BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan mulai bulan Januari 2009 sampai dengan bulan Agustus 2009 di Laboratorium Bioteknologi Tanaman, Departemen Agronomi dan Hortikultura, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Perlakuan radiasi sinar gamma dilakukan di Pusat Aplikasi Teknologi Isotop dan Radiasi (PATIR), Badan Tenaga Atom Nasional (BATAN), Pasar Jumat, Jakarta Selatan. Pengamatan stomata dilakukan di Laboratorium Biologi Tumbuhan, Pusat Studi Ilmu Hayati, Institut Pertanian Bogor.
Bahan dan Alat Bahan tanaman yang digunakan adalah tunas steril tanaman Anthurium Wave of Love yang berumur 14 minggu yang dikulturkan secara in vitro pada media padat dengan pH 5.9. Bahan tanaman yang digunakan sebelumnya berasal dari planlet steril Anthurium Wave of Love. Pada setiap botol kultur terdapat banyak tunas dan di bagian pangkal tunas terbentuk bonggol. Subkultur dilakukan dengan cara memisahkan bonggol tunas dengan ukuran diameter 1 - 2 cm. Media in vitro dibedakan menjadi dua, yaitu media untuk perbanyakan tunas sebelum radiasi dan media untuk subkultur. Komposisi media yang digunakan untuk perbanyakan in vitro tunas Anthurium Wave of Love sebelum radiasi adalah MS + 1 mg/l BAP + 0.1 mg/l IBA + 30 g/l gula + 5 g/l agar, pH 5.9. Komposisi media yang digunakan untuk subkultur setelah perlakuan radiasi adalah MS + 2 mg/l BAP + 0.5 mg/l NAA + 30 g/l gula + 5 g/l agar, pH 5.9. Komposisi media dasar Murashige dan Skoog (MS) disajikan pada Lampiran 1. Bahan lain yang digunakan adalah aquadest, plastik, plastik wrap, karet, tissue, alkohol 70%, clorox, dan spiritus. Bahan untuk pengamatan stomata meliputi kuteks bening dan selotip. Peralatan yang digunakan untuk pembuatan dan sterilisasi media adalah botol kultur volume 300 ml, labu takar volume 1 liter, pipet volumetrik, pengaduk kaca, pH meter, timbangan analitik, magnetic stirrer, dan autoclave. Peralatan yang digunakan saat penanaman atau subkultur meliputi laminar air flow cabinet,
cawan petri, pinset, gunting, scalpel, dan lampu bunsen. Radiasi sinar gamma dengan
60
Co dilakukan di dalam radiator gamma chamber 4000A. Objek gelas
dan mikroskop digunakan untuk pengamatan stomata.
Metode Penelitian Penelitian disusun menggunakan Rancangan Kelompok Lengkap Teracak (RKLT) dengan satu faktor. Faktor yang digunakan adalah dosis radiasi sinar gamma yang terdiri dari 6 taraf, yaitu: 0 Gy (D0), 10 Gy (D1), 20 Gy (D2), 30 Gy (D3), 40 Gy (D4), dan 50 Gy (D5), masing-masing taraf perlakuan diulang tiga kali sehingga ada 18 satuan percobaan. Setiap satuan percobaan terdiri dari 10 tunas sebagai unit terkecil yang diamati. Jumlah seluruh tunas dalam percobaan ini adalah 180 tunas. Model linear yang digunakan adalah : Yij = µ + αi + βj + εij Keterangan : Yij
= nilai perlakuan dosis radiasi ke-i dan kelompok ke-j
µ
= nilai rataan umum pengamatan
αi
= pengaruh perlakuan dosis sinar gamma ke-i (i= 0 Gy, 10 Gy, ....50 Gy)
βj
= pengaruh kelompok ke-j (j = 1, 2, dan 3)
εij
= galat percobaan Data pengamatan dianalisis dengan sidik ragam pada taraf nyata 5 %.
Pengolahan data dilakukan menggunakan software microsoft office excel 2007 dan software SAS 6.12.
Pelaksanaan Penelitian 1. Sterilisasi peralatan Botol kultur, cawan petri, pinset, gunting, dan scalpel dicuci bersih, kemudian disterilkan di dalam autoclave pada suhu 1210 C dan tekanan 17.5 psi selama 60 menit. Alat tanam dan cawan petri yang sudah disterilkan dimasukkan ke dalam oven pada suhu 100 0C.
