12
BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Survei penyakit klorosis dan koleksi sampel tanaman tomat sakit dilakukan di sentra produksi tomat di daerah Cianjur, Cipanas, Lembang, dan Garut. Deteksi virus dilakukan di Laboratorium Virologi, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilakukan dari bulan Februari sampai Oktober 2010.
Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu sampel daun tomat yang bergejala penyakit klorosis. Selain bahan tanaman, digunakan juga beberapa bahan kimia atau reagensia yang dipergunakan untuk ekstraksi RNA, RT-PCR, PCR, dan elektroforesis. Bahan-bahan yang digunakan untuk ekstraksi RNA diantaranya yaitu, nitrogen cair, merkaptoethanol, ethanol 96%, buffer RLT, buffer RW1, buffer RPE, dan RNAse free water. Bahan-bahan yang diperlukan untuk RT-PCR yaitu 50 mM DTT (dithiothreitol), M-MuLV Rev, 10 mM dNTP (deoksiribonukleotida triphosphat), RNAse inhibitor, oligo (dT), dan H2O. Untuk PCR, diperlukan bahan kimia seperti buffer PCR 10X + Mg2+, 10 mM dNTP, H2O, Taq DNA polymerase, sucrose cresol 10X, dan primer. Selain itu, agarose, buffer Tris-Acetat EDTA (TAE) 0,5X, dan ethidium bromida juga diperlukan sebagai bahan pembuatan gel dalam proses elektroforesis. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah sarung tangan, mortar dan pistil, tabung mikro 2 ml, mesin sentrifuse, pipet, QIAshredder spin column ungu, RNeasy mini colomn pink, Automated Thermal cycler (Gene Amp PCR System 9700; PE Applied Biosystem, USA), alat pencetak gel, alat elektroforesis, transluminator ultraviolet, dan kamera digital.
13
Metode Penelitian Penyediaan Sampel Tanaman Tomat Sumber ToCV dan TICV Bahan yang digunakan dalam penelitian ini yaitu sampel daun tomat yang bergejala penyakit klorosis. Sampel tanaman tomat yang positif terinfeksi tunggal oleh Tomato chlorosis virus (ToCV) maupun Tomato infectious chlorosis virus (TICV), dan yang positif terinfeksi ganda oleh TICV dan ToCV diperoleh dari hasil penelitian terdahulu (Fitriasari 2010).
Pengambilan Sampel Tanaman Tomat di Lapangan yang Terserang Virus Beberapa sampel diperoleh dari lapangan untuk menguji penerapan metode RT-PCR terhadap sampel dari lapangan. Pengambilan sampel dilakukan di sentra produksi tomat di beberapa daerah seperti Cianjur, Cipanas, Lembang, dan Garut. Sampel daun yang diambil dari lapangan dideteksi di laboratorium.
Deteksi Diferensial ToCV dan TICV Melalui RT-PCR Untuk dapat membedakan virus ToCV dan TICV yang menginfeksi tanaman tomat, dilakukan deteksi virus melalui metode RT-PCR dan menggunakan primer khusus yang dapat digunakan dalam RT-PCR yang dapat mengamplifikasi virus secara terpisah. Ekstraksi RNA total. RNA total diekstraksi dari jaringan daun tanaman tomat bergejala penyakit klorosis dengan menggunakan Rneasy Plant Mini Kits (Qiagen Inc., Chatsworth, CA., USA). Tahapannya adalah sebanyak 0,1 g sampel daun digerus dengan menggunakan mortar dan pistil steril dengan bantuan nitrogen cair. Hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 ml dan ditambahkan 450 µl buffer RLT yang mengandung 1% merkaptoethanol, kemudian divortex. Sampel diinkubasi pada suhu 56ºC selama 10 menit. Sampel dipipet, lalu dimasukkan ke dalam QIAshredder spin column ungu dan ditempatkan pada tabung koleksi 2 ml, lalu disentrifuse pada kecepatan 13000 rpm selama 2 menit. Supernatan dipipet tanpa menyentuh pelet dalam tabung
