16
METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada lahan agroforestri yang terdapat di Desa Selaawi, secara administrasi berada di Kecamatan Talegong, Kabupaten Garut, Propinsi Jawa Barat. Pemilihan lokasi penelitian dilakukan secara purposive pada lahan agroforestri yang dikembangkan oleh petani. Penelitian ini dilakukan mulai Juni 2010 sampai dengan Mei 2011.
Metode Penelitian
Analisis Tempat Tumbuh
Pengambilan data dilakukan: a. Penentuan petak penelitian, membuat plot lingkaran dengan luasan 0,01 ha pada petak tegakan mindi muda, mindi tua dan hutan pinus. Pengukuran tegakan dalam plot meliputi pengukuran diameter dan tinggi pohon secara keseluruhan. b. Pengukuran tegakan dalam plot meliputi pengukuran diameter dan tinggi pohon secara keseluruhan. c. Pengambilan sampel tanah dengan menggunakan ring tanah atau bor tanah.
Alat dan Bahan
Bahan-bahan yang digunakan antara lain contoh tanah utuh untuk analisis sifat fisik tanah, contoh tanah komposit untuk analisis sifat kimia dan biologi tanah, dan bahan–bahan kimia untuk analisis sifat tanah. Peralatan yang digunakan dalam penelitian: peta lokasi, autoklaf, cawan petri, ayakan, ember, polybag, gelas ukur, tabung reaksi,
botol,
oven,
mikroskop, kamera,
meteran/mistar, caliper, timbangan analitik, cangkul, kompas, GPS, sekop, komputer, soil tester, bor tanah, oven memert, gelas ukur, tabung film, plastik,
17
kertas label, kertas saring, saringan, peralatan tulis, dan peralatan analisis laboratorium. Tempat Tumbuh
Untuk mendapatkan data mengenai sifat fisik, kimia tanah, diambil contoh tanah dari 3 tegakan yang berbeda. Pengambilan data sifat fisik dan kimia tanah maka diambil 3 ulangan dari setiap penutupan lahan pada kedalaman 0-20 cm. Cara pengambilan contoh tanah adalah sebagai berikut : a. Contoh tanah utuh (undisturbed soil sample) Pengambilan contoh tanah utuh untuk analisa sifat fisik tanah seperti berat isi (bulk density), porositas, permeabilitas. Pengambilan contoh tanah utuh hanya pada satu kedalaman yaitu 0-20 cm . Kegiatan pengambilan contoh tanah dimulai dengan membersihkan bagian tubuh tanah yang akan diambil dari penutupan serasah dan batu, kemudian diratakan. Ring sample diletakkan tegak lurus di atas permukaan tanah tersebut dan ditekan hanya tiga perempat bagian masuk ke dalam tanah. Selanjutnya, meletakkan ring sample kedua di atas ring pertama, kemudian ditekan kembali sampai ring pertama dan ring kedua masuk ke dalam tanah. Ring beserta di dalamnya digali dengan menggunakan sekop/cangkul. Kedua ring dipisahkan dengan, hati-hati kemudian kelebihan tanah yang ada pada bagian atas dan bawah ring diiris hingga rata. Ring ditutup dengan menggunakan kantong plastik (Purwowidodo 2004). Kemudian tanah dianalisa di laboratorium. b. Contoh tanah biasa (disturbed soil sample) Pengambilan contoh tanah biasa digunakan untuk analisa sifat kimia seperti pH, KTK, kadar air, dan kandungan hara. Kegiatan pengambilan contoh tanah dimulai dengan membersihkan permukaan tanah dari tanaman, daun dan sisa kotoran kemudian tanah diambil secara komposit dari 3 titik dengan menggunakan cangkul dan pisau pada kedalaman 0 – 20 cm, kemudian dicampur menjadi tanah komposit sebanyak 1 kg. Contoh tanah dimasukan ke dalam kantung plastik dan diberi label dan dimasukkan ke dalam cool box agar terjaga kelembabannya. Kemudian tanah dianalisa di laboratorium (Purwowidodo 2004) l. Sifat fisik tanah
