Kode/Nama Bidang Ilmu : 306/Ilmu Kedokteran Dasar
LAPORAN AKHIR HIBAH PENELITIAN DOSEN MUDA
PEMBERIAN EKSTRAK ETANOL BULBUS BAWANG DAYAK (Eleutherine americana Merr) MENINGKATKAN KADAR SUPEROKSIDA DISMUTASE MENCIT DALAM KONDISI STRES OKSIDATIF
TIM PENGUSUL dr. Ida Ayu Dewi Wiryanthini, M.Biomed (0022038106) dr. I Wayan Surudarma, M.Si (0014027305) dr. I Wayan Gede Sutadarma, M.Gizi, Sp.GK (0016128003)
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS UDAYANA
NOVEMBER 2015 1
HALAMAN PENGESAHAN HIBAH PENELITIAN DOSEN MUDA Judul Penelitian
Bidang Ilmu Ketua Peneliti a. Nama lengkap dengan gelar b. NIP/NIDN c. Pangkat/Gol d. Jabatan Fungsional/Struktural e. Pengalaman penelitian f. Program Studi/Jurusan g. Fakultas h. Alamat Rumah/HP i. E-mail Jumlah Tim Peneliti Pembimbing a. Nama lengkap dengan gelar b. NIP/NIDN c. Pangkat/Gol/NIP d. Jabatan Fungsional/Struktural e. Pengalaman penelitian f. Program Studi/Jurusan g. Fakultas Lokasi Penelitian Kerjasama (jika ada) a. Nama Instansi b. Alamat Jangka waktu penelitian Biaya Penelitian
: Pemberian Ekstrak Etanol Bulbus Bawang Dayak (Eleutherine americana Merr) Meningkatkan Kadar Superokside Dismutase Mencit Dalam Kondisi Stres Oksidatif : : dr. Ida Ayu Dewi Wiryanthini, M.Biomed : 19810322 200604 2 002/0022038106 : Penata /III c : Lektor : (terlampir dalam CV) : Pendidikan Dokter : Kedokteran : Br. Celuk, Kapal, Mengwi/081239990399 :
[email protected] : 3 orang : dr. I Nyoman Arcana, Sp.Biok : 19500711 198003 1 002/ : Pembina/IVa : Lektor Kepala : (terlampir dalam CV) : Pendidikan Dokter : Kedokteran : Fakultas Kedokteran Universitas Udayana ::: 6 bulan : Rp.10.000.000,- (Sepuluh Juta Rupiah)
Mengetahui Ketua PSPD FK Unud
Denpasar, 25 November 2015 Ketua Peneliti
(Dr.dr. Dw Putu Purwa Samatra, Sp.S(K)) NIP: 19550321 198303 1 004
(dr. IA Dewi Wiryanthini, M.Biomed) NIP: 19810322 200604 2 002
Mengetahui Ketua LPPM Universitas Udayana
(Prof. Dr. Ir. I Nyoman Gde Antara, M.Eng) NIP: 19640807 199203 1 002 i
DAFTAR ISI
DAFTAR ISI ................................................................................................................
ii
RINGKASAN...............................................................................................................
iii
BAB I. PENDAHULUAN ...........................................................................................
1
A. Perumusan masalah ..........................................................................................
2
B. Tujuan Penelitian ..............................................................................................
2
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA .................................................................................
2
Kerangka Konsep dan Hipotesis ...........................................................................
5
BAB III. METODE PENELITIAN ..............................................................................
5
Waktu dan Tempat Penelitian ...............................................................................
5
Populasi dan Sampel..............................................................................................
5
Desain Penelitian ...................................................................................................
7
Variabel dan Definisi Operasional ........................................................................
7
Alat dan Bahan Penelitian .....................................................................................
8
Jalannya Penelitian ................................................................................................
8
Analisis Data .........................................................................................................
10
BAB IV. BIAYA dan JADWAL PENELITIAN..........................................................
11
4.1 Biaya ................................................................................................................
11
4.2 jadwal Penelitian .............................................................................................
11
BAB V. KRMAJUAN PENELITIAN .........................................................................
11
Daftar Pustaka ..............................................................................................................
12
Lampiran ......................................................................................................................
14
ii
RINGKASAN Seiring berjalannya waktu, angka kejadian penyakit degeratif semakin meningkat di masyarakat. Banyak hal yang menyebabkan terjadinya penyakit, salah satunya diakibatkan oleh stres oksidatif. Stres oksidatif diakibatkan oleh jumlah antioksidan yang lebih rendah dibandingkan radikal bebas, sehingga memicu pembentukan radikal bebas baru. Carbotetrachlorida atau CCl4 merupakan salah satu senyawa hidrokarbon terhalogenasi yang paling toksik, berbentuk cair, mudah menguap, larut dalam minyak alami dan tidak tercampur dengan air. Pemberian CCl4 baik per oral maupun per-inhalasi menyebabkan kerusakan hepar berupa perlemakan dan nekrosis, sehingga CCl4 merupakan model terbaik sebagai senyawa penginduksi radikal bebas pada sel hepar. Bawang dayak (Eleutherine americana Merr) banyak dijumpai di Kalimantan maupun pulau lainnya di Indonesia. Bawang dayak berupa pohon perdu, banyak mengandung antioksidan terutama flavonoid, baik pada umbi atau bulbus maupun pada daunnya. Masyarakat awam telah banyak memanfaatkan bawang dayak sebagai obat alternatif untuk gangguan sembelit, demam dan gangguan lainnya. Dengan telah banyak digunakannya bawang dayak oleh masyarakat umum, maka tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui efektivitas ekstrak umbi bawang dayak untuk meningkatkan kadar enzim Superoksida Dismutase (SOD) pada mencit dalam keadaan stres oksidatif karena pemberian CCl4. Mencit akan dibagi menjadi 4 kelompok perlakuan dengan 3 variasi dosis ekstrak umbi bawang dayak. Sebelum perlakuan akan dilakukan pemeriksaan SOD pre test, kemudian mencit akan diberikan ekstrak umbi bawang dayak selama 7 hari. Pada hari ke-8 semua mencit diberikan CCl4 per oral, 72 jam setelah pemberian CCl4 dilakukan pemeriksaan SOD post test.
