´ılem je, aby kvantily vˇsech vzork˚u byly stejn´e. Kvantilov´a normalizace je zaloˇzena na poˇrad´ı a proto neexistuj´ı zˇ a´ dn´e pˇredpoklady na rozloˇzen´ı dat. Posledn´ım krokem je sumarizace. Jakmile je sonda zbavena sˇumu a znormalizovan´a, je potˇreba ji zesumarizovat do koneˇcn´e hodnoty. Pouˇzit´a sumarizace vych´az´ı z pozorov´an´ı, zˇ e log-transformovan´e PM hodnoty vypl´yvaj´ı z line´arn´ıho aditivn´ıho modelu, kter´y se skl´ad´a z koeficientu afinity, logaritmovan´e hodnoty skuteˇcn´eho sign´alu a nez´avisl´e chyby. V´ysledkem cel´eho procesu normalizace je matice hladin genov´e exprese, kde v ˇra´ dc´ıch jsou jednotliv´e geny a v sloupc´ıch jednotliv´e vzorky/pacienti.
2.2
Mnohon´asobn´y klasifik´ator top-sk´oruj´ıc´ıch p´aru˚
Pro dalˇs´ı zpracov´an´ı dat bylo nutn´e vybrat vhodn´y postup na porovn´av´an´ı a zaˇrazen´ı gen˚u, kter´e jsou typick´e pro BRAF mutantn´ı n´adory, do jednotliv´ych tˇr´ıd, v tomto pˇr´ıpadˇe s mutac´ı BRAF a bez mutace BRAF. V jiˇz nˇekolikr´at zmiˇnovan´em cˇ l´anku Popovici et al., byl autory navrˇzen a pouˇzit mnohon´asobn´y klasifik´ator top-sk´oruj´ıc´ıch p´ar˚u (multiple topscoring pairs, zkr´acenˇe mTSP), kter´y s 96% sensitivitou a 86% specificitou dok´azˇ e zaznamenat n´ador s mutac´ı BRAF. Mnohon´asobn´y klasifik´ator top-sk´oruj´ıc´ıch p´ar˚u vyuˇz´ıv´a 32 p´ar˚u gen˚u, kter´e byly zjiˇstˇeny jako dostateˇcn´e pro identifikaci BRAF mutace v n´adorov´e buˇnce. Tento klasifik´ator vych´az´ı z jiˇz dˇr´ıve vytvoˇren´eho klasifik´atoru TSP (Geman et al., 2004) na pˇredpov´ıd´an´ı skupin a p´arov´e porovn´av´an´ı dat z expresn´ıch microarray´ı. L´epe ˇreˇceno, metoda se snaˇz´ı naj´ıt rozd´ıly mezi dvˇema tˇr´ıdami hled´an´ım p´ar˚u gen˚u, jejichˇz hladina exprese typicky pˇrech´az´ı z jedn´e tˇr´ıdy do tˇr´ıdy druh´e. V´ybˇer p´ar˚u gen˚u by se dal jednoduˇse popsat jako v´ybˇer dvou prvk˚u z mnoˇziny 64 gen˚u s opakov´an´ım. Pˇri v´ybˇeru z´aleˇz´ı na poˇrad´ı prvk˚u. T´ımto zp˚usobem se porovnaj´ı vˇsechny moˇzn´e p´ary gen˚u a ke kaˇzd´emu genu se spoˇc´ıt´a sk´ore jako funkce z pod´ılu spr´avnˇe klasifikoˇ sk´ore je empirick´a pravdˇepodobnost odhadnut´a jako procento pˇr´ıpad˚u, van´ych pˇr´ıpad˚u. Cili ve kter´em je zachov´ano pravidlo, zˇ e exprese prvn´ıho genu je menˇs´ı neˇz exprese genu druh´eho u BRAF mutace a z´aroveˇn exprese prvn´ıho genu je vˇetˇs´ı neˇz exprese druh´eho genu pro vzorky bez mutace. Tato pravdˇepodobnost se z´ısk´av´a z testovac´ıch dat. P´ary byly seˇrazen´e na z´akladˇe jejich sk´ore a n´aslednˇe vybr´any ty, jejichˇz sk´ore nab´yvalo vyˇssˇ´ıch hodnot neˇz 0,6. Hodnota 0,6 ˇr´ık´a, zˇ e 60% pˇr´ıpad˚u bylo klasifikov´ano spr´avnˇe a tud´ızˇ je toto nejniˇzsˇ´ı moˇzn´a hranice, pokud chceme zajistit robustnost a z´aroveˇn specificitu souboru. D´ale byly z v´ybˇeru vyˇrazen´e geny tak, aby vznikly pouze p´ary unik´atn´ı. To znamen´a, zˇ e se gen m˚uzˇ e vyskytovat jen na jedn´e pozici v jednom p´aru. T´ımto zp˚usobem vzniklo 32 p´ar˚u gen˚u, kter´e jsou vyps´any v tabulce 2. Rozhodovac´ı pravidlo pro jeden p´ar gen˚u je velmi jednoduch´e. Vzorek klasifikujeme jako BRAF mutantn´ı pokud plat´ı, zˇ e exprese prvn´ıho genu je niˇzsˇ´ı neˇz druh´eho genu (G1 < G2). Jenˇze v pˇr´ıpadˇe v´ıce p´ar˚u gen˚u mus´ıme dan´e pravidlo upravit a pro klasifikaci vyuˇz´ıt vlastnost´ı pr˚umˇeru, jakoˇzto nejreprezentativnˇejˇs´ı m´ıry. D´ıky tomu, zˇ e p´ary jsou vybran´e podle urˇcit´eho pravidla, pak vˇsechny mus´ı m´ıt sv˚uj pod´ıl na koncov´e hodnotˇe, pokud exprese jednoho nebo v´ıce z gen˚u nab´yv´a extr´emn´ıch hodnot, pak by tyto hodnoty mˇely ovlivnit celkov´e sk´ore. Vytvoˇr´ıme si jednu mnoˇzinu vˇsech expres´ı prvn´ıch gen˚u v 32 p´arech a druhou mnoˇzinu, kter´a bude obsahovat vˇsechny exprese druh´ych gen˚u. Pak za BRAF mutanty oznacˇ´ıme ty vzorky, pro kter´e bude platit, zˇ e pr˚umˇern´a exprese gen˚u z prvn´ı mnoˇziny je menˇs´ı neˇz pr˚umˇern´a exprese gen˚u z druh´e mnoˇziny (pr˚umˇer GL < pr˚umˇer GR). Ovˇsem ne vˇzdy pˇri anal´yz´ach je k dispozici vˇsech 64 gen˚u. Metoda byla aplikovan´a i na datov´ych souborech, kter´e obsahovaly m´enˇe neˇz tˇechto 32 p´ar˚u gen˚u. Na z´akladˇe v´ysledk˚u 13
2
ˇ E´ METODY DATOVE´ SOUBORY A POUZIT
z tˇechto soubor˚u bylo zjiˇstˇeno, zˇ e klasifik´ator funguje i s 8 p´ary gen˚u. P´ar# 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Gen 1 Gen 2 C13orf18 CTSE DDC AQP5 PPP1R14D REG4 HSF5 RSBN1L SATB2 RASSF6 TNNC2 CRIP1 GGH PPPDE2 SPINK1 PLK2 PTPRO TM4SF4 ZSWIM1 MLPH RNF43 RBM8A CELP SOX8 CBFA2T2 PIWIL1 PTPRD LOC388199 CDX2 S100A16 TSPAN6 RBBP8
P´ar# 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
Gen 1 Gen 2 VAV3 OSBP2 CFTR KLK10 PHYH DUSP4 PLCB4 HOXD3 ZNF141 C11orf9 PPP1R14C CD55 FLJ32063 TRNP1 APCDD1 FSCN1 ACOX1 KIAA0802 C10orf99 PLLP MIR142 IRX3 ARID3A SLC25A37 C20orf111 PIK3AP1 AMACR TPK1 AIFM3 ZIC2 CTTNBP2 SERPINB5
Tabulka 2: 32 p´ar˚u gen˚u pro identifikaci BRAF mutant˚u
2.3
Testov´an´ı hypot´ez a korekce mnohon´asobn´eho porovn´av´an´ı
V neposledn´ı ˇradˇe jsem testovala hypot´ezy. Nejprve jse testovala rozd´ıly v platnosti vztah˚u gen˚u G1 < G2, kter´y je specifick´y pro BRAF mutantn´ı n´adory kolorekta, mezi r˚uzn´ymi tk´anˇemi a mezi levou a pravou stranou stˇreva. Jelikoˇz platnost vztah˚u pro jednotliv´y p´ar gen˚u jsem mˇela vyj´adˇrenou v procentech, pak jsem pouˇz´ıvatla Pearson˚uv ch´ı-kvadr´at test. N´aslednˇe jsem pouˇzila korekci mnohon´asobn´eho porovn´av´an´ı, konkr´etnˇe Benjamini-Hochbergovu korekci. D´ale jsem testovala rozd´ıly v genov´e expresi mezi norm´aln´ı tk´an´ı, adenomem a karcinomem. K tomuto testov´an´ı jsem si vybrala Mann-Whitneyho test a opˇet jsem pouˇzila Benjamini-Hochbergovu korekci. D˚uvody, proˇc jsem se tozhodla pro tento test uvedu v podkapitole testov´an´ı hypot´ez.
14
3
3
´ VYSLEDKY
V´ysledky
V n´asleduj´ıc´ıch podkapitol´ach se budu vˇenovat v´ysledk˚um, kter´e jsem z´ıskala po pouˇzit´ı mTSP na kaˇzd´y p´ar gen˚u u kaˇzd´eho vzorku. Tyto v´ysledky rozdˇel´ım do tˇr´ı skupin. Nejprve se zamˇeˇr´ım na interpretaci na cel´em souboru a pokus´ım se zjistit, ve kter´em st´adiu v´yvoje n´adoru doch´az´ı ke zmˇen´am genov´e exprese a zda se daj´ı definovat geny, kter´e by mohly definovat BRAF mutaci v poˇca´ teˇcn´ıch st´adi´ıch v´yvoje n´adoru. D´ale se pod´ıv´am zda se liˇs´ı exprese u n´ador˚u, adenom˚u a norm´aln´ı tk´anˇe v z´avislosti, na kter´e stranˇe stˇreva byla tk´anˇ odebran´a. V n´asleduj´ıc´ı cˇ a´ sti se budu zab´yvat rozd´ıly mezi pilovit´ymi a nepilovit´ymi adenomy a karcinomy. V posledn´ı cˇ a´ sti se budu vˇenovat testov´an´ı sk´ore, zda je rozd´ıl mezi sk´ore norm´aln´ı tk´anˇe, adenomu a karcinomu.
