3 METODE Bahan Penelitian Tanaman pakan yang digunakan dalam penelitian adalah 10 jenis tanaman legum yang umum dipergunakan sebagai pakan ternak di Indonesia dan dipilih dari beberapa daerah di Indonesia (Tabel 3.1). Jenis dari tanaman legum pakan yang diteliti terdiri dari dua kelompok, yaitu kelompok pohon (Leucaena leucocephala, Indigofera zollingeriana dan Desmodium sp) dan kelompok herba (Calopogonium mucunoides, Macroptilium bracteatum, Centrocema pascuorum, Pueraria javanica, Clitoria ternatea, Centrocema pubescens, dan Stylosanthes seabrana). Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah: tanah, pupuk kandang, mikoriza dengan merk dagang Mycofer (Gigaspora margarita dan Glomus manihotis) dari Laboratorium bioteknologi kehutanan, PAU, IPB; aquades; es batu, serta bahan-bahan kimia untuk analisa prolin dan karbohidrat terlarut (WSC) daun. Tabel 3.1 Tempat pengambilan bibit tanaman legum pakan penelitian No. Legum 1. Leucaena leucocephala 2. Indigofera zollingeriana 3. Desmodium sp 4. Calopogonium mucunoides 5. Centrocema pubescens 6. Pueraria javanica 7. Macroptilium bracteatum 8. Clitoria ternatea 9. Centrocema pascuorum 10. Stylosanthes seabrana
yang digunakan pada Asal Jawa Barat Jawa Barat Jawa Barat Jawa Timur Jawa Timur Jawa Timur NTT NTT NTT NTT
Peralatan Penelitian Alat-alat yang digunakan pada penelitian adalah: pot kapasitas 5 kg, plastic klip, coolbox, thermometer, Spectrofotometer LW Scientifific UV-200-RS Ultraviolet and Visible tahun 2008, timbangan analitik ADAM PW 254 tahun 2008, waterbath MEMMERT type WN8 10 tahun 2008, WP4 DewPoint Potentiometer ICT International, tabung reaksi, eppendorf 1.5 ml, mikropipet, mortar, dan lain-lain.
Rancangan Percobaan Penelitian ini dirancang menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) pola faktorial 2x2 dengan 3 ulangan, yang terdiri dari faktor pemberian mikoriza, yaitu: tanpa mikoriza (-M) dan inokulasi dengan mikoriza (+M); dan faktor penyiraman, yaitu: disiram (W) dan tidak disiram (D). Model matematis mengacu pada Steel dan Torrie (1995). Model linier analisis keragaman pada penelitian ini adalah: Yijk = µ + αi + βj + (αβ)ij + εijk Keterangan: Yijk = Nilai pengamatan pada perlakuan mikoriza ke-i, penyiraman ke-j dan ulangan ke-k µ = rataan umum αi = pengaruh mikoriza ke-i βj = pengaruh penyiraman ke-j (αβ)ij = pengaruh interaksi mikoriza ke-i dan penyiraman ke j εijk = pengaruh galat Data yang diperoleh dianalisis dengan ANOVA, jika terdapat pengaruh terhadap peubah yang diukur maka dilanjutkan dengan uji LSMEAN.
