BAB III BAHAN DAN METODE 3.1 Tempat dan Waktu Penelitiantelah dilaksanakan mulai Februari 2013 sampai dengan Juni 2013. Pengambilan sampel lamun Enhalus acoroides dan Thalassia hemprichii dilakukan pada bulan Februari 2013 di Perairan Pulau Pramuka Kepulauan Seribu DKI Jakarta. Identifikasi metabolit sekunder dan ekstraksi dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Perikanan dan Ilmu Kelautan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan (FPIK) Universitas Padjadjaran (Unpad). Uji aktivitas antioksidan dan Uji Total Kadar Polifenol dilakukan di Laboratorium Penelitian dan Pelayanan Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA), Unpad. Sedangkan Uji Peroksida dilakukan di Laboratorium Kimia Analitik, Jurusan Kimia, FMIPA Unpad. 3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat Tabel 1. Alat dan Kegunaannya NO 1
Alat Global
Positioning
Kegunaan System
Untuk menentukan titik pengambilan sampel
(GPS) 2
Termometer
Untuk mengukur suhu perairan sampel
3
Refraktometer
Untuk mengukur salinitas perairan sampel
4
pH meter
Untuk mengukur pH perairan sampel
5
Kotak Styroform
Untuk menyimpan sampel selama perjalanan
6
Kantong plastik
Untuk menyimpan sampel
7
Gunting
Untuk memotong sampel
8
Pisau
Untuk mencacah sampel
9
Talenan
Untuk tempat alas saat proses pencacahan sampel
10
Blender
Untuk menghaluskan sampel menjadi serbuk
11
Kertas label
Untuk memberi tanda
12
Pipet tetes
Untuk mengambil cairan kimia
13
Pipet volum
Untuk mengambil cairan kimia
14
Tabung reaksi
Untuk tempat terjadinya reaksi/pencampuran
20
21
Tabel 1 (lanjutan). Alat dan Kegunaannya NO
Alat
Kegunaan
15
Kaca arloji
Untuk tempat meneteskan cairan uji
16
Penangas air
Untuk memanaskan
17
Alumunium Foil
Untuk menutup gelas ukur/erlenmeyer
18
Erlenmeyer
Untuk maserasi
19
Gelas kimia
Untuk maserasi
20
Gelas ukur
Untuk mengukur volume pelarut
21
Timbangan analitik
Untuk mengukur berat padatan
22
Spatula
Untuk mengambil padatan
23
Orbital shaker
Untuk pengadukan saat maserasi
24
Kertas saring
Untuk memisahkan filtrat dan residu
25
Rotatory evaporator
Untuk menguapkan pelarut
26
Botol vial
Untuk menyimpan ekstrak pekat
27
Mikropipet
Untuk mengambil cairan kimia dalam jumlah kecil
28
Magnetic stirrer
Untuk menghomogenkan larutan
29
Spektrofotometri UV-vis
Untuk mengukur serapan/absorbansi
30
Buret
Untuk titrasi
31
Inkubator
Untuk mempercepat oksidasi
3.2.2 Bahan Tabel 2. Bahan yang digunakan No
Bahan
No
Bahan
1
Sampel daun, rimpang,, akar, buah,
13
H2SO4
Uji Fitokimia dan Ekstraksi
14
NaOH 10%
2
Pereaksi meyer
15
Etanol 70%
3
Pereaksi wagner
16
FeCl3 5%
4
Serbuk magnesium
17
Es Batu
5
Amil alcohol
18
Amil alkohol
6
Kloroform
7
Metanol
19
Vitamin C (Asam askorbat)
8
Akuades
20
Kristal 2,2–difenil-2-pikrihidrazil (DPPH)
9
Asetat Anhidrida
10
Asam sulfat pekat
21
Asam Galat
11
Air panas
22
Na2CO3 5%
12
HCl 2N
23
Follin Ciocalteau 50%
bunga, lamun
Uji Aktivitas Antioksidan
Uji Total Kadar Polifenol
22
Tabel 2 (Lanjutan). Bahan yang digunakan No
Bahan
No
Bahan
Uji Bilangan Peroksida 24
Minyak Ikan, Minyak Nabati
27
Kalium Iodida
25
Cairan Tween 20
28
Indikator pati 1%
26
Asam asetat glasial
29
Natrium tiosulfat 0,1 N
