BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Bioteknologi SEAFAST Centre, Laboratorium Biokimia Pangan dan Laboratorium Kimia Pangan Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, IPB pada bulan Februari hingga Juli 2010.
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan pada penelitian ini adalah daun mengkudu (Morinda citrifolia L.) dengan 2 tingkat ketuaan yaitu daun pangkal berwarna hijau tua dan daun pucuk yang berwarna hijau agak muda (Gambar 1). Bahan kimia diantaranya Na asetat (Merck), asam asetat (Merck), EDTA (Amersham Biosciences), gliserol (Bio Basic Inc), polivinilpirolidon (PVP K 30), , β-mercaptoetanol (Bio Basic Inc), es batu, akuades, akuabides (Ikapharmindo Putramas), silika gel 60 H (Merck), ammonium sulfat (Merck), etanol (Merck), asam fosfat (Merck), asam borat (Amersham Biosciences), boraks (Merck), kasein (Merck), NaOH (Merck), HCl (Merck), tirosin (Merck), TCA (Merck), Na sulfit (Merck), asam sulfat (Merck), CaCl2 (Merck), Na2CO3 (Merck), pereaksi folin ciocalteau (Sigma Aldrich),
marker BM rendah (Fermentas SM-0431), yaitu beta galaktosidase
116kDa, bovin serum albumin 66.2kDa, ovalbumin 45kda, laktat dehidrogenase 35kDa, RE ase Bsp 25kDa, beta laktoglobulin 18.4kDa dan lisozim 14.4kDa, akrilamid (Applichem), buffer tris-HCL (Amersham Biosciences-Merck), SDS (Bio Basic Inc), TEMED (N,N,N,N-tetrametilenetilen-diamina), APS (ammonium persulfat), bromophenol blue, BSA serta kasein Hammerstein (Merck), bromophenol blue (Bio Basic Inc), Coomassie Brilliant Blue R-250 (Applichem), Coomassie Brilliant Blue G-250 (Bio Basic Inc). Peralatan yang digunakan adalah hand blender Aletta A746, sentrifus Hermle Z383K, oven, neraca analitik, seperangkat alat elektroforesis gel mini protean 3 sel (Biorad), kantong dialisis Sigma D9652, freezer, spektrofotometer UV-Vis, Shimadzu seri UV-2450, Quantity one (Biorad), penangas air, pengaduk magnetik, tabung eppendorf, pipet mikro dan alat-alat gelas.
19
A
B
Gambar 2. (A) Daun Pucuk, (B) Daun Pangkal Metode Penelitian Secara garis besar kerja penelitian ini terdiri dari : 1) Karakterisasi sifat fisik dan kimia daun mengkudu, 2) Pemurnian enzim menurut metode Piero dan Petrone (1999) dan Thomas et al. (2009) dan dilakukan beberapa modifikasi menurut Bollag dan Edelstein (1991), tahap pemurnian ini dilakukan pada suhu dingin (4-6oC),
(3) Pendugaan kelas protease daun mengkudu.
Garis besar
gambaran penelitian dapat dilihat pada Gambar 3. Karakterisasi Sifat Fisik dan Kimia Daun Mengkudu Daun mengkudu yang dipilih adalah daun segar yang tidak memiliki cacat fisik maupun mikrobiologi. Daun dipilih berdasarkan dua tingkat ketuaan yaitu daun pucuk berwarna hijau muda diambil 2 helai daun dari pucuk dan daun pangkal berwarna hijau tua yang diambil 2 helai daun dari pangkal. Daun mengkudu yang diperoleh berasal dari kebun mengkudu IPB. IPB menanam pohon mengkudu yang dibenihkan sendiri dari biji mengkudu pada tahun 2000. Spesies mengkudu yang digunakan untuk penelitian diuji di Laboratorium LIPI Cibinong.
Prof. Dr.
