3 BAHAN DAN METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dimulai pada bulan Oktober 2004 sampai dengan April 2005. Pelaksanaan penelitian ini dilakukan di Laboratorium Pengolahan, Kimia dan Mikrobiologi Pusat Riset Pengolahan Produk dan Sosial Ekonomi Kelautan dan Perikanan, Badan Riset Kelautan dan Perikanan, Departemen Kelautan dan Perikanan, Jl. K.S. Tubun Petamburan Jakarta, Laboratorium Kimia Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat, Balai Besar Penelitian Bioteknologi dan Genetik, Departemen Pertanian, Cimanggu Bogor dan Tempat Pendaratan Ikan dan Pasar
tradisional di sekitar Kecamatan Labuan, Kabupaten Pandeglang,
Propinsi Banten serta TPI Belanakan, Subang, Propinsi Jawa Barat. 3.2 Bahan dan Alat Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan kembung segar bebas formalin dari Tempat Pendaratan Ikan Muara Angke, Jakarta Utara dan Tempat Pendaratan Ikan Belanakan, Subang, Jawa Barat,test kit buatan aquamerck, biji picung (Pangium edule) dari Desa Pabuaran Kecamatan Sukamakmur Cileungsi Kabupaten Bogor, dari Pasar Ciampea dan Desa Rumpin Leuwiliang kabupaten Bogor serta garam yang diperoleh dari pasar Anyar Bogor dan pasar Palmerah Jakarta Barat, serta bahan-bahan kimia lain dan media dari Laboratorium Pusat Riset Pengolahan Produk dan Sosial Ekonomi Kelautan dan Perikanan, Badan Riset Kelautan dan Perikanan, Departemen Kelautan dan Perikanan, Jl. K.S. Tubun Petamburan Jakarta dan Laboratorium Kimia Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat dan Balai Besar Penelitian Bioteknologi dan Genetik, Departemen Pertanian, Cimanggu Bogor. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan, alat pemecah biji (palu, batu), alat pencungkil, kolewang (alat pencacah), sendok atau spatula, baskom, wadah plastik tertutup/ember dan boks sterofoam. Untuk keperluan analisis kimia, biokimia, dan mikrobiologis diperlukan beberapa alat
24
serta bahan kimia dan media sebagaimana tercantum dalam sub bab 3.3.2. Disamping itu dipergunakan pula alat-alat untuk uji organoleptik, seperti piring, gelas, plastik, nampan dan sebagainya. 3.3 Metode Penelitian Penelitian ini terdiri dari dua tahap yaitu tahap pendahuluan dan tahap utama. Pemilihan campuran daging biji picung dan campuran garam yang paling unggul dilakukan berdasarkan uji organoleptik. Pada penelitian pendahuluan, ikan kembung bebas formalin yang digunakan untuk penelitian ini diperoleh dari Muara Angke Jakarta dengan ukuran 10 ekor/kg. Ikan tersebut dibuang isi perut dan insangnya, dicuci bersih kemudian ditiriskan lalu ditimbang sesuai kebutuhan. Garam dan picung yang telah dicacah ditimbang sesuai dengan kebutuhan ikan yang telah dipersiapkan dengan perbandingan penambahan garam dan picung sebagai berikut : Tabel 4 Perbandingan Penambahan Picung dan Garam dalam % terhadap Bobot Ikan pada Penelitian Pendahuluan Picung Garam
2%
4%
6%
8%
10%
1%
g1p2
g1p4
g1p6
g1p8
g1p10
2%
g2p2
g2p4
g2p6
g2p8
g2p10
3%
g3p2
g3p4
g3p6
g3p8
g3p10
4%
g4p2
g4p4
g4p6
g4p8
g4p10
5%
g5p2
g5p4
g5p6
g5p8
g5p10
Garam dan picung yang telah ditimbang diaduk hingga tercampur, lalu dilumurkan pada ikan kembung segar dan sebagian lagi dimasukkan ke dalam isi perut ikan. Ikan kemudian dikemas dalam kantong plastik terbuka dan disusun dalam keranjang bambu sesuai kode perlakuan, untuk ditempatkan dalam ruang penyimpanan pada suhu kamar. Lama pengamatan 15 hari dan diamati setiap 3 hari sekali terhadap nilai organoleptik.