3.1
Klasifikace skupiny BRAF mutantu˚
Na z´akladˇe mTSP jsem predikovala 7 pacient˚u s karcinomem (8,75%), 14 pacient˚u s adenomem (11,57%) a 3 pacienty (2,94%), kter´ym byla odebran´a norm´aln´ı tk´anˇ , jako BRAF mutantn´ı. Pouˇzit´ım TSP byly z´ısk´any v´ysledky uveden´e v n´asleduj´ıc´ı tabulce, kde procenta uveden´a v buˇnk´ach znamenaj´ı pod´ıl p´ar˚u, pro kter´e plat´ı pravidlo G1 < G2, v dan´e populaci. V´ysledky jsem tak´e zn´azornila graficky na obr´azku 4. Ve 100% pro vˇsechny tˇri typy tk´anˇe bylo toto pravidlo zachovan´e pro p´ary gen˚u HSF5 < RSBN1L, ZSWIM1 < MLPH, CDX2 < S100A16 a ZNF141 < C11orf9 . Takt´ezˇ p´ar TNNC2 < CRIP1 ve vˇetˇsinˇe pˇr´ıpad˚u zachov´av´a vztah gen˚u G1 < G2. Naopak ani jednou pro vˇsechny tˇri typy tk´anˇe nebylo pravidlo zachov´ano v pˇr´ıpadˇe p´ar˚u SATB2 < RASSF6 a CBFA2T2 < PIWIL1. Tyto v´ysleky bych mohla interpretovat tak, zˇ e tyto p´ary nejsou specifick´e pro BRAF mutanty, ale tento u´ sudek by byl chybn´y, protoˇze sk´ore tˇechto p´ar˚u bylo velmi vysok´e, takˇze by mˇely b´yt specifick´e. Probl´em by mohl b´yt d´an rozd´ıly v sond´ach a jejich specificitˇe k jednotliv´ym gen˚um mezi platformami. Zat´ımco klasifik´ator vznikal na datech platformy ALMAC, j´a jsem ve sv´e anal´yze pouˇz´ıvala Affymetrix. Tˇesnˇe pˇred odevzd´an´ım t´eto pr´ace se na z´akladˇe m´ych v´ysledk˚u zjistilo, zˇ e nˇekter´e z gen˚u na platformˇe ALMAC mˇely sˇpatnou anotaci. Pˇri zamˇeˇren´ı se na pacienty, u kter´ych pˇri pouˇzit´ı mTSP platil vztah gen˚u specifick´ych pro BRAF mutantn´ı n´adory, jsem pozorovala nˇekolik zaj´ımav´ych v´ysedk˚u i po pouˇzit´ı TSP. U pacient˚u s norm´aln´ı tk´an´ı platil vztah G1 < G2 u p´ar˚u SPINK1 < PLK2, TSPAN6 < RBBP8 a ACOX1 < KIAA0802 pouze pro pacienty, kteˇr´ı byli na z´akladˇe mTSP klasifikovan´ı jako BRAF mutantn´ı. Stejn´e v´ysledky jsem pozorovala i u pacient˚u s karcinomem pro p´ary PHYH < DUSP4 a APCDD1 < FSCN1. Bohuˇzel u adenom˚u nebyl zpozorov´an zˇ a´ dn´y takov´y vztah. Na z´akladˇe tohoto pozorov´an´ı jsem p´ary SPINK1 < PLK2, TSPAN6 < RBBP8 a ACOX1 < KIAA0802 urˇcila jako specifick´e pro norm´aln´ı tk´anˇ a p´ary PHYH < DUSP4 a APCDD1 < FSCN1 jako specifick´e pro n´adorovou tk´anˇ . Na z´akladˇe v´ysˇe zm´ınˇen´ych v´ysledk˚u, kter´e jsou zhrnuty v tabulce 3 a graficky zobrazeny na obr´azku 4, usuzuji, zˇ e zmˇeny v expresi gen˚u, typick´ych pro BRAF mutantn´ı n´adory, nast´avaj´ı jiˇz v norm´aln´ı tk´ani a jsou pozorovateln´e i v tk´ani adenomu. 14 p´ar˚u gen˚u, kter´e jsou specifick´e pro BRAF mutantn´ı n´adory, se vyskytuje v m´enˇe neˇz 15%, coˇz je v´yskyt BRAF mutant˚u v populaci s kolorekt´aln´ım karcinomem, a dalˇs´ı dva p´ary v m´enˇe neˇz 30%, coˇz je v´yskyt BRAF-like.
15
3
P´ar genu˚ ZNF141 < C11orf9 CDX2 < S100A16 ZSWIM1 < MLPH HSF5 < RSBN1L TNNC2 < CRIP1 PPP1R14C < CD55 C20orf111 < IK3AP1 CTTNBP2 < SERPINB5 C13orf18 < CTSE PPP1R14D < REG4 ARID3A < SLC25A37 CFTR < KLK10 CELP < SOX8 AMACR < TPK1 PTPRO < TM4SF4 VAV3 < OSBP2 AIFM3 < ZIC2 ACOX1 < KIAA0802 DDC < AQP5 TSPAN6 < RBBP8 RNF43 < RBM8A C10orf99 < PLLP SPINK1 < PLK2 APCDD1 < FSCN1 PHYH < DUSP4 PLCB4 < HOXD3 CBFA2T2 < PIWIL1 SATB2 < RASSF6
Norm´aln´ı tk´anˇ 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 56,1% 78,0% 54,9% 89,1% 8,5% 35,1% 14,1% 34,9% 11,9% 14,3% 17,9% 0,0% 1,5% 9,9% 1,5% 0,0% 0,0% 0,8% 1,8% 0,0% 6,8% 0,0% 0,0%
Adenom 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 92,6% 41,6% 94,3% 69,8% 75,1% 41,4% 51,2% 14,2% 9,4% 27,5% 21,5% 3,7% 7,8% 1,1% 3,3% 0,0% 1,5% 0,0% 2,6% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
´ VYSLEDKY
Karcinom 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 80,0% 75,3% 55,0% 53,1% 47,6% 45,8% 42,5% 39,2% 34,7% 26,6% 14,2% 11,0% 10,6% 10,2% 10,0% 6,6% 5,0% 3,9% 1,7% 1,3% 1,3% 0,0% 0,0% 0,0%
Tabulka 3: Procento p´ar˚u gen˚u u jednotliv´ych typ˚u tk´an´ı splˇnuj´ıc´ıch pravidlo G1 < G2
16
17 3 ´ VYSLEDKY
Obr´azek 4: Prouˇzkov´e grafy pro p´ary gen˚u u norm´aln´ı tk´anˇe, adenom˚u a karcinom˚u
3
3.2
´ VYSLEDKY
Lev´a vs. prav´a strana stˇreva
BRAF mutace se asi v 60% pˇr´ıpad˚u vyskytuje na prav´e stranˇe tlust´eho stˇreva (Yokota et al., 2011). Do lev´e strany stˇreva se poˇc´ıt´a koneˇcn´ık, esovit´a kliˇcka, sestupn´y traˇcn´ık a 2/3 pˇr´ıcˇ n´eho traˇcn´ıku. Zbytek pˇr´ıcˇ n´eho traˇcn´ıku, vzestupn´y traˇcn´ık a slep´e stˇrevo se zaˇrazuje na pravou stranu stˇreva. Na tuto skuteˇcnost jsem se zamˇeˇrila ve sv´e bakal´aˇrsk´e pr´aci a snaˇzila jsem se porovn´avat genov´e exprese tk´an´ı s ohledem na m´ısto odebr´an´ı tk´anˇe. V datov´ych souborech GSE20916, GSE9254 a GSM8671 bylo uvedeno, ze kter´ych cˇ a´ st´ı tlust´eho stˇreva dan´a tk´anˇ poch´az´ı a ty jsem vyuˇzila pro tuto anal´yzu. Poˇcet pacient˚u v jednotliv´ych kategori´ıch, kteˇr´ı byli z´ıskani z v´ysˇe zmiˇnovan´ych soubor˚u, je uveden v n´asleduj´ıc´ı tabulce (tab. 4). Strana Lev´a Prav´a
Norm´aln´ı tk´anˇ 61 14
Adenom 66 10
Karcinom 25 11
Tabulka 4: Poˇcet pacient˚u v jednotliv´ych kategori´ıch
Na v´ysledky jsem pak nahl´ızˇ ela ze dvou u´ hl˚u pohledu. Za prv´e jsem se zamˇerˇila na sledov´an´ı rozd´ıl˚u genov´e exprese mezi tk´anˇemi s rozdˇelen´ım na pravou a levou stranu stˇreva (obr. 5). N´aslednˇe jsem se zamˇeˇrila na pozorov´an´ı rozd´ıl˚u mezi pravou a levou stranou stˇreva u jednotliv´ych tk´an´ı. V tabulce (tab. 5) je v procentech vyj´adˇrena platnost klasifikaˇcn´ıho pravidla pro BRAF mutaci u jednotliv´ych typ˚u tk´anˇe lokalizovan´ych na lev´e stranˇe stˇreva. 100% platnost u vˇsech tˇr´ı typ˚u jsem pozorovala u p´ar˚u: HSF5 < RSBN1L, TNNC2 < CRIP1, ZSWIM1 < MLPH, CDX2 < S100A16 a ZNF141 < C11orf9. Kromˇe p´aru TNNC2 < CRIP1 tyto p´ary platily ve 100% v cel´em souboru. Naopak p´ary SATB2 < RASSF6, RNF43 < RBM8A, CBFA2T2 < PIWIL1, PHYH < DUSP4, APCDD1 < FSCN1 a C10orf99 < PLLP nikdy neklasifikovali vzorek jako BRAF mutantn´ı. P´ary gen˚u specifick´e pro norm´aln´ı tk´anˇ na lev´e stranˇe stˇreva by mohly b´yt C13orf18 < CTSE a C20orf111 < IK3AP1, u kter´ych plat´ı tato nerovnost ve v´ıce neˇz 85%, coˇz je z´aroveˇn dvojn´asobn´y poˇcet pˇr´ıpad˚u neˇz u adenom˚u a karcinom˚u. U adenom˚u by se dalo o p´arech PPP1R14D < REG4 hovoˇrit jako o specifick´ych pro adenom. V pˇr´ıpadˇe karcinom˚u p´ary PPP1R14C < CD55 a CTTNBP2 < SERPINB5 zachovaly ze 100% klasifikaˇcn´ı pravidlo pro BRAF mutaci v tk´ani. D´ale by specifick´ymi p´ary pro tuto tk´anˇ mohly b´yt DDC < AQP5 a CFTR < KLK10.
