BAB 3
BAHAN DAN METODE PENELITIAN
3.1. Alat-alat
1. Neraca Analitik
Mettler PM 480
2. Rotary Evaporator
Buchi
3. Corong 4. Gelas Beaker
Pyrex
5. Gelas Ukur
Pyrex
6. Kolom Kromatografi
Pyrex
7. Plat Skrining 8. Labu Erlenmeyer
Pyrex
9. Oven 10. Melting Point Apparatus
Fisher Johns
11. Bosch Monoscope 12. Lampu UV 13. Tabung Reaksi 14. Rak Tabung Reaksi 15. Plat Kromatografi Lapis Tipis 16. Magnetik Stirer 17. Hot Plate
Nuova
18. Chamber 19. Indikator Universal 20. Alat soklet 21. Labu Alas
Pyrex
22. Blender
Maspion
23. Stoples 24. Corong Pisah
Pyrex
25. Spektrofotometer IR
Jasco FT-IR 5300
26. Spektrometer 1H-NMR
Hitachi FT-NMR-1900
3.2. Bahan – bahan
1. Batang Brotowali 2. Etanol
(P.a. E.Merck)
3. HCl
2N
4. NH 4 OH
Pekat
5. Kloroform
(P.a. E.Merck)
6. Aquadest 7. MgSO 4 Anhidrat 8. Pereaksi Meyer 9. Pereaksi Wagner 10. Pereaksi bouchardat 11. Pereaksi Dragendorf 12. Silika Gel 60 G
( E.Merck. Art. 7734)
13. Silika Gel 60 GF 254
( E.Merck. Art. 10180)
3.3. Prosedur Penelitian
3.3.1. Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah batang tumbuhan Brotowali (Tinospora crispa (L.)MIERS) yang diperoleh dari pajak sore Padang Bulan Medan yang kemudian dibuat dalam bentuk serbuk halus sebanyak 1000 g
3.3.2. Uji Skrining Fitokimia
Dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif terhadap sampel tumbuhan Brotowali (Tinospora crispa (L.)MIERS) untuk membuktikan adanya kandungan alkaloid dalam
sampel dengan uji skrining fitokimia, yaitu serbuk batang tumbuhan Brotowali ditimbang sebanyak 5 g, dimaserasi dengan 20 ml etanol, selama 2 jam, disaring dan filtrat yang diperoleh dibagi menjadi 4 bagian, yaitu : Filtrat I
: ditambahkan 2 tetes pereaksi Meyer ternyata terbentuk endapan warna putih, hal ini menunjukkan adanya senyawa alkaloida.
Filtrat II
: ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorf ternyata terbentuk endapan warna jingga, hal ini menunjukkan adanya senyawa alkaloida.
Filtrat III
: ditambahkan 2 tetes pereaksi Wagner ternyata terbentuk endapan warna coklat, hal ini menunjukkan adanya senyawa alkaloida.
Filtrat IV
: ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat ternyata terbentuk endapan warna coklat, hal ini menunjukkan adanya senyawa alkaloida
3.3.3.Prosedur Untuk Memperoleh Senyawa Kimia Ekstrak Batang Tumbuhan Brotowali (Tinospora crispa(miers))
Serbuk batang brotowali ditimbang sebanyak 1000 g dimaserasi dengan pelarut etanol 2 L, pekerjaan dilakukan 4 kali, lalu dipisahkan ampas dengan ekstrak. Ekstrak hasil sokletasi ini kemudian dipekatkan pada rotary evaporator pada suhu 65 0C sehingga diperoleh ekstrak pekat. Ekstrak pekat ini kemudian dipartisi dengan etil asetat : air yang kemudian diambil fraksi air, fraksi air kemudian diasamkan dengan HCL 2 N sampai pH 2, kemudian diaduk selama 3 jam dengan pengaduk magnet, lalu disaring. Larutan hasil pemisahan ini kemudian dibasakan dengan NH 4 OH pekat sampai pH 10, kemudian diekstraksi dengan kloroform : air (1:1) sebanyak 4 kali. Diambil lapisan bawah yang berupa ekstrak kloroform lalu dicuci dengan aguadest sampai netral, kemudian dikeringkan dengan 15 g MgSO 4 anhidrat, diamkan 1 malam lalu disaring, kemudian diambil larutannya dan dipekatkan dengan rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak kasar sebanyak 18 g.
