21
METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan selama 6 bulan, mulai Maret sampai dengan Agustus 2010 di laboratorium Mikrobiologi Medis, laboratorium Terpadu unit pelayanan mikrobiologi terpadu Bagian Mikrobiologi Medik, dan Laboratorium Imunologi bagian Mikrobiologi Medik Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, serta kandang ayam Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilakukan dalam lima tahap, yaitu tahap kultur bakteri murni untuk dibuat antigen, tahap penyuntikan antigen, tahap ekstraksi IgY dari kuning telur dengan teknik pemisahan sederhana, tahap uji keberadaan antibodi spesifik pada kuning telur segar, dan tahap uji keberadaan antibodi spesifik pada telur yang diberi perlakuan pemanasan bertingkat. Pengujian keberadaan antibodi dilakukan dengan teknik imunodifusi (AGPT) dan Haemaglutinasi Inhibisi (HI).
Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah 25 ekor ayam betina petelur tipe Isa Brown umur 20 minggu yang siap bertelur, isolat bakteri Escherichia coli strain EPEC dan Salmonella Enteritidis dari Laboratorium Bakteriologi FKH IPB, koleksi telur positif mengandung antibodi anti diare dan anti flu burung, vaksin AI (killed vaccine), media cair Brain Heart Infusion (BHI Broth), NaCl fisiologis, Blood Agar, aquadestilata, miliQ, NaOH 1 N, HCl 0,2 N, agarose, PBS, Freund Adjuvant Complete dan Incomplete, RBC 1%, virus (AI) standar 4 HAU, alkohol teknis 70%, dan pakan ayam komersial produksi PT. Gold Coin 105 untuk layer. Alat yang digunakan adalah sentrifuse Sorvall T21, vortex, cawan petri, tabung reaksi, gelas objek, tisu, tusuk gigi, kapas, ose, api bunsen, korek/ pemantik api, gelas ukur, water bath, microwave, termometer, timer, spoit, disposable syringe, tip mikropipet 1 ml dan 100 mikroliter, pipet, mikropipet, kertas saring, plastik, microtube 1,5 ml, puncher, inkubator, kompor gas/penangas
22
air, refrigerator, freezer, kandang baterai, tempat pakan dan tempat minum hewan percobaan.
Metode Penelitian 1. Tahap Kultur Biakan Antigen Murni Untuk Dijadikan Vaksin Inaktif Antigen yang digunakan untuk disuntikan ke tubuh ayam adalah bakteri Escherichia coli dan Salmonella Enteritidis yang telah dibiakkan/ditumbuhkan di media agar (Blood Agar), kemudian diinkubasi selama 24 jam. Isolat bakteri ini selanjutnya dibiakan di BHI Broth sebanyak 50 ml dan diinkubasi selama 24 jam. Bakteri yang telah dibiakan di BHI Broth tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm pada suhu 19°C selama 15 menit, kemudian supernatan dibuang dan pelet dicuci sebanyak 3 kali dengan larutan NaCl fisiologis sebanyak volume supernatan yang dibuang. Larutan pelet disentrifugasi kembali selama 15 menit dengan kecepatan 5000 rpm. Pelet ditampung dan ditambahkan NaCl fisiologis, kemudian pada tabung yang berbeda sebanyak 20 ml NaCl fisiologis dihomogenkan dengan campuran pelet tadi dan distandarkan dengan standar McFarland II. Standar Mcfarland II merupakan penyetaraan kandungan bakteri dalam media cair pertumbuhan yang mengandung saline menggunakan pendekatan densitas spektrofotometri yaitu 6x108 CFU/ml (Anonim(2)
2009).
Tahapan selanjutnya homogenat
tersebut ditangas dalam penangas air (water bath) pada suhu 60°C selama 2 jam untuk menginaktifkan antigen. Penambahan adjuvant dilakukan dengan mencampurkan homogenat antigen dengan Freund Adjuvant Complete atau Incomplete dengan perbandingan 1:1, kemudian dihomogenkan.
2. Tahap Penyuntikan Antigen Ayam yang disuntik dengan antigen sebanyak 22 ekor, sedangkan 3 ekor tidak diberi perlakuan/kontrol negatif. Penyuntikan antigen bakteri dilakukan sebanyak 4 kali dengan interval 1 minggu. Pada minggu pertama, untuk antigen bakteri (Escherichia coli dan Salmonella Enteritidis) tidak menggunakan adjuvant. Antigen tersebut disuntikkan secara intravena sebanyak 0,5 ml per ekor. Minggu kedua, penyuntikan antigen tersebut
23
dicampur dengan Freund Adjuvant Complete, sedangkan minggu ketiga dan keempat menggunakan Freund Adjuvant Incomplete diberikan sebanyak 1 ml per ekor secara subkutan. Vaksin AI inaktif diberikan pada minggu pertama dan minggu keempat sebanyak 1 ml per ekor secara subkutan.