18
3 P´ar genu˚ CTTNBP2 < SERPINB5 PPP1R14C < CD55 ZNF141 < C11orf9 CDX2 < S100A16 ZSWIM1 < MLPH TNNC2 < CRIP1 HSF5 < RSBN1L CFTR < KLK10 PPP1R14D < REG4 DDC < AQP5 C20orf111 < IK3AP1 VAV3 < OSBP2 C13orf18 < CTSE AIFM3 < ZIC2 ARID3A < SLC25A37 PTPRO < TM4SF4 AMACR < TPK1 C10orf99 < PLLP ACOX1 < KIAA0802 APCDD1 < FSCN1 PLCB4 < HOXD3 PHYH < DUSP4 TSPAN6 < RBBP8 CBFA2T2 < PIWIL1 CELP < SOX8 RNF43 < RBM8A SPINK1 < PLK2 SATB2 < RASSF6
Norm´aln´ı tk´anˇ 67,2% 77,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 1,6% 27,9% 16,4% 85,2% 26,2% 93,4% 0,0% 21,3% 23,0% 3,3% 0,0% 1,6% 0,0% 9,8% 0,0% 1,6% 0,0% 16,4% 0,0% 1,6% 0,0%
Adenom 100,0% 98,5% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 37,9% 93,9% 3,0% 40,9% 9,1% 45,5% 0,0% 21,2% 19,7% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 10,6% 0,0% 0,0% 0,0%
´ VYSLEDKY
Karcinom 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 60,0% 60,0% 60,0% 40,0% 24,0% 16,0% 12,0% 4,0% 4,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0%
Tabulka 5: Procento p´ar˚u gen˚u u jednotliv´ych typ˚u tk´an´ı z lev´e strany stˇreva splˇnuj´ıc´ıch pravidlo G1 < G2
V dalˇs´ı tabulce (tab. 6) je opˇet v procentech vyj´adˇrena platnost klasifikaˇcn´ıho pravidla pro BRAF mutaci u jednotliv´ych typ˚u tk´anˇe, ale tentokr´at lokalizovan´ych na prav´e stranˇe stˇreva. 100% platnost u vˇsech tˇr´ı typ˚u jsem pozorovala znovu u p´ar˚u: HSF5 < RSBN1L, TNNC2 < CRIP1, ZSWIM1 < MLPH, CDX2 < S100A16 a ZNF141 < C11orf9. Naopak p´ary SATB2 < RASSF6, RNF43 < RBM8A, CBFA2T2 < PIWIL1, PHYH < DUSP4, APCDD1 < FSCN1 a C10orf99 < PLLP nikdy neklasifikovaly vzorek jako BRAF mutantn´ı. Na rozd´ıl od tk´an´ı z lev´e strany stˇreva, u p´aru SPINK1 < PLK2 jem v ani jednom pˇr´ıpadˇe nepozorovala platnost pravidla specifick´eho pro BRAF mutaci. Pˇri sledov´an´ı rozd´ıl˚u mezi tˇremi typy tk´anˇe stoj´ı za zm´ınku v´ıce neˇz 21%platnost klasifikaˇcn´ıho pravidla pro BRAF mutaci u p´aru PLCB4 < HOXD3 pro norm´aln´ı tk´anˇ zat´ımco u adenom˚u a karcinom˚u nebyl ani jeden v´yskyt. Obdobnˇe p´ar AIFM3 < ZIC2 pro karcinom klasifikoval 18,2%vzork˚u jako BRAF mutantn´ıch, kdeˇzto v pˇr´ıpadˇe adenomu a norm´aln´ı tk´anˇe jsem klasifikovala 0% Zjiˇst’ov´an´ım gen˚u, kter´e by mohly b´yt specifick´e pro jednotliv´e tk´anˇe odebran´e na prav´e stranˇe stˇreva, jsou v´ysledky v pˇr´ıpadˇe adenom˚u totoˇzn´e s levou stranou stˇreva. Pro norm´aln´ı 19
3
´ VYSLEDKY
tk´anˇ by specifick´ym p´arem gen˚u mohl b´yt p´ar C20orf111 < IK3AP1, kter´y splˇnoval pravidlo G1 < G2 pro BRAF mutaci ve vˇsech vzorc´ıch. A pro karcinom z prav´e strany stˇreva povaˇzuji za specifick´e p´ary PPP1R14C < CD55 a CTTNBP2 < SERPINB5. P´ar genu˚ CTTNBP2 < SERPINB5 PPP1R14C < CD55 ZNF141 < C11orf9 CDX2 < S100A16 ZSWIM1 < MLPH TNNC2 < CRIP1 HSF5 < RSBN1L CFTR < KLK10 PPP1R14D < REG4 DDC < AQP5 C20orf111 < IK3AP1 VAV3 < OSBP2 C13orf18 < CTSE AIFM3 < ZIC2 ARID3A < SLC25A37 PTPRO < TM4SF4 AMACR < TPK1 C10orf99 < PLLP ACOX1 < KIAA0802 APCDD1 < FSCN1 PLCB4 < HOXD3 PHYH < DUSP4 TSPAN6 < RBBP8 CBFA2T2 < PIWIL1 CELP < SOX8 RNF43 < RBM8A SPINK1 < PLK2 SATB2 < RASSF6
Norm´aln´ı tk´anˇ 64,3% 57,1% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 28,6% 7,1 % 28,6% 100,0% 0,0% 71,4% 0,0% 28,6% 35,7% 21,4% 0,0% 7,1% 0,0% 21,4% 0,0% 7,1% 0,0% 28,6% 0,0% 0,0% 0,0%
Adenom 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 50,0% 100,0% 10,0% 40,0% 10,0% 70,0% 0,0% 20,0% 30,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 10,0% 0,0% 0,0% 0,0%
Karcinom 90,9% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 54,5% 72,7% 27,3% 36,4% 27,3% 27,3% 18,2% 18,2% 18,2% 0,0% 9,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 9,1% 0,0% 18,2% 0,0% 0,0% 9,1%
Tabulka 6: Procento p´ar˚u gen˚u u jednotliv´ych typ˚u tk´an´ı z prav´e strany stˇreva splˇnuj´ıc´ıch pravidlo G1 < G2
20
21 3 ´ VYSLEDKY
Obr´azek 5: Prouˇzkov´e grafy pro p´ary gen˚u u norm´aln´ı tk´anˇe, adenom˚u a karcinom˚u
3
´ VYSLEDKY
U norm´aln´ı tk´anˇe jsem pozorovala ze 100% zachov´an´ı vztah˚u pro BRAF mutaci u p´ar˚u ZNF141 < C11orf9, CDX2 < S100A16, ZSWM1 < MLPH, TNNC2 < CRIP1 a HSF5 < RSDN1L, a to bez z´avislosti na stranˇe v´yskytu ve stˇrevˇe. Zaj´ımavost´ı je, zˇ e vztah VAV3 < OSBP2 byl v norm´aln´ı tk´ani na lev´e stranˇe stˇreva zachovan´y ve v´ıce jak 1/4 pˇr´ıpad˚u, zat´ımco na stranˇe prav´e nebyl zachov´an ani v jednom pˇr´ıpadˇe. V n´asleduj´ıc´ı tabulce (tab. 7) jsem zaznamenala v kolikati procentech pˇr´ıpad˚u plat´ı vztah gen˚u G1 < G2, kter´y je specifick´y pro BRAF mutantn´ı n´adory, v norm´aln´ı tk´ani s ohledem na m´ısto odebr´an´ı. Pro zjiˇst’ov´an´ı, zda je rozd´ıl mezi pravou a levou stranou statisticky v´yznamn´y jsem pouˇzila Pearson˚uv ch´ı-kvadr´at test na hladinˇe v´yznamnosti α=0.05. Na z´akladˇe p-hodnoty jsem urˇcila p´ary gen˚u VAV3 < OSBP2 a PPP1R14D < REG4 jako specifick´e pro levou stranu stˇreva a p´ary CFTR < KLK10 a AMACR < TPK1 jako specifick´e pro pravou stranu stˇreva. V´ysledky by mohly znamenat, zˇ e BRAF mutanti maj´ı rozd´ılnˇe exprimovan´e geny na lev´e a prav´e stranˇe stˇreva. P´ar genu˚ VAV3 < OSBP2 CFTR < KLK10 AMACR < TPK1 PPP1R14D < REG4 PLCB4 < HOXD3 TSPAN6 < RBBP8 ACOX1 < KIAA0802 DDC < AQP5 CELP < SOX8 PPP1R14C < CD55 C13orf18 < CTSE PTPRO < TM4SF4 SPINK1 < PLK2 C20orf111 < IK3AP1 ARID3A < SLC25A37 CTTNBP2 < SERPINB5 SATB2 < RASSF6 RNF43 < RBM8A CBFA2T2 < PIWIL1 PHYH < DUSP4 APCDD1 < FSCN1 C10orf99 < PLLP AIFM3 < ZIC2 HSF5 < RSBN1L TNNC2 < CRIP1 ZSWIM1 < MLPH CDX2 < S100A16 ZNF141 < C11orf9
Lev´a strana 26,2% 1,6% 3,3% 27,9% 9,8% 1,6% 1,6% 16,4% 16,4% 77,0% 93,4% 23,0% 1,6% 85,2% 21,3% 67,2% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0%
Prav´a strana 0,0% 28,6% 21,4% 7,1% 21,4% 7,1% 7,1% 28,6% 28,6% 57,1% 71,4% 35,7% 0,0% 100,0% 28,6% 64,3% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0%
p-hodnota 0,0000086184 0,0000125468 0,0025256000 0,0030688000 0,2118480000 0,2145422222 0,2145422222 0,2145422222 0,2145422222 0,2203854545 0,2203854545 0,2271733333 0,4434769231 0,5536000000 0,5626133333 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
Tabulka 7: Procento p´ar˚u gen˚u u norm´aln´ı tk´anˇe splˇnuj´ıc´ıch pravidlo G1 < G2 s ohledem na m´ısto v´yskytu (ˇrazeno dle p-hodnoty).
22
3
´ VYSLEDKY
V pˇr´ıpadˇe adenom˚u jsem nepozorovala v´yznamn´e rozd´ıly v zachov´an´ı klasifikaˇcn´ıho pravidla pro BRAF mutace mezi pravou a levou stranou stˇreva (tab. 8). Po pouˇzit´ı Pearsonova ch´ı-kvadr´at testu a n´asledn´e Benjamini-Hochberg korekce p-hodnot jsem zjistila, zˇ e ani jeden p´ar nevyˇsel statisticky v´yznamn´y pro levou nebo pravou stranu stˇreva. P´ar genu˚ C13orf18 < CTSE DDC < AQP5 PTPRO < TM4SF4 CFTR < KLK10 PPP1R14D < REG4 VAV3 < OSBP2 ARID3A < SLC25A37 CELP < SOX8 PPP1R14C < CD55 C20orf111 < IK3AP1 SATB2 < RASSF6 SPINK1 < PLK2 RNF43 < RBM8A CBFA2T2 < PIWIL1 TSPAN6 < RBBP8 PHYH < DUSP4 PLCB4 < HOXD3 APCDD1 < FSCN1 ACOX1 < KIAA0802 C10orf99 < PLLP AMACR < TPK1 AIFM3 < ZIC2 HSF5 < RSBN1L TNNC2 < CRIP1 ZSWIM1 < MLPH CDX2 < S100A16 ZNF141 < C11orf9 CTTNBP2 < SERPINB5
Lev´a strana 45,5% 3,0% 19,7% 37,9% 93,9% 9,1% 21,2% 10,6% 98,5% 40,9% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0%
Prav´a strana 70,0% 10,0% 30,0% 50,0% 100,0% 10,0% 20,0% 10,0% 100,0% 40,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0%
p-hodnota 0,63364 0,73080 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00
Tabulka 8: Procento p´ar˚u gen˚u u adenom˚u splˇnuj´ıc´ıch pravidlo G1 < G2 s ohledem na m´ısto v´yskytu (ˇrazeno dle p-hodnoty).
23
3
´ VYSLEDKY
U karcinom˚u jsem pozorovala (tab. 9) 100% zachov´an´ı vztahu G1 < G2 u sˇesti p´ar˚u: PPP1R14C < CD55, ZNF141 < C11orf9, CDX2 < S100A16, ZSWM1 < MLPH, TNNC2 < CRIP1 a HSF5 < RSDN1L. D´ale jsem pozorovala, zˇ e zat´ımco p´ary C10orf99 < PLLP, TSPAN6 < RBBP8, CELP < SOX8 a SATB2 < RASSF6 s v´yskytem v karcinomech na lev´e stranˇe nikdy neklasifikovaly BRAF mutaci, tak na prav´e stranˇe doˇslo k zachov´an´ı vztahu pro klasifikaci do 20%. Na z´akladˇe Pearsonova ch´ı-kvadr´at testu na hladinˇe v´yznamnosti 0.05 byl tento rozd´ıl urˇcen jako statisticky v´yznamn´y a tyto p´ary povaˇzuji za specifick´e pro kracinom vyskytuj´ıc´ı se na prav´e stranˇe stˇreva. Tak´e p´ary PTPRO < TM4SF4 a ARID3A < SLC25A37 jsem urˇcila jako pravdˇepodobnˇe specifick´e pro pravou stranu stˇreva, protoˇze p-hodnota v ch´ı-kvadr´at testu vyˇsla menˇs´ı neˇz mnou zvolen´a hladina v´yznamnosti. Rozd´ıl u p´aru DDC < AQP5 mezi levou a pravou stranou je 32,7% a na z´akladˇe Pearsnova ch´ı-kvadr´at testu byl tento rozd´ıl urˇcen jako v´yznamn´y a tento p´ar je specifick´y pro v´yskyt karcinomu na lev´e stranˇe stˇreva. P´ar genu˚ CELP < SOX8 DDC < AQP5 SATB2 < RASSF6 TSPAN6 < RBBP8 C10orf99 < PLLP PTPRO < TM4SF4 ARID3A < SLC25A37 C13orf18 < CTSE AIFM3 < ZIC2 PPP1R14D < REG4 CTTNBP2 < SERPINB5 CFTR < KLK10 VAV3 < OSBP2 C20orf111 < IK3AP1 SPINK1 < PLK2 RNF43 < RBM8A CBFA2T2 < PIWIL1 PHYH < DUSP4 PLCB4 < HOXD3 APCDD1 < FSCN1 ACOX1 < KIAA0802 AMACR < TPK1 HSF5 < RSBN1L TNNC2 < CRIP1 ZSWIM1 < MLPH CDX2 < S100A16 ZNF141 < C11orf9 PPP1R14C < CD55
Lev´a strana 0,0% 60,0% 0,0% 0,0% 0,0% 4,0% 4,0% 16,0% 12,0% 60,0% 100,0% 60,0% 24,0% 40,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0%
Prav´a strana p-hodnota 18,2% 0,00055692 27,3% 0,0065184 9,1% 0,01032 9,1% 0,01032 9,1% 0,01032 18,2% 0,01032 18,2% 0,01032 27,3% 0,300755 18,2% 0,75684 72,7% 0,75684 90,9% 1,00 54,5% 1,00 27,3% 1,00 36,4% 1,00 0,0% 1,00 0,0% 1,00 0,0% 1,00 0,0% 1,00 0,0% 1,00 0,0% 1,00 0,0% 1,00 0,0% 1,00 100,0% 1,00 100,0% 1,00 100,0% 1,00 100,0% 1,00 100,0% 1,00 100,0% 1,00
Tabulka 9: Procento p´ar˚u gen˚u u karcinom˚u splˇnuj´ıc´ıch pravidlo G1 < G2 s ohledem na m´ısto v´yskytu (ˇrazeno dle p-hodnoty).