18
Sample tanah yang digunakan merupakan sample tanah utuh sebanyak 100 gram yang diambil pada kedalaman 0 - 20 cm. Sifat fisik tanah yang dianalisis antara lain tekstur, bulk density, porositas, kedalaman solum tanah, ketersediaan air dan permeabilitas. 2. Sifat kimia tanah Analisis sampel tanah di laboratorium dilakukan untuk penetapan: N-total, dengan metode Kjeldahl; Nitrat, dengan metode titrasi; P tersedia, dengan metode Bray; K tertukar, ekstrak NH4OAc dan diukur dengan flamefotometer; C-organik, dengan metode Walkley & Black; pH H2O, dengan pH stick; tekstur, dengan metode analisis granuler cara pipet; berat volume, dengan metode ring sampler; porositas dengan perhitungan menurut rumus n:l- (BV/BJ); kemantapan agregat. (Purwowidodo 2004). Parameter sifat fisik dan sifat kimia tanah disajikan pada Tabel 1. Tabel 1 Parameter sifat fisik dan sifat kimia tanah No Parameter yang diambil 1. Iklim (Suhu, Kelembaban, dan Curah hujan) 2.
3.
Sifat fisik a. Bulk density b. Porositas c. Air tersedia d. Kadar air e. Tekstur tanah f. Struktur tanah g. Kedalaman perakaran tanah Sifat kimia a. C-Organik b. N total c. P d. K e. KTK f. pH
Metode analisis Pengukuran lapang dan data sekunder Nisbah bobot tanah Volumeter Gravimetri Gravimetri Metode pipet Pengamatan lapang Pengamatan lapang Kjeldahl Kjeldahl P-Bray II NH4Oac pH 7, AAS NH4OacpH 7, Titrasi pH meter (Potentiometer)
Analisis Vegetasi
Analisis vegetasi dilakukan untuk mendapatkan data indeks nilai penting (INP) jenis vegetasi baik tanaman hutan maupun tumbuhan bawah pada lokasi penelitian. Untuk mendapatkan data vegetasi tanaman hutan maka akan dilakukan
19
sampling terhadap penutupan lahan. Pada penelitian ini petak contoh dibuat dengan metode petak lingkaran (Soerianegara & Indrawan 1998). 1. Kerapatan tegakan (Jumlah pohon per hektar) Jumlah pohon per hektar adalah jumlah pohon per petak ukur dibagi dengan luas petak ukur dilakukan sebagai berikut: N= n / Lp Ket: N = jumlah pohon per hektar n = jumlah pohon dalam petak ukur Lp = luas petak ukur (ha) 2. Luas bidang dasar (LBDS) Luas bidang dasar seluruh tanaman diperoleh dari jumlah luas bidang dasar individu tanaman dalam petak ukur dibagi dengan luas petak ukur dilakukan sebagai berikut:
dan
Bi = π / 4 (Di2 / 10000)
Ket : Di = diameter tanaman ke-I (cm) B = luas bidang dasar seluruh tanaman (m2/ha) Bi = luas bidang dasar tanaman ke-I (cm2) n = jumlah tanaman dalam petak ukur Lp = luas petak ukur (ha) 3. Volume tegakan Volume tagakan diperoleh dari jumlah volume individu pohon dalam petak ukur dibagi dengan luas petak ukur dilakukan sebagai berikut:
Volume individu pohon dalam petak ukur di peroleh dengan persamaan penduga volume kayu bawang yang disusun oleh Sumadi et al. (2007): Vi = 0,0000501Di2,13 Hi0,769 Ket : Di = diameter tanaman ke-i (cm)
20
Hi = tinggi total pohon ke-i (m) V = volume tagakan (m3/ha) Vi = volume pohon ke-I hingga diameter ujung 10 cm dengan kulit (m3) n = jumlah tanaman dalam petak ukur Lp = luas petak ukur (ha)
Analisis Data
Untuk menganalisis data kualitas tempat tumbuh pada berbagai tegakan digunakan program komputer dengan software Microsoft Excel 2007, Minitab 15.