14 koleksi, lalu dipindahkan ke dalam tabung mikro 2 ml baru. Kemudian ditambahkan 0,5 vol ethanol 96% (± 225 ml) dan dicampur dengan rata. Sampel dimasukkan (± 650 ml) termasuk endapan yang terbentuk ke dalam RNeasy mini colomn pink, kemudian ditempatkan pada tabung koleksi 2 ml lalu disentrifuse pada kecepatan 10000 rpm selama 15 detik. Cairan yang terdapat pada tabung koleksi dibuang, kemudian ditambahkan 700 ml buffer RW1 ke dalam RNeasy colomn, lalu ditutup dengan baik dan disentrifuse pada kecepatan 10000 rpm selama 15 detik untuk mencuci colomn. RNeasy colomn dipindahkan ke dalam tabung koleksi 2 ml baru, buffer RPE dipipet sebanyak 500 µl lalu dimasukkan ke dalam RNeasy colomn dan ditutup rapat, disentrifuse pada kecepatan 10000 rpm selama 15 detik. Tabung koleksi digunakan kembali, ditambahkan sebanyak 500 µl buffer RPE lalu disentrifuse pada kecepatan 10000 rpm selama 2 menit. Untuk meyakinkan bahwa colomn telah kering, colomn dipindahkan pada tabung koleksi baru, kemudian disentrifuse pada kecepatan 10000 rpm selama 1 menit. Selanjutnya, 40 µl RNAse free water ditambahkan ke dalam RNeasy colomn, didiamkan 10 menit lalu disentrifuse pada kecepatan 10000 rpm selama 1 menit. Siapan RNA total ini digunakan sebagai template dalam reaksi RT-PCR. Sintesis cDNA. RNA hasil ekstraksi selanjutnya ditranskripsi balik menjadi cDNA (complementary DNA) dengan menggunakan teknik Reverse Transcription (RT). Reaksi RT dibuat dengan total volume 10 µl yang mengandung 2 µl RNA total, 1 µl buffer RT 10X, 0,35 µl 50 mM DTT (dithiothreitol), 2 µl 10 mM dNTP (deoksiribonukleotida triphosphat), 0,35 µl M-MuLV Rev, 0,35 µl RNase inhibitor, 0,75 µl oligo (dT), dan 3,2 µl H2O. Komponen-komponen tersebut digunakan untuk satu kali reaksi RT. Reaksi RT dilakukan dalam sebuah Automated Thermal cycler (Gene Amp PCR System 9700; PE Applied Biosystem, USA) yang diprogram untuk satu siklus pada suhu 25ºC selama 5 menit, 42ºC selama 60 menit, dan 70ºC selama 15 menit. Siapan cDNA hasil RT ini, digunakan sebagai DNA template dalam reaksi PCR. Amplifikasi DNA dengan PCR. Amplifikasi DNA virus dilakukan dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR) dengan menggunakan
pasangan
primer yang telah didesain khusus untuk mengamplifikasi virus secara terpisah. Pasangan primer yang spesifik digunakan untuk mendeteksi virus ToCV yaitu
15 ToCV-CF (5’-GTGTCAGGCCATTGTAAACCAAG-3’) dan ToCV-CR (5’CACAAAGCGTTTCTTTTCATAAGCAGG-3’) dengan prediksi ukuran produk 360 bp. Sedangkan pasangan primer yang spesifik digunakan untuk mendeteksi virus TICV yaitu TICV-CF (5’-AATCGGTAGTGACACGAGTAGCATC-3’) dan TICV-CR (5’-CTTCAAACATCCTCCATCTGCC-3’) dengan prediksi ukuran produk 417 bp. Dalam penelitian ini, dilakukan tiga cara untuk mengamplifikasi DNA ToCV, TICV, dan keduanya. Pertama, pasangan primer ToCV digunakan untuk mengamplifikasi DNA ToCV, TICV, dan campuran kedua DNA tersebut. Kedua, digunakan pasangan primer TICV untuk mengamplifikasi DNA ToCV, TICV, dan campuran kedua DNA tersebut. Ketiga, digunakan
pasangan
mengamplifikasi
primer
TICV
dan
ToCV
yang
dicampur
untuk
DNA ToCV, TICV, dan campuran kedua DNA tersebut.