iii
JUDUL PENELITIAN Pemberian Ekstrak Etanol Bulbus Bawang Dayak (Eleutherine americana Merr) Meningkatkan Kadar Superokside Dismutase Mencit Dalam Kondisi Stres Oksidatif.
BAB I. PENDAHULUAN Penyakit yang berkembang di masyarakat saat ini mengalami perubahan dari penyakit yang sebelumnya diakibatkan oleh mikroorganisme menjadi penyakit yang diakibatkan oleh perubahan gaya hidup. Gaya hidup seperti kebiasaan merokok, jarang berolahraga, kebiasaan makan yang tidak sehat serta polusi lingkungan menyebabkan terjadinya penyakit degeneratif dan kanker. Seiring dengan bertambah majunya tingkat pengetahuan, masyarakat mulai mencari upaya untuk mempertahankan kesehatan, salah satunya dengan mengkonsumsi makanan yang kaya akan kandungan antioksidan. Penggunaan antioksidan telah secara luas diketahui dapat mencegah terbentuknya radikal bebas. Secara umum, antioksidan dapat dibedakan menjadi dua kelompok, yaitu antioksidan enzimatik dan nonenzimatik. Antioksidan enzimatik yang disebut juga antioksidan pencegah terdiri dari superoxide dismutase, catalase dan glutathione peroxidase. Antioksidan nonenzimatis disebut juga antioksidan pemutus rantai dibagi menjadi dua kelompok yaitu antioksidan larut lemak seperti tokoferol, karotenoid, flavonoid, quinon dan bilirubin serta antioksidan larut air seperti asam askorbat, asam urat, protein pengikat logam, dan protein pengikat heme (Winarsi, 2007). Radikal bebas yaitu senyawa kimia yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan pada bagian terluar dari orbitnya, sehingga memiliki kecenderungan menarik elektron dari senyawa lain menyebabkan radikal bebas bersifat sangat reaktif (Mayes & Botham, 2003). Suatu kondisi dimana jumlah antioksidan lebih rendah dibandingkan radikal bebas disebut stres oksidatif, menyebabkan terjadinya kerusakan pada asam basa nukleus, lemak, dan protein yang mempengaruhi kondisi kesehatan sel dan viabilitasnya atau menginduksi terjadinya berbagai macam respon seluler melalui pembentukan senyawa reaktif sekunder dan akhirnya kematian sel oleh karena nekrosis atau apoptosis (Dalle-Donne et al, 2006). Radikal bebas menyebabkan peroksidasi lipid yang salah satunya ditandai dengan peningkatan produksi malondialdehide (MDA) disertai penurunan kadar antioksidan enzimatis (Pangkahila, 2007). Bawang dayak atau disebut juga bawang tiwai (Eleutherine americana Merr) umumnya digunakan sebagai obat atau ramuan tradisional oleh masyarakat pedalaman. Kandungan yang terdapat dalam umbi bawang dayak berupa senyawa alkaloid, glikosida, flavonoid, fenolik, 1
saponin, triterpenoid, tannin, steroid dan kuinon (Firdaus, 2006). Penelitian sebelumnya membuktikan adanya aktivitas antioksidan yang kuat pada ekstrak etanol bulbus bawang dayak dengan nilai IC50 sebesar 25,33 µg/mL (Kuntorini & Astuti, 2010). Pada penelitian sebelumnya diperoleh keadaan stres oksidatif dapat diinduksi dengan pemberian larutan Carbontetrachlorida per oral dengan dosis 0,55 mg/g BB pada hewan coba mencit jantan umur 2,5-3 bulan dengan berat badan 25-30 gram. Radikal bebas yang terbentuk akan memperoksidasi lipid dari membran sel hepar sehingga mengalami kerusakan dan mudah pecah. Pecahnya sel hepar akan disertai dengan pelepasan Glutamic-Pyruvate Transaminase (GPT) ke dalam darah dan besarnya peningkatan kadar Serum GPT berbanding lurus dengan derajat kerusakan sel hepar (Arcana, Adioka
dan Wihandani, 2008).
Peningkatan SGPT karena pecahnya sel hepar juga diserta penurunan kadar antioksidan internal salah satunya Superoksida Dismutase (SOD). Meskipun bawang dayak (Eleutherine americana Merr) memiliki kandungan antioksidan yang tinggi namun masih diperlukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui efektifitas bulbus bawang dayak sebagai antioksidan dalam meningkatkan kadar SOD darah mencit dalam kondisi stres oksidatif.