Eksplorasi Pengetahuan Lokal Sistem Agroforestri
Pengumpulan data eksplorasi pengetahuan lokal akan dilakukan melalui teknik wawancara mendalam (indepth interview), pengisian kuisioner, dan Focus Group Disscussion (FGD). Dilakukan terhadap beberapa orang informan kunci yang terlibat langsung dalam agroforestri mindi. Jumlah responden yang akan ditentukan sesuai dengan jumlah yang terlibat dalam kegiatan ini. Teknik penentuan sampel yang akan diwawancarai yaitu dengan snowball sampling. Penentuan sampel mula-mula jumlahnya kecil kemudian membesar, ibarat bola salju yang menggelinding yang lama-lama menjadi besar. Dalam penentuan sampel, pertama-tama dipilih satu dua orang, tetapi karena dengan dua orang ini belum merasa lengkap data yang diberikan, maka peneliti mencari orang lain yang dipandang lebih tahu dan dapat melengkapi data yang diberikan oleh dua orang sebelumnya. Begitu seterusnya, sehingga jumlah sampel semakin banyak (Sugiyono 2009). Data yang dikumpulkan berupa sistem silvikultur agroforestri mindi yaitu teknik penanganan benih, perbanyakan tanaman dan teknik pengelolaan lahan.
21
Penggambaran Model Local Ecological Knowledge
Local Ecological Knoowledge (LEK) diperoleh dari hasil wawancara mendalam (indepth interview) dan observasi lapangan tentang teknik pengelolaan lahan pada sistem agroforestri, komponen-komponen dalam teknik pengelolaan lahan pada sistem agroforestri, dan interaksi antar komponen
dalam teknik
pengelolaan lahan pada sistem agroforestri. Data yang didapatkan melalui hasil wawancara
tersebut
kemudian
disusun
berdasarkan
rumus
(grammer)
yang
menjadi telah
pernyataan
diterapkan
pada
(statement) program
Agroecological Knowledge Toolkit 5 (AKT 5). Kemudian data-data tersebut diolah dengan menggunakan program aplikasi AKT 5 dan dianalisis secara deskriptif. Analisis SWOT
Analisis SWOT adalah identifiksi berbagai faktor secara sistematis untuk merumuskan strategi perusahaan. Analisis ini didasarkan pada logika yang dapat memaksimalkan kekuatan (strengths) dan peluang (opportunities), namun secara bersamaan dapat meminimalkan kelemahan (weakness) dan ancaman (threats). Proses pengambilan keputusan strategis selalu berkaitan dengan pengembangan misi, tujuan, strategi, dan kebijakan perusahaan. Dengan demikian perencanaan strategis (strategic planner) harus menganalisis faktor-faktor strategis perusahaan (kekuatan, kelemahan, peluang dan ancaman) dalam kondisi yang ada saat ini (Rangkuti 2006). Alat yang dipakai untuk menyusun faktor-faktor strategis perusahaan adalah matrik SWOT. Matrik ini dapat menggambarkan secara jelas bagaimana peluang dan ancaman eksternal yang dihadapi perusahaan dapat disesuaikan dengan kekuatan dan kelemahan yang dimilikinya. Matrik ini dapat menghasilkan empat set kemungkinan alternatif strategis (Rangkuti 2006). Tahapan analisis SWOT disajikan pada Tabel 2.
