BAB III BAHAN DAN METODE
3.1
Tempat dan Waktu Penelitian ini dilaksanakan pada bulan April-Mei 2013 di Waduk Saguling
Kabupaten Bandung Barat Provinsi Jawa Barat. Analisis logam berat dalam air dan organ serta pembuatan preparat histologi dilakukan di PPSDAL Unpad, Jurusan Kimia dan Jurusan Biologi Fakultas MIPA Unpad serta pengamatan preparat di Balai Uji Standar Karantina Ikan, Pengendalian Mutu, dan Keamanan Hasil Perikanan (BUSKIPM) Jakarta Timur.
3.2
Bahan dan Alat Penelitian.
3.2.1
Bahan Penelitian
a.
Ikan Uji Ikan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan patin (Pangasius sp)
yang di tangkap langsung dari tiga stasiun di waduk Saguling dan
stasiun
pembanding di ambil dari kolam budidaya Cijengkol Subang. Ikan Patin yang digunakan untuk penelitian ini yaitu sebanyak 12 ekor, dengan ukuran kisaran 20cm, 30cm, dan 40cm. setiap ukuran diambil 1 ekor ikan yang mewakili stasiunnya masing-masing. b.
Bahan Untuk Analisis Histopatologi
1.
Albumin Mayer yang terdiri dari Albumin dan Gliserin berfungsi untuk merekatkan jaringan.
2.
Alkohol (etanol) berfungsi untuk mengurangi kadar air dalam jaringan atau Dehidrasi.
3.
Aquades digunakan untuk pencucian jaringan.
4.
Bouin yang terdiri dari Asam Fikrat, Asam Asetat Glacial dan formalin sebagai larutan fiksatif untuk merendam organ sehingga tidak rusak.
5.
Entellen digunakan untuk penempelan objek glass dengan cover glass.
6.
Eosin digunakan untuk proses pewarnaan jaringan menjadi warna merah muda pada sitoplasma.
26
27
7.
Hematoksilin digunakan untuk proses pewarnaan jaringan menjadi warna biru pada nukleus.
8.
NaCl fisiologis untuk membersihkan darah pada organ
9.
Paraffin berfungsi untuk pengisian jaringan atau Infiltrasi.
10.
Xylene berfungsi untuk menghilangkan alkohol pada jaringan atau Clearing (Lampiran 1).
c.
Bahan Analisis Logam Berat pada Air. Bahan yang digunakan untuk analisis logam berat Pb dan Cd adalah air
suling, asam nitrat (HNO3) pekat, HCl, larutan standar logam Pb dan Cd, dan gas asetilen (C2H2) (Lampiran 2). d.
Bahan Analisis Logam Berat pada Organ. Bahan kimia yang digunakan untuk analisis logam berat yang
terakumulasi dalam organ ikan Patin yaitu aquades untuk proses pengenceran dan HNO3 6,5% digunakan untuk melarutkan logam berat di dalam organ Insang, Hati dan Daging ikan Patin (Lampiran 3).
3.2.2
Alat-alat Penelitian.
a.
Alat yang Digunakan dalam Pengambilan Sampel Ikan Patin dan Organ Insang, Hati dan Daging.
Box sterofoam digunakan untuk membewa sampel ikan
Gunting bedah digunakan untuk memisahkan organ insang, hati dan daging dari ikan patin.
Pancing untuk menangkap ikan Patin.
Pinset digunakan untuk mengambil organ insang, hati dan daging.
Pisau digunakan untuk memfilet daging ikan patin.
Plastik digunakan untuk membawa sampel ikan patin.
Suntikan untuk menyemprotkan NaCl fisiologis dan larutan boang.
Tabung oksigen digunakan untuk memasok oksigen untuk ikan yang akan di packing (Lampiran 4).
28
b.
Alat yang Digunakan dalam Pengukuran Kualitas Air dan Logam Berat .
Botol 300 ml dan cool box untuk menyimpan semple air
Peralatan gelas untuk analisis kadar Pb dan Cd
Kertas saring untuk menyaring sample air
DO meter untuk mengukur kadar oksigen terlarut
Thermometer untuk mengukur suhu air
pH meter untuk mengukur pH air
Seperangkat alat Atomi Absorpsi Spectrometry (AAS) untuk mengatur kandungan logam Pb dan Cd pada sample air (AAS; lampu holow katoda Pb dan Cd; gelas piala 250 mL; pipet ukur 2 mL; 5 mL; 10 mL; 20 mL; 30 mL; 40 mL dan 50 mL; labu ukur 100 mL; corong gelas; erlenmeyer; pemanas listrik; kertas saring whatman 40, dengan ukuran pori θ 0.42 µm; dan labu semprot) (Lampiran 5).
c.