A. PERUMUSAN MASALAH Apakah pemberian ekstrak bulbus bawang dayak (Eleutherine americana Merr) dapat meningkatkan kadar Superoksida Dismutase (SOD) mencit dalam kondisi stres oksidatif ?
B. TUJUAN PENELITIAN Tujuan Umum : Untuk mengetahui apakah ekstrak bulbus bawang dayak (Eleutherine americana Merr) dapat meningkatkan kadar Superokside Dismutase (SOD) mencit dalam kondisi stres oksidatif. Tujuan Khusus : Untuk mengetahui efektifitas ekstrak bulbus bawang dayak (Eleutherine americana Merr) sebagai antioksidan dengan mengukur kadar Superoksida Dismutase (SOD) mencit dalam kondisi stres oksidatif.
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA Bawang dayak berasal dari daratan Amerika dan telah dibudidayakan di Indonesia. Bawang dayak banyak dijumpai di Sumatera, Jawa, dan Kalimantan (Elisa, 2009). Bawang dayak merupakan tanaman perdu dan termasuk dalam famili Iridaceae, memiliki banyak 2
manfaat yaitu sebagai antiradang, untuk menghentikan perdarahan dan anti tumor. Bagian bawang dayak yang umum digunakan yaitu umbi dan daun (Redaksi Agromedia, 2008; Mangan, 2009). Umbi bawang dayak mengandung alkaloid, flavonoid, saponin, terpenoid, steroid, glikosida, tanin, fenolik, antrakuinon (Singarimbun, 2011). Golongan senyawa kimia yang terdapat pada ekstrak etanol umbi bawang dayak adalah alkaloid, flavonoid, glikosida, saponin, antrakuinon glikosida, tanin dan triterpenoid/steroid. Golongan senyawa kimia yang terdapat pada fraksi etilasetat adalah senyawa fenol, tanin dan flavonoid (Mierza, 2011; Subramaniam, et al., 2012). Umbi bawang dayak dapat digunakan untuk mengatasi sembelit, disuria, radang usus, disentri dan luka, daunnya digunakan untuk demam, nifas dan antiemetik. Selain itu air rebusan umbi dapat digunakan sebagai obat penyakit kuning, disentri dan radang usus (Wardani, 2009). Radikal bebas yaitu senyawa kimia yang memiliki satu atau lebih elektron yang tidak berpasangan pada bagian terluar dari orbitnya, sehingga memiliki kecenderungan menarik elektron dari senyawa lain menyebabkan radikal bebas bersifat sangat reaktif (Mayes & Botham, 2003). Oksidan merupakan suatu senyawa yang dapat menarik elektron. Berdasarkan definisinya oksidan dan radikal bebas sering dianggap sama karena keduanya memiliki sifat yang mirip yaitu sama-sama memiliki kemampuan untuk menarik elektron. Namun radikal bebas memiliki reaktifitas yang tinggi, sehingga tidak semua oksidan merupakan radikal bebas dan semua radikal bebas merupakan oksidan (Winarsi, 2007). Sifat yang dimiliki oleh radikal bebas yaitu memiliki reaktifitas yang tinggi karena kecenderungannya menarik elektron serta memiliki kemampuan mengubah suatu molekul menjadi suatu radikal bebas yang baru. Bila radikal bebas yang baru terbentuk bertemu dengan molekul yang lain maka akan terbentuk radikal bebas yang baru lagi, demikian seterusnya sehinga terjadi reaksi rantai (chain reaction). Bila elektron yang berikatan dengan radikal bebas berasal dari senyawa yang memiliki ikatan kovalen akan sangat berbahaya karena ikatan kovalen tersebut digunakan bersama-sama pada orbit luarnya. Umumnya senyawa yang memiliki ikatan kovalen adalah molekul-molekul besar seperti lemak, protein dan DNA (Winarsi, 2007). Sasaran utama radikal bebas adalah protein, asam lemak tak jenuh, dan lipoprotein serta unsur DNA termasuk karbohidrat. Dari ketiga molekul tersebut, yang paling rentan terhadap serangan radikal bebas adalah asam lemak tak jenuh. Senyawa radikal bebas di dalam tubuh
3
dapat merusak asam lemak tak jenuh ganda pada membran sel, mengakibatkan dinding sel menjadi rapuh (Winarsi, 2007). Carbotetrachlorida atau CCl4 merupakan salah satu senyawa hidrokarbon terhalogenasi, berbentuk cair, mudah menguap, larut dalam minyak alami dan tidak tercampur dengan air. Diantara senyawa hidrokarbon terhalogenisasi, CCl4 merupakan turunan yang paling toksik dibandingkan Chloroform (CHCl3) atau methyldichlorida (CH2Cl2). Pemberian CCl4 per oral maupun per-inhalasi menyebabkan kerusakan hepar berupa perlemakan dan nekrosis. Metabolisme CCl4 berlangsung di endoplasmic reticulum dan dikatalisis enzin Cytochrom P450. Carbotetrachlorida dimetabolisir menjadi radikal aktif CCl3* (triklormetil) dan dengan oksigen berubah menjadi radikal bebas CCl3O2* (triklormetilperoksida). Carbotetrachlorida merupakan senyawa penginduksi stres oksidatif paling baik yang dapat diberikan