9
BAB III BAHAN DAN METODE 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan September 2011 sampai dengan Juli 2012. Kegiatan ekstraksi DNA sampai PCR-RFLP dilakukan di laboratorium Analisis Genetik, Bagian Silvikultur, Fakultas Kehutanan, Institut Pertanian Bogor. Sequencing DNA, contoh dikirim ke PT. Genetika Science di Singapura (http://base-asia.com). 3.2 Bahan dan Alat Penelitian 3.2.1 Koleksi Contoh Uji Daun Contoh daun terdiri dari S.macrophylla, S.mahagoni, A. indica, M. azedarach, dan M. excelsa yang digunakan untuk analisis PCR dan sequencing DNA. Contoh daun berasal dari tiga lokasi yaitu sekitar kampus Fakultas Kehutanan IPB (S.macrophylla, S.mahagoni, K. anthotheca, dan M. azedarach), dan Pusat Penelitian dan Pengembangan Kehutanan Bogor (A. indica). 3.2.2 Analisis Genetik Alat dan bahan yang digunakan untuk analisis genetik dengan penanda PCR terbagi dalam beberapa tahap pekerjaan, yaitu tahapan ekstraksi DNA, uji kualitas DNA, visualisasi DNA serta analisis data. Alat dan bahan yang digunakan pada teknik PCR disajikan pada Tabel 1. Tabel 1 Alat dan bahan untuk teknik analisis genetik Analisis
Ekstraksi Alat: sarung tangan, tube 2ml, mortar, sudip, pestel, tips, mikropipet, mesin centrifugase, vorteks, waterbath, freezer, desikator
PCR Bahan: PVP 1%, Chloroform IAA, Isopropanol dingin, NaCl, Etanol 100%, buffer TE
Tahapan Kerja Uji kualitas DNA Alat: sarung tangan, timbangan analitik, gelas ukur, tabung erlenmeyer, cetakan agar, microwave,mikropipet, mesin elektroforesis fisher scientific,bak EtBr, kamera/alat foto DNA, mesin UV Transiluminator,laptop. Bahan: agarosee, bufer TAE 1x, DNA ekstraksi, Blue juice 10x, EtBr
PCR Alat: sarung tangan, tube 0,2ml, rakmikrotube, alat tulis, mikropipet, tips, mesin centrifugasi, mesin PCR PTC - 100
Bahan: DNA, primer spesifik forward dan reverse, Green Go Taq master mix (promega#M7122)
10
3.3 Prosedur Penelitian Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah teknik PCR. Secara umum prosedur penelitian teknik PCR disajikan pada Gambar 5. Tahap penelitian terdiri dari tiga tahap analisis yaitu analisis sekuen ITS2, analisis fragmen ITS2 dan analisis fragmen mat-K secara in silico. 3.3.1 Analisis Sekuen ITS2 Ekstraksi DNA Kegiatan ekstraksi dan isolasi DNA dari daun dilakukan dengan menggunakan metode CTAB (cetyl trimethyl ammonium bromide) yang dimodifikasi untuk mendapatkan DNA yang cukup murni. Contoh daun (2x2 cm2) digerus di dalam pestel bersih, lalu dipindahkan ke dalam tube 1,5 mL dan ditambahkan 500−700 larutan penyangga ekstrak dan 100 µL PVP 2%. Hasil gerusan kemudian dikocok dengan vortex agar menjadi homogen, selanjutnya diinkubasi dalam waterbath selama 60 menit pada suhu 650C. Untuk mengikat DNA ditambahkan kloroform 500 µL dan fenol 10 µL, lalu dikocok sampai homogen. Sentrifugasi dilakukan untuk memisahkan fase air dan fase bahan organik (supernatan) pada kecepatan 11.000 rpm selama 10 menit. Supernatan diambil dan dipindahkan ke dalam tube baru, lalu ditambahkan isopropanol dingin 500 µL dan NaCl 300 µL. Campuran supernatan dengan isopropanol dingin dan NaCl disimpan dalam freezer selama 60 menit untuk mendapatkan supernatan DNA. Kegiatan selanjutnya adalah pencucian DNA dengan menambahkan etanol 100% sebanyak 300 µL lalu disentrifugasi pada kecepatan 11.000 rpm selama 10 menit. Cairan etanol dibuang dengan hati-hati agar supernatan DNA tidak ikut terbuang, pelet DNA disimpan di dalam desikator selama ±15 menit, selanjutnya ditambahkan larutan penyangga TE 20 µL, setelah itu dikocok dan disentrifugasi kembali. Langkah tersebut dilakukan sampai mendapatkan DNA yang murni, jika belum mendapatkan DNA yang bersih dan masih memiliki banyak kotoran perlu diulangi kembali langkah-langkah seperti yang telah dijelaskan di atas. DNA yang bersih dapat diuji melalui tahap elektroforesis pada gel agarose yang dilakukan pada setiap akhir dari suatu teknik analisis genetik. Agarose yang digunakan memiliki konsentrasi yang berbeda pada setiap pengujian kualitas DNA sesuai pada teknik yang sedang dilakukan.