3. Tahap Pengenceran Sederhana/Segar Kuning Telur Pasca penyuntikan antigen telur yang dihasilkan selanjutnya dikoleksi. Dilakukan pengujian setiap minggu pada kuning telur dengan pengenceran sederhana/segar untuk mengetahui keberadaan antibodi spesifik (Manggung 2010). Kuning telur dipisahkan dari putih telur, kemudian diletakkan diatas kertas saring agar putih telur tidak ikut terbawa bersama kuning telur. Sebanyak 0,5 ml kuning telur ditampung dalam microtube yang berisi 1 bagian PBS atau sekitar 0,5 ml. Campuran dalam microtube tersebut dihomogenkan dengan alat vortex. Suspensi yang telah homogen dapat digunakan untuk uji (Poetri 2006).
4. Tahap Perlakuan dengan Pemanasan Bertingkat pada Telur yang Sebelumnya telah diketahui Positif Mengandung Antibodi Spesifik Penelitian ini menggunakan telur yang telah dikoleksi dan mengandung antibodi anti diare (Escherichia coli dan Salmonella Enteritidis) dan anti flu burung (H5N1) (Manggung 2010). Digunakan 10 butir sampel telur hasil koleksi dari induk ayam yang berbeda pada tanggal produksi yang sama. Selanjutnya ke-10 telur dibagi dalam 5 kelompok (lima suhu pemanasan yang berbeda), masing-masing kelompok terdiri dari 2 butir telur. Dilakukan pemanasan atau perebusan telur menggunakan water bath selama 5 menit. Pemanasan/perebusan telur menggunakan lima suhu berbeda dengan rentang 10oC dimulai dari suhu 60oC, 70oC, 80oC, 90oC, dan 100oC. Derajat pemanasan dan waktu yang digunakan merupakan suhu dan waktu eksploratif yang mendekati metode pemanasan/perebusan telur setengah matang hingga matang yang umum dilakukan di masyarakat. Selanjutnya telur yang sudah direbus masing-masing diberi label sesuai dengan derajat pemanasannya. Tahap selanjutnya telur dipisahkan antara putih telur dengan kuning telurnya.
24
Dilakukan pengenceran kuning telur menggunakan PBS dengan perbandingan 1 bagian kuning telur dengan 2 bagian pengencer, selanjutnya kuning telur yang telah diencerkan disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit, supernatan digunakan untuk menguji keberadaan antibodi spesifik dengan metode AGPT dan HI (Soejoedono et al. 2005).
5. Tahap Uji Keberadaan Antibodi Spesifik dengan AGPT dan Uji HI 5.1. Teknik Imunodifusi Agar Gel Precipitation Test (AGPT) Agar gel dibuat dengan melarutkan 0,5 gram agarose dalam 25 ml miliQ dan 25 ml PBS pH 7,2. Ditambahkan Na Acid sebagai bahan anti jamur sebanyak 0,001 gram/ml. Larutan ini dipanaskan dengan penangas air sampai larut dan warna larutan menjadi bening. Sebanyak 4 ml agar gel tersebut dituangkan pada gelas objek menggunakan pipet dan ditunggu hingga mengeras. Setelah agar gel mengeras, dibuat sumur-sumur dengan puncher. Sebanyak 25 µl antigen (Escherichia coli atau Salmonella Enteritidis) dimasukkan ke dalam sumur tengah dan pada sumur sekelilingnya dimasukan 25 µl kuning telur yang telah diberi perlakuan pemanasan. Gelas obyek diletakan di atas tisu basah agar terjaga kelembabannya, dan disimpan dalam wadah tertutup untuk mencegah terjadinya kontaminasi. Reaksi dibaca setelah 18–48 jam dan reaksi positif ditunjukan dengan adanya garis presipitasi (garis buram putih) pada daerah antara sumur antigen dengan sumur kuning telur segar. Ini menandakan bahwa antigen dan antibodi tersebut homolog. Uji AGPT ini digunakan untuk mendeteksi antibodi terhadap antigen bakteri Escherichia coli dan Salmonella Enteritidis. Antigen yang digunakan adalah isolat bakteri (Escherichia coli dan Salmonella Enteritidis) yang ditumbuhkan dalam 50 ml media BHI Broth yang diinkubasi pada suhu 37°C selama 18–24 jam. Kemudian masing-masing isolat disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 15 menit. Supernatan dibuang dan pelet dicuci dengan 5 ml NaCl fisiologis, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama
25
15 menit. Pencucian dengan NaCl fisiologis dilakukan sebanyak 3 kali. Setelah proses pencucian selanjutnya pelet ditambah dengan 0,5 ml HCl 0,2 N dan satu tetes phenol red ditambahkan sebagai indikator kemudian ditangas pada suhu 52°C selama 2 jam. Selanjutnya ditambahkan NaOH 1N sampai warna berubah menjadi merah, lalu disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang dihasilkan digunakan sebagai antigen terlarut dan disimpan pada suhu 4°C (Pasaribu & Wibawan 1993).
5.2. Pengujian terhadap antibodi H5N1 5.2.1. Pembuatan larutan sel darah merah 1% Darah yang digunakan adalah darah ayam bebas avian influenza, yaitu ayam yang tidak pernah terpapar virus avian influenza dan divaksinasi
dengan
vaksin
H5N1.