24
3
3.3
´ VYSLEDKY
Pilovit´y adenom vs. nepilovit´e adenomy a karcinomy
Pilovit´e polypy, histologick´e varianty hyperplastick´ych polyp˚u, velmi cˇ asto pˇredstavuj´ı riziko malign´ıho zvratu a uvaˇzuje se o nich jako o n´adorech s jinou cestou vzniku, kter´e v 75-83% maj´ı BRAF mutaci (Leggett et al., 2010). K pozorov´an´ı rozd´ıl˚u odliˇsnˇe exprimovan´ych gen˚u u pilovit´ych adenom˚u a nepilovit´ych adenom˚u jsem mˇela k dispozici pouze jeden soubor GSE12514, kter´y obsahoval jen 8 pacient˚u a pouze 10 kompletn´ıch p´ar˚u gen˚u ke klasifikaci. U 3 pacient˚u byly pozorov´any polypy a u 5 pacient˚u histologick´e varianty hyperplastick´ych polyp˚u - pilovit´e polypy. V pˇr´ıpadˇe pilovit´ych polyp˚u byly na z´akladˇe mTSP 4 vzorky (80%) predikov´any jako BRAF mutantn´ı. U vzork˚u s nepilovitou variantou polyp˚u jsem predikovala pouze jeden (33,3%) jako BRAF mutantn´ı. Pouˇzit´ım Fisherova exaktn´ıho testu jsem zjistila, zˇ e tento rozd´ıl nen´ı v´yznamn´y, ale tento v´ysledek m˚uzˇ e b´yt velmi ovlivnˇen faktem, zˇ e jsem mˇela k dispozici pouze 8 pacient˚u. Specifick´e p´ary gen˚u v pˇr´ıpadˇe pilovit´e varianty polypu by mohly b´yt AMACR < TPK1 a APCDD1 < FSCN1. Z grafu (obr. 6) vid´ıme, zˇ e pravidlo G1 < G2 bylo zachov´ano z 80 a v´ıce procent. Pˇri detailn´ım prozkoum´an´ı jsem zjistila, zˇ e pro tyto dva p´ary vztah plat´ı pr´avˇe u 4 vzork˚u, kter´e na z´akladˇe mTSP splˇnovaly klasifikaˇcn´ı pravidlo pro BRAF mutaci v n´adoru. Pro oba p´ary tak´e platil vztah gen˚u G1 < G2 u pacienta s nepilovit´ym adenomem, kter´eho jsem pˇri pouˇzit´ı mTSP klasifikovala jako pacienta s BRAF mutac´ı. U tohoto pacienta jako jedin´eho s nepilovit´ym adenomem jsem tak´e pozorovala zachov´an´ı vztah˚u G1 < G2 u p´aru CTTNBP2 < SERPINB5. D´ale stoj´ı za zm´ınku p´ary CBFA2T2 < PIWIL1 a RNF43 < RBM8A (p-hodnota u obou < 0,01), kter´e v pˇr´ıpadˇe nepilovit´eho adenomu predikuj´ı BRAF mutaci v 0% zat´ımco u pilovit´eho adenomu jsem detekovala v´yskyt BRAF mutace u 40% vzork˚u. Dalˇs´ı statisticky v´yznamn´y rozd´ıl byl u p´ar˚u TSPAN6 < RBBP8 a PHYH < DUSP4, u kter´ych p-hodnota po Benjamini-Hochbergovˇe korekci vyˇsla < 0,01 a proto by tento p´ar mohl b´yt specifick´y pro nepilovit´e adenomy.
Obr´azek 6: Prouˇzkov´y graf pro p´ary gen˚u u pilovit´ych a nepilovit´ych polyp˚u Ke sledov´an´ı odliˇsnˇe exprimovan´ych gen˚u u pilovit´ych a nepilovit´ych karcinom˚u jsem mˇela k dispozici jen jeden soubor GSE4045, kter´y obsahoval 37 pacient˚u a 16 kompletn´ıch
25
3
´ VYSLEDKY
p´ar˚u gen˚u ke klasifikaci. U 29 pacient˚u byly pozorovan´e karcinomy a 8 pacient˚u byly pozorov´any histologick´e varianty karcinom˚u - pilovit´e karcinomy. V pˇr´ıpadˇe pilovit´ych polyp˚u byly na z´akladˇe mTSP 6 vzork˚u (75%) predikov´any jako BRAF mutantn´ı. U vzork˚u s nepilovitou variantou polyp˚u jsem predikovala 4 vzorky (13,8%) jako BRAF mutantn´ı. Toto procento odpov´ıd´a procentu´aln´ımu zastoupen´ı BRAF-like n´ador˚um, o kter´ych jsem se zmiˇnovala jiˇz dˇr´ıve. I na tyto v´ysledky jsem pouˇzila Fisher˚uv exaktn´ı test a zjistila jsem, zˇ e tento rozd´ıl je statisticky v´yznamn´y. Za specifick´e p´ary gen˚u pro pilovit´e karcinomy jsem urˇcila TSPAN6 < RBBP8 a CFTR < KLK10, kter´e se vyskytly u vˇsech pacient˚u, kteˇr´ı na z´akladˇe mTSP byli klasifikovan´ı jako BRAF mutantn´ı. U pacient˚u s pilovit´ym karcinomem, ale neklasifikovan´ych jako BRAF mutantn´ı, tyto p´ary gen˚u nesplˇnovaly pravidlo G1 < G2. Avˇsak u nepilovit´ych karcinom˚u jsem zˇ a´ dn´e podobn´e znaky nepozorovala. Na garfu (obr. 7) je zobrazeno v kolika procentech pˇr´ıpad˚u bylo zachovan´e pravidlo G1 < G2, kter´e je specifick´e pro BRAF mutantn´ı n´adory, u jednotliv´ych p´ar˚u gen˚u. U p´ar˚u PHYH < DUSP4, PLCB4 < HOXD3, PTPRO < TM4SF4 a RNF43 < RBM8A jsem pomoc´ı Pearsonova ch´ı-kvadrt´a testu zjistila statisticky v´yznamn´y rozd´ıl mezi pilovit´ym a nepilovit´ym karcinomem, p-hodnota po Benjamini-Hochbergovˇe korekci vyˇsla mnohem menˇs´ı neˇz 0,01.
Obr´azek 7: Prouˇzkov´y graf pro p´ary gen˚u u pilovit´ych a nepilovit´ych polyp˚u V tabulce 10 je pˇrehled v kolika procentech plat´ı vztah G1 < G2 u pilovit´ych adenom˚u a karcinom˚u a u nepilovit´ych adenom˚u a karcinom˚u. Porovn´an´ı mezi populac´ı s karcinomem a adenomem bylo moˇzn´e udˇelat jen u sˇesti p´ar˚u. Hned prvn´ı velk´y rozd´ıl jsem pozorovala u p´aru DDC < AQP5, kter´y se v pilovit´ych adenomech vyskytoval v 60%, zat´ımco v pilovit´ych karcinomech ani jednou. Stejn´e to bylo i v pˇr´ıpadˇe nepilovit´ych adenom˚u a karcinom˚u. Dalˇs´ı v´yznamn´y rozd´ıl byl pozorov´an u p´ar˚u CFTR < KLK10 a RNF43 < RBM8A. U tˇechto p´ar˚u platil vztah, kter´y je typick´y pro BRAF mutantn´ı n´adory, u karcinom˚u v 75% a u adenom˚u ve 40% a 60%. Posledn´ı rozd´ıl pozorovan´y mezi pilovit´ymi adenomy a karcinomy je vztah u p´aru PHYH < DUSP4, kter´y se v adenomech v˚ubec nevyskytoval a v karcinomech se vyskytl ve 25%. Naopak u nepilovit´ych adenom˚u a karcinom˚u byl vztah p´aru PHYH < DUSP4 zachov´an u adenom˚u a u karcinom˚u nebyl zachov´an v ani jednom pˇr´ıpadˇe. 26
3
´ VYSLEDKY
Statisticky v´yznamn´y rozd´ıl mezi nepilovit´ymi karcinomy a adenomy vyˇsel tak´e u p´aru RNF43 < RBM8A, u kter´eho vztah G1 < G2 platil v 13,8% pro nepilovit´y karcinom, ale v 0% pro nepilovit´y adenom. Tak´e rozd´ıl u p´aru TSPAN6 < RBBP8 vyˇsel na z´akladˇe Pearsonova ch´ı-kvadr´at testu jako statisticky v´yznamn´y. V nepilovit´em karcinomu byl vztah zachov´an jen ve 24,1% tak u nepilovit´eho adenomu ve 100%. Vˇsechny rozd´ıly vyˇsly statisticky v´yznamn´e na z´akladˇe Pearsonova ch´ı-kvadr´at testu. V´ysledn´e p-hodnoty po pouˇzit´ı Benjamini- Hochbergovˇe korekci byly mnohem menˇs´ı neˇz 0,01, jen v pˇr´ıpadˇe sledov´an´ı rozd´ıl˚u mezi pilovit´ymi adenomy a karcinomy u p´aru RNF43 < RBM8A byla p-hodnota rovna 0,03939. P´ar genu˚ AMACR < TPK1 DDC < AQP5 TSPAN6 < RBBP8 CFTR < KLK10 RNF43 < RBM8A PHYH < DUSP4 APCDD1 < FSCN1 GGH < PPPDE2 CBFA2T2 < PIWIL1 CTTNBP2 < SERPINB5 TNNC2 < CRIP1 ZSWIM1 < MLPH ZNF141 < C11orf9 PTPRO < TM4SF4 ARID3A < SLC25A37 ACOX1 < KIAA0802 PLCB4 < HOXD3 CELP < SOX8 VAV3 < OSBP2 SPINK1 < PLK2
Pilovit´y adenom 100,0% 60,0% 60,0% 40,0% 40,0% 0,0% 80,0% 60,0% 40,0% 20,0% -
Pilovit´y karcinom 87,5% 0,0% 75,0% 75,0% 62,5% 25,0% 100,0% 100,0% 100,0% 87,5% 87,5% 62,5% 25,0% 0,0% 0,0% 0,0%
Nepilovit´y adenom 66,7% 66,7% 100,0% 33,3% 0,0% 33,3% 66,7% 33,3% 0,0% 33,3% -
Nepilovit´y karcinom 86,2% 0,0% 24,1% 20,7% 13,8% 0,0% 86,2% 100% 100% 51,7% 100,0% 51,7% 3,5% 0,0% 0,0% 0,0%
Tabulka 10: Procento p´ar˚u gen˚u u pilovit´ych adenom˚u a karcinom˚u splˇnuj´ıc´ıch pravidlo G1 < G2.
Vzhledem k n´ızk´emu poˇctu vzork˚u se nalezen´e rozd´ıly mus´ı interpretovat opatrnˇe. K jejich potvrzen´ı bude nutno prov´est dalˇs´ı anal´yzy na vˇetˇs´ıch datov´ych souborech, prozat´ım nedostupn´ych. Na grafu vˇsak vid´ıme, zˇ e by pilovit´e polypy a karcinomy mohly m´ıt odliˇsnosti v expresi gen˚u a proto si mysl´ım, zˇ e stoj´ı za to se v budoucnu vˇenovat studiu tˇechto variant polyp˚u a karcinom˚u.