3.3 Metode Penelitian Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode observasi dengan melakukan eksperimen di laboratorium menggunakan faktor perbedaan konsentrasi ekstrak. Penelitian ini meliputi identifikasi metabolit sekunder, ekstraksi, uji aktivitas antioksidan, uji total kadar polifenol, dan uji bilangan peroksida. Identifikasi kandungan metabolit sekunder menggunakan uji kualitatif fitokimia dengan prinsip reaksi warna, pengendapan, serta pembentukan busa (Harborne 1987). Ekstraksi menggunakan metode maserasi (Quinn 1998 dalam Agustiningrum 2004) yaitu perendaman sampel berulang dengan menggunakan pelarut sampai tidak berwarna lagi, prinsipnya adalah proses difusi karena perbedaan konsentrasi di luar dan di dalam sel. Uji aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH (Blois 1958 dalam Molyneux 2004) pada berbagai konsentrasi sampel serta menggunakan Vitamin C sebagai pembanding dengan prinsip penyerapan hidrogen oleh radikal bebas dari antioksidan ditunjukkan dengan nilai absorbansi dengan menggunakan spektrofotometer. Uji total kadar polifenol menggunakan metode total phenolic content (TPC) folin-ciocalteu dengan prinsip reaksi oksidasi dan reduksi kolorimetrik untuk mengukur semua senyawa fenolik dalam sampel uji (Singleton dan Rossi 1965). Uji bilangan peroksida menggunakan prinsip oksidasi-reduksi pengurangan bilangan peroksida pada emulsi minyak yang telah ditambahkan sampel dengan cara titrasi iodometri (Santoso et al. 2003 dalam Prabowo 2009).
23
3.4 Prosedur Penelitian 3.4.1 Pengambilan dan Persiapan Sampel Bahan lamun Enhalus acoroides dan Thalassia hemprichii diambil dari lapangan secara lengkap mulai dari ujung akar sampai ujung daun, lalu dibawa ke laboratorium. Setelah itu bagian-bagian dari tegakan yaitu daun, rimpang, akar, bunga, daging buah, dan biji dipotong serta dipisahkan dengan menggunakan gunting. Kemudian dicuci dan dikeringkan dengan cara diangin-anginkan. Selanjutnya setiap bagian yang telah dipisahkan dipotong kecil/ dicacah dengan menggunakan gunting untuk kemudian dihaluskan dengan menggunakan blender sampai menjadi serbuk. 3.4.2 Identifikasi Metabolit Sekunder (Harborne 1987) a. Alkaloid Serbuk sampelditimbang sebanyak 1 g, kemudian dilarutkan dalam kloroform, dan ditambahkan beberapa tetes amonia (NH4OH).Larutan ekstrak disaring dalam tabung reaksi tertutup, Ekstrak kloroform dalam tabung reaksi dikocok dengan 10 tetes H2SO4 2M, ditambahkan pereaksi 2 tetes pereaksi Meyer dan pereaksi Wagner. Perubahan ada tidaknya endapan diamati. b. Flavonoid Sampel serbuk 1 g diekstraksi dengan menggunakan metanol kemudian dibagi menjadi tiga tabung reaksi. Tabung pertama ditambahkan Amil alkohol, HCl pekat 2 tetes kemudian ditambah 0,1 g Mg serbuk. Tabung reaksi kedua ditambahkan H2SO4 2N sebanyak 2 tetes.Tabung terakhir ditambahkan NaOH 10% sebanyak 2 tetes.Ketiga tabung dikocok kuat. Perubahan warna diamati. c. Steroid/Triterpenoid Sebanyak 1 g sampel diekstraksi dengan menggunakan kloroform, disaring. Kemudian diteteskan ke dalam kaca arloji dan dibiarkan kering. Kemudian ditambahkan pereaksi Lieberman Burchad yaitu satu tetes asam asetat anhidrida dan satu tetes asam sulfat pekat. Perubahan warna diamati.
