BAB III BAHAN DAN METODE
3.1
Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian
ini
dilaksanakan
di
Laboratorium
Bioteknologi
dan
Laboratorium Akuakultur Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran. Penelitian dilaksanakan dalam dua tahap yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian utama. Penelitian pendahuluan dilaksanakan pada bulan Januari 2013 sampai dengan Februari 2013. Penelitian utama dilaksanakan pada bulan April 2013 sampai dengan Mei 2013. 3.2
Alat dan Bahan
3.2.1. Alat Penelitian Alat-alat yang digunakan dalam penelitian adalah : 1. Peralatan yang digunakan untuk uji zona hambat ekstrak daun nangka terhadap bakteri :
Alumunium foil digunakan untuk membungkus alat-alat.
Autoclave dengan tekanan 1 atm, pada suhu 1210C untuk mensterilkan alat dan media.
Bunsen untuk mensterilkan alat inokulasi bakteri.
Erlenmeyer 250 mL merk Pyrex sebagai alat untuk menempatkan media agar.
Falcon Centrifuge Tube 15 mL sebagai alat untuk membuat larutan bakteri Aeromonas hydrophila.
Gelas ukur 1 L merk Pyrex sebagai alat untuk mengukur volume bahan cair yang akan digunakan.
Hot plates dan magnetic stirer sebagai alat untuk menghomogenkan media agar.
Inkubator sebagai tempat untuk inkubasi bakteri.
17
18
Jangka sorong digital ketelitian 0,1 mm sebagai alat untuk mengukur zona bening yang terbentuk.
Jarum ose sebagai alat untuk mengambil biakan bakteri.
Kapas sebagai penutup pada tabung reaksi.
Kertas saring Whatman no. 42 dengan diameter 5 mm sebagai kertas cakram untuk menentukan zona bening.
L glass sebagai alat untuk meratakan bakteri dalam petri dish.
Laminar air flow sebagai ruang kerja aseptis dengan bantuan sterilisasi UV.
Mikropipet merk Eppendorf sebagai alat untuk mengambil suspensi.
Parafilm sebagai segel cawan petri untuk mencegah kontaminasi.
Petri dish merk Pyrex sebagai tempat pembiakan bakteri sebanyak 6 buah.
Plastik tahan panas sebagai pembungkus alat-alat setelah sebelumnya dibungkus oleh alumunium foil untuk disterilisasi.
Spektrofotometer Genesys 10 UV sebagai alat untuk menghitung kepadatan mikrooganisme.
Timbangan analitik merk Precisa ketelitian 0,001 g sebagai alat untuk menimbang bahan.
2. Peralatan yang digunakan untuk uji LC50 :
Aerator, selang aerasi dan batu aerasi sebagai alat untuk memasok O2 pada setiap akuarium dan bak fiber.
Akuarium ukuran 20 x 40 x 30 cm3 sebagai wadah penelitian sebanyak 8 buah.
Serok kain kasa sebagai alat untuk mengambil ikan mas.
Software Epa Probhit Analysis untuk menganalisis nilai toksisitas ekstrak daun nangka.
19
3. Peralatan yang digunakan dalam penelitian utama :
Aerator, selang aerasi dan batu aerasi sebagai alat untuk memasok O2 pada setiap akuarium dan bak fiber
Akuarium ukuran 20 x 40 x 30 cm3 sebagai wadah penelitian sebanyak 15 buah.
Alat
Suntik
dengan ketelitian
0,1
mL sebagai
alat
untuk
menginfeksikan bakteri pada ikan.
Serok kain kasa sebagai alat untuk mengambil ikan
4. Peralatan yang digunakan untuk pengukuran kualitas air :
DO meter merk Hanna HI-3810 sebagai alat untuk mengukur oksigen terlarut.
pH meter merk Lutron pH-44 sebagai alat untuk mengukur dan mengontrol derajat keasaman air.
Termometer dengan ukuran 00C–1000C sebagai alat untuk mengukur suhu air.
3.2.2. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah : 1. Ikan Uji Ikan uji yang digunakan adalah ikan mas dengan ukuran 7–10 cm berasal dari Balai Benih Ciparay. 120 ekor untuk uji pendahuluan LC50 48 jam ekstrak daun nangka dan 30 ekor untuk stok. 225 ekor untuk penelitian utama dan 75 untuk stok. 2. Daun Nangka Daun nangka diperoleh dari PEDCA FPIK UNPAD Jatinangor-Sumedang. 3. Bakteri Bakteri yang digunakan adalah Aeromonoas hydrophila yang berasal dari Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar, Bogor.