2. Pembuatan media Komposisi media yang digunakan untuk perbanyakan tunas sebelum radiasi adalah MS + 1 mg/l BAP + 0.1 mg/l IBA + 30 g/l gula + 5 g/l agar, pH 5.9. Media dibuat dengan menggunakan larutan stok yang telah disiapkan. Komposisi masing-masing larutan stok untuk membuat media dasar Murashige dan Skoog disajikan pada Lampiran 1. Larutan stok adalah larutan yang konsentrasinya sudah dipekatkan sehingga untuk pembuatan media hanya diperlukan dalam volume yang kecil. Semua larutan stok yang diperlukan dipipet, kemudian ditambahkan zat pengatur tumbuh dan gula, setelah itu dilarutkan dengan aquadest. Larutan dimasukkan ke dalam labu takar dan ditambahkan air steril hingga mencapai volume 1 liter. Derajat keasaman larutan diukur dengan menggunakan pH meter. Larutan dibuat menjadi pH 5.9. Apabila pH lebih tinggi dari yang diharapkan, maka diturunkan dengan penambahan larutan HCl 1 N dan sebaliknya apabila pH lebih rendah dinaikkan dengan penambahan NaOH atau KOH 1 N. Agar sebanyak 5 g/l ditambahkan ke dalam media sebagai bahan pemadat. Media dimasak sampai mendidih, selanjutnya media dimasukkan ke dalam botol kultur dengan volume 25 ml/botol dan ditutup dengan plastik. Media selanjutnya disterilkan di dalam autoclave pada suhu 1210C dan tekanan 17.5 psi selama 20 menit. 3. Perbanyakan tunas Tunas yang diradiasi berasal dari kultur in vitro tanaman Anthurium Wave of Love. Subkultur dilakukan dengan memisah-misahkan bonggol tunas dengan diameter 1 - 2 cm. Subkultur dilakukan di dalam laminar air flow cabinet yang telah disemprot dengan alkohol 70% dan disinari dengan sinar UV selama satu jam. Semua alat yang digunakan disterilkan dengan cara disemprot dengan alkohol sebelum dimasukkan ke dalam laminar. Pisau, pinset dan gunting yang diperlukan dalam proses penanaman eksplan harus dicelupkan terlebih dahulu ke dalam alkohol 70% dan dibakar. Perbanyakan tunas Anthurium Wave of Love dilakukan selama 14 minggu pada media MS + 1 mg/l BAP + 0.1 mg/l IBA + 30 g/l gula + 5 g/l agar, pH 5.9. Perbanyakan tunas bertujuan agar tersedia tunas yang cukup untuk perlakuan dan agar tunas yang diperoleh memiliki kandungan zat pengatur tumbuh endogen
homogen sehingga kondisi tanaman sebelum diberi perlakuan diasumsikan seragam. 4. Radiasi sinar gamma Unsur Cobalt isotop 60 (60Co) digunakan sebagai sumber radiasi sinar gamma. Botol kultur dimasukkan ke dalam radiator gamma chamber 4000A. Dosis radiasi sinar gamma yang diberikan disesuaikan dengan taraf perlakuan. 5. Penanaman eksplan setelah radiasi Tunas yang telah diradiasi ditanam kembali selama tiga hari setelah perlakuan karena media yang terkena radiasi bersifat toksik bagi tanaman. Penanaman hari pertama merupakan ulangan I, hari kedua adalah ulangan II, dan hari ketiga merupakan ulangan III. Tunas yang ditanam merupakan tunas tunggal, pada setiap botol ditanam dua tunas. Komposisi media yang digunakan setelah radiasi adalah MS + 2 mg/l BAP + 0.5 mg/l NAA + 30 g/l gula + 5 g/l agar, pH 5.9. 6.
Subkultur I dan II Subkultur dibedakan menjadi 2 bagian, yaitu subkultur I dan subkultur II.
Subkultur II dilakukan 8 minggu setelah subkultur I. Subkultur dilakukan dengan cara memisahkan tunas yang terbentuk menjadi tunas tunggal dan ditanam pada media MS + 2 mg/l BAP + 0.5 mg/l NAA + 30 g/l gula + 5 g/l agar, pH 5.9. Subkultur bertujuan untuk memisahkan kimera yang terbentuk pada tunas yang diradiasi dan untuk mengamati kestabilan mutan yang terbentuk. Subkultur dilakukan di dalam laminar air flow cabinet. 7.
Pengamatan Stomata Pengamatan stomata dilakukan di akhir pengamatan, yaitu pada 16 minggu
setelah radiasi (MSR). Stomata diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali. Luas bidang pandang mikroskop pada perbesaran 400 kali adalah 0.28 mm2. Penghitungan jumlah stomata dilakukan pada satu bidang pandang di dalam satu preparat. Rata-rata jumlah stomata setiap perlakuan merupakan hasil rata-rata jumlah stomata/bidang pandang dari 9 daun, kemudian hasilnya dikonversi menjadi jumlah stomata/mm2. Ukuran stomata diukur berdasarkan panjang stomata. Setiap preparat daun Anthurium Wave of Love
diukur tiga stomata. Ukuran stomata setiap perlakuan merupakan hasil rata-rata dari 27 stomata yang dipilih secara acak.
