BAB III BAHAN DAN METODE 3.1Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan Mei hingga Nopember 2013. Pengambilan sampel air laut dan sedimen di Pantai Karangsong, Kabupaten Indramayu Jawa Barat. Penelitian utama dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Perikanan dan Kelautan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Pengukuran bobot minyak dilakukan di Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Imu Pengetahuan Alam Universitas Padjadjaran. Pengidentifikasian bakteri dengan uji biokimia dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati Institut Teknologi Bandung.
3.2 Alat dan Bahan Alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi: 1.
Botol sampel steril dan plastik sampel untuk menyimpan sampel saat kegiatan sampling
2.
Labu Erlenmeyer (Pyrex) ukuran 250 mL sebagai alat untuk menempatkan media kultivasi (Agar) ataupun tempat kultivasi cair
3.
Gelas ukur (Iwaki) ukuran 5 ml, 10 ml, dan 100 ml sebagai alat untuk mengukur volume bahan cair (medium atau reagent)
4.
Tabung reaksi sebagai wadah pengenceran atau pembiakan (kultivasi) bakteri dalam media agar miring
5.
Rak tabung reaksi untuk menyimpan tabung reaksi
6.
Vortex mixer (Health H-VM-300) untuk menghomogenkan suspensi pada awal kultivasi
7.
Timbangan analitik (Precisa Gravimetrics ketelitian 0,1 mg) untuk menimbang medium dan sampel yang digunakan.
8.
Hot plate with magnetic stirer (Lab companion-speed 1000 rpm) untuk memanaskan dan menghomogenkan medium agar
9.
Laminar flow cabinet sebagai ruang kerja aseptis dalam isolasi bakteri. 20
21
10.
Pipet untuk mengambil suspensi atau bahan cair dalam ukuran mililiter (ml)
11.
Mikropipet (Eppendorf) ukuran 10-100 μL dan 100-1000 μL untuk mengambil suspensi atau bahan cair dalam ukuran mikroLiter (μL)
12.
Cawan petri sebagai tempat pembiakan (kultivasi) bakteri
13.
Jarum ose sebagai alat untuk memindahkan biakan mikroorganisme dalam proses kultivasi
14.
L glass untuk meratakan suspensi bakteri.
15.
Bunsen sebagai alat bantu aseptisasi ruang kerja dan sterilisasi jarum ose pada kegiatan kultivasi bakteri
16.
Autoclave sterilizer (Al american power/220V) untuk melakukan sterilisasi alat dan medium
17.
General purpose incubator (Sheldon manufacturing inc.) untuk membiakkan (inkubasi) mikroorganisme selama proses kultivasi.
18.
Incubator shaker (Zhicheng tipe ZHWY-1102C) untuk membiakkan bakteri dalam medium cair
19.
Spektrofotometer (Thermo scientific model genesys 10uv) merupakan alat untuk menghitung kepadatan bakteri berdasarkan karakteristik nilai absorbansi
20.
Corong pisah sebagai alat untuk mengekstrasi isolat bakteri
21.
Rotari evaporator (Heidolph) untuk mengekstrasi pelarut dan minyak
22.
Desikator untuk menguapkan dan mendinginkan alat
23.
Kertas label untuk memberi label pada setiap alat yang digunakan
24.
Pengaduk kaca untuk mengaduk larutan
25.
Termometer skala 0°C-100°C ketelitian 0,1°C untuk mengukur suhu air saat kegiatan sampling
26.
Kertas lakmus untuk mengukur pH medium
27.
Plastik wrap untuk merapatkan bagian pinggir cawan petri
28.
Alumunium foil sebagai alas timbangan saat menimbang medium
29.
Plastik untuk membungkus alat saat sterilisasi ataupun saat penyimpanan
30.
Kertas untuk membungkus alat yang digunakan saat sterilisasi ataupun saat penyimpanan
22
31.
Mikroskop untuk mengamati koloni dan morfologi bakteri
32.