secara per oral dengan dosis 0,55 mg/g BB atau 0,346 mikro liter/g BB. Radikal Triklormetilperoksida mengoksidasi lipid membran sel hepar menjadi senyawa lain yang kehilangan kemampuan proteksinya sehingga menyebabkan sel hepar pecah dengan disertai keluarnya komponen sitoplasma seperti enzim GPT, sehingga CCl4 merupakan model terbaik sebagai senyawa penginduksi radikal bebas pada sel hepar (Winaya & Suarsana, 2005). Flavonoids merupakan antioksidan yang kuat yang dapat berfungsi sebagai agen pereduksi, sebagai antioksidan pendonor atom hidrogen dan sebagai pemutus singlet oksigen. Efisiensi antioksidan flavonoids berhubungan langsung dengan derajat hidroksilasinya dan menurun dengan penambahan gula. Flavonoids efektif untuk menangkal radikal hidroksil dan peroksil serta anion superoksid. Flavonoids memiliki peranan dalam berbagai proses biologis dalam tubuh manusia yang dapat berpengaruh pada membran sel, peroksidasi lipid, dan oksidasi LDL yang dapat mencegah terjadinya penyakit jantung dan pembuluh darah (Fuhrman & Aviram, 2002). Enzim Superoksida Dismutase (SOD) berfungsi sebagai katalisator reaksi dismutasi dari anion superoksida menjadi hidrogen peroksida dan oksigen. SOD melindungi sel-sel tubuh dan mencegah terjadinya proses peradangan yang diakibatkan oleh radikal bebas dan memerlukan bantuan zat-zat mineral gizi seperti mangan (Mn), seng (Zn) dan tembaga (Cu) agar bisa bekerja. Penurunan kadar SOD berimplikasi pada beberapa kondisi dan penyakit seperti reumatoid artritis, infeksi saluran pernafasan, katarak dan infertil (Winarsi, 2007). Penelitian yang dilakukan oleh Bub dkk pada tahun 2000 menyatakan bahwa aktivitas SOD eritrosit pada kaum pria yang diberi jus tomat selama seminggu meningkat dari 816 µ/gHb menjadi 961 µ/gHb. Peningkatan ini disebabkan oleh kandungan antioksidan likopen pada tomat yang dapat menghambat terjadinya reaksi oksidasi disertai penurunan konsentrasi 4
MDA. Penemuan ini membuktikan bahwa aktivitas antioksidan enzimatis sangat dipengaruhi oleh antioksidan non enzimatis (Bub et al., 2000). Kerangka Konsep dan Hipotesis Kerangka Konsep Ekstrak bawang dayak
Faktor Internal - Usia - Berat badan - Radikal Bebas Endogen - Glikosilasi, metilasi
Faktor Eksternal Stres Oksidatif CCl4
Kadar Antioksidan Kadar SOD
Hipotesis Dari kerangka konsep dan landasan teori yang ada dapat disusun suatu hipotesis dari penelitian ini yakni sebagai berikut : Ekstrak etanol bulbus bawang dayak (Eleutherine americana Merr) dapat meningkatkan kadar Superokside Dismutase (SOD) tikus dalam kondisi stres oksidatif.
BAB III. METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Waktu penelitian selama 6 bulan yang berlangsung mulai bulan Juni 2015 sampai dengan Nopember 2015. Tempat penelitian adalah di Laboratorium Biokimia dan Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana.
Populasi dan Sampel Populasi dalam penelitian ini adalah mencit jantan (Mus musculus strain Balb/C), umur antara 2,5-3 bulan dengan berat badan antara 25-30 gram yang didapat dari Animal Laboratory Unit Laboratorium Farmakologi FK UNUD. Besar sampel dalam penelitian ini dihitung menggunakan rumus Pocock, 1984 yaitu : n =
2 σ2 x f (α,β) (μ1 – μ2)2
Keterangan : 5
n
= jumlah sampel
μ1
= rerata hasil variabel kelompok perlakuan
μ2
= rerata hasil variabel kelompok kontrol
σ
= simpang baku kelompok kontrol
α
= tingkat kesalahan I (ditetapkan 0,1)
β
= tingkat kesalahan II (ditetapkan 0,1)
f (α,β)
= besarnya diperoleh dari tabel (Pocock, 1984, tabel 9.1, pp. 125)
Dari penelitian sebelumnya diperoleh (Arcana, Adioka dan Wihandani, 2008) : μ1
= 28,08 mg/dl
μ2
= 33,04 mg/dl
σ
= 2,67
α
= 0,05
β
= 0,1
f (α,β)
= 10,5
Sehingga besar sampel adalah : n =
2 σ2 x f (α,β) (μ1 – μ2)2
n = 2 (2,67)2 x 10,5 (28,08 – 33,04)2 n = 2 x 5,36 x 10,5 (-4,96)2 n = 10,72 x 10,5 24,6016 n = 4,58 ≈ 5 Dengan demikian diperoleh jumlah sampel 5 ekor mencit per kelompok. Sehingga jumlah sampel seluruhnya adalah 20 ekor mencit. Teknik penentuan sampel dilakukan dengan cara sebagai berikut : a. Dari populasi mencit Mus musculus dilakukan pemilihan sampel berdasarkan kriteria inklusio (jantan, umur 2,5-3 bulan, berat 25-30 gram, sehat). b. Dari jumlah sampel yang telah memenuhi syarat diambil secara acak sederhana untuk memperoleh jumlah sampel yang sesuai dengan yang diperoleh dengan menggunakan rumus Pocock yaitu 5 ekor tiap kelompok.