3.4
Testov´an´ı sk´ore
C´ılem testov´an´ı bylo zjistit, zda existuj´ı statisticky v´yznamn´e rozd´ıly v expresi gen˚u v norm´aln´ı tk´ani, adenomu a karcinomu a urˇcit, kter´e konkr´etn´ı dvojice se liˇs´ı. K testov´an´ı jsem vyuˇzila sk´ore, kter´e jsem uˇz jednou z´ıskala v mTSP, a to sice odeˇctem pr˚umˇern´e exprese gen˚u na lev´e stranˇe rovnice od pr˚umˇern´e exprese gen˚u na stranˇe prav´e (sk´ore = pr˚umˇer GR pr˚umˇer GL). Nemohla jsem pouˇz´ıt expresi gen˚u, protoˇze vztahy menˇs´ı/vˇetˇs´ı neˇz druh´y gen 27
3
´ VYSLEDKY
nic neˇr´ıkaj´ı o absolutn´ım rozd´ılu mezi dvˇema geny, proto jsem porovn´avala sk´ore. Na grafu (obr. 8) je vykresleno rozloˇzen´ı sk´ore pro vˇsechny tˇri skupiny. Nulov´e hypot´ezy byly n´asleduj´ıc´ı: H0 : Mezi sk´ore populace s norm´aln´ı tk´an´ı a populace s adenomem nen´ı rozd´ıl. H0 : Mezi sk´ore populace s norm´aln´ı tk´an´ı a populace s karcinomem nen´ı rozd´ıl. H0 : Mezi sk´ore populace s adenomem a populace s karcinomem nen´ı rozd´ıl. Alternativn´ı hypot´ezy ve vˇsech tˇrech pˇr´ıpadech byly tvaru: sk´ore mezi dvˇema populacemi je rozd´ıln´e, brala jsem v u´ vahu obˇe extr´emn´ı varianty - extr´emnˇe n´ızk´e i extr´emnˇe vysok´e hodnoty testov´e statistiky.
Obr´azek 8: Histogramy zn´azorˇnuj´ıc´ı rozloˇzen´ı sk´ore pro jednotliv´e populace Pro ovˇeˇren´ı normality dat jsem pouˇzila Shapiro-Wilk˚uv test. Z v´ysledk˚u Shapiro-Wilkova testu bylo patrn´e, zˇ e nelze zam´ıtnout nulovou hypot´ezu, zˇ e sk´ore vypoˇc´ıtan´e pro tk´anˇ z karcinomu m´a norm´aln´ı rozloˇzen´ı. V pˇr´ıpadˇe adenomu a norm´aln´ı tk´anˇe p-hodnota vyˇsla mnohem menˇs´ı neˇz 0,05 a nulovou hypot´ezu o normalitˇe dat jsem zam´ıtla. Na z´akladˇe graf˚u (obr. 9) jsem pozorovala u adenomu a norm´aln´ı tk´anˇe log-norm´aln´ı rozloˇzen´ı s v´yskytem z´aporn´ych hodnot, kter´e mi zabraˇnovaly v pouˇzit´ı logaritmick´e transformace pro z´ısk´an´ı norm´aln´ıho rozloˇzen´ı. D´ıky tomuto faktu se mi v´ybˇer vhodn´eho statistick´eho testu z´uzˇ il na neparametrick´e testy, kter´e nemaj´ı pˇredpoklady o rozloˇzen´ı vstupn´ıch dat a lze je pouˇz´ıt i pˇri asymetrick´em rozloˇzen´ı. Dalˇs´ı d˚uleˇzitou roli pˇri v´ybˇeru testu sehr´ala skuteˇcnost, zˇ e mezi skupinami neexistuje vazba typu cˇ lovˇek pˇred a po operaci, ale jedn´a se o zcela nez´avisl´e skupiny pacient˚u. Na z´akladˇe tˇechto krit´eri´ı jsem se rozhodla vybrat Mann-Whitneyho test. Hladinu v´yznamnosti testu α stanov´ım 0,05 a vzhledem ke tvaru alternativn´ı hypot´ezy jsem pouˇzila oboustrann´y test. Korekci p-hodnot na mnohon´asobn´e porovn´av´an´ı jsem pouˇzila BenjaminiHochbergovu. Porovn´av´an´ım skupin s norm´aln´ı tk´an´ı a adenomem jsem nulovou hypot´ezu zam´ıtla, mezi sk´ore populace s norm´aln´ı tk´an´ı a populace s adenomem je rozd´ıl, sk´ore populace s norm´aln´ı tk´an´ı je menˇs´ı neˇz sk´ore populace s adenomem. V pˇr´ıpadˇe porovn´av´an´ı skupin s norm´aln´ı tk´an´ı a karcinomem jsem nulovou hypot´ezu opˇet zam´ıtla. Mezi sk´ore populace s norm´aln´ı tk´an´ı a populace s karcinomem je rozd´ıl, sk´ore populace s norm´aln´ı tk´an´ı je menˇs´ı neˇz sk´ore populace s karcinomem. Ovˇsem v pˇr´ıpadˇe tˇret´ı hypot´ezy jsem nulovou hypot´ezu nezam´ıtla. V´ysledky jsou zn´azornˇen´e na n´asleduj´ıc´ım grafu (obr. 9).
28
3
Obr´azek 9: Boxplot porovn´an´ı sk´ore pro jednotliv´e populace
29
´ VYSLEDKY
4
4
´ ´ BIOLOGICKO - MEDICINSK A´ INTERPRETACE VYSLEDK U˚
Biologicko - medic´ınsk´a interpretace v´ysledku˚
V t´eto kapitole bych se r´ada pod´ıvala na vliv jednotliv´ych gen˚u z p´ar˚u gen˚u, kter´e byly v pˇredchoz´ı kapitole vybr´any jako specifick´e. Oba geny z p´aru AMACR < TPK1 jsou cˇ leny metabolick´e dr´ahy. AMACR ovlivˇnuje prim´arn´ı biosynt´ezu zˇ luˇcov´ych kyselin, TPK1 pak ovlivˇnuje metabolismu tyaminu. Gen CFTR, kter´y byl jako pˇredeˇsl´y p´ar specifick´y pro norm´aln´ı tk´anˇ s v´yskytem na prav´e stranˇe stˇreva, ovlivˇnuje sekreci zˇ luˇci a zˇ aludeˇcn´ıch kyselin. Gen KLK10, kter´y tvoˇr´ı p´ar a CFTR, ovlivˇnuje transport chloridov´ych iont˚u. Jedn´a se tedy o geny, kter´e jsou pˇr´ımo specifick´e pro stˇrevo a jeho norm´aln´ı funkci, proto bych cˇ ekala zmˇeny v genov´e expresi u gastrointestin´aln´ıch n´ador˚u. VAV3 hraje d˚uleˇzitou roli v angiogenezi, novotvorbˇe c´ev, kter´a je v´yznamn´ym faktorem pod´ılej´ıc´ım se na sˇ´ıˇren´ı n´ador˚u. OSBP2 je zodpovˇedn´y za spojov´an´ı 7-ketocholesterolu. Tyto dva geny tvoˇr´ı p´ar, kter´y byl spolu s p´arem PPP1R14D < REG4 zvolen´y jako specifick´y p´ar pro norm´aln´ı tk´anˇ na lev´e stranˇe. PPP1R14D ovlivˇnuje fosforylaci serin/threonin proteinu a REG4 vyvol´av´a z´anˇetliv´e odpovˇedi gastrointestin´aln´ıho epitelu. DDC najdeme v mnoha drah´ach, jako napˇr´ıklad metabolismus fenylalaninu, histidinu, tryptofanu a tyrosinu. D´ale ovlivˇnuje z´avislost na amfetam´ınu, alkoholu cˇ i kokainu. Druh´y z p´aru DDC < AQP5 ovlivˇnuje sekreci slinn´ych zˇ l´az. Jelikoˇz je zn´amo, zˇ e pit´ı alkoholu, kouˇren´ı cˇ i bran´ı jin´ych n´avykov´ych l´atek patˇr´ı mezi rizikov´e faktory, pak by nikoho asi nemˇelo pˇrekvapit, zˇ e gen DDC se vyskytl mezi 64 geny dostaˇcuj´ıc´ımi pro identifikaci BRAF mutace v tlust´em stˇrevˇe. U gen˚u C10orf99 a CELP zat´ım nen´ı zn´ama jejich funkce. Gen PLLP, kter´y tvoˇr´ı p´ar s C10orf99, ˇr´ıd´ı tvorbu myelinov´e pochvy kolem nervov´ych vl´aken a tak´e se u´ cˇ astn´ı transportu sign´al˚u nervov´e soustavy. SOX8, kter´y ej v p´aru s CELP, hraje d˚uleˇzitou roli v centr´aln´ı nervov´em syst´emu a v´yvoji limbick´eho syst´emu. Prvn´ı z p´aru TSPAN6 < RBBP8 reguluje bunˇecˇ n´y v´yvoj, aktivitu, r˚ust a pohyb, zat´ımco druh´y jmenovan´y se pod´ıl´ı na regulaci mei´ozy a mit´ozy. Tady by se dalo spekulovat o tom, zda zv´ysˇen´a cˇ i sn´ızˇ en´a exprese genu RBBP8 m´a za n´asledek aktivnˇejˇs´ı mei´ozu a mit´ozu u BRAF mutantn´ıch n´ador˚u. Dalˇs´ı p´ar specifick´y pro n´adory vyskytuj´ıc´ı se na prav´e stranˇe stˇreva SATB2 < RASSF6 m´a d˚uleˇzitou roli v bunˇecˇ n´em cyklu. SATB2 je zapojen´y do regulace transkripce a RASSF6 je schopn´y navodit apopt´ozu. Gen PTPRO ovl´ad´a tyrosinfosf´atovou aktivitu a gen TM4SF4 reguluje proliferaci epiteli´aln´ıch bunˇek ve stˇrevˇe. Posledn´ı p´ar, kter´y jsem urˇcila jako specifick´y pro n´adory na prav´e stranˇe stˇreva ARID3A < SLC25A37, se pod´ıl´ı na diferenciaci lymfocyt˚u a na nezbytn´e biosynt´eze hemu. Zv´ysˇen´a exprese genu APCDD1, kter´y byl oznaˇcen´y jako specifick´y pro pilovit´e adenomy, je cˇ asto spojovan´a s kolorekt´aln´ımi karcinomy. Jeho d˚uleˇzit´ym u´ kolem je inhibice Wnt sign´aln´ı dr´ahy, kter´a ˇr´ıd´ı dˇelen´ı, diferenciaci a pˇreˇz´ıv´an´ı bunˇek. P´arov´ym genem je FSCN1, kter´y organizuje aktinov´e filamenty a formuje bunˇecˇ n´e v´ystupky, jako biˇc´ıky, kter´e jsou d˚uleˇzit´e pro pohyb a migraci bunˇek. Dalˇs´ı p´ar specifick´y pro pilovit´e adenomy byl RNF43 < RBM8A. RNF43 reguluje tvorbu ubiquitinu a RBM8A se vyskytuje v dr´aze ˇr´ıd´ıc´ı transport RNA. N´asleduj´ıc´ı dva p´ary byly zvoleny jako specifick´e pro nepilovit´e adenomy. CTTNBP2 k´oduje protein se sˇesti se opakuj´ıc´ımi ankyriny a nˇekolika oblastmi bohat´ymi na prolin. SERPINB5 je cˇ lenem p53 sign´aln´ı dr´ahy, kter´a zastavuje bunˇecˇ n´y cyklus v pˇr´ıpadˇe, zˇ e je poˇskozen´a DNA aˇz do doby neˇz je opravena. Pokud opravy nemohou b´yt provedeny, pak buˇnka vstupuje do apopt´ozy. Gen PHYH k´oduje tvorbu peroxisom˚u a jeho p´arov´y kolega DUSP4 reguluje MAPK kask´adu defosforylac´ı treoninu nebo tyrozinu. P´ary TSPAN6 < RBBP8, CFTR < KLK10, RNF43 < RBM8A, PHYH < DUSP4 a PTPRO < TM4SF4, kter´e byly specifick´e pro pilovit´e karcinomy, jsem jiˇz popsala v´ysˇe a jedi30
4
´ ´ BIOLOGICKO - MEDICINSK A´ INTERPRETACE VYSLEDK U˚
n´ym nezm´ınˇen´ym p´arem je PLCB4 < HOXD3. HOXD3 je d˚uleˇzit´y transkripˇcn´ı faktor, kter´y hraje d˚uleˇzitou roli v morfogenezi. Gen PLCB4 najdeme ve spoustˇe r˚uzn´ych dr´ah´ach. Za zm´ınku stoj´ı sekrece slinivky bˇriˇsn´ı, sekrece slinn´ych zˇ l´az, sekrece zˇ aludeˇcn´ıch sˇt’a´ v, v´apn´ıkov´a sign´aln´ı dr´aha a Wnt sign´aln´ı dr´aha. Tyto informace by mohly pomoci s biologick´ym pochopen´ım probl´emu. Spuˇstˇen´ı experimentu na myˇs´ıch modelech cˇ i bunˇecˇ n´ych lini´ıch by mohlo zjisti, jak vyˇradit nˇekter´y z v´ysˇe zmiˇnovan´ych gen˚u a jak se zmˇen´ı agresivita BRAF mutantn´ıho n´adoru po vyˇrazen´ı, pˇr´ıpadnˇe jak je tento gen citliv´y na biologickou l´ecˇ bu.