Eko Baroto Waluyo dari LIPI menyatakan bahwa mengkudu yang digunakan dalam penelitian ini termasuk spesies Morinda citrifolia Linn. Daun dibesihkan dari debu atau kotoran yang menempel menggunakan tissu. Sebagian daun dianalisa proksimat meliputi analisa kadar protein (AOAC, 1999), lemak (AOAC, 1999), air dan abu (AOAC, 1999) dan kadar karbohidrat (by difference).
20
Daun mengkudu ↓ Penyortasian ↓ Pengering-anginan → analisa proksimat ↓ Penambahan buffer sodium asetat pH 5 ( 5mM EDTA, 14mM 2mercaptoetanol, 10% PVPP dan 10% gliserol (daun :buffer = 1:5 ; berat daun 10g) ↓ Penggilingan menggunakan blender (4 kali @ 15detik pada kecepatan tinggi) ↓ Penyaringan→ Ampas ↓ Sentrifugasi filtrat pada 3775g (4oC), 30 menit → Ampas ↓ Supernatan (Ekstrak enzim kasar) * ↓ Penambahan silika gel 60 H 1.4%, divorteks 5 menit ↓ Sentrifugasi 3775g (4oC), 15 menit → Ampas ↓ Supernatan (Ekstrak Silika) * ↓ Penambahan ammonium sulfat 100% jenuh,diaduk dengan magnetic stirrer, 30 menit ↓ o Sentrifugasi 1972g (4 C), 30 menit → Supernatan* ↓ Endapan* ↓ Pelarutan dalam jumlah pelarut minimal ↓ Dialisis ↓ Dialisat* ↓ Elektroforesis SDS-PAGE, Zimogram ↓ Pendugaan Kelas Protease Gambar 3. Garis besar kerja penelitian Ket: *Analisa kadar protein (Bradford, 1976) ) dan aktifitas protease (Bergmeyer dan Grassl, 1983)
21
Pemurnian Enzim Tahap pemurnian enzim meliputi ekstraksi enzim kasar, penambahan silika, pemekatan menggunakan garam ammonium sulfat jenuh, dialisis serta fraksinasi enzim menggunakan Sodium Dodecil Sulfat Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) dan zimogram untuk mengetahui bobot molekul enzim protease. Penelitian ini menggunakan buffer asetat pH 5, dicampur dengan EDTA 5mM, Polyvinyl pyrrolydone (PVP K 30) 10%, gliserol 10% dan βmerkaptoethanol 14mM. Buffer yang diperlukan untuk ekstraksi disiapkan pada hari yang sama dengan hari ekstraksi. Sampel daun (10g) dipotong-potong dan ditambah buffer ekstraksi bersuhu o
4 C (daun : buffer ekstraksi = 1 : 5), kemudian diblender dengan kecepatan tinggi (4 x 15 detik) dengan wadah yang dikelilingi oleh es batu, selanjutnya disaring menggunakan kain saring (2 lapis) dan filtrat disentrifus dingin 4oC 3775g (5900 rpm) selama 30 menit sehingga dihasilkan supernatan ekstrak enzim kasar. Supernatan yang didapat ditambah dengan silika 1,4% dan divorteks selama 5 menit dan disentrifus 4oC pada 3775g (5900 rpm) selama 15 menit. Supernatan yang dihasilkan adalah ekstrak hasil penambahan silika (ekstrak silika). Supernatan yang didapat selanjutnya diendapkan menggunakan ammonium sulfat 100% jenuh. Ammonium sulfat yang ditambahkan 100% dengan tujuan untuk mengendapkan semua protein yang ada. Endapan enzim dipisahkan menggunakan sentrifus dingin 4oC 1972,2g (3500 rpm). Endapan enzim selanjutnya didialisis menggunakan kantung dialisis
atau membran selulosa
Sigma seri D9652 dengan diameter 21mm, panjang 10cm. Sebelum melakukan dialisis, kantung selulosa dipersiapkan terlebih dahulu. Sepanjang 10cm kantung dialisis dicuci dengan air mengalir selama 3-4 jam, kemudian direndam dalam larutan Na sulfit 0.3% selama 1 menit pada suhu 80oC. Kantung dialisis dicuci menggunakan air bersuhu 60oC selama 2 menit dan diasamkan dengan larutan asam sulfat 0,2%.