6
Desain Penelitian Penelitian ini adalah eksperimental murni acak in vivo dengan desain Pre and Post Test Control Group Design pada hewan coba. O1 ---------------P0--------- O2 P
O3 -------------- P1 --------- O4
S
O5 -------------- P2 --------- O6 O7 ------------- P3 --------- O8 Keterangan : P : Populasi
S : Sampel
O1, O3, O5, O7
: Pre test (kadar SOD sebelum diinduksi CCl4)
O2, O4, O6, O8
: Post test (kadar SOD setelah diinduksi CCl4)
P0
: pemberian aquabidest 1 ml perhari selama 7 hari dan pemberian CCl4 pada hari ke-8
P1
: pemberian ekstrak bulbus bawang dayak 4 mg/30 gram BB mencit perhari selama 7 hari dan pemberian CCl4 pada hari ke-8
P2
: pemberian ekstrak biji kakao 8 mg/30 gram BB mencit perhari selama 7 hari dan pemberian CCl4 pada hari ke-8
P3
: pemberian ekstrak biji kakao 16 mg/30 gram BB mencit perhari selama 7 hari dan pemberian CCl4 pada hari ke-8
Variabel dan Definisi Operasional Variabel Penelitian 1. Variabel bebas dalam penelitian ini ekstrak bulbus bawang dayak. 2. Variabel tergantung adalah kadar Superoksida Dismutase (SOD) darah. 3. Variabel kendali adalah umur, berat badan, kesehatan dan kondisi lingkungan. Definisi Operasional Variabel 1. Stres oksidatif adalah stres yang diakibatkan pemberian CCl4 per oral 0,55 mg/gram berat badan mencit pada hari ke-8 penelitian. 2. Pemberian ekstrak bulbus bawang dayak adalah pemberian ekstrak bulbus bawang dayak dengan 3 variasi dosis. Ekstrak bulbus bawang dayak : ekstrak bulbus bawang dayak yang diberikan pada mencit dengan 3 dosis yang berbeda, berdasarkan hasil penelitian sebelumnya diperoleh dosis toksik pada tikus adalah 200 mg/kgBB tikus (Yurindani, 2010), sehingga digunakan setengah dosis toksik yaitu 100 mg/kgBB tikus, jadi untuk mencit dengan berat badan 30 gram diperoleh dosis 4 mg. Dosis ekstrak bulbus bawang dayak untuk kelompok P1 adalah 7
4 mg/30 gram berat badan mencit, kelompok P2 diberikan dosis 8 mg/30 gram berat badan mencit dan kelompok P3 diberikan dosis 16 mg/30 gram berat badan mencit. Masingmasing dosis ekstrak bulbus bawang dayak tersebut kemudian dilarutkan dengan 1 ml aquabides dan diberikan sekali sehari. 3. Kadar Superoksida Dismutase (SOD) adalah kadar SOD yang diukur menggunakan reagen pemeriksaan SOD dan dinyatakan sebagai kadar Superoksida Dismutase (SOD). 4. Berat badan adalah berat badan mencit jantan yang dewasa yang ditimbang dengan timbangan elektronik denan merek “Sartorius” setiap minggu selama perlakuan. 5. Usia yaitu umur mencit jantan dewasa dalam hitungan bulan. 6. Cahaya, suhu dan kelembaban, yaitu kondisi lingkungan yang dialami oleh mencit jantan dewasa. Pada penelitian ini kondisi lingkungan yang dialami selama masa percobaan akan dibuat sama.
Alat dan Bahan Penelitian Alat yang dipergunakan dalam penelitian ini adalah : kandang berukuran 50 x 40 x 15 cm sebanyak 4 buah didalamnya terdapat sekam, tempat makanan dan botol minuman, timbangan electronic scale merek Sartorius dengan kapasitas 5000 gram. Bahan Penelitian berupa mencit putih jantan galur Mus musculus usia 2,5-3 bulan dengan berat antara 25-30 gram, ekstrak bulbus bawang dayak, aquabides, makanan standar untuk mencit jantan, ether, EDTA, reagensia untuk pengukuran kadar SOD.