3.3.4. Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis dimaksudkan untuk mencari pelarut yang sesuai di dalam analisis kromatografi kolom. Dimana ekstrak kasar yang diperoleh dilakukan analisis secara kromatografi lapisan tipis dengan pelarut yang digunakan adalah kloroform 100% dan campuran pelarut kloroform : etanol (5 : 1 v/v, 4 : 1 v/v, 3 : 1 v/v, 2 : 1 v/v, 1 : 1 v/v). Sehingga akan diperoleh perbandingan pelarut kloroform : metanol yang sesuai untuk kromatografi kolom. Prosedur : Ke dalam bejana kromatografi lapis tipis dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak kloroform 100 %. Ekstrak encer dietil eter ditotolkan pada palat KLT yang diaktifkan. Plat dimasukkan ke dalam bejana
yang berisi developer – developer yang telah
dijenuhkan, kemudian ditutup rapat dan dielusi. Setelah dielusi, plat dikeluarkan dari bejana, dikeringkan. Noda yang terbentuk diamati dengan sinar ultraviolet. Kemudian harga Rf nya dihitung.
Perlakuan yang sama dilakukan untuk campuran pelarut antara kloroform : etanol (5 : 1 v/v, 4 : 1 v/v, 3 : 1 v/v, 2 : 1 v/v, 1 : 1 v/v). Dari hasil analisis KLT menunjukkan bahwa batang tumbuhan Brotowali mengandung senyawa alkaloida. Dari hasil pemisahan yang lebih baik diberikan pada fase gerak kloroform : etanol ( 4 : 1 v/v). Harga Rf nya dapat dilihat pada kromatogram ( tabel 1 )
3.3.5. Isolasi Senyawa alkaloida dengan Kromatografi Kolom
Terhadap 18 g ekstrak kasar dilakukan isolasi senyawa alkaloida dengan kromatografi kolom. Fasa diamnya adalah silika gel 60 G (E.Merck Art. 7734) dan fasa geraknya adalah kloroform : etanol (4 : 1 v/v). Prosedur : Peralatan untuk kolomkromatografi dirangkai, terlebih dahulu dibuburkan silika gel 60 G ( E.Merck. Art. 7734 ) sebanyak 55 g dengan menggunakan kloroform 100 %, diaduk sampai homogen dan dimasukkan ke dalam kolom kromatografi lalu dielusi dengan
kloroform 100 % hingga bubur silika gel padat dan homogen. Dimasukkan 18 g ekstrak kasar batang tumbuhan brotowali ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel. Sampel dibiarkan turun dan terserap dengan baik pada silika gel dipuncak kolom, lalu ditambahkan fase gerak kloroform : etanol ( 4 : 1 v/v) secara perlahan –lahan dan diatur sehingga liran fraksi yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Hasil yang diperoleh ditampung dalam beberapa botol vial, lalu diuapkan diudara terbuka sampai pelarutnya habis hingga terbentuk kristal alkaloida.