Sisa asam dihilangkan dengan cara
membilas kantung dialisis menggunakan air bersuhu 60oC.
Dialisis endapan
enzim dilakukan selama 5 jam dengan wadah dikelilingi dengan es batu. Setiap 1 jam buffernya diganti dan selanjutnya sampel difraksinasi dengan SDS-PAGE dan
22
zimogram untuk mengetahui bobot molekul protease
(Bollag dan Edestein,
1991). Setiap tahap pemurnian diukur massa yang masuk dan massa keluar dan massa yang hilang (Gambar 4). Kehilangan massa terbesar terjadi pada saat pemblenderan dan penyaringan karena ampas tertinggal di dalam blender dan kertas saring. Pengamatan Kadar Air (AOAC, 1999) Sejumlah sampel (1-2g) dimasukkan ke dalam cawan yang telah diketahui beratnya. Kemudian cawan dimasukkan ke dalam oven bersuhu 105oC hingga diperoleh berat yang konstan. Perhitungan kadar air dilakukan berdasarkan berat basah dengan menggunakan rumus : Kadar air (%b/b) = Dimana :
a−b × 100% c
a = berat cawan dan sampel awal (g) b = berat cawan dan sampel akhir (g) c = berat sampel awal (g) Kadar Protein (AOAC, 1999) Sejumlah sampel (100-250mg) ditimbang ke dalam labu Kjeldahl. Kemudian ditambahkan 1.9 ± 0.1g K2SO4 , 40 ± 10mg HgO dan 2 ± 0.1ml H2SO4. Sampel dididihkan selama 1-1.5 jam dengan kenaikan suhu secara bertahap sampai cairan menjadi jernih, lalu didinginkan. Sejumlah kecil akuades diteteskan secara perlahan lewat dinding labu kemudian labu digoyang pelan agar kristal yang terbentuk larut kembali. Isi labu kemudian dipindahkan ke dalam alat destilasi dan labu dibilas 5-6 kali dengan 1-2ml akuades. Selanjutnya ditambahkan 8-10ml larutan 60% NaOH-5% Na2S2O3ke dalam alat destilasi. Erlenmeyer yang berisi 5ml H3BO3 dan 2 tetes indikator metilen red-metilen blue diletakkan di bawah kondensor dengan kondisi ujung kondensor terendam di bawah larutan H3BO3.
23
Daun mengkudu DM :10g; DT:10g
Ampas DM: 3.30g; DT:3,57g
Pemblenderan dan penyaringan Buffer asetat pH 5 DM : 50g; DT: 50g
Hilang (loss) DM:7.49g; DT:7.94g
Filtrat DM:49.21g; DT:48.49g Ampas DM:1.70g; DT:1.63g
Sentrifugasi
Hilang (loss) DM:0.71g; DT:2.86g
Ekstrak kasar DM:46.66g;DT:46.03g
Silika 1.4% DM:0.63g; DT:0.64g
Ampas DM:2.82g; DT:2.91g
Sentrifugasi
Hilang (loss) DM: 2.17g; DT:2.26g
Ekstrak silika DM:42.30;DT:41.5
6 Garam ammonium sulfat DM:21.46g; DT:21.06g
Pengendapan
Supernatan DM:52.03g; DT:49.78g
Hilang (loss) DM:4.81g; TK4:5.36g
Endapan DM:6.92g; DT:7.42g
Buffer diganti setiap 1 jam selama 5 jam DM:21.46g; DT:21.06g
Dialisis
Dialisat DM:17.8mL; DT:17.5mL
Gambar 4. Diagram Neraca Massa selama Tahapan Pemurnian (DM : daun pucuk, DT : daun pangkal)
24
Destilasi dilakukan hingga diperoleh destilat sebanyak ±15ml. Destilat yang diperoleh selanjutnya diencerkan hingga ± 50ml dan dititrasi dengan HCl terstandar sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu. Perhitungan kadar protein dilakukan dengan rumus : %N=
[(ml HCl-ml blanko) × N HCl ×14.007 × 100 mg sampel
Kadar protein
g protein = %N × 6.25 100g bahan basah
Kadar Abu (AOAC, 1999) Sampel ditimbang 3.0g dalam cawan pengabuan, sampel diarangkan sampai tidak berasap di oven. Sampel yang sudah menjadi arang dimasukkan pada tanur 600oC.