11
5 jenis : S. mc, S. mg, M. az, A. in, dan K. an
Sampel daun
CTAB (Doyle and Doyle 1990)
Ekstraksi DNA
Ya
Tidak
Elektroforesis agarose 1 %
-ITS2 PCR (Banks 1985)
PCR
Ya
Tidak
Elektroforesis agarose 2%
Restriksi enzim secara in silico
5 jenis sampel ITS2
Sekuen
18 enzim (sesuai pada 1.2)
Analisis Data
-BioEdit v.7.0.9 -ClustalW2 EBI-EMBL -TreeviewX -PopGene, NTSYs dan pDRAW32
Gambar 5 Bagan alur penelitian di laboratorium (S. mc = S. macrophylla; S. mg = S. mahagoni; K. an = K. anthotheca; A. in = A. indica; M. az =M. azedarach)
Pengujian Kualitas DNA DNA hasil ekstraksi kemudian uji kualitas dengan menggunakan teknik elektroforesis agarose 1% (w/v). Gel ini dibuat dengan melarutkan agarose sebanyak 0,33 g ke dalam 33 µL larutan TAE (tris HCl-acetic acid-EDTA). Kemudian campuran dipanaskan di dalam microwave sampai mendidih. Larutan gel kemudian dituangkan ke dalam cetakan gel. Cetakan gel tersebut telah dipasang sisir/comb yang berfungsi untuk membuat sumur gel. Setelah gel membeku, sisir dicabut dan gel beserta cetakannya diletakkan di dalam bak elektroforesis yang telah berisi larutan penyangga TAE. DNA hasil ekstraksi diambil sebanyak 3 µL dan ditambah 2 µL blue juice 10X, selanjutnya dilakukan proses elektroforesis dengan menggunakan aliran listrik dengan tegangan 100 V selama 1 jam. Gel
yang
sudah
dielektroforesis
dilakukan
pewarnaan
dengan
merendamkan gel di dalam larutan Ethidium Bromida (EtBr), yaitu campuran 10
12
µL EtBr dan 190 mL aquades selama 15 menit. Kemudian profil DNA hasil ekstraksi dideteksi dengan menggunakan UV transilluminator. Proses Amplifikasi DNA dengan Teknik PCR (polymerase chain reaction) DNA hasil ekstraksi diamplifikasi dengan menggunakan primer ITS2. Menurut Marder (2001), primer diperlukan karena DNA polimerase tidak dapat memulai replikasi tanpa terjadi penempelan primer terlebih dahulu terhadap DNA target. Adapun urutan nukleotida dari primer tersebut terdapat pada Tabel 2. Tabel 2 Primer yang digunakan untuk amplifikasi DNA Gen
Posisi gen
Sekuen primer (5'-3')
Suhu annealling (°C)
Sumber
ITS2
Second Internal Transcribed Spacer
5’-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-3’
480
White et al. 1990
Secara umum proses PCR menggunakan lima komponen utama yang dicampurkan ke dalam tube 0,2 mL. Komponen yang diperlukan untuk teknik PCR terdapat pada Tabel 3. Tabel 3 Komposisi bahan-bahan yang digunakan untuk PCR No 1 2 3 4 5
Komponen
Volume (µL)
Cetakan DNA Forward Primer Reverse Primer Nucleas free water Green Go Taq Master Mix Kit Jumlah
2,5 1,9 1,9 3,5 10,0 19,8
Proses PCR dilakukan melalui tiga tahapan yaitu denaturation, annealing, dan extention. Pada proses ini suhu yang dipakai berbeda-beda tergantung pada teknik, bahan kimia dan primer yang digunakan. Pengaturan suhu untuk PCR terdapat pada Tabel 4. Tabel 4 Tahapan-tahapan dalam proses PCR Tahapan