31
5
5
DISKUSE
Diskuse
V´ysledky ukazuj´ı, zˇ e predikce BRAF V600E mutace v n´adorech tlust´eho stˇreva na z´akladˇe porovn´av´an´ı 32 p´ar˚u gen˚u detekuje nˇekter´e p´ary do skupiny BRAF mutace jiˇz v norm´aln´ı tk´an´ı a tyto p´ary jsou tak´e detekovan´e v tk´ani adenomu a poˇca´ teˇcn´ıch st´adi´ıch v´yvoje karcinomu. Ot´azkou je, zda by tyto p´ary byly dostateˇcn´e k predikov´an´ı BRAF mutace ve vyv´ıjej´ıc´ıch se karcinomech. Pˇredpokl´ad´am, zˇ e nejlepˇs´ı cestou ke zjiˇstˇen´ı, by bylo sledov´an´ı potenci´aln´ıch pacient˚u, za kter´e povaˇzuji ty, v jejichˇz rodinˇe se nˇekdy vyskytl n´ador tlust´eho stˇreva nebo kteˇr´ı jiˇz jednou touto rakovinou proˇsli. Odebr´an´ı tk´anˇe z adenomu a pˇr´ıpadnˇe i okoln´ı tk´anˇe, kter´a se z histologick´eho hlediska povaˇzuje za norm´aln´ı, a popˇr´ıpadˇe karcinomu, za pˇredpokladu zˇ e nenastalo u´ pln´e odstranˇen´ı adenomu a t´ım p´adem nedoˇslo k v´yvoji karcinomu u pacient˚u a porovn´an´ı genov´e exprese tˇechto vzork˚u by n´am mohlo l´epe osvˇetlit zmˇeny vedouc´ı ke vzniku karcinomu a pomohlo by n´am s potvrzen´ım teorie, zˇ e zmˇeny v genov´e expresi mohou vznikat jiˇz na u´ rovni norm´aln´ı tk´anˇe. A vˇsak jsem si vˇedoma cˇ asov´e a finanˇcn´ı n´aroˇcnosti tohoto n´avrhu a tak´e n´aroˇcnost´ı pro pacienty je mi jasn´e, zˇ e je to nere´aln´e. Na druhou stranu by pomohlo testov´an´ı na myˇs´ıch modelech, ze kter´eho by se mohl vyvinout nˇejak´y diagnostick´y test, kter´y by uˇz z tk´anˇe adenomu u pacienta zjistil, zda u nˇej nedoch´az´ı ke zmˇen´am vedouc´ım k BRAF agresivn´ı formˇe n´adoru. V pˇr´ıpadˇe pozorov´an´ı rozd´ıl˚u zmˇen v genov´e expresi na lev´e a prav´e stranˇe stˇreva jsem se na v´ysledky d´ıvala ze dvou u´ hl˚u pohledu. Za prv´e jak´e jsou rozd´ıly v genov´e expresi ve v´yvoji n´adoru mezi pravou a levou stranou stˇreva. A za druh´e jak´e jsou rozd´ıly v dan´e tk´an´ı v z´avislosti na stranˇe stˇreva, ze kter´e byla tk´anˇ odebran´a. Na z´akladˇe znalost´ı, zˇ e BRAF mutace se vyskytuje v 60% pˇr´ıpad˚u na prav´e stranˇe, jsem pˇredpokl´adala rozd´ıly v genov´e expresi mezi pravou a levou stranou stˇreva. V´ysledky t´eto pr´ace ukazuj´ı, zˇ e jsem se ve sv´ych pˇredpokladech moc nem´ylila, protoˇze u tk´anˇe z n´adoru jsem pozorovala zmˇenu v sedmi p´arech gen˚u, rozd´ıly se pohybuj´ı v rozmez´ı 10-33%, u adenomu jsem nepozorovala zˇ a´ dn´e rozd´ıly a u norm´aln´ı tk´anˇe byl rozd´ıl mezi levou a pravou stranou stˇreva u pˇeti p´ar˚u v rozmez´ı 10-26%. Vˇsechny tyto rozd´ıly vyˇsly statisticky v´yznamn´e. Pˇri zjiˇst’ov´an´ı, ve kter´em st´adiu v´yvoje n´adoru doch´az´ı ke zmˇen´am v genov´e expresi na lev´e a prav´e stranˇe stˇreva, jsem dospˇela k z´avˇeru, zˇ e na obou stran´ach stˇreva pozorujeme zmˇeny uˇz v norm´aln´ı tk´ani. P´ary, u kter´ych platil vztah G1 < G2, kter´y je specifick´y pro BRAF mutaci, uˇz v norm´aln´ı tk´ani, tak platil tak´e v tk´ani adenomu a karcinomu. Probl´emem studia pilovit´ych a nepilovit´ych polyp˚u, se kter´ym jsem se musela vypoˇra´ dat, byl nedostatek vzork˚u, kter´y mi poskytl pouze jeden soubor o 8 pacientech, nebot’ u ostatn´ıch nebylo uvedeno o jak´y typ adenomu se jedn´a. Avˇsak i na tak mal´em souboru se objevily rozd´ıly genov´e exprese u pilovit´ych polyp˚u oproti ostatn´ım typ˚um adenom˚u. Se stejn´ym probl´emem jsem se pot´ykala i v pˇr´ıpadˇe hled´an´ı rozd´ıl˚u v genov´e expresi u pilovit´ych adenom˚u. I kdyˇz jsem mˇela k dispozici 8 pacient˚u s pilovit´ym polypem a 29 s nepilovit´ym, v´ysledky se st´ale nedaj´ı povaˇzovat za reprezentativn´ı. D˚uleˇzit´ym krokem do budoucna je z´ısk´av´an´ı z´aznam˚u pacient˚u, o jak´y typ adenomu a karcinomu se jedn´a, a vytv´aˇren´ı dalˇs´ıch datov´ych soubor˚u, na kter´ych by se daly ovˇeˇrit v´ysledky m´e pr´ace. Tyto z´aznamy by tak´e mohly b´yt uˇziteˇcn´e pro lepˇs´ı urˇcen´ı specifick´ych gen˚u pro jednu cˇ i druhou skupinu polyp˚u a n´ador˚u. Osobnˇe povaˇzuji za d˚uleˇzit´e soustˇredit se na zkoum´an´ı pilovit´ych adenom˚u, jelikoˇz pr´avˇe u nich je cˇ asto pozorovan´y malign´ı zvrat a vysok´y v´yskyt BRAF V600E mutace.
32
´ ER ˇ ZAV
Z´avˇer Tato pr´ace se zab´yvala studiem exprese gen˚u, kter´e byly zjiˇstˇeny jako typick´e pro V600E BRAF mutantn´ı n´adory tlust´eho stˇreva, z´ıskan´ych z norm´aln´ı tk´anˇe, adenomu a poˇca´ teˇcn´ıch st´adi´ı karcinomu. C´ılem pr´ace bylo prostudov´an´ı dynamiky zmˇen v expresi gen˚u a stanoven´ı, ve kter´em obdob´ı v´yvoje n´adoru a v kter´e cˇ a´ sti stˇreva doch´az´ı ke zmˇen´am exprese. V´yznamn´ym pˇredpokladem pro anal´yzu a n´aslednˇe spr´avnou interpretaci v´ysledk˚u se stalo naˇcten´ı dostupn´e literatury t´ykaj´ıc´ı se probl´emu vzniku n´ador˚u v tlust´em stˇrevˇe, mutace, a to pˇredevˇs´ım mutace BRAF proteinu a samozˇrejmˇe nem˚uzˇ u opomenout MAPK/ERK sign´aln´ı kask´adu, jej´ımˇz d˚uleˇzit´ym cˇ lenem je pr´avˇe BRAF protein. D˚uleˇzit´ym krokem bylo tak´e detailn´ı nastudov´an´ı metod, zejm´ena mnohon´asobn´eho klasifik´atoru top-sk´oruj´ıc´ıch p´ar˚u zaloˇzen´eho na porovn´av´an´ı 32 p´ar˚u gen˚u, kter´e byly stanoven´e jako dostateˇcn´e pro klasifikaci n´adoru s V600E BRAF mutac´ı. Mnohon´asobn´y klasifik´ator top-sk´oruj´ıc´ıch p´aru jsem aplikovala na 9 veˇrejnˇe dostupn´ych datov´ych soubor˚u, kter´e byly vybr´any na z´akladˇe urˇcit´ych krit´eri´ı. Datov´e soubory musely obsahovat z´aznamy z expresn´ıch mikroˇcip˚u. Dalˇs´ım krit´eriem bylo zvolen´ı takov´ych datov´ych soubor˚u, kter´e obsahovaly z´aznamy z bunˇek norm´aln´ıch tk´an´ı, adenom˚u a cˇ asn´ych st´adi´ı n´ador˚u tlust´eho stˇreva. Veˇsker´e anal´yzy jsem pak prov´adˇela v programu R. D´ale jsem na data pouˇzila klasifik´ator top-sk´oruj´ıc´ıch p´ar˚u na jednotliv´e p´ary gen˚u pro zjiˇstˇen´ı, kter´e p´ary gen˚u a s jak´ym pod´ılem v populaci zachov´avaj´ı pravidlo G1 < G2 pro identifikaci BRAF mutace v tk´ani. Na z´akladˇe tˇechto v´ysledk˚u jsem definovala geny, kter´e by mohly b´yt specifick´e pro norm´aln´ı tk´anˇ , adenom a poˇca´ teˇcn´ı st´adium v´yvoje n´adoru. A naopak jsem definovala i nˇekter´e geny, kter´e v˚ubec nebyly specifick´e pro BRAF mutantn´ı n´adory, protoˇze se naˇsly ve 100% pˇr´ıpad˚u ve vˇsech tˇrech typech tk´anˇe. Vˇetˇsina tˇechto gen˚u by mˇela b´yt velmi specifick´a a proto si mysl´ım, zˇ e si zasluhuj´ı podrobnˇejˇs´ı pˇrezkoum´an´ı. Z v´ysledk˚u zveˇrejnˇen´ych v t´eto pr´aci se uk´azalo, zˇ e p´ary gen˚u, kter´e byly v norm´aln´ı tk´an´ı klasifikov´any jako BRAF mutantn´ı, byly tak´e klasifikov´any v tk´ani adenomu a karcinomu. Tyto v´ysledky n´am d´avaj´ı nadˇeji, zˇ e by se mutace BRAF V600E v tlust´em stˇrevˇe dala odhalit v cˇ asn´ych st´adi´ıch v´yvoje n´adoru. V dalˇs´ım kroku jsem vyuˇzila moˇznost´ı, kter´e mi nab´ızely 3 soubory k tomu, abych do vyhodnocov´an´ı zavedla dalˇs´ı parametr, a to sice m´ısto odebr´an´ı dan´e tk´anˇe. Pˇrid´an´ım tohoto parametru jsem z p˚uvodn´ıch tˇr´ı zkouman´ych skupin dostala skupin 6 - norm´aln´ı tk´anˇ lev´a a prav´a strana, adenom lev´a a prav´a strana a karcinom lev´a a prav´a strana stˇreva. Nejprve jsem se zamˇeˇrila na pozorov´an´ı rozd´ıl˚u mezi dan´ymi tk´anˇemi s ohledem na stranu stˇreva. Jak na lev´e, tak na prav´e stranˇe stˇreva byly viditeln´e zmˇeny genov´e exprese u norm´aln´ı tk´anˇe. N´aslednˇe jsem se zamˇeˇrila na zkoum´an´ı pro kaˇzdou tk´anˇ zvl´asˇt’ s ohledem na stranu odebr´an´ı. U norm´aln´ı tk´anˇe jsem pozorovala rozd´ıl u 5 p´ar˚u, u adenomu u ani jednoho, avˇsak u tk´anˇe n´adorov´e jsem pozorovala rozd´ıl u 7 p´ar˚u gen˚u. Po aplikov´an´ı Pearsonova ch´ı-kvadr´at testu a n´asledn´e Benjamini-Hochbergovˇe korekci p-hodnot vyˇsly tyto rozd´ıly statisticky v´yznamn´e. Posledn´ı vyuˇzit´ı klasifik´atoru v m´e pr´aci bylo pˇri hled´an´ı odliˇsnost´ı v genov´e expresi mezi pilovit´ymi a nepilovit´ymi adenomy i karcinomy. Tento u´ daj jsem mˇela k dispozici jen u dvou soubor˚u o celkem 45 pacientech. Z tohoto d˚uvodu nem˚uzˇ u v´ysledky povaˇzovat za reprezentativn´ı. Budu-li m´ıt v budoucnu pˇr´ıleˇzitost, pak bych se r´ada zab´yvala touto problematikou, nebot’ v tom vid´ım velk´y potenci´al. Souˇca´ st´ı t´eto pr´ace bylo tak´e zjistit, zda se liˇs´ı sk´ore mezi norm´aln´ı tk´an´ı, adenomem a karcinomem. Sk´ore jsem si vypoˇc´ıtala jiˇz dˇr´ıve na z´akladˇe hodnot z´ıskan´ych z klasifik´atoru. Nulov´a hypot´eza o neexistenci rozd´ılu byla zam´ıtnuta na z´akladˇe v´ysledk˚u z MannWhitneyho testu na hladinˇe v´yznamnosti 0,05. Sk´ore populace s norm´aln´ı tk´an´ı je menˇs´ı neˇz sk´ore populace s karcinomem. V posledn´ı ˇradˇe jsem testovala zda je rozd´ıl mezi sk´ore 33
´ ER ˇ ZAV
norm´aln´ı tk´an´ı a adenomem a mezi adenomem a karcinomem. Zat´ımco pˇri porovn´av´an´ı rozd´ılu mezi adenomem a karcinomem nem˚uzˇ u zamitnout nulovou hypot´ezu, v pˇr´ıpadˇe norm´aln´ı tk´anˇe a adenomu jsem ji mohla zam´ıtnout a tud´ızˇ potvrzuji alternativn´ı hypot´ezu, zˇ e je rozd´ıl mezi sk´ore norm´aln´ı tk´anˇe a adenomu. Sk´ore norm´aln´ı tk´anˇe je menˇs´ı neˇz sk´ore adenomu.