Sampel yang sudah menjadi abu didinginkan dalam desikator dan
ditimbang. b berat abu Kadar abu (% ) = × 100 b berat sampel
Kadar Lemak (AOAC, 1999)
Labu lemak dikeringkan dengan oven, didinginkan dalam desikator dan ditimbang sebelum digunakan. Sampel ditimbang 3.0g, dibungkus dengan kertas saring dan diekstraksi soxhlet menggunakan pelarut heksan selama 6 jam. Labu lemak hasil ekstraksi dioven, didinginkan dalam desikator dan ditimbang sampai tercapai berat konstan. b berat lemak Kadar lemak (% ) = ×100 b berat sampel
Aktifitas Enzim (Bergmeyer dan Grassl, 1983)
Aktifitas protease diukur mengikuti prosedur seperti pada Tabel 4. Pereaksi disiapkan terlebih dahulu. Supernatan yang sudah diwarnai diukur absorbansinya pada 578nm. Aktifitas protease dihitung berdasarkan rumus : U A sampel − A blanko) Aktiitas protease ( ) = × (1/T) x FP mL A standar − A blanko 25
Dimana :
A : absorbansi T : waktu inkubasi (35 menit) FP: faktor pengenceran
Satu unit aktifitas protease didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dapat menghasilkan 1µmol produk tirosin per menit pada kondisi pengukuran. Specific Activity (Harris dan Angal, 1989) Specific activity atau aktifitas spesifik dihitung berdasarkan persamaan :
Speciic activity (
Recovery (%) (Harrris, 1989)
U Aktiitas enzim (U) )= mg total protein (mg)
Recovery (%) dihitung berdasarkan persamaan : Recovery % = Purification fold (Harris, 1989)
total aktiitas enzim tahap (n) total aktiitas enzim tahap (n − 1)
Purification fold dihitung berdasarkan persamaan berikut : Puriicat ion fold = Neraca Massa (Toledo, 1991)
speciic activity tahap (n) speciic activity tahap (n − 1)
Neraca massa dihitung berdasarkan prinsip jumlah massa yang masuk sama dengan jumlah massa yang keluar. Neraca massa dihitung berdasarkan persamaan berikut : Massa yang masuk (g) = massa yang keluar (g) + kehilangan massa(g)
26
Tabel 4. Pengujian Aktifitas Enzim Metode Bergmeyer dan Grassl (1983) Pereaksi Bufer borat pH 8 Bufer kasein HCl 0.02 M Larutan enzim protease Akuades Tirosin 5 mM
Sampel (mL) Blanko (mL) Standar (mL) 1 1 1 1 1 1 0.2 0.2 0.2 0,2 0.2 0.2 Inkubasi 35 menit, 37oC TCA 0.1 M 2 2 2 CaCl2 0.2 o Inkubasi 37 C, 10 menit dilanjutkan dengan sentrifus 1448.9g selama 10 menit Supernatan 1.5 1.5 1.5 Na2CO3 0.4 M 5 5 5 Pereaksi Folin-Ciocalteau 1 1 1 o Inkubasi 37 C, 20 menit dan diukur absorbansi pada 578 nm
Kadar Protein ( Bradford, 1976) Sebelum mengukur absorbansi sampel, terlebih dahulu dipersiapkan blanko dan standar sehingga dapat dibuat kurva standar yang digunakan untuk menghitung konsentrasi protein sampel. Standar yang digunakan adalah BSA. Untuk blanko, sebanyak 100ul akuades ditambahkan 5ml pereaksi Bradford dan diukur absorbansinya pada 595nm. Pembuatan standar BSA untuk pembuatan kurva standar adalah sebanyak 100ul larutan BSA (100-1000ug/ml) dipipet ke dalam tabung reaksi berukuran 1.2 x 10cm. Kemudian ditambahkan 5ml pereaksi Bradford. Larutan divorteks dan diukur secara spektrofotometri pada λ= 595nm setelah 5 menit. Kurva standar yang diperoleh digunakan untuk mengukur konsentrasi sampel daun pucuk dan daun pangkal. Sampel yang akan dianalisa diambil sebanyak 100µL ditambah 5mL pereaksi bradford, divortek dan didiamkan selama 5 menit, kemudian diukur absorbansi sampel dan dihitung kadar protein.