24
d. Fenol hidroquinon Sebanyak 1 g serbuk sampel dilarutkan dalam 20 ml etanol 70%, setelah dikocok kemudian diambil 1 ml, selanjutnya ditambahkan2 tetes pereaksi FeCl35%. Perubahan warna diamati. e. Saponin Sebanyak 1 gserbuk sampel dimasukan dalam erlenmeyer, ditambahkan 10 ml air panas, didihkan selama 5 menit, kemudian disaring dalam keadaan panas, larutan diambil sebanyak 10 ml kemudian dikocok kuat secara vertikal selama 10 detik. Pembentukan busa diamati. f. Tanin Sebanyak 1 gserbuk sampel ditambahkan air, dididihkan selama beberapa menit dan saring, diambil 2ml hasil penyaringan (filtrat) dan ditambahkan 1 sampai 2 tetes pereaksi FeCl35 %. Perubahan warna diamati. 3.4.3 Ekstraksi (Quinn 1998 dalam Agustiningrum 2004) Tujuan dilakukan ekstraksi iniadalah untuk mengambil atau mendapatkan senyawa metabolit sekunder yang terkandung di dalam tegakan lamun. Bagianbagian sampel lamun (daun, rimpang, akar, bunga, daging buah, serta biji) yang telah dihaluskan kemudian ditimbang sebanyak 40 g dan direndam dengan pelarut metanol sebanyak 400 ml selama 3 x 24 jam. Hasil maserasi yang berupa larutan kemudian disaring dengan kertas saring sehingga didapat filtrat dan residu. Filtrat yang diperoleh di evaporasi hingga diperoleh ekstrak pekat dengan menggunakan Rotatory evaporator pada suhu 40C-50C. Sedangkan pada residu dilakukan pengulangan perendaman sampai tidak berwarna lagi. Dari proses ini maka diperoleh ekstrak pekat metanol daun, rimpang, akar bunga, daging buah, serta biji. 3.4.4 Uji Aktivitas Antioksidan (Blois 1958 dalam Molyneux 2004) Berdasarkan penelitian Putri (2011) dan Rumiantin (2011) yang dijadikan sebagai acuan, maka ekstrak pekat dari bagian-bagian lamun hasil ekstraksi menggunakan pelarut metanol dilarutkan dalam metanol dengan berbagai
25
konsentrasi, dengan membuat larutan stok terlebih dahulu (Lampiran 3). Sebagai pembanding dan kontrol positif, digunakan antioksidan yang biasa digunakan masyarakat yaitu Vitamin C yang dibuat dengan cara dilarutkan dalam pelarut metanol dengan konsentrasi 0,25, 0,5, 1, 2 dan 4 ppm. Larutan DPPH 160 ppm dibuat denganmelarutkan 1,6 mgDPPH dengan pelarut metanol sebanyak 10 ml. Proses pembuatan larutan DPPH dilakukan dalam kondisi suhu rendah dan terlindung dari sinar matahari. Larutan ekstrak dan larutan antioksidan pembanding (kontrol positif)yang telah dibuat masing-masing diambil 4,5 ml dan direaksikan dengan 500 μl larutan DPPH dalam tabung reaksi yang berbeda serta diberi label. Larutan blanko sebagai kontrol negatif juga dibuat dengan melarutkan 500μl larutan DPPH ditambahkan metanol 4,5 ml. Larutan tersebut kemudian diinkubasi pada suhu 37C selama 30 menit dan diukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 515 nm. 3.4.5 Uji Total Kadar Polifenol (Singleton dan Rossi 1965) Ekstrak lamun masing-masing sampel sebanyak 5 mg dilarutkan dengan 2 ml etanol 96% dalam tabung reaksi. Campuran tersebut ditambahkan 5 ml akuades dan 0,5 ml reagen Follin-Ciocalteau (50% v/v), kemudian didiamkan selama 5 menit. Selanjutnya ditambahkan 1 ml larutan natrium karbonat (7.5% b/v), dihomogenasi dan diinkubasi pada suhu ruang selama 1 jam dalam kondisi tanpa cahaya (gelap). Kandungan total fenol diukur dengan spektrofotometer UVVisible (UV-Vis) pada panjang gelombang 765 nm. 3.4.6 Uji Bilangan Peroksida (Santoso et al. 2003 dalam Prabowo 2009) Minyak yang digunakan dalam penelitian adalah minyak ikan yang diperoleh dari pengumpul minyak daerah Cimahi Jawa Barat, minyak goreng yang masih baru diperoleh dari pasaran, minyak goreng bekas pakai yang sudah dipakai untuk menggoreng sebanyak kurang lebih tiga kali dalam skala rumah tangga. Sistem emulsi minyak dibuat mengacu pada metode Santoso et al. (2003) yang dimodifikasi, yaitu dengan menghomogenkan 5 g (6 ml)dan 30 ml akuades yang telah ditambahkan 1,25 ml tween 20. Sistem emulsi lemak ditambahkan ekstrak
