3 METODE PENELITIAN
Tempat dan Waktu Penelitian dilakukan di Laboratorium Kimia Pangan SEAFAST Center Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka Bogor. Pelaksanaan Penelitian selama tiga bulan dari Agustus-Oktober 2012. Bahan dan Alat Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah propolis dari daerah Sulawesi Selatan (Kabupaten Luwu), Kalimantan Barat (Kabupaten Sambas), NTB (Kabupaten Lombok), Kabupaten Ciamis (Jawa Barat). Sampel Ekstrak propolis diperoleh dari CV Nutrima, Bogor. Propolis mentah dari ke empat wilayah diekstrak oleh CV Nutrima untuk kemudian diperoleh propolis cair. Ekstrak propolis yang diterima sebanyak dua botol ukuran 100 ml. Ekstrak propolis kemudian disimpan di lemari pendingin untuk keperluan analisis selanjutnya. Sebelum dianalisis sampel dikocok terlebih dahulu untuk homogenisasi. Bahan kimia untuk analisis yang digunakan untuk uji aktivitas antioksidan meliputi kristal 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) dan Trolox (6-hydroxy2,5,7,8-tetramethylchroman-2-Carboxylic Acid) sebagai pembanding. Bahanbahan untuk penentuan total fenol adalah etanol 70%, akuades, Na2CO 3 5%, reagen Folin-Ciocalteau 50%, dan asam galat. Bahan-bahan untuk penentuan total flavonoid adalah kuersetin , NaNO 2 dan AlCl 3 . Bahan analisis FTIR adalah KBr. Alat Peralatan yang digunakan antara lain timbangan digital, spektrofotometer UV-Vis, spektrofotometer FTIR Tensor 37 (Bruker), tabung reaksi dan vortex. Metode Penelitian Pada penelitian ini dilakukan analisis profil mteabolit terhadap ekstrak propolis menggunakan FTIR, penentuan total fenol, penentuan total flavonoid, dan pengujian aktivitas antioksidan dengan metode DPPH .
22 Analisis Sampel Menggunakan Spektroskopi FTIR Preparasi sampel dilakukan dengan teknik pengolesan yaitu sampel propolis diteteskan pada window (lapisan tipis KBr) sebanyak 1 tetes (0,2 ml) kemudian diratakan ke seluruh permukaan window sampai bisa tertembus oleh sinar. Kemudian dicari terlebih dahulu spektrum dari pelarut propilen glikol yang digunakan yang berfungsi sebagai background. Setelah mendapatkan background kemudian data background disimpan sebagai acuan. Kemudian window yang telah diolesi sampel dimasukkan kedalam sample holder pada alat FTIR. Kemudian operasikan alat FTIR sampai didapatkan suatu spektrum dari sampel tersebut. Ulangan dilakukan sebanyak lima kali terhadap masing-masing sampel sehingga diperoleh lima spektrum untuk setiap sampel, sedangkan total spektrum FTIR dari ke empat sampel (Jawa Barat, Kalimantan Barat, Sulawesi Selatan, NTB) adalah 20 spektrum. Selain sampel dianalisis pula spektrum dari propolis komersial sebagai pembanding yang diulang sebanyak 5 kali. Spektrum IR dalam format OPUS disimpan dalam format data point table (DPT) yang dapat dibuka dengan menggunakan perangkat lunak Microsoft Excel. Data spektrum yang digunakan ialah data keseluruhan serapan. Spesifikasi dan parameter alat: • • • • •
Sumber cahaya = MIR (Medium Infrared) Background scanning = 32 scans Sample scanning = 32 scans Detektor = DLATGS (Deuterated Lanthanum Triglycine Sulfate) Spectrum results = transmittance
Penentuan Aktivitas Antioksidan Analisis Aktivitas Antioksidan Metode DPPH Aktivitas antioksidan diukur sebagai persentase DPPH yang tersisa dalam larutan (Mihai 2011). Sebanyak 295 µl larutan DPPH 1 mM (dalam metanol) dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Propolis dengan berbagai konsentrasi dimasukkan ke dalam labu ukur lalu dilarutkan dalam metanol hingga volume larutan tepat 10 ml. Larutan tersebut didiamkan selama 30 menit dan diukur absorbansnya pada 517 nm. Pengujian dilakukan sebanyak tiga kali ulangan. Trolox digunakan sebagai kontrol positif dan untuk pembanding dengan masingmasing kosentrasi 2, 4, 6, 8, dan 10 ppm.