Jalannya Penelitian Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biokimia dan Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Udayana. Tahapan penelitian yang dilakukan adalah sebagai berikut : 1. Pembuatan ekstrak bulbus bawang dayak Bulbus bawang dayak dikupas kulitnya terlebih dahulu, kemudian dihaluskan. Serbuk bulbus bawang dayak ditimbang 500 gram, dimasukkan ke dalam alat maserasi dan ditambahkan etanol 97% secara perlahan sambil diaduk hingga cairan etanol merendam 1 cm di atas permukaan sampel. Ekstraksi selama 3x24 jam, pergantian pelarut dilakukan sekali sehari. Pelarut diuapkan menggunakan vacuum rotary evaporator pada suhu 40oC sampai tidak menguap lagi. Filtrat diuapkan kembali di atas waterbath dan ditimbang berat ekstrak yang dihasilkan (Ernawati & Anni, 2012). 2. Membuat larutan CCl4 dengan cara melarutkan 3,5 ml CCl4 dalam minyak kelapa sampai didapat volume 50 ml. 8
3. Persiapan sebelum penelitian : a. Persiapan binatang percobaan meliputi pemilihan umur yang sama, sehat, berat badan yang sesuai serta persiapan kandang dan makanan hewan. b. Hari pertama sampai hari ketujuh dilakukan adaptasi binatang percobaan. 4. Perlakuan pada hewan coba : Sebanyak 20 ekor mencit putih jantan Mus musculus diukur kadar SOD darahnya (pre test) kemudian dirandomisasi dan dibagi menjadi 4 kelompok. P0 sebagai kontrol negatif diberi perlakuan hanya dengan aquabidest, P1 diberi perlakuan dengan ekstrak bulbus bawang dayak 4 mg/30 gram berat badan, P2 diberi perlakuan dengan ekstrak bulbus bawang dayak 8 mg/30 gram berat badan mencit per hari dan P3 diberi perlakuan dengan ekstrak bulbus bawang dayak 16 mg/30 gram berat badan mencit per hari. Perlakuan diberikan selama 7 hari. Pada hari ke-8 masing-masing kelompok perlakuan diberikan larutan CCl4 0,55 mg/gram berat badan mencit secara oral dan pemberian ekstrak bulbus bawang dayak tetap dilakukan. Selanjutnya pada hari ke-11 atau 72 jam setelah pemberian larutan CCl4, dilakukan pengambilan darah untuk pemeriksaan post test untuk memeriksa kadar SOD darah. Skema rancangan penelitian adalah sebagai berikut : 20 ekor mencit jantan Mus musculus
7 hari
Pemeriksaan kadar SOD darah (pre test )
Randomisasi
P0
P1
P2
P3
Diet standar Aquabides
Diet standar EBBD 4 mg/30 gr
Diet standar EBBD 8 mg/30 gr
Diet standar EBBD 16 mg/30 gr
Pemberian CCl4 dosis 0,55 mg/gram BB
Pemeriksaan kadar SOD darah (post test ) 72 jam setelah pemberian CCl4 Analisis
9
7 hari
1 hari
5. Pengukuran kadar Pengukuran Kadar Superoksida Dismutase (SOD) Sampel darah diambil dari medial canthus sinus orbitalis sebanyak 2 mL. Darah dimasukkan ke dalam tabung yang mengandung EDTA 1 mg/mL darah, kemudian disentrifuse 4000 rpm selama 15 menit untuk memperoleh plasma yang akan digunakan untuk memeriksa kadar SOD. Reagen yang diperlukan : 1.
Mixed Substrate 0,05 mmol/l Xanthine 0,025 mmol/l
2.
Buffer 50 mmol/l, pH 10,2 CAPS 0,94 mmol/l
3.
Xanthine Oxidase 80 U/l
4.
Standar Untuk pemeriksaan kadar antioksidan SOD dilakukan berdasarkan buku manual dari
Randox laboratories, 2006. Dipersiapkan dua buah tabung, satu digunakan untuk tandar sedangkan yang lagi satu digunakan untuk pemeriksaan sampel plasma. Ke dalam tabung sampel dimasukkan 0,05 ml sampel plasma, sedangkan ke dalam tabung standar dimasukkan 0,05 ml larutan standar. Kedua tabung dimasukkan 1,7 ml larutan mixed substrate. Kedua larutan dalam tabung dikocok dengan mesin vortex. Terakhir ditambahkan larutan xanthine oxidase 0,25 ml ke dalam masing-masing tabung dan dikocok dengan mesin vortex. Setelah 30 detik pertama absorbansi campuran dibaca (A1) dalam spektrofotometer dan tiga menit berikutnya (A2). Kadar SOD dihitung dengan rumus: A2 – A1 3
Analisis Data Data yang diperoleh pada penelitian ini dianalisis sebagai berikut : a. Analisis deskriptif b. Uji normalitas data. Uji ini dilakukan untuk mengetahui apakah data berdistribusi normal dengan menggunakan uji Shapiro-Wilk. c. Uji homogenitas data dengan Leven test. d. Uji komparabilitas. Jika data berdistribusi normal digunakan uji one way Anova untuk membandingkan antar kelompok. Bila data tidak berdistribusi normal digunakan uji Kruskal-Wallis untuk membandingkan antar kelompok. e. Derajat kemaknaan pada penelitian ini adalah α = 0,05
10
BAB IV. BIAYA DAN JADWAL PENELITIAN 4.1 Biaya No
Jenis Pengeluaran
Biaya yang Diusulkan (Rp)
1
Gaji dan upah
1.625.000
2
Bahan habis pakai dan peralatan
8.175.000
3
Perjalanan
4
Lain-lain (Laporan dan seminar)
200.000
Jumlah
10.000.000
4.2 Jadwal Kegiatan No
Jenis Kegiatan
1
1
Persiapan Penelitian
2
Pelaksanaan Penelitian
3
Pengumpulan Data Penelitian
4
Analisis Data
5
Penyusunan Laporan Penelitian
2
3
4
5
Tahun ke-1 6 7 8
9
10
11
12
BAB V. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN Data kadar SOD darah sebelum dan sesudah perlakuan disajikan pada tabel 1 berikut : Tabel 1. Data Kadar SOD sebelum dan sesudah perlakuan
No
Kadar SOD (%) P0 Pre Post
Kadar SOD (%) P1 Pre Post
Kadar SOD (% ) P2 Pre Post
Kadar SOD (%) P3 Pre Post
1
76,36
16,36
74,55
43,64
89,09
69,09
87,27
70,91
2
78,18
18,18
70,91
58,18
85,45
65,45
83,64
63,64
3
87,27
12,73
69,09
50,91
80
56,36
74,55
61,82
4
83,64
21,82
81,82
47,27
72,73
52,73
80
65,45
5
80
20
78,18
34,55
74,55
60
85,45
67,27
M
81,09
17,82
74,91
42,91
80,36
60,73
82,18
65,82
Data kadar SOD sebelum maupun sesudah perlakuan pada masing-masing kelompok diuji normalitasnya menggunakan uji Shapiro-Wilk, menunjukkan data berdistribusi normal (p>0,05). 11
Data kadar SOD antar kelompok sebelum maupun sesudah perlakuan diuji homogenitasnya menggunakan uji Levene test, menunjukkan data homogen (p>0,05).