20
4. Media Bakteri Media yang digunakan untuk kultur adalah Nutrien Agar merk dagang Oxoid dengan dosis pembuatan 28 gram/L. 5. Aquades dan alkohol Aquades dan alkohol digunakan untuk mencuci preparat dan alat yang telah digunakan. 6. Etanol 96 % Etanol digunakan sebagai bahan pelarut ekstrak daun nangka. 7. NaCl Fisiologis 0,9 % NaCl fisiologis sebagai larutan suspensi bakteri. 8. Pakan Pakan yang digunakan merupakan pelet komersil merk PF-600 dengan kandungan protein 39 %. 3.3
Metode Penelitian Metode penelitian dilakukan secara eksperimental dengan menggunakan
Rancangan Acak Lengkap (RAL) yang terdiri atas lima perlakuan. Setiap perlakuan diulang sebanyak tiga kali. Perlakuan yang diberikan adalah perendaman benih ikan mas dalam larutan ekstrak daun nangka dengan konsentrasi berbeda. Konsentrasi yang digunakan dalam penelitian, didasarkan atas penelitian pendahuluan. 3.4
Prosedur Penelitian
3.4.1 Penelitian Pendahuluan 1. Pembutan Ekstrak Daun Nangka Pembuatan ekstrak daun nangka dilakukan untuk mendapatkan stok ekstrak yang digunakan dalam penelitian. Tahapan pembuatan ekstrak daun nangka (Lampiran 1).
21
2. Uji Fitokimia Daun Nangka Uji fitokimia daun nangka dilakukan untuk mengetahui kandungan yang terdapat di dalam daun nangka. Pengujian dilakukan yaitu uji kandungan alkaloid, falvonoid, saponin dan tanin. Tahapan pengujian fitokimia (Lampiran 2). 3. Uji Zona Hambat Uji zona hambat dilakukan untuk mengetahui kemampuan ekstrak daun nangka sebagai antibakteri dalam menghambat metabolisme kerja bakteri Aeromonas hydrophila. Uji zona hambat dilakukan pada berbagai konsentrasi yaitu 100.000 ppm, 10.000 ppm, 1000 ppm, 100 ppm dan 10 ppm dengan tiga kali ulangan dan kontrol menggunakan ampisilin dengan konsetrasi 10.000 ppm, 1000 ppm dan 100 ppm dengan dua kali ulangan. Langkah kerja untuk uji zona hambat sebagai berikut : 1. Peralatan dan bahan yang digunakan untuk uji zona hambat disterilisasi terlebih dahulu dengan autoclave pada suhu 1210C dan tekanan 1 atm selama 15 menit. 2. Pembuatan konsentrasi ekstrak daun nangka dilakukan dengan cara pengenceran dengan aquades (Lampiran 3). 3. Pembuatan media NA sebagai media pertumbuhan Aeromonas hydrophila (Lampiran 4). 4. Pembuatan larutan bakteri dengan kepadatan 108 cfu/mL pada tabung falcon (Lampiran 5). 5. Pengambilan suspensi cairan bakteri kepadatan 108 cfu/mL sebanyak 0,1 mL dengan pipet ukur kemudian teteskan diatas permukaan agar yang telah memadat. 6. Meratakan penyebaran bakteri dalam media agar menggunakan L glass. 7. Meletakan kertas cakram yang telah dipersiapkan diatas media petri dish agar NA yang telah diinokulasi dengan bakteri Aeromonas hydrophila. 8. Meneteskan ekstrak daun nangka dengan konsentrasi sebesar 10 ppm, 100 ppm, 1000 ppm, 10.000 ppm dan 100.000 ppm ke atas kertas cakram.