Pelaksanaan Penelitian Penelitian Pelaksanaan penelitian ini dimulai dengan mempersiapkan media tanam menggunakan tanah latosol dan pupuk kandang dengan perbandingan = 9: 1, tanah sebanyak 4.5 kg dan pupuk kandang 0.5 kg. Bibit tanaman legum pakan yang telah disiapkan disemai terlebih dahulu, ditumbuhkan sampai berumur 1 bulan. Selanjutnya tanaman legum pakan dipindahkan ke dalam pot kapasitas 5 kg media tanam. Khusus untuk perlakuan dengan mikoriza, pada media tanam ditambahkan Mycofer (inokulasi mikoriza komersial yang mengandung G. margarita dan G. manihotis) sebanyak 20 gram (±1 sendok makan) pada lubang tanam kemudian baru tanaman dipindahkan. Setiap lubang tanam ditanami dengan 2 individu tanaman legum pakan. Tanaman dipelihara selama ± 1 bulan. Pemeliharaan dilakukan dengan menyiram tanaman dua hari sekali, membersihkan gulma yang tumbuh secara manual, dan pemupukan dengan NPK dilakukan pada 14 hari setelah tanaman dipindahkan ke dalam pot. Setelah tanaman tumbuh dengan baik selanjutnya dilakukan pemangkasan awal (trimming) untuk menyeragamkan tinggi tanaman. Satu minggu kemudian perlakuan cekaman kekeringan dimulai yaitu dengan tidak melakukan penyiraman sampai tanaman mati (untuk perlakuan cekaman kekeringan = D), sedangkan untuk perlakuan disiram (W) dilakukan penyiraman 1 kali sehari yaitu pada pagi hari. Sebelum perlakuan cekaman kekeringan dimulai, semua media tumbuh dalam pot disiram terlebih dahulu sampai tercipta kondisi jenuh. Kemudian pot diberi plastik mulsa yang dibentuk bulat dengan diameter ±35 cm untuk menutupi permukaan pot agar tidak terjadi evaporasi, dan dilubangi di tengahnya sebagai ruang untuk tanaman. Plastik mulsa diselotip di sekeliling pot pada perlakuan cekaman kekeringan (D), dan pada perlakuan disiram (W) diberi sedikit celah
yang tidak diselotip untuk memudahkan penyiraman. Perlakuan dimulai pada keesokan harinya dan dihitung sebagai hari ke-0. Pengambilan sampel kadar air tanah, kadar air relatif daun, dan potensial air daun dilakukan per 4 hari, serta sampel prolin dilakukan per 8 hari dimulai sejak hari ke-0. Penyiraman pot untuk perlakuan W dilakukan setiap pagi hari, sedangkan untuk perlakuan D tidak dilakukan penyiraman sampai tanaman mencapai lethal point dan ini berarti perlakuan dihentikan. Selanjutnya tanaman dipotong (dipanen), dan dapat dilakukan pengambilan sampel tanaman untuk peubah karbohidrat terlarut (WSC) daun dan bobot kering tanaman.
Peubah yang diukur Kadar air tanah (%) Kadar air tanah diuji secara manual, yaitu dengan cara mengambil 5 gram sampel tanah segar (BS) yang diambil dari tanah pada kedalaman 20 cm, kemudian dioven 1050 C selama 24 jam. Kemudian timbang berat setelah dioven (BO). Kadar air tanah dapat dihitung menggunakan rumus berikut: 𝐵𝑆−𝐵𝑂 KAT = 𝐵𝑂 𝑥 100% Kadar air tanah diukur setiap 4 hari sekali, mulai dari hari ke-0 sampai perlakuan cekaman kekeringan selesai yang ditandai dengan tanaman mulai menunjukkan tanda-tanda kematian (lethal point). Bobot kering akar, batang dan daun (g/pot) Setelah pemanenan, bagian tanaman seperti akar, batang dan daun segar dikeringkan pada suhu 70º C selama 48 jam, kemudian ditimbang sebagai bobot kering akar, batang dan daun. Potensial air daun (MPa) Sampel yang digunakan untuk pengukuran potensial air daun adalah daun segar tanaman legum pakan. Sampel diambil pada pukul 4 WIB dini hari dan langsung dimasukkan ke dalam cup WP4, ditutup dan dimasukkan ke dalam coolbox. Pengukuran potensial air daun legum dilakukan setiap 4 hari sekali.