Gambar 1 Grafik Peningkatan Kadar SOD Setelah Pemberian Ekstrak Bawang Dayak Gambar 1 di atas menggambarkan bahwa pemberian ekstrak biji kakao mulai dosis 16 mg dapat meningkatkan kadar SOD dibandingkan dengan kontrol. Hasil penelitian di atas menunjukkan dengan peningkatan dosis akan meningkatkan efek peningkatan kadar SOD dalam darah mencit yang telah dinduksi carbontetrachlorida (CCl4). Penelitian ini juga sesuai dengan penelitian yang dilakukan oleh Bub dkk pada tahun 2000 menyatakan bahwa aktivitas SOD eritrosit pada kaum pria yang diberi jus tomat selama seminggu meningkat dari 816 µ/gHb menjadi 961 µ/gHb. Peningkatan ini disebabkan oleh kandungan antioksidan likopen pada tomat yang dapat menghambat terjadinya reaksi oksidasi disertai penurunan konsentrasi MDA. Penemuan ini membuktikan bahwa aktivitas antioksidan enzimatis sangat dipengaruhi oleh antioksidan non enzimatis (Bub et al., 2000). Mekanisme penghambatan penurunan kadar SOD karena flavanols (epicatechin, catechin dan procyanidin) yang terdapat pada ekstrak biji kakao bekerja dengan menangkap radikal bebas (free radical scavenger) terhadap radikal hidroksil, anion superoksida, radikal peroksil dan alkoksil serta sebagai pengkelat Fe (chelating agent) (Baba et al., 2007).
C. SIMPULAN DAN SARAN Berdasarkan hasil penelitian ini dapat disimpulkan bahwa pemberian ekstrak bawang dayak dapat mengatasi keadaan stres oksidatif dengan meningkatkan kadar SOD darah mencit yang telah dinduksi carbontetrachlorida (CCl4). Dosis ekstrak bawnag dayak 16 mg lebih efektif meningkatkan kadar SOD sehingga lebih efektif mencegah terjadinya stres oksidatif. 12
Saran untuk hasil penelitian ini agar dapat diaplikasikan pada manusia, maka perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai efek toksik, baik akut maupun kronis dari ekstrak bawang dayak.
DAFTAR PUSTAKA Arcana, I.N., Adioka, G.M dan Wihandani, D.M. 2008. Daya Hepatoprotektor Ekstrak Buah Jambu Biji, Buni dan Wortel pada Mencit yang Diinduksi dengan CCl4. Medicina.Vol 39. No 1. Januari 2008. Baba, S., et al. 2007. Continuous Intake of Polyphenolic Compounds Containing Cocoa Powder Reduces LDL Oxidative Susceptibility and Has Beneficial Effects on Plasma HDL-Cholesterol Concentrations in Humans. Am J Clin Nutr. 85:709-717. Bub, A. et al. 2000. Moderate Intervention with Carotenoid-Rich vegetable Products Reduces Lipid Peroxidation in Men. Journal of Nutrition. 130: 2200-2206. Dalle-Donne. I., Rossi, R., Colombo, R., Giustarini, D., and Milzani, A. 2006. Biomarkers of Oxidative Damage in Human Disease. Clinical Chemistry. 52 (4): 601-623. Elisa, 2009. Pengaruh Penambahan Bahan Pengisi dari Agar-agar dan Variasi Konsentrasi Ekstrak Bawang Tiwai Terhadap Mutu Permen Bawang Tiwai. Skripsi Fakultas Pertanian, Universitas Mulawarman, Samarinda. Ernawati dan dan Anni N. 2012. Efek Antioksidan Ekstrak Etanol Bulbus Bawang Dayak (Eleutherine Americana Merr) Terhadap Struktur Mikroanatomi Tubulus Seminiferus Testis Tikus yang Dipapar Asap Rokok. Sains dan Terapan Kimia. Vol. 6(2): 93-100). Firdaus, R. 2006. Telaah Kandungan Kimia Ekstrak Metanol Umbi Bawang Tiwai (Eleutherine americana (Aubl.) Merr). Skripsi. Institute Teknologi Bandung, Bandung. Fuhrman, B., Aviram, M. 2002. Polyphenols and Flavonoids Protect LDL Against Atherogenic Modifications. In: Cadenas, E., Packer, L. (editors). Handbook of Antioxidants. New York: Marcel Dekker. p.303-350. Kuntorini, E.M. dan Astuti, M.D. 2010. Penentuan Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanol Bulbus Bawang Dayak (Eleutherine americana Merr). Sains dan Terapan Kimia. Volume 4. Nomor 1, hal 15-22. Lalamentik, G. 2008. Terapi Sulih Testosteron (Testosterone Replacement Therapy) Memperbaiki Korpus Kavernosum Tikus Wistar (Rattus Norvegicus) yang dikastrasi (tesis). Denpasar. Universitas Udayana. Mangan, Y. 2009. Solusi Mencegah dan Mengatasi Kanker. Jakarta : Agromedia Pustaka, hal.64. 13