22
9. Metode pengerjaan dilakukan secara steril di ruang laminar air flow untuk mencegah kontaminasi. 10. Menginkubasikan selama 18–24 jam pada suhu 270C. 11. Diameter zona hambatan yang dihasilkan berupa zona bening pada uji ini kemudian diamati. Hasil pengamatan uji zona hambat yang disebabkan oleh ekstrak daun nangka pada metode difusi agar dapat dilihat pada Tabel 1 dan 2. Tabel 1. Hasil pengamatan uji zona hambat pada metode difusi agar Perlakuan (ppm)
Zona Hambat Ulangan keI
II
III
Rata-rata (mm)
100.000 10.000
9,52 8,86
10,69 9,2
10,03 9,12
10,08 9,06
1000 100 10
8,24 8,03 7,27
9,16 8,66 7,21
8,79 7,04 6,41
8,73 7,91 6,96
Tabel 2. Hasil pengamatan kontrol uji zona hambat pada metode difusi agar Perlakuan (ppm)
Zona Hambat Ulangan keI II
Rata-rata (mm)
10.000 1000
9,81 8,17
9,16 8,36
9,48 8,26
100
8,07
7,94
8,01
Berdasarkan tabel diatas, diketahui konsentrasi minimum rata-rata yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri adalah pada konsentrasi 10 ppm dengan diameter zona hambat rata-rata 6,96 mm dan konsentrasi yang dapat menghambat pertumbuhan terbesar adalah 100.000 ppm dengan diameter zona hambat rata-rata 10,08 mm. Kontrol yang dilakukan untuk penelitian ini mengunakan ampisilin karena diketahui bahwa ampisilin merupakan antibiotik yang dapat mengobati infeksi ringan sampai sedang yang disebabkan oleh bakteri dan telah banyak diaplikasikan dalam bidang kesehatan.
23
Berdasarkan hasil uji zona hambat dapat diketahui bahwa semakin bertambahnya konsentrasi ekstrak yang diberikan, maka zona hambat yang dihasilkan juga semakin besar (Lampiran 6). Sehingga semakin besar konsetrasi ekstrak maka semakin efektif untuk membunuh bakteri Aeromonas hydrophila. 4. Uji LC50 (Lethal Concentration 50 %) Perendaman Ekstrak Daun Nangka Uji LC50 perendaman ekstrak daun nangka dilakukan untuk mendapatkan konsentrasi ekstrak dengan mortalitas ikan mas sebanyak 50 % selama 48 jam. Perlakuan pada uji LC50 dilakukan dengan dua ulangan pada konsentrasi 50 ppm, 100 ppm, 300 ppm, dan 600 ppm (Lampiran 3). Ikan uji dimasukan ke dalam wadah perlakuan berupa akuarium dengan padat penebaran 15 ekor/akuarium. Sebelum dilakukan uji LC50 ikan mas terlebih dahulu diaklimatisasi selama 7 hari dan diberi pakan pelet secara adlibitum. Kemudian akuarium diisi ekstrak daun nangka sesuai perlakuan. Hasil uji LC50 perendaman ekstrak daun nangka terhadap benih ikan mas yang dilakukan pada penelitian pendahuluan dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3. Hasil uji LC50 48 jam ekstrak daun nangka pada benih ikan mas Perlakuan A1 A2 B1 B2 C1 C2 D1 D2 E1 E2
24 15 15 14 14 9 11 -
Mortalitas pada jam ke48 Tidak dihitung lagi Tidak dihitung lagi -
Jumlah
Keterangan : A = Ekstrak daun nangka konsentrasi 600 ppm B = Ekstrak daun nangka konsentrasi 300 ppm C = Ekstrak daun nangka konsentrasi 100 ppm D = Ekstrak daun nangka konsentrasi 50 ppm E = Tanpa perendaman ekstrak daun nangka (0 ppm)
15 15 14 14 9 11 0 0 0 0
24
Kelangsungan hidup ikan dalam uji LC50 dianalisis melalui program Probit Analysis menggunakan software dari US Environmental Protection Agency (US EPA). Nilai LC50 yang diperoleh adalah 101,910 ppm ekstrak daun nangka dapat mengaikbatkan mortalitas benih ikan mas sebanyak 50 % dalam waktu 48 jam (Lampiran 7). Berdasarkan hasil zona hambat dan uji LC50, konsentrasi yang efektif untuk menghambat pertumbuhan Aeromonas hydrophila berada diatas nilai zona hambat terkecil dan dibawah nilai LC5048 jam. Sehingga perlakuan yang digunakan dalam penelitian ini adalah :
Perlakuan A = Tanpa perendaman ekstrak daun nangka (0 ppm)
Perlakuan B = Ekstrak daun nangka konsentrasi 20 ppm
Perlakuan C = Ekstrak daun nangka konsentrasi 30 ppm
Perlakuan D = Ekstrak daun nangka konsentrasi 40 ppm
Perlakuan E = Ekstrak daun nangka konsentrasi 50 ppm
Model umum rancangan yang digunakan adalah : = µ +
+
(Gaspersz 1991)
Keterangan : Xij = Hasil pengamatan pada perlakuan ke-i ulangan ke-j µI = Rata-rata umum τj = Pengaruh perlakuan ke-i εij = Pengaruh faktor random perlakuan ke-i ulangan ke-j 3.4.2 Penelitian Utama Penelitian utama dilakukan dengan rancangan perlakuan berdasarkan penelitian pendahuluan. Perlakuan tersebut yaitu pada konsentrasi ekstrak daun nangka 0 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm. Prosedur yang dilakukan selama penelitian adalah sebagai berikut : 1. Persiapan wadah perlakuan sebanyak 15 buah. 2. Wadah perlakuan diisi dengan air sebanyak 15 L. 3. Penempatan wadah perlakuan.