3.3.6. Pemurnian Kristal Hasil Isolasi
Dari analisis taip – tiap fraksi dengan kromatografi lapisan tipis, diperoleh noda – noda dengan harga Rf yang hampir sama, ykni pada fraksi 15 – 30. lalu fraksi tesebut digabungkan dan diuapkan, diperoleh larutan pekat berwarna Kuning kehijauan. Kemudian dicuci dengan pelarut etanol secara berulang – ulang sebanyak 3 kali, kemudian dikeringkan hingga terbentuk kristal berwarna kuning berbentuk jarum sebanyak 1,38 g
3.3.7. Analisis Kristal Hasil Isolasi
3.3.7.1. Analisis Pada Kromatografi Lapis Tipis
1. Kristal yang diperoleh dari hasil rekristalisasi ditimbang sebanyak 15 mg lalu dilarutkan dalam 10 ml etanol, lalu ditotolkan pada plat KLT 2. Larutan fasa gerak yaitu kloroform : etanol ( 4 : 1 v/v ) dimasukkan kedalam bejana kromatografi yang telah dijenuhkan dengan bantuan kertas saring. Plat yang telah ditotolkan sampel dimasukkkan kedalam bejana kromatografi dan dielusi. 3. Plat dikeluarkan dari bejana kromatografi selanjutnya dikeringkan dan diamati dibawah sinar lampu UV yang memberikan warna biru, yang menunjukkan adanya alkaloid ( harga Rf dapat dilihat pada tabel 2 )
3.3.7.2. Uji Reaksi Warna Terhadap Kristal Hasil Isolasi Dengan Pereaksi Alkaloida
Larutan kristal dari prosedur 3.3.7.1 dibagi dalam empat tabung reaksi : 1. Tabung I ditambahkan dengan 2 tetes pereaksi Mayer memberikan endapan berwarna putih 2. Tabung II ditambahkan dengan 2 tetes pereaksi Wagner memberikan endapan berwarna coklat. 3. Tabung III ditambahkan dengan 2 tetes pereaksi Bouchardat memberikan endapan berwarna coklat. 4. Tabung IV ditambahkan dengan 2 tetes pereaksi Drangendorff memberikan endapan berwarna jingga.
3.3.7.3. Penentuan Titik Lebur
Kristal hasil isolasi yang telah murni diletakkan diatas plat melting point apparatus, dihidupkan alat dan diatur temperaturnya. Lalu diamati temperatur sampai kristal melebur. Titik lebur kristal yang diperoleh 175 - 177 0C.
3.3.74. Analisis Spektroskopi Kristal Hasil Isolasi
Analisis kristal hasil isolasi dengan alat spektrofotometer FT – IR dan spektrometer 1
H – NMR diperoleh dari Laboratorium Dasar Bersama FMIPA UNAIR Surabaya
dengan menggunakan pelarut CDCl 3 larutan standar TMS
BAGAN PENELITIAN
Sampel kering, bubuk 1000 gr ← Diekstraksi secara maserasi dengan pelarut etanol (2 L) ← Disaring ← Diulangi pekerjaan sebanyak 4 kali
Ekstrak etanol
Ampas
← Skrining Fitokimia ← Pekatkan dengan rotary evaporator
Ekstrak pekat etanol ← Diekstraksi secara partisi dengan pelarut etil asetat : air (1:1 v/v )sebanyak 3 kali
Fraksi etil asetat
Fraksi air ← ← ←
Diskrining fitokimia Dipekatkan dipenangas air Diasamkan dengan HCl 2 M sampai pH 2,diaduk dengan magnetic stirer selama 3 jam, disaring
Larutan asam ← ←
Lapisan Atas
Dibasakan dengan NH4OH pekat sampai pH 10,aduk dengan magnetic stirer selama 3 jam,diamkan selama 3 jam Disaring
Endapan
Filtrat larutan basa
← Dikeringkan dalam oven ← Dilarutkan dengan etanol ← Diekstraksi partisi dengan CHCl3 : air ( 1:1 v/v) 300 ml ulangi sebanyak 4 kali
Ekstrak CHCl3 ← Dicuci dengan aguadest sampai netral, keringkan dengan MgSO4 anhidreat 15 g,diamkan 1 malam dan disaring
Ekstrak CHCl3 ← Dipekatkan dengan rotarievaporator
Ekstrak CHCl3 pekat ← Diskrining Fitokimia ← Dianalisis KLT dengan pelarut kloroform 100% , Kloroform : etanol (5:1), (4:1),(3:1),(2:1),(1:1) v/v ← Dipisahkan dengan kolom kromatografi dengan fasa diam silica gel 60 G dan fasa gerak kloroform : etanol (4:1) V/V ← Ditampung tiap fraksi sebanyak 5 ml ← Dianalisis KLT dan digabung fraksi dengan Rf yang sama