Alat yang Digunakan dalam Pembuatan Preparat Histologi Organ Ikan Patin.
Botol film digunakan untuk menyimpan sampel organ insang, hati dan daging.
Cawan Pewarnaan digunakan pada proses pewarnaan jaringan.
Hot plate digunakan untuk memanaskan objek glass.
Jara digunakan untuk merentangkan sayatan organ.
Kotak organ digunakan untuk proses pencetakan blok paraffin.
Kotak preparat digunakan untuk menyimpan preparat yang telah jadi.
Label digunakan untuk mengkode preparat.
Mikroskop untuk pengamatan preparat histologi
Mikrotom untuk memotong blok paraffin
Objek glass dan cover glass untuk membuat preparat
Oven digunakan untuk menyimpan paraffin.
Petri disk digunakan untuk tempat pengisian paraffin.
29
Pinset digunakan untuk memindahkan organ.
Pisau bedah digunakan untuk memotong organ.
Spidol digunakan untuk menandai wadah sampel organ.
Stopwatch digunakan untuk pengingat waktu.
Talenan untuk tempat memotong organ (Lampiran 6)
d.
Alat yang Digunakan dalam Analisis Logam Berat pada Organ Ikan Patin.
Batang pengaduk digunakan untuk mengaduk organ dengan larutan agar tercampur.
Blub pipet dan pipet 10ml merk iwaki pyrex digunakan untuk mengambil larutan HNO3 6,5%.
Botol film digunakan untuk menyimpan sampel organ insang, hati dan daging segar.
Cawan keramik digunakan untuk menyimpan organ untuk diabukan.
Corong digunakan untuk memasukan larutan.
Crush tank digunakan untuk mengambil cawan
Frezzer digunakan untuk membekukan organ agar tidak busuk.
Hot plate digunakan untuk mereaksikan larutan HNO3 dengan organ
Kertas saring digunakan untuk memisahkan larutan dengan ampas organ.
Labu ukur 50 ml (merk iwaki pyrex) digunakan untuk menghomogenkan larutan.
Pisau digunakan untuk memotong organ.
Plastik digunakan untuk menyimpan larutan yang akan di AAS
Seperangkat alat Atomic Absorption Spectrometry (AAS) untuk mengukur kandungan logam berat dalam insang, hati dan daging.
Spidol digunakan untuk menandai wadah sampel organ.
Talenan untuk tempat memotong organ.
Tanur (merk camsco) untuk mengabukan sampel
30
Timbangan analitik (merk mettle tuledo) dengan ketelitian 0,0001 g untuk menimbang sempel organ ikan (Lampiran 7).
e.
Alat Pendukung Penelitian.
Alat tulis digunakan untuk mencatat.
Kamera digital sebagai alat dokumentasi.
3.3
Metode Penelitian Metode yang digunakan dalam penelitian ini menggunakan metode survei,
sampel ikan diambil dari 3 stasiun di waduk Saguling dan ikan pembanding didapatkan dari kolam budidaya Cijengkol Subang. Lokasi pengambilan sampel di Waduk Saguling (Gambar 6) , yaitu : Stasiun 1 :
Maroko, merupakan daerah perikanan yang menjadi pintu masuk air dari sungai Citarum ke Waduk Saguling.
Stasiun 2:
Ciminyak, merupakan perairan yang dimungkinkan memiliki sedimentasi paling tinggi karena sebagai pusat KJA.
Stasiun 3 :
Pintu Air, merupakan pengeluaran air dari dalam waduk Saguling yang akan mengalir kembali ke Sungai Citarum.
Gambar 6. Stasiun Pengambilan Sampel Ikan di Waduk Saguling. (Sumber : PLTA Waduk Saguling)
31
Stasiun 4 :
Kolam Budidaya Cijengkol Subang, yang merupakan stasiun pembanding.
3.4
Prosedur Penelitian.
3.4.1
Pengukuran Kualitas Air Parameter kualitas air yang di ukur dalam penelitian ini adalah DO, suhu,
pH dan Logam Pb dan Cd. Sampel air permukaan diambil dari tiga stasiun penelitian di waduk Saguling dengan dua kali ulangan, air permukaan kemudian di masukan ke dalam botol 300 ml yang telah di beri asam HNO3 kemudian sampel air dimasukan ke laboratorium untuk di uji AAS (Tabel 5). Tabel 5. Parameter Kualitas Air dan Metode Analisis. Parameter Fisika
Suhu
Metode
Satuan 0
Pengukuran
Alat
Lokasi
C
Potensitometrik
Thermometer
Insitu
DO
mg/L
Potensitometrik
DO meter
In situ
pH
-
Potensitometrik
pH meter
In situ
Logam
Pb
mg/L
AAS
AAS
Laboraturium
Berat
Cd
mg/L
AAS
AAS
Laboratorium
Kimiawi
(Sumber: Balai Besar Wilayah Sungai Citarum, dalam Rachmadi, 2012)
4.4.2
Pengambilan Sampel Ikan Patin.