8.
Kondisi Ruang Kultur untuk Inkubasi Kultur in vitro Anthurium Wave of Love diinkubasi di ruang kultur. Botol
kultur disusun pada rak bertingkat dengan intensitas cahaya 1000-2000 lux selama 24 jam sehari. Suhu ruangan kultur untuk inkubasi adalah 230C.
Pengamatan Peubah yang diamati setiap minggu selama 16 minggu meliputi : Tinggi tunas, diukur mulai dari pangkal batang sampai daun yang paling atas Jumlah daun, diamati daun yang telah membuka Jumlah akar, diamati akar yang berukuran ≥ 0.5 cm Saat munculnya tunas baru Jumlah tunas baru, diamati tunas yang tingginya ≥ 0.5 cm Warna daun Bentuk daun
Peubah yang diamati saat minggu ke 16 adalah: LD50, dihitung berdasarkan jumlah eksplan yang hidup setelah diberi perlakuan Bentuk, ukuran, dan jumlah stomata, diamati secara mikroskopik dengan perbesaran 400 kali Persentase mutan Persentase mutan =
jumlah tanaman mutan pada dosis A jumlah tanaman yang diradiasi
x 100%
Pengamatan tunas dilakukan dengan ketentuan sebagai berikut : Jumlah tunas awal Tunas awal adalah jumlah tunas yang ditanam pada awal subkultur I dan awal subkultur II. Jumlah tunas setiap satuan percobaan pada awal subkultur 1 adalah sama, yaitu 10 tunas. Jumlah tunas pada awal subkultur II tidak sama untuk setiap satuan percobaan karena ditentukan oleh hasil perbanyakan
subkultur I. Semua tunas hasil pemeliharaan subkultur I setelah 8 MSR dipindahkan ke media baru dan diamati pada pemeliharaan setelah subkultur II sampai 16 MSR. Tunas terkontaminasi Kontaminasi tunas disebabkan oleh cendawan dan bakteri. Ada dua kemungkinan terhadap tunas yang terkontaminasi. Pertama, kontaminasi tunas yang masih bisa diselamatkan atau disterilkan, artinya kontaminan yang tidak mengenai seluruh bonggol Anthurium Wave of Love in vitro. Pada tunas tersebut dilakukan sterilisasi dengan menggunakan clorox 5% dan diinkubasi kembali di ruang kultur. Kedua, tunas yang tidak bisa diselamatkan atau disterilkan karena kontaminan sudah menutupi eksplan tunas Anthurium Wave of Love in vitro. Tunas yang tidak bisa disterilkan dinyatakan sebagai data hilang dan tidak diamati pada minggu-minggu berikutnya. Terhadap tunas terkontaminasi yang dilakukan sterilisasi juga terdapat dua kemungkinan. Pertama, tunas menjadi steril kembali dan kemungkinan lainnya adalah tunas menjadi mati karena tidak tahan terhadap bahan sterilan. Tunas yang mati karena bahan sterilan dicirikan dengan warna bonggol atau tangkai daun tunas menjadi putih. Tunas yang mati karena bahan sterilan dinyatakan sebagai data hilang dan tidak diamati pada minggu-minggu berikutnya. Tunas yang mati karena pengaruh radiasi sinar gamma Tunas yang dinyatakan mati karena pengaruh radiasi sinar gamma adalah tunas yang daunnya sudah berwarna coklat dan mengering. Tunas yang mati karena pengaruh radiasi sinar gamma tetap diamati sampai minggu terakhir pengamatan (16 MSR), nilai tinggi tunas, jumlah daun dan jumlah akar dianggap nol. Data hilang Data tunas yang dinyatakan sebagai data hilang adalah data tunas yang terkontaminasi dengan kontaminan yang menutupi seluruh bonggol dan tunas yang mati karena tidak tahan terhadap bahan sterilan. Tunas-tunas tersebut tidak diamati pada minggu-minggu berikutnya.
Tunas yang diamati setiap minggu sampai 16 MSR Tunas yang diamati setiap minggu sampai 16 MSR adalah tunas yang masih hidup dan tunas yang mati karena pengaruh radiasi sinar gamma. Tunas yang mati karena pengaruh radiasi tetap diamati sebagai tanaman contoh, nilai pengamatannya dinyatakan nol.