Fraksi 15 -30 ← Diuapkan pelarutnya
Residu warna kuning kehijauan ← Direkristalisaasi dengan pelarut etanol
Kristal Murni
Dianalisis dengan KLT
Diukur titik lebur
Dianalisis dengan Spektrofotometer FT - IR
Dianalisis dengan Spektrometer 1 H - NMR
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Penelitian
Hasil isolasi senyawa alkaloida dari ekstrak batang brotowali dengan cara maserasi dengan pelarut etanol. Setelah ekstrak etanol dipekatkan, kemudian diasamkan dan diaduk, kemudian disaring dan kemudian dibasakan sampai pH 10. Aduk selama 3 jam, diamkan, disaring dan diekstraksi secara partisi dengan kloroform : air, lalu dipisahkan. Ekstrak kloroform dipekatkan dan dianalisa dengan kolom kromatografi. Dari hasil analisa kromatografi dengan menggunakan silika gel 60 G sebagai adsorben dan dielusi dengan kloroform : etanol ( 4 : 1 v/v ). Fraksi yang diperoleh dipekatkan dan residu yang terbentuk direkristalisasi dengan etanol berulang – ulang. Dari hasil rekristalisasi diperoleh kristal berwarna kuning, berbentuk jarum dengan titik lebur 175 – 177 0C.
Dari hasil analisa kromatografi dengan menggunakan fase gerak kloroform : etanol ( 4 : 1 v/v ), menunjukkan noda tunggal berwarna biru yang daimati dibawah lampu UV, berarti kristal hasil isolasi adalah murni.
Hasil analisis dengan menggunakan spektroskopi Infra Merah (FT – IR ) pada kristal hasil isolasi menghasilkan pita – pita serapan pada daerah bilangan gelombang sebagai berikut : 1. Pada bilangan gelombang 3474,64 cm-1 2. Pada bilangan gelombang 2922,42 cm-1 3. Pada bilangan gelombang 2851,14 cm-1 4. Pada bilangan gelombang 1732,86 cm-1 5. Pada bilangan gelombang 1651,02 cm-1 6. Pada bilangan gelombang 1503,79 cm-1 7. Pada bilangan gelombang 1461,69 cm-1
8. Pada bilangan gelombang 1438,01 cm-1 9. Pada bilangan gelombang 1382,38 cm-1 10. Pada bilangan gelombang 1227,77 cm-1 11. Pada bilangan gelombang 1026,84 cm-1 12. Pada bilangan gelombang 901,19 cm-1 13. Pada bilangan gelombang 875,10 cm-1 14. Pada bilangan gelombang 730,41 cm-1 15. Pada bilangan gelombang 655,99 cm-1 Spektrum infra merah komponen senyawa hasil isolasi dapat dilihat pada lampiran B Hasil analisis spektroskopi resonansi magnetik inti proton ( 1H – NMR ) senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pelarut CDCl 3 dan TMS sebagai estándar memberikan signal – signal pergeseran kimia pada daerah sebagai berikut : Pergeseran kimia ( 1H – NMR ) senyawa hasil isolasi (ppm) : 1. 0,881 – 1,106 menunjukkan puncak multiplet 2. 1,262 – 1,396 menunjukkan puncak singlet 3. 1,809 – 1,960 menunjukkan puncak singlet 4. 2,043 – 2,248 menunjukkan puncak singlet 5. 3,551 – 3,817 menunjukkan puncak doblet 6. 5,484 – 5,565 menunjukkan puncak doblet 7. 7,296
menunjukkan puncak singlet
Spektrum magnetik inti proton komponenen senyawa hasil isolasi dapat dilihat pada lampiran C
4.2. Pembahasan
Tumbuhan Brotowali(Tinospora crispa (L.)MIERS.)adalah merupakan salah satu dari famili menispermaceae yang merupakan tumbuhan merambat dengan panjang mencapai 2,5m atau lebih. Masyarakat sudah biasa menggunakan tanaman ini untuk pengobatan berbagai penyakit antara lain: rematik, demam, sakit kuning, kencing manis, dan penyakit kolera, dengan merebus batangnya dan air rebusan diminum yang berasa pahit.
