16
BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan Mei sampai Agustus 2012 di Laboratorium Kesehatan Masyarakat Veteriner, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Alat dan Bahan Alat yang digunakan adalah tabung reaksi dan rak, cawan Petri, pipet volumetrik 0.1 dan 1ml, pinset, gelas ukur, bunsen, Vortex, kertas cakram dengan diameter 6 mm, dan inkubator. Bahan yang digunakan adalah Buffered Peptone Water (Pronadisa Cat. 1402.00) 0.1%, Plate Count Agar (Acumedia 7157A), Saboroud Dextrose Agar (Himedia M063-500G), Nutrien Agar (Oxoid CM0003), Nutrien Broth (Pronadisa Cat.1216.00), akuades steril, dan alkohol 70%. Bakteri uji yang digunakan adalah S. aureus American Type Culture Collection (ATCC) 25923 yang mewakili bakteri Gram positif, sedangkan E. coli ATCC 25922 yang mewakili bakteri Gram negatif.
Metode Penelitian Sampel Sampel yang diuji adalah dua jenis disinfektan komersial dari produsen yang berbeda. Sampel dibagi menjadi 4 kelompok berdasarkan perbedaan konsentrasi, yaitu: A1 =
Disinfektan
dengan
bahan
aktif
2-aminoetanol
1-5%,
C12-15
alkoholetoksilat 1-5%, alkil dimetil benzil amonium klorida 1-5%, 1,3 propanediamin, dan 2,2’ oksibisetanol dengan konsentrasi 0.4% A2 =
Disinfektan
dengan
bahan
aktif
2-aminoetanol
1-5%,
C12-15
alkoholetoksilat 1-5%, alkil dimetil benzil amonium klorida 1-5%, 1,3 propanediamin, dan 2,2’ oksibisetanol dengan konsentrasi 0.8%
17
B1 =
Disinfektan dengan bahan aktif 5-15% surfaktan non-ionik dan <5% surfaktan amfoterik dengan konsentrasi 1:80
B2 =
Disinfektan dengan bahan aktif 5-15% surfaktan non-ionik dan <5% surfaktan amfoterik dengan konsentrasi 1:60
C=
Kontrol atau air
Sampel kedua berupa botol pengemas yang telah didisinfeksi oleh produsen yogurt menggunakan dua jenis disinfektan dengan perbedaan cara pemakaian (bilas dan spray).
Kerangka Penelitian Bahan Aktif
Konsentrasi
Pengujian Daya Hambat
A
1
Aplikasi Daya Hambat 2
Disinfektan
Waktu Kontak
Waktu Kontak Aplikasi
B
Pengujian Daya Kerja Disinfektan Daya Bunuh Disinfektan terhadap Pertumbuhan Bakteri Pengujian untuk mengetahui daya bunuh disinfektan terhadap pertumbuhan bakteri dilakukan menggunakan metode kertas cakram (Fardiaz dan Jenie 1989). Nutrien agar (7 ml) dalam tabung-tabung reaksi dicairkan dalam penangas air dan didinginkan hingga suhu 50 °C. Media agar tersebut diinokulasi dengan satu ose
18
kultur cair S. aureus (Gram positif) atau E. coli (Gram negatif) kemudian dituang ke dalam cawan Petri steril lalu dibiarkan hingga media memadat. Dua kertas cakram dimasukkan ke dalam disinfektan menggunakan pipet steril dan ditiriskan. Cakram diletakkan di atas media agar yang mengandung mikroorganisme, kemudian diinkubasi pada suhu 37 °C selama 24 jam. Pengamatan dilakukan dengan mengukur diameter zona hambat yang terbentuk di sekeliling kertas cakram. Diameter zona hambat diukur dari tepi kertas hingga tepi pertumbuhan dan dilakukan dari bagian bawah media agar, bukan dari permukaan media.
Nutrien Agar (50 °C)
Inokulasi bakteri (1 ose bakteri Gram negatif atau Gram positif)
Tuang ke dalam cawan Petri (biarkan memadat)
Rendam kertas cakram ke dalam disinfektan (tiriskan)
Letakkan kertas cakram di atas media
Pengamatan (mengukur diameter zona bening)
Inkubasi 37 °C selama 24 jam
Gambar 1 Prosedur kerja daya bunuh disinfektan dengan metode kertas cakram.
Lama Waktu Kontak Disinfektan Pengujian untuk mengetahui lama waktu kontak disinfektan dapat dilakukan dengan menggunakan uji pengenceran siap pakai (Fardiaz dan Jenie 1989). Kultur
19
S. aureus (Gram positif) dalam nutrien broth dituang ke dalam tabung berisi sejumlah batang-batang gelas steril. Kultur E. coli (Gram negatif) berumur 48 jam dimasukkan ke dalam tabung yang berisi sejumlah batang-batang gelas steril. Kultur bakteri dalam tabung kemudian dibuang dan batang-batang gelas steril diletakkan dalam cawan Petri yang terpisah dan dibiarkan mengering. Satu batang gelas dimasukkan ke dalam tabung berisi disinfektan menggunakan pinset steril. Batang gelas dibiarkan dalam tabung disinfektan selama waktu kontak 1, 5, 10, 30, dan 60 menit. Setiap tabung diberi label waktu kontak sesuai dengan disinfektan yang digunakan agar tercatat dengan baik. Larutan disinfektan dibuang pada akhir waktu kontak dengan membakar mulut tabung kemudian dengan hati-hati disinfektan dituang ke dalam sink (bak pencuci) tanpa membuang batang gelas. Batang gelas dimasukkan ke dalam tabung berisi akuades steril selama satu menit lalu dimasukkan ke dalam nutrien broth dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 °C. Pengamatan hasil uji dilakukan dengan melihat pertumbuhan bakteri pada nutrien broth. Interpretasi hasil: + = Keruh, adanya pertumbuhan - = Jernih, tidak adanya pertumbuhan
Uji Keberhasilan Disinfeksi pada Botol Pengemas Keberhasilan disinfeksi pada botol pengemas diuji dengan metode bilas (Fardiaz dan Jenie 1989). Larutan BPW 0.1% sebanyak 20 ml dimasukkan ke dalam botol yang telah didisinfeksi, ditutup rapat, dihomogenkan 10-12 kali, dan botol diputar-putar secara horizontal sebanyak 25 kali. Sebanyak 1.0 ml dan 0.1 ml suspensi tersebut dimasukkan ke dalam cawan Petri kemudian media PCA atau media SDA dituangkan dan dibiarkan memadat. Hasil yang diamati dari uji ini adalah: 1. Jumlah kapang dan khamir, yaitu jumlah koloni yang tumbuh pada media SDA. 2. Jumlah total mikroorganisme, yaitu jumlah koloni yang tumbuh pada media PCA.
20
Jumlah koloni yang tumbuh pada kedua medium tersebut dihitung dan dinyatakan dalam jumlah koloni per wadah botol dengan perhitungan sebagai berikut: Jumlah koloni per wadah botol = Jumlah koloni dalam 1 ml × 20 ml Atau = Jumlah koloni dalam 0.1 ml×10×20 ml
Analisa data Data yang diperoleh dari penelitian ini dianalisis menggunakan program SPSS 16.0 untuk hasil pengujian daya bunuh disinfektan terhadap pertumbuhan bakteri dan secara deskriptif untuk hasil lainnya. Pada program SPSS, uji komparatif yang digunakan adalah uji ANOVA. Uji ini digunakan untuk melihat hubungan komparatif variabel numerik yang berdistribusi normal dan lebih dari dua kelompok.