26
bagian lamun terbaik dari tahap sebelumnya yaitu daunEnhalus acoroides dengan konsentrasi136,40 ppm, dan 200 ppm yang selanjutnya disebut sampel minyak. Kemudian sampel minyak disimpan selama empat belas hari untuk minyak ikan dan satu hari untuk minyak goreng dalam inkubator bersuhu 40C untuk mempercepat oksidasi. Sampel minyak selanjutnya ditimbang sebanyak 5 g (6 ml) di dalam labu erlenmeyer kemudian ditambahkan 30 ml pelarut (60% asam asetat glacial dan 40% kloroform). Setelah larut kemudian ditambahkan 0,5 ml larutan KI jenuh dan didiamkan 10 menit sambil dikocok. Iodin yang terbentuk dititrasi dengan larutan Na2S2O3 0,1 N dengan penambahan indikator pati 1%. Titrasi dihentikan saat larutan sampel berubah dari berwarna biru setelah ditambahkan indikator pati menjadi tidak berwarna. Hasil pengurangan volume akhir terhadap volume awal larutan Na2S2O30,1 N yang ditunjukkan oleh skala buret merupakan volume total larutan Na2S2O30,1 N yang digunakan untuk titrasi sampel. Cara yang sama seperti prosedur diatas ddibuat juga untuk penetapan blanko sebagai kontrol negatif namun tidak dilakukan penambahan sampel (0 ppm). Kemudian dilakukan analisa perhitungan nilai bilangan peroksida. 3.5 Parameter yang diamati Parameter yang diamati dari penelitian ini adalah meliputi identifikasi metabolit sekunder dan uji aktivitas antioksidan 3.5.1 Identifikasi Metabolit sekunder Tabel 3. Parameter uji fitokimia Uji Fitokimia Uji Alkaloid
Parameter yang diamati + jika adanya endapan putih kekuningan + jika adanya endapan cokelat
Uji Flavonoid
+ jika terbentuk warna orange/kuning/merah/cokelat
Uji Steroid/ Triterpenoid
+ jika terbentuk warna merah/biru/ungu
Uji Saponin
+ jika terbentuk busa stabil 1-10cm, tidak hilang pada penambahan HCl 2 N
Uji Fenol Hidrokuinon
+ jika terbentuk warnahijau-biru/ungu
Uji Tanin
+ jika terbentuk warna biru/hijau kehitaman
Sumber tabel : Harborne (1987)
27
3.5.2 Inhibisi antioksidan Perhitungan yang digunakan adalah nilai EC50 (Effecient Concentration 50%) untuk menggambarkan besarnya konsentrasi senyawa uji yang dapat menangkal radikal sebesar 50%. Berikut perhitungannya (Molyneux 2004) % Inhibisi =
absorbansi blanko − absorbansi sampel x 100% absorbansi sampel
Nilai EC50 diperolehdengan menggunakan persamaan regresi linier, diplotkan dalam sumbu x dan y. EC50Y=a+bx Semakin kecil nilai EC50maka semakin tinggi aktivitas antioksidan yang dimilikinya (Molyneux 2004) 3.5.3 Kadar Total Fenol Kandungan total fenol diinterpretasikan sebagai milligram ekivalen asam galat (GAE= Galic Acid Equivalent) per gram sampel (mg GAE/g sampel) kemudian dipersentasikan (Singleton 1965). Kadar polifenol % =
Pengukuran kadar polifenol rata − rata x 1000 konsentrasi awal sampel
3.5.4 Evaluasi Aktivitas Antioksidan (Penghitungan Bilangan Peroksida) Tahapan ini bertujuan untuk menentukan seberapa besar konsentrasi ekstrak terpilih yang mampu menghambat pembentukan peroksida dalam emulsi minyak dinyatakan dengan nilai peroksida. Nilai bilangan peroksida dinyatakan miliequivalen per 1 kg minyak atau lemak dapat dihitung dengan rumus berikut (Ketaren 1986) : ℎ
=
A x N x 1000 x100% G
A = Jumlah ml larutan Na2S2O3 untuk titrasi N= Normalitas larutan Na2S2O3 G=Berat sampel (g)
Semakin tinggi bilangan peroksida maka semakin tinggi pula tingkat ketengikan suatu minyak (ASA 2000 dalam Wildan 2002).
28
3.6 Analisa Data Data yang diperoleh berupa reaksi perubahan warna, terbentuknya endapan, dan adanya busa pada identifikasi metabolit sekunder , nilai daya inhibisi EC50, total kadar polifenol, serta
nilai bilangan peroksida pada uji
aktivitas antioksidan kemudian dianalisis secara deskriptif dan ditampilkan dalam bentuk tabel dan gambar.