27
Elektroforesis Gel dan Zimogram SDS-PAGE Untuk mengetahui bobot molekul protein yang terdapat pada endapan enzim maka
digunakan
elektroforesis
SDS-PAGE
(Sodium
Dodecil
Sulfate
Polyacrylamide Gel Electrophoresis). Komposisi gel untuk SDS-PAGE dan zimogram dapat dilihat pada Tabel 5. Tabel 5. Komposisi Gel Pemisah dan Gel Penahan SDS-PAGE dan Zimogram Bahan Aqua bidestilata Akrilamid 30% 1.5M tris HCl pH 8.8 0.5 M tris HCl pH 6.8 Kasein 1% Ammonium persulfat TEMED Jumlah
Gel Pemisah 12% 3.5mL 4.0mL 2.5mL 50µL 5µL ~10mL
Gel Penahan 5% 2.3mL 0.67mL 1.0mL 30µL 5µL ~4mL
Zimogram 2.1mL 4.2mL 2.5mL 1.0mL 100µL 10µL 10mL
Pembuatan Gel Disiapkan sepasang gel elektroforesis, yang terdiri dari gel pemisah (separating gel) dan gel penahan (stacking gel). Bahan kimia yang diperlukan untuk gel pemisah disiapkan, dicampur, diaduk dengan pengaduk magnet, dan dengan cepat diisikan ke dalam plat pembentuk gel. Gel akan terbentuk setelah 30-45 menit.Larutanlarutan untuk gel penahan disiapkan, dicampur dan diaduk dengan pengaduk magnet dan diisikan pada plat pembentuk gel, di atas gel pemisah. Sisir disiapkan pada larutan gel penahan yang akan mengalami polimerisasi untuk membentuk sumur-sumur elektroforesis. Gel terbentuk setelah 15-30 menit. Penyiapan Larutan Sampel dan Protein Marker Protein sampel dan protein penanda masing-masing 40µL dicampur dengan buffer sampel sebanyak 10µL dimasukkan dalam tabung eppendorf dan dipanaskan pada penangas air mendidih selama 5 menit. Protein sampel yang
28
diinjeksikan sebanyak 10µL dan 7µL untuk protein penanda.Protein sampel dan penanda dimasukkan ke dalam sumur
elektroforesis menggunakan Syringe
Hamilton. Running Elektroforesis Gel yang diisi dengan larutan sampel dan protein penanda dipasang pada piranti elektroforesis. Sebanyak 400mL buffer elektroforesis dituangkan pada tempatnya,
sehingga
permukaan
gel
terendam
sedalam
kira-kira 2cm.