Sampel ikan Patin diambil dari empat stasiun penelitian, ikan patin yang diambil sebanyak 1 ekor untuk pengujian histopatologi dan untuk pengamatan logam berat.
Ikan patin diambil dari alam dengan cara dipancing, ikan yang dijadikan sampel penelitian adalah ikan yang berukuran panjang total 20 cm, 30 cm, dan 40 cm masing- masing sebanyak satu ekor.
Ikan patin yang tertangkap kemudian diukur panjang total serta bobot tubuh, setelah itu dibedah di lapangan kemudian organ insang, hati dan daging di bawa ke laboratorium untuk selanjutnya diuji histologi dan AAS.
32
3.4.3
Pengukuran Logam Berat Pb dan Cd.
a.
Air. Sampel air yang didapat dari setiap stasiun diawetkan dengan cara di
tambahkan HNO3 pekat hingga pH mencapai 2 untuk kemudian dianalisis kandungan logam Pb dan Cd dilaboratorium. Pengukuran logam Pb dan Cd pada sampel air dilakukan dengan menggunakan metode spektofotometri serapan atom (SSA)-nyala dengan dua kali pengulangan. Posedur pengukuran kadar Pb dan Cd pada sampel air mengacu SNI No. 06-6596-2001 tentang perlakuan contoh air untuk analisis logam (pengukuran kadar logam total) dengan spektrofotometer serapan atom (SSA): 1) Persiapan contoh uji Sampel Air yang diambil tanpa penyaringan diawetkan dengan HNO3 pekat sehingga pH mencapai 2. Contoh yang diterima dilaboratorium dikocok sampai homogen, kemudian air diambil menggunakan pipet 25 mL dan masukkan kedalam gelas erlenmeyer. Sampel air tersebut di tambahkan 2,5 mL HNO3 pekat. Tempatkan di atas pelat pemanas dan panaskan sampai hampir kering. Jaga jangan sampai mendidih. Sampel uji di Dinginkan, kemudian ditambahkan 2,5 ml HNO3 pekat dan tutup gelas erlenmeyer dengan corong gelas panaskan kembali di atas pelat sampai hampir kering dan warna residu menjadi bening. Sampel uji ditambahkan 1 ml HNO3 (1:1), kemudian tutup dengan corong gelas dan panaskan dengan api kecil hingga keseluruhan residu larut kembali Dinding gelas erlenmeyer dan corong gelas dibilas dengan aquabidets dan saring larutan contoh dengan kertas saring whatman N0.40 . tampung hasil saringan kedalam labu ukur 25 ml. Sampel uji di tambahkan aquabidest sampai tanda batas dan kocok sampai seba sama. Larutan siap untuk dianalisis (Lampiran 8).
33
2)
Pembuatan larutan baku logam Timbal dan Kadmium, Pb 100 dan Cd 100 mg/L Larutan induk logam timbal dan kadmium diambil menggunakan pipet 10 mL, kemudian Pb dan Cd 100 mg/L dimasukan ke dalam labu ukur 100 mL. Larutan induk dicampurkan dengan larutan pengencer sampai tanda tera.
3)
Pembuatan larutan baku logam Timbal dan Kadmium, Pb 10 mg/L dan Cd 10 mg/L Pipet 50 mL larutan standar logam timbal dan cadmium, Pb dan Cd 100 mg/L ke dalam labu ukur 500 mL. Tepatkan dengan larutan pengencer sampai tanda tera.
4)
Pembuatan larutan kerja logam timbal dan kadmium. Masukan larutan ke dalam Pipet 0 mL; 2 mL; 5 mL; 10 mL; 20 mL; 30 mL; 40 mL dan 50 mL larutan baku Timbal dan Kadmium, Pb dan Cd 10 mg/L masing-masing ke dalam labu ukur 100 mL. Larutan di tambahkan larutan pengencer sampai tepat tanda tera sehingga diperoleh konsentrasi logam besi 0,0 mg/L; 0,2 mg/L; 0,5 mg/L; 1,0 mg/L; 2,0 mg/L; 3,0 mg/L ; 4,0 mg/L dan 5,0 mg/L.
5)
Prosedur dan pembuatan kurva kalibrasi Alat SSA di optimasi sesuai petunjuk penggunaan alat. Masing-masing larutan kerja yang telah dibuat diukur. Kuat kurva kalibrasi untuk mendapatkan persamaan garis regresi. Contoh uji yang sudah dipersiapkan dan diukur
b)
Organ Insang, Hati dan Daging Ikan Patin. Prosedur pengukuran logam berat dalam insang, hati dan daging
berdasarkan metode Laboratorium Penelitian dan Pelayanan Jurusan Unpad, sebagai berikut : 1.