25
4. Ikan uji dimasukan ke dalam wadah perlakuan yang telah disiapkan dengan kepadatan 15 ekor per wadah. 5. Ikan dipelihara selama 7 hari dan diberi pakan pelet secara adlibitum. 6. Penginfeksian
bakteri
Aeromonas
hydrophila
dengan
kepadatan
108 cfu/mL sebanyak 0,1 mL dengan cara menyuntikkan pada tubuh ikan secara intramuscular. 7. Ekstrak daun nangka dipersiapkan sesuai perlakuan yaitu 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm, 50 ppm (Lampiran 3). 8. Pengamatan gejala klinis. Jika gejala klinis telah nampak, baru dilakukan perendaman dengan ekstrak daun nangka sesuai perlakuan selama 48 jam. 9. Setelah 48 jam perendaman, air pemeliharaan diganti dengan air baru tanpa diberi ekstrak daun nangka selama masa pemeliharaan. 10. Pada masa pemeliharaan dilakukan penyiponan dan pergantian air. 11. Pemberian pakan pelet komersil secara adlibitum dengan frekuensi dua kali sehari yaitu pukul 08.00 dan 16.00 WIB. 12. Pengamatan kelangsungan hidup dilakukan setiap hari selama masa pengobatan (2 hari) dan masa pemeliharaan (14 hari). 3.5
Parameter yang Diamati
3.5.1 Gejala Klinis Gejala klinis yang diamati adalah kerusakan tubuh dan tingkah laku ikan yang mencakup respon terhadap pakan dan uji refleks (respon terhadap kejutan) dengan cara mengetuk kaca akuarium. Perubahan gejala klinis yang disebabkan oleh serangan bakteri Aeromonas hydrophila yaitu warna tubuh ikan menjadi agak gelap, kulit kasar dan timbul pendarahan selanjutnya menjadi borok, kemampuan berenang turun dan sering megap-megap di permukaan air karena insang rusak dan sulit bernapas, perut terlihat agak kembung, seluruh sirip rusak dan berwarna keputihan, serta mata rusak dan agak menonjol (Cahyono 2011). Pengamatan dilakukan setiap hari selama masa pengobatan (2 hari) dan masa pemeliharaan (14 hari).
26
3.5.2 Kelangsungan Hidup Kelangsungan hidup ikan mas diamati dengan cara menghitung jumlah ikan yang mati setiap hari selama masa pengobatan. Rumus kelangsungan hidup Effendie (1997) : =
×
%
Keterangan: KH = Tingkat kelangsungan hidup ikan (%) Nt = Jumlah ikan uji yang hidup pada akhir penelitian (ekor) No = Jumlah ikan uji yang hidup pada awal penelitian (ekor) 3.5.3 Kualitas Air Parameter kualitas air yang diukur antara lain suhu, pH, DO, dan amonia yang diukur dua kali, yaitu pada tahap awal penelitian (hari pertama), tahap pertengahan penelitian (hari ketujuh), dan pada tahap akhir penelitian (hari keempat belas). 3.6
Analisis Data Pengaruh perlakuan perendaman benih ikan mas dalam ekstrak daun
nangka terhadap kelangsungan hidup dianalisis menggunakan Anova (Analisis of Variance) atau uji F dan jika terdapat pengaruh pada perlakuan dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan pada taraf kepercayaan 95 % (Gasperz 1991). Gejala klinis yang terjadi dianalisis secara deskriptif.