Elektroforesis dijalankan dengan mengalirkan arus listrik 70V untuk dua gel. Elektroforesis dihentikan setelah warna biru BPB mencapai kira-kira 0.5cm dari batas bawah gel pemisah. Gel hasil elektroforesis dilepas dari plat menggunakan spatula dan siap dilakukan pewarnaan protein. Pewarnaan Protein Comassie Blue Gel pemisah hasil elektroforesis direndam dalam larutan pewarna gel selama 20 menit sambil digoyang konstan pada mesin penggoyang. Kelebihan warna dihilangkan dengan larutan peluntur warna sampai diperoleh pita-pita protein berwarna biru dengan latar belakang jernih. Bobot molekul (BM) protein-protein dalam sampel ditentukan dengan menghitung nilai Rf dari masing-masing pita yang nampak, kemudian diplotkan pada kurva standar log BM terhadap Rf protein penanda. Pewarnaan dengan Silver Stain (Moertz et al. 2001) Pewarnaan silver disebutkan 20-200 kali lebih sensitif dibanding pewarnaan dengan comassie (CBB). Pewarnaan ini bisa mendeteksi 0.05-0.1ng/mm2 gel protein (Harris dan Angal, 1989). Zimogram Pembuatan Gel Disiapkan sepasang gel elektroforesis, yang terdiri dari gel pemisah dan gel penahan. Komposisi gel pemisah dan gel penahan seperti pada Tabel 5. Bahan
29
kimia yang diperlukan untuk gel pemisah disiapkan, dicampur, diaduk dengan pengaduk magnet, dan dengan cepat diisikan ke dalam plat pembentuk gel. Gel akan terbentuk setelah 30-45 menit. Larutan-larutan untuk gel penahan disiapkan, dicampur dan diaduk dengan pengaduk magnet dan diisikan pada plat pembentuk gel, di atas gel pemisah. Sisir disiapkan pada larutan gel penahan yang akan mengalami polimerisasi untuk membentuk sumur-sumur elektroforesis. Gel terbentuk setelah 15-30 menit. Penyiapan Larutan Sampel dan Protein Marker Protein sampel dan protein penanda masing-masing 40µl dicampur dengan buffer sampel sebanyak 10µl dimasukkan dalam tabung eppendorf.
Protein
sampel yang diinjeksikan sebanyak 18µL dan 15µL untuk protein penanda.Protein sampel dan penanda dimasukkan ke dalam sumur elektroforesis menggunakan Syringe Hamilton. Running Elektroforesis Gel yang diisi dengan larutan sampel dan protein penanda dipasang pada piranti elektroforesis. Sebanyak 400mL buffer elektroforesis dituangkan pada tempatnya,
sehingga
permukaan
gel
terendam
sedalam
kira-kira 2cm.
Elektroforesis dijalankan dengan mengalirkan arus listrik 70V untuk dua gel. Elektroforesis dihentikan setelah warna biru BPB mencapai kira-kira 0.5cm dari batas bawah gel pemisah. Gel hasil elektroforesis dilepas dari plat menggunakan spatula dan siap dilakukan pewarnaan protein. Inkubasi Gel pemisah hasil elektroforesis direndam dalam larutan Triton X-100 2.5% selama 1 jam sambil digoyang pada mesin penggoyang. Setelah itu gel direndam didalam larutan buffer asetat pH 5 dan diinkubasikan selama 1 jam dan semalaman.
30
Pewarnaan Protein Comassie Blue Gel pemisah hasil elektroforesis direndam dalam larutan pewarna gel selama 20 menit sambil digoyang konstan pada mesin penggoyang. Kelebihan warna dihilangkan dengan larutan peluntur warna sampai diperoleh pita-pita protein berwarna biru dengan latar belakang jernih. Bobot molekul (BM) protein-protein dalam sampel ditentukan dengan menghitung nilai Rf dari masing-masing pita yang nampak, kemudian diplotkan pada kurva standar log BM terhadap Rf protein penanda.
Pendugaan Kelas Protease Daun Mengkudu Tahap ini dilakukan untuk menduga kelas protease dari daun mengkudu. Pendugaan dilakukan menggunakan literatur, studi pustaka dan bank data yang tersedia.
31