Banyaknya manfaat tumbuhan ini mungkin berkaitan dengan banyaknya jenis senyawa kimia yang dikandungnya, antara lain, alkaloida, damar lunak, pati, glikosida, zat pahit, pikroretin, harsa, barberin, palmatin, kolumbin, dan jatrorhize. Zat pahit pikroretin merangsang kerja urat saraf sehingga alat pernafasan dapat bekerja dengan baik. Kandungan alkaloid berberin berguna untuk membunuh bakteri pada luka. Selain itu brotowali juga bermanfaat untuk menambah nafsu makan dan menurunkan kadar gula.
Isolasi senyawa alkaloida yang terkandung pada batang brotowali yang dilakukan secara ekstraksi sokletaasi dengan menggunakan pelarut etanol. Diharapkan senyawa – senyawa alkaloida yang terkandung didalamnya dapat terekstraksi seluruhnya .
Isolasi pemisahan dan pemurnian kristal untuk senyawa alkaloida sudah banyak dilakukan terhadap ekstrak tumbuh – tumbuhan. Beberapa metode yang umum dilakukan antara lain metode J.B.Harborne, Rifael dan Bouillard.I.
Dari hasil penelitian yang kami lakukan terhadap isolasi senyawa alkaloida dari batang brotowali dengan menggunakan metode Bouilllard.I. yang terlebih dahulu dimodifikasi yaitu dalam pemilihan absorben silika gel 60 G dan dielusi dengan kloroform : etanol ( 4: 1 v/v ). Kemudian dipekatkan dan residu yang diperoleh direkristalisasi dengan etanol, sehingga diperoleh kristal berbentuk jarum yang mempunyai titik lebur 175 – 177 0C.
Bila kita perhatikan spektrum kristal yang diisolasi dari batang brotowali dimana elusidasi struktur dengan data spektrofotometer (FT – IR) pada daerah bilangan gelombang tertentu yang spesifik serta data spektrometer magnet inti proton ( 1H-NMR ) dengan menggunakan pelarut CDCl 3 dan standar TMS bahwa pergeseran kimia dari kristal yang spesifik adalah sebagai berikut : 1. Pergeseran kimia pada daerah 0.881 – 1,106 ppm terdapat puncak multiplet yang menunjukkan adanya proton CH atau gugus –C-CH 3 yang mempunyai proton tetangga sehingga memberikan spektrum multiplet, ini didukung oleh data spektrofotometer
FT-IR pada bilangan gelombang 2922,42 cm-1 yang
menunjukkan karakteristik dari molekul CH 3 yang merupakan vibrasi bending dan didukung juga dengan dat vibrasi pada bilangan 1438,01 cm-1 dan 1382,38 cm-1 yang merupakan vibrasi ulur asimetrik dari gugus CH 3 . 2. Pergeseran kimia pada daerah 1,262 – 1,369 ppm terdapat puncak singlet yang menunjukkan adanya proton CH 3 yaitu yang terikat pada gugus –NH-CH 3 , ini didukung oleh data spektrofotometer FT – IR pada bilangan gelombang 3500 – 3100 cm-1 dari NH stretching dan juga muncul pada bilangan gelombang 1651,02 – 1438,01 cm-1 yang merupakan karakteristik dari molekul NH (grup amin ). 