Darah
diambil
dengan
menggunakan syringe kemudian dicampur dengan antikoagulan Na sitrat 3,8% dengan perbandingan 4:1. Darah yang telah siap disentrifugasi dengan kecepatan 2000 rpm selama 10 menit setelah itu supernatan dibuang. Kemudian ditambahkan NaCl fisiologis dengan volume yang sama seperti supernatan yang dibuang. Proses ini diulang sebanyak 3 kali pencucian. Hasil yang didapat dari 3 kali pencucian adalah sel darah merah 100%. Untuk pengenceran sel darah merah 100% menjadi 1% dilakukan dengan 3 kali pengenceran. Pengenceran pertama untuk membuat stok sel darah merah 50% dengan mencampur 1 bagian sel darah merah 100% dengan 1 bagian NaCl fisiologis. Pengenceran kedua untuk membuat stok sel darah merah 5% dengan mencampur 1 bagian sel darah merah 50% dengan 9 bagian NaCl fisiologis. Pengenceran ketiga untuk mendapatkan sel darah merah 1% dengan mencampur 1 bagian sel darah merah 5% dengan 4 bagian NaCl fisiologis. Larutan ini disimpan pada suhu 4°C apabila belum digunakan (CVI 2010).
26
5.2.2.Penyiapan virus standar 4 HAU Dilakukan uji hemaglutinasi (HA) untuk mengetahui titer stok virus H5N1 yang tersedia. Untuk mengetahui ketepatan dari antigen 4 HAU yang akan dipergunakan dilakukan uji back titrasi. Pengujian dilakukan menggunkan V bottom microplate yang diisi dengan 25 µl PBS 1x pada kolom 2–12 dimulai dari baris A–F. Selanjutnya dimasukkan sampel virus H5N1 pada sumur A1–E1 dan sumur A2– E2. Kemudian pada sumur B2 dimasukkan PBS sebanyak 25 µl, sumur C2 ditambahkan PBS 75 µl, sumur D2 ditambahkan PBS 125 µl, sumur E2 ditambahkan PBS sebanyak 175 µl, kemudian pada masing-masing sumur dihomogenkan dengan cara disedot dan dibuang menggunakan mikropipet sebanyak 10 kali. Selanjutnya dilakukan pengenceran bertingkat dengan cara mengambil 25µl cairan dari kolom A2–E2
ke kolom A3–E3 dan dihomogenkan
dengan cara menyedot cairan naik dan turun menggunakan pipet sebanyak 5 kali. Langkah ini di ulangi sampai ke kolom A12–E12 dan cairan terakhir dibuang sebanyak 25 µl. Ditambahkan kembali 25 µl PBS pada setiap sumur, dilanjutkan dengan memasukkan RBC 1% sebanyak 25 µl. kemudian plate dihomogenkan selama 10 menit, lalu plate di inkubasi selama 60 menit pada suhu 4°C (CVI 2010).
5.2.3.Uji Hemaglutinasi Inhibisi (HI) Pengujian HI ini menggunakan V bottom microplate. Sumur nomor 1–10 diisikan 25 µl larutan PBS 1x menggunakan mikropipet. Sumur kolom A diisi sampel kuning telur sebanyak 25 µl kemudian dihomogenkan dengan mikropipet. Selanjutnya 25 µl dari sumur kolom A diambil dan dipindahkan ke dalam sumur kolom B, ini merupakan proses pengenceran bertingkat. Pengenceran tersebut dilanjutkan ke sumur C hingga sumur kolom H dan dari sumur kolom H ini suspensi dibuang sebanyak 25 µl. Sumur nomor 1–10 diisikan suspensi antigen/virus AI standar 4 HAU sebanyak 25 µl, kemudian diinkubasikan selama 60 menit pada suhu 4°C dengan
27
tujuan memberi kesempatan antigen dapat bereaksi dengan antibodi yang terdapat dalam kuning telur. Tahap selanjutnya semua sumur nomor 1–10 di mulai dari kolom A–H ditambahkan 25 µl suspensi RBC 1%, lalu dihomogenkan dengan cara digoyang-goyangkan atau dapat menggunakan plate shaker. Plate diinkubasikan kembali pada suhu 4°C selama 60 menit (CVI 2010). Uji HI digunakan untuk deteksi antibodi H5N1. Interpretasi hasil titer HI ditunjukkan pada pengenceran tertinggi yang masih memberikan hambatan (inhibisi) pada antigen 4 HAU. Inhibisi ditetapkan dengan melakukan pengamatan pengamatan sel darah merah pada sumur-sumur cawan mikro, hasil positif jika sel darah merah mengendap serupa dengan sel darah merah kontrol. Inhibisi dapat pula ditetapkan dengan melakukan pengamatan sel darah merah pada lubang-lubang cawan mikro, bila cawan mikro dimiringkan terlihat sel darah merah membentuk tetesan air mata serupa dengan sel darah merah kontrol (Indriani et al. 2004).