Kamera digital untuk dokumentasi kegiatan dan kondisi lingkungan saat sampling
Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini meliputi : 1.
Sampel Air Laut dan Sedimen yang pernah tercemar minyak bumi dari Pantai Karangsong
2.
Crude Oil asal Pertamina UP VI Balongan sebagai sumber hidrokarbon
3.
Akuades atau air laut
4.
Reagen pewarna Gram (Karbol Gentian Violet, Lugol, dan Air Fuchsin)
5.
Media Stone Mineral Salt Solution + Ekstrak Ragi (SMSSe)
6.
Media SMSSe padat
7.
NaCl Fisiologis
8.
Natrium Nitrit 1%
3.3 Metode Penelitian Penelitian ini menggunakan metode observasi di laboratorium. Alur penelitiannya yaitu dimulai dengan sterilisasi alat, penyiapan media, sampling bakteri indigenous dari air laut dan sedimen yang pernah tercemar minyak bumi asal Pantai Karangsong lalu dibawa ke laboratorium Bioteknologi Perikanan dan Kelautan Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran, selanjutnya dilakukan isolasi bakteri penghasil biosurfaktan sampai didapat isolat murni, lalu dilakukan uji emulsifikasi terhadap isolat murni tersebut. Isolat murni penghasil biosurfaktan tertinggi selanjutnya diuji biodegradasi hidrokarbon. Setelah diuji kemampuan menghasilkan biosurfaktan dan mendegradasi hidrokarbon, isolat murni tersebut diidentifikasi jenisnya dengan uji biokimia.
23
3.4 Prosedur Penelitian Diagram alir prosedur penelitian disajikan pada Gambar 1 di bawah ini.
Gambar 1. Diagram Alir Prosedur Penelitian
24
3.4.1 Sterilisasi Alat Alat-alat yang akan digunakan dicuci terlebih dahulu dan dikeringkan. Alat kemudian dibungkus dengan kertas pembungkus setelah itu dilakukan sterilisasi basah atau uap dengan autoklaf dilakukan dengan memasukkan alat atau medium yang akan disterilisasi ke dalam plastik tahan panas, selanjutnya memasukkan alat yang sudah terbungkus tersebut ke dalam autoclave hingga suhu 121°C yang dipertahankan selama 15 menit pada tekanan 1 atm.
3.4.2 Penyiapan Media a.
Media Stone Mineral Salt Solution + Ekstrak Ragi (SMSSe) Media yang digunakan dalam isolasi, fermentasi bakteri penghasil
biosurfaktan dan uji biodegradasi hidrokarbon adalah dengan media SMSSe. Untuk membuat media SMSSe padat ditambahkan bacto agar sebanyak 15 gram/liter aquadest. Komposisi media SMSSe dapat dilihat di Lampiran 4. Penambahan bacto agar bertujuan agar media SMSSe dapat menjadi padat. Masing-masing media yang telah disiapkan disterilisasi menggunakan autoclave pada 121° C dengan tekanan 1 atm dan dipertahankan selama 15 menit.
3.4.3 Pengambilan Sampel Air dan Sedimen Sampel yang diambil adalah air laut dan sedimen dari Pantai Karangsong Kabupaten Indramayu Jawa Barat yang pernah terkena tumpahan minyak bumi. Sampel air laut dan sedimen masing-masing diambil dari 4 titik yang berbeda di pinggir pantai tanpa ulangan. Sampel air laut diambil cara memegang botol steril bagian bawah dan mencelupkan botol steril 20 cm di bawah permukaan air dengan posisi botol berlawanan dengan arah aliran (Lampiran 1). Sedangkan untuk sampel sedimen diambil dari permukaan dasar perairan dengan menggunakan grab sampler. Sampel air laut dan sedimen tersebut dimasukkan ke dalam botol sampel steril dan diberi label serta disimpan dalam kondisi dingin dalam cool box untuk menghindari terjadinya degradasi jumlah bakteri bahkan kematian bakteri pada sampel. Setelah itu sampel segera
25
diperlakukan dengan tenggang waktu tidak lebih dari 24 jam, meliputi tahap pengenceran sampai pengisolasian.