23 Persentase penghambatan aktivitas radikal bebas diperoleh dari nilai absorbansi sampel. Hambatan (persentase) dihitung dengan rumus : % Inhibisi = Absorbansi blanko – Absorbansi sampel x 100 Absorbansi blanko Nilai konsentrasi dan hambatan ekstrak diplot masing-masing pada sumbu x dan y. Persamaan regresi diperoleh dari hubungan antara konsentrasi sampel dan presentase penghambatan aktivitas radikal bebas. Nilai konsentrasi penghambatan aktivitas radikal bebas sebanyak 50% (IC 50 ) dihitung dengan menggunakan persamaan regresi. Nilai IC 50 diperoleh dengan memasukkan Y=50 serta nilai A dan B yang telah diketahui. Nilai x sebagai IC 50 dapat dihitung dengan persamaan : y = A + B ln(x) Keterangan : y = persen inhibisi A = slope B = intercept x = konsentrasi sampel (mg/l) Analisis Statistik PCA dan PLS Spektrum FTIR sebanyak 25 spektrum yaitu setiap sampel sebanyak lima spektrum dalam format OPUS disimpan dalam format tabel titik data (DPT) yang dapat dibuka dengan menggunakan peranti lunak Microsoft Excel 2007. Analisis data PCA dan PLS dilakukan dengan menggunakan peranti lunak The Unscrambler X 10.2. Pengelompokan sampel dilakukan oleh PCA dengan memanfaatkan
data
serapan
spektrum
FTIR
yang
terukur,
sedangkan
pengelompokan yang dikorelasikan dengan aktivitas antioksidan dilakukan oleh PLS. Analisis PCA dan PLS pada FTIR digunakan sebagai analisis untuk mengetahui pengelompokkan propolis berdasarkan asal daerah dan aktivitas antioksidannya. Penentuan Senyawa Bioaktif 1) Penentuan Kandungan Total Fenol Kandungan
total
fenol
ditentukan
dengan
menggunakan
metode
Kolorimetri Folin-Ciacolteau (Kumazawa et al. 2002). Asam galat digunakan standar dengan hasil yang diperoleh merupakan sejumlah mg ekivalen asam galat
24 (GAE) per 100 gram sampel. Sebanyak 0,5 mL propolis dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambah 0,5 mL reagen Folin-Ciocaluteu. Campuran kemudian dihomogenkan dengan vortex selama tiga menit. Selanjutnya ditambahkan 0,5 mL larutan Na2CO3 10%, campuran didiamkan dalam ruang gelap selama 60 menit. Absorbansi dibaca pada λ 760 nm dengan spektrofotometer. Sampel dihitung hingga konsentrasi akhir pada 20µg/mL. Hasilnya dinyatakan sebagai mg asam galat/g sampel. 2) Penentuan Kandungan Total Flavonoid Kandungan total flavonoid propolis diukur dengan menggunakan metode aluminium klorida kolorimeteri (Chang et al. 2002). Senyawa kuersetin digunakan sebagai standar dengan hasil yang diperoleh merupakan sejumlah mg dari ekivalen kuersetin (QE) per 100 gram ekstrak sampel. Ke dalam 0,5 mL propolis ditambahkan 2,8 mL aquades. Kemudian larutan ditambahkan 0,1 mL NaNO 2 1M. Setelah 6 menit, campuran ditambahkan 0,1 mL aluminium klorida 10% dan campuran divortek hingga homogen serta didiamkan 30 menit. Selanjutnya absorbansinya diukur pada λ 415 nm. Kurva standar kalibrasi menggunakan kuersetin dalam metanol dengan konsentrasi antara 12,5 hingga 100 µg/mL. Kandungan flavonoid dinyatakan sebagai sejumlah mg dari ekivalen kuersetin per 100 mg sampel. Analisis Statistik Rancangan penelitian yang digunakan untuk analisis statistik adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) non faktorial (satu faktor) dengan tiga ulangan (Gaspers, 1991), sedangkan faktor perlakuannya yaitu pengaruh asal daerah propolis dengan lima taraf perlakuan sebagai berikut: A1. Propolis dari Kabupaten Luwu (Sulawesi Selatan), A2. Propolis dari Kabupaten Sambas (Kalimantan Barat), A3. Propolis dari Kabupaten Lombok (Nusa Tenggara Barat), A4. Propolis dari Kabupaten Ciamis (Jawa Barat) A5. Propolis Komersial Hipotesis rancangan acak lengkap (RAL) total fenol, total flavonoid dan aktivitas antioksidan propolis adalah sebagai berikut: H0: asal daerah propolis tidak berpengaruh nyata terhadap total fenol, total
25 flavonoid dan aktivitas antioksidan propolis (αi = 0) H1: asal daerah propolis berpengaruh nyata terhadap total fenol, total flavonoid dan aktivitas antioksidan propolis (αi ≠ 0) Model rancangan acak lengkap yang digunakan untuk menganalisis data adalah: Yij = μ + αi + εij Keterangan : Yij = hasil pengamatan terhadap total fenol, total flavonoid dan aktivitas antioksidan propolis (i) pada ulangan ke-j μ = rataan umum αi = pengaruh asal daerah propolis εij = sisaan akibat pengaruh asal daerah propolis taraf ke-i pada ulangan ke-j Analisis data menggunakan analisis ragam (ANOVA). Jika analisis ragam menunjukkan hasil berbeda nyata maka dilakukan uji lanjut Duncan untuk melihat pengaruh perbedaan antar perlakuan. Analisis Data mengenai Hubungan Nilai Total Fenol, Flavonoid dan Kapasitas Antioksidan Untuk melihat korelasi kandungan fenol, flavonoid dengan aktivitas antioksidan digunakan analisis korelasi Pearson (Pearson’s product moment correlation) yang dinyatakan sebagai koefisien korelasi (r) (Gomez and Gomez 1996; Ireland 2010). Analisis data dilakukan terhadap kapasitas antioksidan yang dinyatakan dalam % penghambatan (% inhibisi) radikal bebas DPPH (IC 50 ). Sementara itu untuk mengetahui perbedaan kemampuan antioksidan dalam menghambat perkembangan radikal bebas DPPH dilakukan uji analisis variansi pada α-0.05. Hasil analisis dinyatakan mempunyai korelasi positif jika hasil perhitungan menghasilkan nilai koefisien korelasi r > 0.8 (Ireland, 2010) yang artinya lebih dari 80% nilai total feno/flavonoid berpengaruh terhadap kapasitas antioksidan sebagai radikal scavenger. Pengolahan data menggunakan Microsoft Excel dan SPSS.