Komponen reagensia yang diperlukan untuk cara 1 dan 2 terlihat pada Tabel 1, sedangkan komponen reagensia untuk cara ketiga terlihat pada Tabel 2. Untuk mendeteksi sampel dari lapangan, PCR dilakukan dengan mencampur kedua primer. Reaksi PCR dengan total volume 25 µl, terdiri atas 1 µl masing-masing primer, 2,5 µl buffer PCR 10X + Mg2+, 0,5 µl 10 mM dNTP, 2,5 µl sucrose cresol 10X, 0,3 µl Taq DNA polymerase, 14,2 µl H2O, dan 1 µl DNA template. Amplifikasi ini dilakukan pada Automated Thermal cycler (Gene Amp PCR System 9700; PE Applied Biosystem, USA). Amplifikasi ini didahului dengan denaturasi awal pada 94ºC selama 4 menit. Kemudian dilanjutkan dengan 30 siklus yang terdiri dari denaturasi pada 94ºC selama 1 menit, penempelan primer (annealing) pada 62ºC selama 1 menit, dan pemanjangan (Extension) pada 72ºC selama 2 menit. Khusus untuk siklus terakhir, ditambahkan 10 menit pada 72ºC untuk tahapan sintesis, dan siklus berakhir pada suhu 4ºC. Setelah dilakukan PCR, maka hasil yang diperoleh dapat dielektroforesis. PCR dilakukan berkali-kali untuk melihat validasi pasangan primer ToCV, pasangan primer TICV, dan pasangan primer keduanya.
16
Tabel 1 Reagensia PCR dan konsentrasi yang diperlukan untuk validasi pasangan primer ToCV dan TICV yang digunakan secara terpisah terhadap 3 template cDNA yang berbeda ToCV Reagensia H2O
1
Vol. per reaksi (µl)1 14,2
TICV
42,6
Vol. per reaksi (µl) 14,2
Konsentrasi (µl) 2
42,6
Buffer PCR 10X + Mg2+
2,5
7,5
2,5
7,5
dNTP mix (10 mM)
0,5
1,5
0,5
1,5
Socrose cresol 10x
2,5
7,5
2,5
7,5
Taq DNA polymerase
0,3
0,9
0,3
0,9
Primer ToCV-CF
1
3
-
-
Primer ToCV-CR
1
3
-
-
Primer TICV-CF
-
-
1
3
Primer TICV-CR
-
-
1
3
cDNA (infeksi ToCV)
1
3
1
3
cDNA (infekti TICV)
1
3
1
3
cDNA (infeksi ganda)
1
3
1
3
Volume total yang diperlukan sebanyak 25 µl untuk 1X reaksi. Volume total yang diperlukan sebanyak 75 µl untuk 3X reaksi.
2
Konsentrasi (µl)
17
Tabel 2 Reagensia PCR dan total konsentrasi yang diperlukan untuk validasi pasangan primer ToCV dan TICV yang digunakan secara bersamaan1 Vol. per reaksi (µl) 12,2
Konsentrasi (µl) 2 36,6
Buffer PCR 10X + Mg2+
2,5
7,5
dNTP mix (10 mM)
0,5
1,5
Socrose cresol 10x
2,5
7,5
Taq DNA polymerase
0,3
0,9
Primer ToCV-CF
1
3
Primer ToCV-CR
1
3
Primer TICV-CF
1
3
Primer TICV-CR
1
3
cDNA (infeksi ToCV)
1
3
cDNA (infekti TICV)
1
3
cDNA (infeksi ganda)
1
3
Reagensia H2O
1
Pasangan primer ToCV dan pasangan primer TICV dicampur dalam 1 tube PCR. Volume total yang diperlukan sebanyak 75 µl untuk 3X reaksi.
2
Elektroforesis. Pembuatan gel agarose dilakukan dengan konsentrasi 1%. Agarose sebanyak 3 gr dimasukkan ke dalam tabung Erlenmeyer 100 ml, lalu ditambahkan 30 ml buffer Tris-Acetat EDTA (TAE) 0,5x (0,045 M Tris-Acetat, 0,01 M EDTA). Kemudian campuran dipanaskan dalam microwave sampai agarose larut. Larutan agar didinginkan hingga suhu 60ºC selama kurang lebih 15 menit, lalu ditambahkan 1,5 µl ethidium bromida kemudian diaduk. Sebelumnya, pencetak gel disiapkan terlebih dahulu dan sisir gel diletakkan di bagian atas pencetak gel. Selanjutnya, larutan gel agarose dituang ke dalam cetakan. Gel didiamkan sampai mengeras (30-45 menit). Setelah mengeras, gel diambil dan diletakkan ke dalam bak elektroforesis yang berisi buffer TAE 0,5 kali. Sebanyak 7 µl DNA hasil PCR dimasukkan ke dalam sumur gel elektroforesis dan pada sumuran gel elektroforesis yang berada di posisi sebelah kiri dimasukkan 10 µl 100 bp DNA ladder. Elektroforesis dilakukan dengan tegangan 50 volt selama 60 menit. Hasil elektroforesis divisualisasikan dengan transluminator ultraviolet. Pita DNA yang terbentuk pada hasil elektroforesis tersebut dipotret dengan menggunakan kamera digital.