3.4.4
Isolasi Bakteri Penghasil Biosurfaktan
3.4.4.1 Pengenceran Sampel dan Isolasi Bakteri Isolasi bakteri dari sampel air laut dan sedimen dilakukan dengan teknik pengenceran bertingkat, yaitu sebanyak 1 ml air laut dan 1 gram sedimen dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berbeda yang masing-masing telah ditambahkan 9 mL larutan NaCI fisiologis, vortex sebentar agar suspensi homogen. Selanjutnya, sebanyak 1 mL suspensi diambil dari tabung pertama kemudian dimasukkan ke dalam tabung pengencer pertama yang berisi 9 mL NaCl fisiologis secara aseptis, setelah tabung pengencer kedua divorteks, 1 mL suspensi dimasukkan ke dalam tabung pengencer kedua, begitu seterusnya hingga pengenceran ketujuh. Teknik pengenceran bertingkat dapat dilihat pada Gambar 2 di bawah ini.
Gambar 2. Teknik Pengenceran Bertingkat
Masing-masing suspensi bakteri dari tabung pengenceran 10-5, 10-6 dan l0-7 diinokulasikan ke dalam media SMSSe + bacto agar dengan metode pour plate sebanyak 0,1 ml. Setelah itu diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam. Bakteri yang tumbuh dimurnikan lagi berdasarkan karakteristik morfologi yang sama dengan teknik goresan pada media SMSSe + bacto agar sehingga didapatkan
26
koloni tunggal. Isolat-isolat murni yang didapat disimpan atau dipelihara pada agar miring SMSSe + bacto agar dan diletakkan dalam refrigerator sebagai stok.
3.4.4.2 Karakterisasi Bakteri Penghasil Biosurfaktan Masing-masing biakan murni diamati karakterisasi keragaman bakteri meliputi morfologi koloni berupa ukuran, warna, bentuk, tepian, kenaikan permukaan. Pengamatan dilakukan setelah 24 jam waktu inkubasi. Selanjutnya, dilakukan pengamatan bentuk dan warna sel bakteri dengan teknik pewarnaan Gram (Lampiran 6). Pengamatan morfologi bakteri ini untuk melihat kemurniaan bakteri yang telah diisolasi.
3.4.4.3 Penyiapan Inokulum untuk Prekultur Inokulum untuk fermentasi dipersiapkan untuk melakukan uji emulsifikasi dengan mengambil 1 ose isolat murni dari media SMSSe + bacto agar yang ditumbuhkan pada 50 ml media SMSSe. Kultur diinkubasi dengan incubator shaker pada suhu kamar kecepatan 200 rpm selama 3 hari. Setelah hari ke 3, kemudian dihitung populasi sel bakteri sampai mencapai populasi 106 sel/ml (Tabatabaee et al. 2005).
3.4.4.4 Fermentasi untuk Persiapan Uji Emulsifikasi Prekultur yang telah dipersiapkan dipindahkan 1 ml (populasi 106) secara aseptis ke dalam Erlenmeyer 250 ml yang telah berisi 50 ml larutan SMSSe Selanjutnya diinkubasi dengan menggunakan incubator shaker pada temperatur kamar dan kecepatan 200 rpm selama 3 hari. Bakteri yang berpotensi menghasilkan biosurfaktan ditandai dengan terbentuknya busa (foam) pada larutan fermentasi. (Tabatabaee et al. 2005). Kultur hasil fermentasi ini selanjutnya digunakan untuk uji emulsifikasi.
27
3.4.5
Biodegradasi Total Petroleum Hydrocarbon
3.4.5.1 Peremajaan Bakteri Tiga biakan murni bakteri terbaik dalam menghasilkan biosurfaktan di media agar miring ditumbuhkan kembali di medium SMSSe padat dengan cara menginokulasikan 1 ose biakan bakteri dari masing-masing biakan murni ke dalam media di wadah cawan petri. Kultur diinkubasi selama 1-2 hari pada suhu 30°C.