Gambar 3.1 WP4, Dewpoint PotentioMeter, alat pengukur potensial air daun
Potensial air daun pada kondisi tanpa cekaman dan cekaman kekeringan diuji menggunakan WP4 Dewpoint PotentioMeter (Gambar 3.1), dengan cara: sampel daun segar dipotong menjadi beberapa bagian kemudian dimasukkan ke dalam cup WP4. Cup+sampel tanpa tutup dimasukkan ke dalam alat potensiometer dan tunggu sampai di layar menunjukkan nilai seperti ini: “TsTb=-0,58”, kemudian tombol diputar ke posisi “read”, tunggu hingga terdengar bunyi bip beberapa kali dan lampu keseimbangan menyala. Setelah angka menunjukkan posisi konstan, hasil yang tertera di layar WP4 dicatat sebagai nilai potensial air daun (ICT International, 2010). Contoh hasil pengukuran potensial air daun yang terbaca ditunjukkan pada Gambar 3.1. Kadar air relatif daun (%) Pengukuran kadar air relatif daun dilakukan setiap 4 hari sekali sampai tanaman mati. Nilai kadar air relatif daun diukur dengan cara: sampel daun segar ditimbang sehingga didapatkan berat segar (BS), kemudian dimasukkan ke dalam cup. Cup berisi sampel daun segar diberi aquadest sehingga seluruh permukaan daun terendam, ditutup dengan kertas saring, dan disimpan dalam suhu ruang selama 18-24 jam. Air yang masih tersisa dibuang dan sampel ditiriskan dengan tisu, ditimbang sehingga didapatkan berat turgid (BT). Kemudian sampel di oven pada suhu 600 C selama 2x24 jam, ditimbang dan didapatkan berat kering (BK). Nilai kadar air relatif daun didapatkan dengan menggunakan perhitungan: 𝐵𝑆 − 𝐵𝐾 𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑎𝑖𝑟 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑓 𝑑𝑎𝑢𝑛 = 𝑥100% 𝐵𝑇 − 𝐵𝐾 Kadar prolin daun (µmol/g bb) Pengambilan sampel untuk analisa prolin dilakukan setiap 8 hari sekali sampai tanaman mati. Kadar prolin daun diuji mengacu pada metode Bates et al., (1973), dengan prosedur sebagai berikut: sampel daun segar digerus menggunakan nitrogen cair sampai sampel menjadi halus (<1 mm), dan sekitar 100 mg hasil gerusan ditempatkan dalam mikro tube 1.5 ml. Kemudian ditambahkan 1.3 ml asam sulfosalisilat 3% dan diaduk menggunakan vortex. Untuk memisahkan supernatan dengan padatan daun, tabung disentrifuse pada kecepatan 12.000 rpm selama 10 menit pada suhu 40 C. Selanjutnya 200 l supernatan diambil dan dimasukkan ke dalam tabung baru, kemudian direaksikan dengan 200 l larutan asam ninhidril (0,125 gr ninhidril, 3 ml asam asetat glasial, 2 ml 6M fosforic acid dengan agitasi dan pemanasan) dan diaduk menggunakan vortex. Tube diinkubasi dalam waterbath pada suhu 100C, selama 1 jam, kemudian disimpan dalam wadah berisi es batu untuk menghentikan reaksi. Ke dalam setiap tube dimasukkan 400 l toluen kemudian diaduk dengan vortex hingga mengeluarkan cairan merah. Ambil 100 l cairan merah dari hasil reaksi dan dipindahkan ke dalam tube baru, dicampur dengan 900 l toluen. Kemudian dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm. Konsentrasi prolin ditentukan terhadap kurva standar proline yang dibuat menggunakan bahan prolin murni. Kadar karbohidrat terlarut (WSC) daun (mg/g bk) Analisis WSC diuji menggunakan metode Dubois et al. (1956) yang dimodifikasi oleh Buysse dan Merckx (1993) dengan prosedur sebagai berikut:
20 – 30 mg sampel daun kering atau akar kering diekstrak sebanyak 4 kali masing-masing selama 15 menit dalam 10 ml air mendidih. Setelah itu disentrifus pada 3500 rpm selama 10 menit. Supernatant dikoleksi dan dikumpulkan hingga volume akhir mencapai 50 ml. Satu ml supernatant diambil dan dimasukkan ke dalam tabung baru dan ditambahkan satu ml larutan phenol 18 % dan 5 ml konsentrat asam sulfur (H2SO4 concentrate). Campuran tersebut diaduk menggunakan vortex, kemudian dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 490 nm.