22
Tabel 2 Tahapan Analisis SWOT
INTERNAL EKSTERNAL OPPORTUNITIES (O) Tentukan 5 sampai 10 faktor peluang eksternal
TREATHS (T) Tentukan 5 sampai 10 faktor ancaman eksternal
STRENGTHS (S) Tentukan 5 sampai 10 faktor-faktor kekuatan internal Strategi SO Ciptakan strategi yang menggunakan kekuatan untuk mengatasi ancaman
WEAKNESSES (W) Tentukan 5-10 faktor-faktor kelemahan internal
Strategi ST Ciptakan strategi yang menggunakan kekuatan untuk mengatasi ancaman
Strategi WT Ciptakan strategi yang meminimalkan kelemahan untuk memanfatkan peluang
Strategi WO Ciptakan strategi yang meminimalkan kelemahan untuk memanfaatkan peluang
a. Strategi SO Strategi ini dibuat berdasarkan jalan pikiran perusahaan, yaitu dengan memanfaatkan seluruh kekuatan untuk merebut dan memanfaatkan seluruh kekuatan untuk merebut dan memanfaatkan peluang sebesar-besarnya. b. Strategi ST Ini adalah strategi dalam menggunakan kekuatan yang dimiliki perusaahaan untuk mengatasi ancaman. c. Strategi WO Strategi ini diterapkan berdasarkan pemanfaatan peluang yang ada dengan cara meminimalkan kelemahan yang ada. d. Strategi WT Strategi ini di dasarkan pada kegiatan yang bersifat defensif dan berusaha meminimalkan kelemahan yang ada serta menghindari ancaman (Rangkuti 2006).
Mikrosatelit
Analisis DNA pada M. azedarach L. dilakukan dengan menggunakan metode mikrosatelit. Secara umum metode mikrosatelit terdiri dari: a. Ekstraksi DNA
23
Ekstraksi DNA atau isolasi DNA merupakan metode pemisahan DNA dari bahan-bahan yang tidak diperlukan. Metode ekstraksi DNA yang digunakan metode CTAB (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide). Sebagian besar metode untuk ekstraksi DNA dari jaringan tanaman menggunakan larutan buffer CTAB sebagai pelisis dinding sel karena memiliki kelebihan dibandingkan dengan metode lain, yaitu mudah dilakukan, kemungkinan adanya enzim pendegradasi DNA lebih kecil dibandingkan metode lain (Rogers and Bendich 1994 dalam Aritonang et al. 2007), dan dapat diterapkan pada segala jenis jaringan tanaman seperti daun, benih, endosperm, dll. b. Elektroforesis Komponen bahan kimia terpenting yang digunakan dalam proses elektroforesis adalah gel yang sudah terbentuk sumur. Elektroforesis bertujuan untuk melihat migrasi DNA. Agar DNA dapat terlihat berpindah, maka DNA dicampur dengan Blue Juice. DNA sebanyak 3 mikro liter dicampur dengan 2 mikro liter Blue juice 10 X. Campuran tersebut dimasukkan kedalam lubanglubang gel dalam bak elektroforesis yang mengandung larutan buffer dan dialiri dengan arus listrik. DNA akan bermigrasi dari arah negatif (katode) ke arah positif (anode) (Aritonang et al. 2007). c. Polymerase Chain Reaction (PCR) Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 20–30 kali. Setiap siklus terdiri dari tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus: 1. Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu tinggi, 94–96°C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini dilakukan agak lama (sampai 5 menit) untuk memastikan semua berkas DNA terpisah. Pemisahan ini menyebabkan DNA tidak stabil dan siap menjadi template ("patokan") bagi primer. Durasi tahap ini 1–2 menit. 2. Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA template yang komplementer dengan urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 45–60°C. Primer biasanya terdiri dari 10-20 nukleotida dan dirancang berdasarkan daerah konservatif dalam genom tersebut. Makin
24
panjang primer, makin spesifik daerah yang diamplifikasi (Suryanto 2003). Primer ini berperan sebagai opposite strand ketika double helix DNA terpisah pada tahap denaturation dan penempelan ini bersifat spesifik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 1–2 menit. 3. Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA-polimerase yang dipakai. Dengan Taq-polimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 72°C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit (Aritonang et al. 2007). PCR-Mikrosatelit
Prinsip proses PCR adalah suatu siklus berjangka pendek (dengan tiga perubahan suhu yang berubah secara cepat. Reaksi PCR-Mikrosatelit dilakukan dengan menggunakan 15 µl volume larutan yang terdiri dari H 2O 2,5 µl, primer forward dan primer reserve masing-masing. Komposisi bahan-bahan yang digunakan untuk PCR dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3 Komposisi bahan-bahan yang digunakan untuk PCR No 1 2 3 4 5
Komponen Cetakan DNA Forward primer Reserved primer Nucleus free water Green Go Taq Master Mix Kit Jumlah
Volume (µl) 2,5 1,5 1,5 2,5 7,5 15,5
Untuk tahapan-tahapan dalam proses PCR-Mikrosatelit secara rinci dapat dilihat pada Tabel 4. Tabel 4 Tahapan-tahapan dalam proses PCR-Mikrosatelit No Tahapan Suhu (0C) Waktu (Menit) 1 2 3 4 5
Pre-denaturation Denaturation Annealing Extention Final Extention
(Aritonang et al. 2007).