34
´ ZAKLADN ´ ´ SLOVNIK ICH POJMU˚
Slovn´ık z´akladn´ıch pojmu˚ ´ EXPRESE GENOVA Genov´a exprese je oznaˇcen´ı aktivity genu a vyj´adˇren´ı informace obsaˇzen´e v tomto genu. ˇ MIKROCIPY (=ˇcipy, microarray) Mikroˇcipy jsou simult´ann´ı biologick´e technologie, kter´e na z´akladˇe imobilizace biologick´ych objekt˚u, jako jsou napˇr´ıklad molekuly a tk´anˇe, na pevn´y podklad do mal´ych oblast´ı naz´yvan´ych spoty, slouˇz´ı k porovn´av´an´ı tˇechto objekt˚u. Kaˇzd´y spot obsahuje urˇcit´y poˇcet sond urˇcen´ych pro nav´az´an´ı molekul z objekt˚u. Oligonukleotidov´e Affymetrix mikroˇcipy obsahuj´ı kr´atk´e sondy, vˇetˇsinou o d´elce 25-50 oligonukleotidov´ych baz´ı, kter´e jsou specifick´e. Zn´ame jejich pˇresn´y poˇcet ve spotu a proto nepotˇrebujeme druh´y kan´al pro referenˇcn´ı vzorek. Sondy reaguj´ı s odpov´ıdaj´ıc´ımi molekulami tak, zˇ e nav´azˇ´ı molekuly z´ajmu na povrch cˇ ipu cˇ´ımˇz vytvoˇr´ı komplexy. Tyto komplexy jsou n´aslednˇe detekovan´e speci´aln´ımi skenery. V´ysledkem je cˇ´ıseln´a hodnota ud´avaj´ıc´ı intenzitu sign´alu, kter´a odpov´ıd´a mnoˇzstv´ı molekul nav´azan´ych na spot. Mikroˇcipov´a anal´yza se stala jednou z nejv´ıce vyuˇz´ıvan´ych metod molekul´arn´ı biologie pouˇz´ıvanou v biologick´em i medic´ınsk´em v´yzkumu, nebot’ umoˇznˇ uje souˇcasn´e pozorov´an´ı tis´ıc˚u gen˚u, protein˚u cˇ i jin´ych molekul. MUTACE Pojmem mutace se oznaˇcuje zmˇena genetick´eho materi´alu nebo tak´e proces, pˇri kter´em tato zmˇena vznik´a. S mutacemi se setk´av´ame u vˇsech zˇ iv´ych organism˚u, jsou hlavn´ım zdrojem genetick´e variability. Z klinick´eho hlediska jsou to pr´avˇe mutace, kter´e maj´ı vˇetˇsinou na svˇedom´ı vznik n´adorov´eho bujen´ı. D´ale se budu zab´yvat mutacemi genov´ymi, kter´e prob´ıhaj´ı na u´ rovni vl´akna DNA. Z hlediska vlivu na proteosynt´ezu rozliˇsujeme tˇri typy mutac´ı. Mutace nemˇen´ıc´ı smysl jsou zp˚usoben´e substitucemi na tˇret´ı pozici kodonu, ale d´ıky degeneraci genetick´eho k´odu je zaˇrazen´a spr´avn´a aminokyselina. Naproti tomu m´ame mutace mˇen´ıc´ı smysl, kter´e jsou zp˚usobeny substitucemi maj´ıc´ımi za n´asledek zaˇrazen´ı odliˇsn´e aminokyseliny pˇri proteosynt´eze. Posledn´ım typem jsou nesmysln´e mutace, kter´e mˇen´ı kodon urˇcuj´ıc´ı aminokyseliny na terminaˇcn´ı kodon. Tyto mutace jsou zp˚usobeny delec´ı nebo inzerc´ı. Inzerc´ı (adic´ı) rozum´ıme zaˇrazen´ı jednoho nebo v´ıce nadbyteˇcn´ych nukleotidov´ych p´ar˚u, kter´e maj´ı za n´asledek posunut´ı cˇ tec´ıho r´amce a n´asledn´e synt´eze odliˇsn´eho polypeptidu nebo dokonce k pˇredˇcasn´emu ukonˇcen´ı proteosynt´ezy. Ztr´ata jednoho nebo v´ıce nukleotid˚u ´ cinek je podobn´y jako u adic´ı. Substituce znamen´a z p˚uvodn´ı sekvence se naz´yv´a delec´ı. Uˇ n´ahradu b´aze p˚uvodn´ı sekvence za b´azi jinou. N´asledky substituce se odv´ıj´ı od toho, na kter´e pozici kodonu k substituci doˇslo.
35
SEZNAM ZKRATEK
Seznam zkratek BRAF
Serin/treonin-protein kin´aza
DNA
Deoxyribonukleov´a kyselina
EGFR
Receptor pro epiderm´aln´ı r˚ustov´y faktor Epidermal growth factor receptor
ERK
Extracellular signal-regulated kinase
KRAS
Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog
MAPK
Mitogenem aktivovan´a protein kin´aza
MM
Mismatch sondy o d´elce 25-ti oligonukleotidov´ych baz´ı komplement´arn´ıch s transkriptem, 13. b´aze je komplement´arn´ı k odpov´ıdaj´ıc´ı b´azi na PM sondˇe
MSI
Mikrosatelitn´ı nestabilita Microsatellite instability
mTSP
Mnohon´asobn´y klasifik´ator top-sk´oruj´ıc´ıch p´ar˚u Multiple Top-skoring pairs
p53
Protein 53
PETACC-3 Pan European Trial Adjuvant Colon Cancer - 3 velk´a randomizovan´a studie u pacient˚u s kolorekt´aln´ım karcinomem stadia III PM
Perfect match sondy o d´elce 25-ti oligonukleotidov´ych baz´ı komplement´arn´ıch s transkriptem
RMA
Robustn´ı v´ıcerozmˇern´y pr˚umˇer Robust Multiarray Average
RNA
Ribonukleov´a kyselina
36
LITERATURA
Literatura [1] ARUP LABORATORIES, 2010, ’NRAS Mutation Detection in Melanoma and Colorectal Cancer’, National Reference Laboratory. [2] BEHRENS J. & LUSTIG B., 2004, ’The Wnt connection to tumorgenesis’, The International Journal of Developmental Biology, vol. 48, pp. 477-487. [3] BUDINSKA E.; DELORENZI M.; DE ROOCK W.; JACOBS B.; WALKER S.; WILSON C.; DAVISON T.; KENNEDY R. D.; TEJPAR S., 2010, ’New insights to gene expression signatures from primary FFPE tumors for the prediction of response to cetuximab in KRAS and BRAF wild-type colorectal cancer (CRC)’. [4] COOPER G. M., 2000, ’Pathways of Intracellular Signal Transduction’, v knize The Cell: A Molecular Approach, Sunderland (MA), Boston. ISBN-10: 0-87893-106-6. [5] DAVIES H.; BIGNELL R. G.; COX CH.; STEPHENS P.; EDKINS S.; CLEGG S.; TEAGUE J.; WOFFENDIN H.; GARNETT J. M.; BOTTOMLEY W.; DAVIS N.; DICKS E.; EWING R.; FLOYD Y.; GRAY K.; HALL S.; HAWES R.; HUGHES J.; KOSMIDOU V.; MENZIES A.; MOULD C.; PARKER A.; STEVENS C.; WATT S.; HOOPER S.; WILSON R.; JAYATILAKE H.; GUSTERSON A. B.; COOPER C.; SHIPLEY J.; HARGRAVE D.; PRITCHARD-JONES K.; MAITLAND N.; CHENEVIX-TRENCH G.; RIGGINS J. G.; BIGNER D. D.; PALMIERI G.; COSSU A.; FLANAGAN A.; NICHOLSON A.; HO C. W. J.; LEUNG Y.S.; YUEN T. S.; WEBER L. B.; SEIGLER F. H.; DARROW L. T.; PATERSON H.; MARAIS R.; MARSHALL J. CH.; WOOSTER R.; STRATTON R. M. & FUTREAL A. P., 2002, ’Mutations of the BRAF gene in human cancer’, Nature, vol. 417, pp. 949-954. pˇr´ıstupn´y na: http://www.nature.com/nature/journal/v417/n6892/full/nature00766.html [6] FARIS J. E. & RYAN D. P., 2012,; ’Trees, Forests, and Other Implications of BRAF Mutant Gene Signature in Patients With BRAF Wild-Type Disease’, Journal of Clinical Oncology. [7] GEMAN D.; d’AVIGNON CH.; NAIMAN D. Q. & WINSLOW R. L., 2004,; ’Classifying Gene Expression Profiles from Pairwise mRNA Comparisons’, Stat Appl Genet Mol Biol. , vol. 3. [8] GERVAZ P.; BUCHER P. & MOREL P., 2004, ’Two Colons – Two Cancers: Paradigm Shift and Clinical Implications’, Journal of Surgical Oncology, vol. 88, pp. 261-266. [9] GLEBOV O. K.; RODRIGUEZ L. M. & NAKHARA K., 2003, ’Distinguishing Right from Left Colon by the Pattern of Gene Expression’,Cancer Epidemiology Biomarkers, vol. 12, pp. 755-762. [10] GLEBOV O. K.; RODRIGUEZ L. M. & SOBALLE P., 2006, ’Gene Expression Patterns Distinguish Colonoscopically Isolated Human Aberrant Crypt Foci from Normal Colonic Mucosa’,Cancer Epidemiology Biomarkers, vol. 15, pp. 2253-2262. [11] IRIZARRY R. A.; HOBBS B.; COLLIN F.; BEAZER-BARCLAY Y. D.; ANTONELLIS K. J.; SCHERF U. & SPEED T. P., 2003, ’Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data’,Biostatistics, pp. 249264. 37
LITERATURA