Suhu (°C)
Waktu (menit)
Jumlah Siklus
Pre-denaturation Denaturation
95 95
3 1
-
Annealing
48
1
36
Extention Final Extention
72 72
1 10
1 -
13
Hasil PCR kemudian dianalisis dengan melakukan elektroforesis gel agarose 2% (w/v) dalam larutan buffer TAE 1x. Setelah running selesai dilakukan distaining dalam larutan Ethidium Bromide (EtBr). Sequencing DNA Proses sequencing dilakukan setelah DNA hasil amplifikasi diukur kualitasnya dengan cara dielektroforesis pada gel agarose 2%. DNA hasil amplifikasi tersebut kemudian dikirim ke PT. Genetika Science Indonesia di Singapura bersama primer yang telah digunakan dalam proses amplifikasi. Kemudian
dianalisis
dengan
program
ClustalW2
EMBL-EBI
(http://ebi.ac.uk/Tools/msa/clustal-w2), software BioEdit dan TreeViewX (Hall 2007) serta analisis keanekaragaman menggunakan software DNAsp versi 3.5 (Rozas dan Rozas 1999) digunakan untuk mencari nilai keragaman nukleotida. 3.3.2 Analisis Fragmen ITS2 secara In Silico Sekuen DNA dimasukkan pada program pDRAW32 yang dikembangkan oleh AcaClone Software (http://www.acaclone.com). Masing-masing sekuen DNA kemudian dipotong menggunakan 18 enzim restriksi. Setelah dipotong kemudian ditampilkan dengan elektroforesis gel agarose 2 %. 3.3.3 Analisis Fragmen matK Data Mining Meliaceae Data mining tidak dilakukan melalui prosedur kerja pada laboratorium. Data ini diambil dari database GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.g-ov/genbank/) untuk lima spesies yang sama pada region ITS2, ukuran sekuen yang digunakan berbeda pada kedua region, untuk eksplorasi marker pad mat-K digunakan sekuen DNA dengan pangjang ± 800 bp, secara terperinci dapat dilihat seperti disajikan pada Tabel 5. Tabel 5 Spesies yang digunakan untuk region mat-K (GenBank 2012) Spesies Swietenia macrophylla Swietenia mahagoni Azadirachta indica Melia azedarach Khaya anthotheca
Sumber Muellner et al. (2003) Clayton et al. (2007) Muellner et al. (2003) Abbott et al. (2009) Muellner et al. (2003)
GenBank Accession
Panjang basa (bp)
AY128200 EU042907 AY128180 GU134981 AY128190
857 918 863 827 857
14
Sequence DNA Runutan DNA dari data mining dirunutkan dengan menggunakan program perangkat lunak. Perangkat lunak yang digunakan adalah ClustalW2, software BioEdit, TreeViewX. Analisis Fragmen matK secara in silico Sekuen DNA dimasukkan pada program pDRAW32 yang dikembangkan oleh AcaClone Software (http://www.acaclone.com). Masing-masing sekuen DNA kemudian dipotong menggunakan 18 enzim restriksi. Setelah dipotong kemudian ditampilkan dengan elektroforesis gel agarose 2 %.