Sampel insang, hati dan daging ditimbang.
2.
Organ ditanur selama 2 jam sampai suhu tanur 300oC
Kimia
34
3.
Organ yang telah di tanur didiamkan hingga dingin.
4.
Larutan HNO3 6,5% sebanyak 10 ml di masukan ke dalam sampel yang telah di tanur.
5.
Sampel di panaskan pada hot plate selama 5 menit.
6.
Organ diaduk menggunakan batang pengaduk agar tercampur dengan larutan.
7.
Sampel di saring menggunakan kertas saring lalu campurkan aquadesh sampai larutan mencapai 50ml.
8.
Siap diukur AAS dengan panjang gelombang untuk Cd 228 dan Pb 283,3nm (Lampiran 9.). Pengukuran logam berat Pb dan Cd pada organ insang, hati, dan daging
pada ikan ukuran 20 cm, 30 cm, dan 40 cm, untuk mengetahui perbedaan kandungan akumulasi logam berat Pb dan Cd pada organ ikan Patin (Pangasius sp) dan akan dibandingkan dengan ikan budidaya
3.4.4
Pembuatan dan Pengamatan Preparat Histologi Ikan Patin. Uji histologi terdiri atas beberapa tahap yaitu fiksasi, dehidrasi, clearing,
infiltrasi paraffin, embedding paraffin, pembuatan preparat dan pewarnaan H&E. Langkah-langkah pengujian histopatologi menggunakan metode Laboratorium Mikroteknik Hewan Biologi Unpad adalah sebagai berikut: a.
Ikan ukuran 20-41 cm di bedah dan diambil bagian insang, hati dan daging.
b.
Perendaman jaringan dalam larutan Bouin dengan perbandingan 1:3 selama 24 jam (fiksasi)
c.
Perendaman jaringan dalam alkohol 70%, 80%, 96% masing-masing 30 menit serta alkohol 100% selama 15 menit (dehidrasi)
d.
Perendaman jaringan dalam larutan alkohol dan xylene dengan perbandingan 3: 1, 1:1, dan 1:3 serta xylene murni selama 5 menit (clearing)
e.
Perendaman jaringan dalamlarutan xylene dan paraffin dengan perbandingan 3:1, 1:1 dan 1:3 serta paraffin I dan II masing-masing 15menit (infiltrasi paraffin)
f.
Pencetakan blok paraffin (embedding paraffin)
35
g.
Pemotongan blok paraffin menggunakan mikrotom dengan ketebalan 3μm
h.
Penempelan irisan jaringan pada gelas objek yang telah di beri albumin meyer.
i.
Perendaman jaringan dalam xylene I dan II masing-masing 10 menit
j.
Perendaman jaingan dalam alkohol absolut I dan II masin-masing 5 menit
k.
Perendaman jaringan dalam alkohol 95%, 90%, 80%, 70% dan 50% masingmasing 2 menit
l.
Pembilasan dengan air mengalir selama 1 menit
m. Pencelupan dalam akuades (4-5 kali celupan) n.
Perendaman jaringan dalam hematoksilin selama 6 menit
o.
Pembilasan dengan air mengalir selama 15 menit
p.
Pencelupan dengan akuades
q.
Perendaman jaringan dengan eosin selama 4 menit
r.
Pencelupan dengan alkohol 70% (sekali celupan)
s.
Pencelupan dengan alkohol 80% (sekali celupan)
t.
Pencelupan dengan alkohol 90% (4-5 kali celupan)
u.
Perendaman jaringan dalam alkohol 95% selama 5 menit
v.
Perendaman jaringan dalam alkohol 100% I selama 10 menit
w. Perendaman jaringan dalam alkohol 100% II selama 15 menit x.
Perendaman jaringan dalam xylen I, II, dan III selama 10 menit
y.
Penutupan jaringan dengan pemberin entellen (perekat) secukupnya pada gelas objek dan ditutupi dengan gelas penutup
z.
Pengamatan di bawah mikrosop dengan pembesaran 40x10 dan 100x10 (Lampiran 10.). Pengamatan Histopatologi dilakukan pada ikan ukuran 20-41 cm, untuk
mengetahui tingkat kerusakan organ insang, hati dan daging ikan Patin (Pangasius sp) yang terkena logam berat Pb dan Cd dan dibandingkan dengan ikan pembanding.
36
3.5
Analisis Data. Hasil pengamatan terhadap kualitas air, preparat histopatologi organ
insang, hati dan daging ikan patin ukuran 20-41 cm dan uji AAS untuk mengetahui kandungan logam berat dalam organ kemudian dianalisa secara deskriptif komparatif .