3.4.5.2 Penyediaan Inokulum Biodegradasi Bakteri pada SMSSe padat diinokulasikan ke dalam erlenmeyer 250 ml berisi 100 ml SMSSe yang telah disterilisasi sebanyak 2-3 ose. Ke dalam media ini ditambahkan minyak mentah sebanyak 0.1 % v/v sebagai sumber karbon. Erlenmeyer diaduk selama 24 jam dengan rotari shaker pada temperatur ruangan dengan kecepatan 120 rpm untuk menjaga agar proses berlangsung secara aerob.
3.4.5.3 Uji BiodegradasiTotal Petroleum Hydrocarbon Dari setiap inokulum biodegradasi dalam media SMSSe diinokulasikan ke dalam media SMSSe baru sebanyak 10 % v/v dan ke dalam media SMSSe cair baru 100 ml ditambahkan 1 % v/v minyak mentah secara aseptik lalu diinkubasi selama 4 hari (Diswanto dan Kardena 2010). Kultur bakteri dibuat duplo untuk pembuatan kurva pertumbuhan bakteri dan uji biodegradasi bakteri.
3.4.5.4 Perhitungan Jumlah Koloni Bakteri Jumlah koloni bakteri pendegradasi hidrokarbon dihitung dengan cara mengambil 1 ml medium biodegradasi yang telah ditumbuhi bakteri setiap 12 jam sekali selama 3 hari, kemudian dilakukan pengenceran bakteri dari 10-1 sampai 109
. Dari tiga pengenceran terakhir diinokulasikan ke dalam medium SMSSe padat
lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 30°C dengan menggunakan metode pour plate, kemudian dihitung jumlah koloni bakteri yang tumbuh.Hasil penghitungan bakteri dinyatakan dalam satuan Colony Forming Unit (CFU)/ml.
28
3.4.5.5 Pengukuran Kadar Minyak Bumi (TPH) Pengukuran kadar minyak bumi didasarkan pada kelarutannya dalam pengekstrak heksan atau kloroform. Setelah ekstraksi, pelarut diuapkan dan bobot minyak mentah ditentukan dengan metode gravimetri berdasarkan SNI 06 6989.10-2004 (Lampiran 9), selain itu dihitung pula persentase biodegradasi minyak mentah oleh bakteri. Pengamatan proses biodegradasi Total Petroleum Hydrocarbon dilakukan terhadap setiap kultur pada jam ke 0, 24, 48 dan 72 dengan menginjeksikan 6 tetes natrium nitrit 1% untuk mematikan bakteri dan melihat persentase biodegradasi minyak mentah setiap hari (Yani dan Akbar 2009).
3.4.6 Identifikasi Bakteri Identifikasi bakteri dilakukan pada isolat bakteri yang memiliki kemampuan tertinggi menghasilkan biosurfaktan melalui karakterisasi morfologi bakteri, pewarnaan Gram, serta aktivitas biokimianya (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology). Proses identifikasi mikroorganisme dengan uji biokimia digunakan beranekaragam media. Uji biokimia dilakukan untuk mengidentifikasi bakteri berdasarkan enzim yang dihasilkannya. Enzim tersebut terdiri dari enzim ekstraselular dan intraselular. Jenis uji media yang dianalisis adalah uji hidrolisa pati, hidrolisa kasein, fermentasi laktosa, fermentasi sukrosa, fermentasi glukosa, fermentasi mannitol, reduksi nitrat, katalase, indol, hidrogen sulfida, metil merah, Vogus-Proskauer, sitrat, urease dan hidrolisa gelatin. Komposisi yang digunakan sesuai dengan standar Microbiology Laboratory Manual (Cappucino dan Sherman 2008). Gambar 3 merupakan uji yang dilakukan terhadap bakteri target.