95 95 55 72 72
2 2 1 2 5
Jumlah siklus 1 39 1
25
Adapun primer yang digunakan dalam penelitian ini secara rinci dapat dilihat pada Tabel 5. Tabel 5 Primer yang digunakan dalam analisis genetik PCR-Microsatelit Locus Ai_5
Repeat motif (CA)15
Ai_34
(GA)18
Ai_48
(CA)10
Primer sequences F: GAAAGGAGGGTTTTCAAATCA R: TCGGCCGAACACAATTTTA F: ATTTGTGTGTGCGTGCTAGG R: CGAGGAACTGAGACTCCTGAA F: TCCCAGTTATTCAACGTAGGC R: TCTTAATCATGGATTGCTTCACA
Ta (0C) 55
Allele size range (bp) 130–182
55
146–168
55
105–125
(Boontong et al. 2008). Akrilamid
Untuk menguji kualitas DNA hasil PCR mikrosatelit, dilakukan elektroforesis dengan menggunakan gel poliakrilamid hasil campuran dari larutan akrilamid, TEMED dan Ammonium Persulfat (APS). Campuran gel poliakrilamid dipanaskan, dan untuk selanjutnya gel diinjeksikan ke dalam cetakan berupa dua lembar kaca yang direkatkan dengan bahan perekat yang berisi sisir untuk membuat lubang elektroforesis. Buffer yang digunakan untuk elektroforesis adalah buffer TBE 1 x. Elektroforesis dilakukan denga menggunakan aliran listrik sebesar 120 W selama 1-3 jam. Untuk melihat hasil elektroforesis dilakukan pewarnaan menggunakan shaker selama 30 menit. Selanjutnya pita DNA hasil PCR mikrosatelit dilihat dan didokumentasikan dengan menggunakan kamera digital (Yunanto 2010). Analisis Hasil PCR
Hasil dari kegiatan mikrosatelit difoto dan dianalisis dengan melakukan scoring pola pita yang muncul. Pola pita yang muncul disajikan pada Gambar 2. Hasil perhitungan kemudian dianalsis dengan menggunakan software POPGENE 32 Versi 1.31 dan NTSYS Versi 2.02 (Rohlf 1998 dalam Yunanto 2010).
26
Gambar 2 Cara Scoring DNA-Mikrosatelit. Parameter genetik yang diukur dalam penelitian ini adalah variasi genetik di dalam populasi dan antar populasi. Untuk keragaman genetik di dalam populasi parameter yang diukur adalah: 1. Persentase Lokus Polimorfik (PLP) 2. Jumlah alel yang diamati (na) 3. Jumlah alel efektif (ne) 4. Heterozigositas harapan (He) Sedangkan parameter yang diamati untuk keragaman genetik antar populasi digunakan cluster analysis untuk menduga ada tidaknya hubungan kekerabatan berdasarkan jarak genetik yang diperoleh (diadaptasi dari Kholik 2008).