3. Pergeseran kimia pada daerah 1,809 – 1,960 ppm terdapat puncak singlet yang menunjukkan adanya proton CH 2 (metilen) yang diduga tidak mempunyai atom tetangga dan ini didukung oleh data spektrofotometer FT – IR pada bilangan gelombang 2851,14 cm-1 dan 875,10 cm-1 vibrasi stretching. 4. Pergeseran kimia pada daerah 2,043 – 2,248 ppm terdapat puncak singlet dari gugus –OH (hidroksil) dan ini didukung oleh data spektrofotometer FT – IR pada bilangan gelombang 1227,77 cm-1 yang merupakan vibrasi ulur dari gugus –OH (hidroksil) dengan serapan kuat dan tajam. 5. Pergeseran kimia pada daerah 3,551 3,817 ppm terdapat puncakdoblet dari gugus –CH 2 -O atau gugus –CH 2 NO 2 dan ini didukung oleh data spektrofotometer FT – IR pada bilangan gelombang 1503,79 cm-1 dan 1461,02 cm-1 yang merupakan vibrasi ulur dan data ini diperkuat dengan kehadiran vibrasi stretching pada 730,41 – 655,99 cm-1 6.
Pergeseran kimia pada daerah 5,484 – 5,565ppm terdapat puncak doblet dari gugus CH ( =< H ) yang menjauhi TMS dan ini dipengaruhi oleh proton atom tetangga yang bersifat elektronegatif tinggi dan ini didukung oleh data spektrofotometer FT – IR pada bilangan gelombang 1026,84 cm-1 yang merupakan vibrasi ulur dari gugus metin ( –C-H )
7. Pergeseran kimia pada daerah 7,296 ppm terdapat puncak singlet dari gugus CH aromatis yang menjauhi TMS serta proton – protonnya yang menunjukkan protonyang equivalen terhadap tetangga yang mengkibatkan terbentuk puncak singlet yang kuat dan bersifat elektromagnet tinggi dan ini didukung oleh data
spektrofotometer FT – IR pada bilangan gelombang 3030cm-1 dan cincin aromatik tersubstitusi oleh gugus lain yang mengakibatkan munculnya puncak pada bilangan gelombang 901,19 – 730,14 cm-1 yang merupakan vibrasi ulur dari gugus CH aromatis.
Dari hasil pembahasan diatas, jelaslah bahwa kristal yang diisolasi dari batang tumbuhan brotowali adalah senyawa alkaloida, ini ditunjukkan oleh kehadiran atom N pada senyawa tersebut.
BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1.Kesimpulan
1. Hasil isolasi yang diperoleh dari 1000 g batang tumbuhan Brotowali ( Tinospora crispa (L.)MIERS) merupakan kristal kuning berbentuk jarum sebanyak 1,38 g. 2. Dari data spektrum FT-IR dan resonansi magnetik inti proton (1H-NMR), diduga bahwa batang tumbuhan Brotowali ( Tinospora crispa (L.)MIERS ) mengandung senyawa alkaloida, ini ditunjukkan dengan kehadiran atom N pada senyawa hasil isolasi. 3. Titik lebur kristal yang diperoleh adalah 175 - 177 0C
5.2.Saran
1. Perlu dilakukan penelitian terhadap batang tumbuhan Brotowali ( Tinospora crispa (L.)MIERS ) dengan menggunakan pelarut lain. 2. Perlu dilakukan analisis dengan Spektroskopi yang lain seperti Spektroskopi NMR 2 dimensi (COSY-NMR), MS, dan analisis elementer agar diperoleh datadata yang lebih mendukung untuk mendukung kebenaran struktur senyawa alkaloida hasil isolasi.