Mayes, P.A., and Botham, K.M. 2003. Lipids of Physiologic Significance. In: Murray, R.K., Granner, D.K., Mayes, P.A., and Rodwel, V.W (editors). Harper’s Illustrated Biochemistry. 26th. Ed. New York: McGraw Hill. p.111-121. Mierza, V. 2011. Fraksi Etano Umbi Bawang Sabrang (Eleutherine Palmifolia merr) yang Bersifat Antibakteri. Tesis. Medan: Fakultas Farmasi USU. Hal 61. Pangkahila, W. 2007. Anti-Aging Medicine : Memperlambat Penuaan Meningkatkan Kualitas Hidup. Jakarta. Kompas. Pocock, S.J. 1984. The Size of Clinical Trial, In: Clinical Trials, A Practical Approach, John Wiley & Sons. 123-127. Redaksi Agromedia. 2008. Buku Pintar Tanaman Obat. Jakarta : PT. Agromedia Pustaka. Hal. 22-23. Singarimbun, D. 2011. Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Atrakuinon dari Umbi Bawang Sabrang (Eleutherinae bulbus). Skripsi. Medan: Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara. Hal. 31-37. Subramaniam, K., Sembian, S., Femina, W., Febrina, B.S. dan Gilbert, R.R. 2012. Antagonistic Activity of Eleutherine palmifolia Linn. Asian Pacific Journal of Tropical Disease. S491-493. Wardani, R. 2009. Identifikasi Kandungan Senyawa Metabolit Sekunder Ekstrak Kloroform Umbi Bawang Sabrang (Eleutherine palmifolia (L) Merr). Makalah Seminar Kimia di fakultas Keguruan dan Ilmu Pendidikan Universitas Palangkaraya. Hal. 1-10. Winarsi, H. 2007. Antioksidan Alami dan Radikal Bebas. Penerbit Kanisius. Yogyakarta. Winaya, I.B.O &Suarsana,N, 2005. Perubahan Morfologi Hati dan Ginjal Mencit yang Diinduksi Karbotetraklrida (CCl4). Jurnal Vetenier, Maret 2005, pp 21-23 Yurindani, F.S. 2010. Uji Toksisitas Ekstrak Metanol Bulbus Bawang Dayak (Eleutherine palmifolia) pada Jumlah Sel Darah Tikus Galur Wistar (Rattus norvegicus). Skripsi. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Lambung Mangkurat, Banjarbaru. Tidak dipublikasikan.
14
LAMPIRAN Lampiran 1. Format Justifikasi Anggaran Penelitian 1. Honor Honor Honor/jam (Rp) Ketua 12.500 Anggota 10.000 Anggota 10.000
Waktu Minggu Honor per tahun (Jam/minggu) Thn 1 Thn 2 Thn 3 5 10 625.000 5 10 500.000 5 10 500.000 Sub Total (Rp) 1.625.000 1. Peralatan Penunjang Material Justifikasi Kuantitas Harga Harga Peralatan Penunjang Pemakaian Satuan (Rp) Thn 1 Thn 2 Thn 3
Sub Total (Rp) 2. Bahan Habis Pakai Material Justifikasi Pemakaian Mencit jantan Ekor Bawang dayak Kg Tabung evendorf Buah Pipet tip Box Aquabides Liter Kit Pemeriksaan Buah SOD
Kuantitas
Harga Satuan (Rp) 14.000 92.200 1.000 75.000 50.000 6.728.000
25 10 50 1 1 1
Sub Total (Rp) 3. Perjalanan Material Justifikasi Perjalanan
Kuantitas
Harga Satuan (Rp)
Biaya per tahun (Rp) Thn 1 Thn 2 Thn 3 350.000 922.000 50.000 75.000 50.000 6.728.000 8.175.000 -
-
Biaya per tahun (Rp) Thn 1 Thn 2 Thn 3
Sub Total (Rp) 4. Lain-lain Kegiatan Justifikasi Laporan penelitian
Fotocopy Jilid laporan
Kuantitas 500 lembar
Harga Satuan (Rp) 200
10 eks
10.000 Sub Total (Rp) Total Anggaran yang diperlukan setiap Tahun (Rp) Total Anggaran yang diperlukan Seluruh Tahun (Rp)
15
Biaya per tahun (Rp) Thn 1 Thn 2 Thn 3 100.000 100.000 200.000 10.000.000 -
10.000.000
KONVERSI PERHITUNGAN DOSIS UNTUK BEBERAPA JENIS HEWAN DAN MANUSIA (GOSH, 1971)
Dikutip dari Lalamentik, 2008
16
LAPORAN PENGGUNAAN DANA 1. Honor 2. Bahan Habis Pakai - Mencit - Bawang Dayak - Kit SOD 3. Penggandaan Dokumen Jumlah
Rp 1.625.000,Rp 350.000,Rp 922.000,Rp 6.903.000,Rp 200.000,- + Rp 10.000.000,-
17