[12] JIMMENO A.; MESSERSMITH A. W.; HIRSCH R.F.; FRANKLI A. W. & ECK˚ receptoru pro HARDT G. S., 2009, ’Mutace genu KRAS a citlivost k inhibitorum ˚ epiderm´aln´ı rustov´ y faktor u kolorektaln´ıho karcinomu: praktick´a aplikace pˇri v´ybˇeru pacientu˚ ’,Journal of Clinical Oncology, vol. 1, pp. 51-57. pˇr´ıstupn´y na: http://jco.ascopubs.org/content/27/7/1130.full.pdf.cs [13] KARAKAS B.; BACHMAN K. E. & PARK H. B., 2006, ’Mutation of the PIK3CA oncogene in human cancers’, British Journal of Cancer, vol. 94, pp. 455-459. pˇr´ıstupn´y na: http://www.nature.com/bjc/journal/v94/n4/full/6602970a.html [14] KLENER P. & KLENER P. jr., 2010, ’Nov´a protin´adorov´a l´ecˇ iva a l´ecˇ ebn´e strategie v onkologii’,Grada Publishing, Praha, ISBN 978-80-247-2808-7. [15] LaPOINTE L. C.; DUNNE R.; BROWN G. S.; WORTHLEY D. L.; MOLLOY P. L.; WATTCHOW D. & YOUNG G. P., 2007, ’Map of differential transcript expression in the normal human large intestine’,Physiological Genomics, vol. 33, pp. 50-64. [16] LEGGETT B. & WHITEHALL V., 2010, ’Role of the Serrated Pathway in Colorectal Cancer Pathogenesis’,Gastroenterology, vol. 138, pp. 2088-2100. ˇ ´ I. & HRUSKA [17] NOVOTNY M., 2007, ’Biologie cˇ lovˇeka’, Fortuna, Praha. ˇ ´ T. & DUSEK [18] PAVLIK L., 2012 ’Biostatistika’, Cerm, Brno. ISBN 978-80-7204-7826. [19] POPOVIC V.; BUDINSKA E. & DELORENZI M., 2011, ’Rgtsp: a generalized top scoring pairs package for class prediction’, Bioinformatics Advance Access. [20] POPOVIC V.; BUDINSKA E; TEJPAR S.; WEINRICH S.; ESTRELLA H.; HODGSON G.; XIE T.; BOSMAN F.; ROTH A. & DELORENZI M., 2012, ’Identification of Poor-Prognosis BRAF-Mutant-Like Population of Patients With Colon Cancer’, Journal of Clinical Oncology. [21] SNUSTAD P. & SIMMONS M. J. , ’Genetika’. Pˇreloˇzila Relichov´a J., 2009, Muni press. ISBN 978-80-210-4852-2. ˇ ´ J., 2007, ’Famili´arn´ı adenomat´ozn´ı polyp´oza a jej´ı genetick´e [22] STERKOV A vyˇsetˇren´ı’, Onkologick´a p´ecˇ e, vol. 2/07, pp. 13-15. pˇr´ıstupn´y na: http://www.linkos.cz/files/onkologicka-pece/2/19.pdf [23] WANG S. W.; CHEN P., M. & SU Y., 2006’Colorectal carcinoma: from tumorgenesis to treatment’, Cellular and Molecular Life Sciences, vol. 63, pp. 663-671. [24] YOKOTA T.; URA T.; SHIBATA N.; TAKAHARI D.; SHITARA K.; NOMURA M.; KONDO C.; MIZOTA A.; UTSUNOMIYA S.; MURO K. & YATABE Y., 2011’BRAF mutation is a powerful prognostic in advanced and recurrent colorectal cancer’, British Journal of Cancer, vol. 104, pp. 856-862. [25] ZBAR A. P., 2004 ’The imunology of colorectal cancer’, Surgical Oncology, vol. 13, pp. 45-53.
38
LITERATURA
Internetov´e zdroje [URL 1] www.svod.cz ˇ ’SVOD: epidemiologie zhoubn´ych n´ador˚u v Cesk´ e republice’, rok aktualizace: 2011 [URL 2] http://zak.medikus.cz/o-nemocech/polypy-tlusteho-streva-1579 ˇ ak, rok aktualizace: 2011 ’Medikus pro l´ekaˇre!’, autor: MUDr. Petr Z´ [URL 3] http://atlasgeneticsoncology.org ’Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology’, rok aktualizace: 2011 [URL 4] http://telemedicina.med.muni.cz/genomic-proteomic-analysis/index.php ’Anal´yza genomick´ych a proteomick´ych dat’, autorka: Mgr. Eva Budinsk´a, Ph.D. [URL 5] http://www.nature.com ’Nature Reviews — Molecular Cell Biology’, rok aktualizace: 2012 [URL 6] www.kolorektalni-karcinom.cz ’Kolorekt´aln´ı karcinom’, rok aktualizace: 2011 [URL 7] www.cilena-lecba.cz ’Biologick´a l´ecˇ ba’, rok aktualizace: 2012 [URL 8] http://www.drugs.com/drug-class/egfr-inhibitors.html ’Drug informatin online’, rok aktualizace: 2012 [URL 9] http://www.ebi.ac.uk ’European Bioinformatics Institute’, rok aktualizace: 2012 [URL 10] http://www.ncbi.nlm.nih.gov ’National Center for Biotechnology Information’, rok aktualizace: 2012 [URL 11] http://www.genecards.org ’Gene Cards’, rok aktualizace: 2012 [URL 12] http://www.who.int ’World Health Organization’, rok aktualizace: 2012 [URL 13] http://zdravotna.info/?p=711 ’Zdrav´ı a nemoci informace’ [URL 14] http://www.genome.jp/kegg/kegg2.html ’KEGG pathway’, rok aktualizace: 2012 [URL 15] http://www.r-project.org ’The R Project for Statistical Computing’
39
ˇ E´ KE KLASIFIKACI A GENY POUZIT
A
Geny pouˇzit´e ke klasifikaci N´azev genu (anglicky) acyl-CoA oxidase 1, palmitoyl
Lokace genu∗
ACOX1
Entrez GeneID 51
AIFM3
150209
apoptosis-inducing factor, mitochondrion-associated, 3
22q11.21
AMACR
23600
alpha-methylacyl-CoA racemase
5p13.2
APCDD1
147495
adenomatosis polyposis coli down-regulated 1
18p11.22
AQP5
362
aquaporin 5
12q13.12
ARID3A
1820
AT rich interactive domain 3A (BRIGHT-like)
19p13.3
C10orf99
387695
chromosome 10 open reading frame 99
10q23.1
C11orf9
745
chromosome 11 open reading frame 9
11q12.2
C13orf18
144811
chromosome 13 open reading frame 31
13q14.11
C20orf111
51526
chromosome 20 open reading frame 111
20q13.12
CBFA2T2
9139
core-binding factor, runt domain, alpha subunit 2; translocated to, 2
20q11.21
CD55
1604
CD55 molecule, decay accelerating factor for complement
1q32.2
CDX2
1045
caudal type homeobox 2
13q12.2
CELP
1057
carboxyl ester lipase pseudogene
9q34.2
CFTR
1080
cystic fibrosis transmembrane conductance regulator
7q31.2
CRIP1
1396
cysteine-rich protein 1 (intestinal)
14q32.33
CTSE
1510
cathepsin E
1q32.1
CTTNBP2
83992
cortactin binding protein 2
7q31.31
DDC
1644
dopa decarboxylase (aromatic L-amino acid decarboxylase)
7p12.1
DUSP4
1846
dual specificity phosphatase 4
8p12
FLJ32063
150538
hypothetical LOC150538
2q33.1
FSCN1
6624
fascin homolog 1, actin-bundling protein (Strongylocentrotus purpuratus)
7p22.1
GGH
8836
gamma-glutamyl hydrolase
8q12.3
HOXD3
3232
homeobox D3
2q31.1
HSF5
124535
heat shock transcription factor family member 5
17q22
KIAA0802
23255
KIA0802
18p11.22
KLK10
5655
kallikrein-related peptidase 10
19q13.41
Gen
40
17q25.1
ˇ E´ KE KLASIFIKACI A GENY POUZIT
Entrez GeneID LOC388199 388199
N´azev genu (anglicky) proline rich 25
Lokace genu∗
MIR142
406934
microRNA 1421
17q22
MLPH
79083
melanophilin
2q37.3
OSBP2
23762
oxysterol binding protein 2
22q12.2
PHYH
5264
phytanoyl-CoA 2-hydroxylase
10p13
PIK3AP1
118788
phosphoinositide-3-kinase adaptor protein 1
10q24.1
PIWIL1
9271
piwi-like 1 (Drosophila)
12q24.33
PLCB4
5332
phospholipase C, beta 4
20p12.3
PLK2
10769
polo-like kinase 2
5q11.2
PLLP
51090
plasmolipin
16q13
PPP1R14C
81706
protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 14C
6q25.1
PPP1R14D
54866
protein phosphatase 1, regulatory (inhibitor) subunit 14D
15q15.1
PPPDE2
27351
PPPDE peptidase domain containing 2
22q13.2
PTPRD
5789
protein tyrosine phosphatase, receptor type, D
9p23
PTPRO
5800
protein tyrosine phosphatase, receptor type, O
12p12.3
RASSF6
166824
Ras association (RalGDS/AF-6) domain family member 6
4q13.3
RBBP8
5932
retinoblastoma binding protein 8
18q11.2
RBM8A
9939
RNA binding motif protein 8A
1q21.1
REG4
83998
regenerating islet-derived family, member 4
1p12
RNF43
54894
ring finger protein 43
17q22
RSBN1L
222194
round spermatid basic protein 1-like
7q11.23
S100A16
140576
S100 calcium binding protein A16
1q21.3
SATB2
23314
SATB homeobox 2
2q33.1
SERPINB5
5268
serpin peptidase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 5
18q21.33
SLC25A37
51312
solute carrier family 25, member 37
8p21.2
SOX8
30812
Y (sex determining region Y)-box 8
16p13.3
SPINK1
6690
serine peptidase inhibitor, Kazal type 1
5q32
TM4SF4
7104
transmembrane 4 L six family member 4
3q25.1
TNNC2
7125
troponin C type 2 (fast)
20q13.12
Gen
16p13.3
41
ˇ E´ KE KLASIFIKACI A GENY POUZIT
N´azev genu (anglicky) thiamin pyrophosphokinase 1
Lokace genu ∗
TPK1
Entrez GeneID 27010
TRNP1
388610
TMF1-regulated nuclear protein 1
1p36.11
TRX3
7295
thioredoxin
9q31.3
TSPAN6
7105
tetraspanin 6
Xq22.1
VAV3
10451
vav 3 guanine nucleotide exchange factor
1p13.3
ZIC2
7546
Zic family member 2
13q32.3
ZNF141
7700
zinc finger protein 141
4p16.3
ZSWIM1
90204 zinc finger, SWIM-type containing 1 20q13.12 Tabulka 11: Tabulka 64 gen˚u klasifikuj´ıc´ıch BRAF mutaci, jejich
Gen
7q35
Entrez GeneID, anglick´y n´azev a lokaci. ∗
Prvn´ı cˇ´ıslo n´am ud´av´a, na kter´em chromozomu se dan´y gen nach´az´ı. P´ısmeno q znaˇc´ı dlouh´e ram´enko a p´ısmeno p kr´atk´e ram´enko chromozomu. N´asleduj´ıc´ı cˇ´ısla oznaˇcuj´ı region a skupinu. Pokud se v lokaci vyskytuje jeˇstˇe cˇ´ıslo za teˇckou, pak se jedn´a o podskupinu.
42