29
Gambar 3. Uji Biokimia pada Mikroorganisme (Sumber: Cappuccino dan Sherman 2008)
3.5 Parameter Pengamatan 3.5.1 Morfologi Koloni Bakteri Morfologi koloni bakteri diamati berdasarkan ukuran, warna, bentuk, tepian, dan elevasi koloni bakteri yang tumbuh. Ukuran koloni terdiri dari pintpoint (seperti titik), kecil, sedang, dan besar. Warna koloni bakteri antara lain putih, kuning, merah, ungu. Bentuk koloni terdiri dari circular (bulat, bertepi), irregular (tidak beraturan, bertepi), rhizoid (seperti akar, menyebar). Tepian atau margin koloni bakteri yaitu entire (rata), lobate (berlekuk), undulate (bergelombang), serrate (bergerigi), dan filamentous (seperti benang). Elevasi dari koloni yaitu flat (datar, nyaris rata dengan medium), raised (ketinggian koloni terlihat, namun rata pada seluruh permukaan), convex (cembung), umbonate (cembung serta di bagian tengah lebih menonjol). Morfologi koloni bakteri dapat dilihat pada Gambar 4.
30
Gambar 4. Morfologi Koloni Bakteri (Sumber: Cappuccino dan Sherman 2008) 3.5.2 Bentuk dan Warna Sel Bakteri Bentuk sel bakteri dapat dilihat setelah dilakukan proses pewarnaan Gram.Bentuk sel bakteri terdiri dari bulat (coccus), batang (basil) dan spiral (spirilia). Bakteri Gram positif ditunjukkan dengan warna ungu dan bakteri Gram negatif ditunjukkan dengan warna merah. Umur isolat saat dilakukan pewarnaan antara 24-48 jam.
3.5.3 Uji Emulsifikasi Uji emulsifikasi dilakukan untuk mengetahui kemampuan biosurfaktan dalam mengemuisi lapisan lemak. Dalam penelitian ini digunakan crude oil sebagai substrat lemak yang akan diemulsi. Perbandingan antara kerosene dan kultur cair adalah 6: 4. Dimasukkan 6 ml crude oil ke dalam tabung reaksi setelah itu ditambahkan kultur cair 4 ml hasil fermentasi, kemudian divorteks dengan kecepatan tinggi selama 2 menit. Setelah itu didiamkan selama 24 jam untuk melihat kestabilan emulsi. Kemudian diukur indeks emulsifikasi dengan menggunakan rumus Cooper dan Goldenberg (1987). Untuk menghitung indeks emulsifikasi, digunakan rumus sebagai berikut:
31
3.5.4 Kadar Minyak atau Total Petroleum Hydrocarbon (TPH) Kadar minyak bumi dalam media dihitung berdasarkan rumus SNI 06 6989.10-2004.
Keterangan:
A = berat labu + ekstrak (mg) B = berat labu kosong (mg)
3.5.6 Persentase Biodegradasi Minyak Bumi Untuk menentukan persentase biodegradasi dari minyak bumi yang terjadi dapat diketahui dengan rumus :
Keterangan: % B
=
persentase biodegradasi
BMo
=
bobot minyak bumi awal (g)
BMn
=
bobot minyak bumi akhir (g)
Sumber: Herdiyantoro (2005)
3.5.7 Total Plate Count(TPC) Perhitungan jumlah bakteri dilakukan dengan menggunakan metode Total Plate Count (Cappucino dan Sherman 2008), dihitung dengan rumus berikut: (
)
32
Keterangan: K
: banyak koloni (CFU/ml)
a,b,c
: jumlah koloni bakteri
e,f,g
: faktor pengenceran
3.6 Analisis Data Data yang diperoleh dari penelitian ini adalah bakteri yang menghasilkan biosurfaktan melalui uji emulsifikasi yang juga mampu menurunkan kadar Total Petroleum Hydrocarbon (TPH). Data yang ada kemudian dianalisis secara deskriptif dan ditampilkan dalam bentuk tabel dan gambar.