25
Kriteria mutu yang diuji adalah rupa, warna, tekstur, aroma dan rasa pada bahan baku ikan. Penilaian oleh orang dewasa dilakukan menurut skala hedonik dengan kategori penilaian sebagai berikut : 1 = sangat tidak suka 2 = tidak suka 3 = biasa 4 = suka 5 = sangat suka Berdasarkan hasil analisis organoleptik pada penelitian pendahuluan diperoleh hasil kombinasi unggulan yang dilanjutkan untuk penelitian utama, yaitu mempelajari pengaruh penambahan atau penggunaan daging biji picung pada ikan kembung segar dengan kombinasi konsentrasi garam 2% dan 3% dengan picung 2%, 4% dan 6% terhadap penerimaan yang dihasilkan. Tabel 5 Perbandingan Penambahan Picung dan Garam dalam (% terhadap Bobot Ikan) pada Penelitian Utama Picung Garam
2%
4%
6%
2%
g2p2
g2p4
g2p6
3%
g3p2
g3p4
g3p6
Pada penelitian utama ini, evaluasi terhadap penggunaan campuran picung dan garam pada ikan kembung segar dilakukan pada 0 hari setelah 8 jam perlakuan pada pengamatan ke 1, dan setiap 3 hari sekali pada pengamatan berikutnya baik secara kimia, mikrobiologis dan organoleptik. Analisis kimia meliputi kadar protein, kadar lemak, kadar air, kadar abu, kadar sianida, kadar tanin, kadar TVB, kadar TMA, nilai pH dan kadar garam. Analisis kimia untuk uji kadar protein, dan kadar lemak hanya pada ikan segar dan biji picung segar pada awal percobaan saja. Analisis kimia untuk uji kadar garam, kadar sianogen dan kadar tanin dilakukan di awal dan akhir penelitian pada ikan yang diberi perlakuan. Analisis kimia meliputi kadar air, kadar abu, kadar TVB, kadar TMA
26
dan nilai pH dilakukan setiap 3 hari sekali selama pengamatan. Analisis mikrobial meliputi analisis jumlah total bakteri / Total Plate Count, Enterobacter dan H2S producer dan analisis organoleptik meliputi parameter rupa, warna, aroma, tekstur dan rasa yang dilakukan dengan menggunakan lembar skala hedonik (terlampir) dilakukan setiap 3 hari sekali selama pengamatan. Evaluasi terhadap kesukaan dilakukan oleh 10 orang dewasa. 3.3.1 Proses Penambahan Campuran Picung dan Garam pada Ikan Segar Pada prinsipnya, proses penambahan kombinasi campuran picung dan garam pada ikan segar meliputi tahap persiapan bahan ; pengupasan biji picung, pencongkelan dan pencacahan serta pencampuran daging biji picung dengan garam dan pembuangan isi perut ikan kembung. Kemudian pencampuran bahan yang terdiri dari pelumuran campuran picung dan garam pada ikan kembung segar dan pengemasannya. Tahap pencampuran picung dan garam memegang peranan yang sangat penting. Perbandingan campuran bahan harus diatur agar memudahkan dalam penanganannya, sebab karakteristik produk akhir ditentukan oleh perbandingan campuran bahan dan proses yang dilakukan. Seluruh tahap pelumuran campuran picung dan garam pada ikan kembung segar tersebut diharapkan dapat berpengaruh terhadap kenampakan dan mutu produk akhir. Mutu ikan kembung segar secara organoleptik, kimia dan mikrobiologis diharapkan dapat diterima dengan baik oleh konsumen/panelis.
27
1. Pengupasan Biji Picung
2. Pencacahan Daging Biji Picung
3. Pencampuran (Picung dengan Garam)
Ikan
Pembuangan Isi Perut
2. Pencacahan Daging Biji Picung Pencucian 4. Pelumuran (Campuran Picung & Garam pada Ikan Kembung Segar)
5. Pengemasan (dalam ember plastik bertutup, setiap hari dibuka selama 5 menit)
6. Penyimpanan (pada suhu kamar/ruang)
7. Pengamatan (pengujian pada 0 hari setelah 8 jam perlakuan dan setiap 3 hari sekali selama 9 hari penyimpanan)
Gambar 7 Alur Proses Aplikasi Penambahan Campuran Biji Picung dan Garam pada Ikan Kembung Segar
28
Gambar 8 Dokumentasi Alur Proses Aplikasi Penambahan Campuran Biji Picung dan Garam pada Ikan Kembung Segar
29
3.3.2 Pengamatan Analisis terhadap penggunaan campuran picung dan garam pada produk ikan kembung segar meliputi analisis kimia, mikrobiologis dan organoleptik terhadap produk ikan kembung segar yang menggunakan campuran picung dan garam. 3.3.2.1 Analisis Kimia (1) Analisis/Uji Kualitatif Formalin (Merck, Jerman) Pengujian formalin secara kualitatif dilakukan dengan test kit Aquamerck, buatan Jerman. Prinsipnya adalah membandingkan hasil titrasi dengan kartu standar warna. 1) Alat dan Bahan : 1 set Formaldehyde Test kit terdiri dari; 1 buah botol reagent Fo – 1, 1 buah botol reagent Fo – 2, 1 buah botol plastik semprot ukuran 5 ml, 2 buah tabung dengan penutup, 1 buah kartu standar warna, 1 buah kaca pembanding (sliding comparator). 2) Persiapan : Sampel yang sudah diblender bersama aquades disaring 3) Prosedur : - Botol sampel dibilas beberapa kali sebelum digunakan - Sampel disiapkan 5 ml dan blanko5 ml, lalu ditambahkan 5 tetes reagen Fo-1 kedalam botol tersebut dengan menggunakan pipet, kemudian dikocok. - pH diuji dengan kertas pH, pH harus diatas 13, jika perlu dengan menggunakan reagen Fo-1 (cairan sodium hidroksida). - Kemudian ditambahkan 1 sendok kecil reagen Fo-2 lalu ditutup rapat dan dikocok dengan kuat hingga reagen larut sempurna. Tes tube dimasukkan, ditempatkan dalam slide comparator diatas indikasi kartu warna standar lalu dibandingkan, sepanjang skala warna slide comparator hingga sama warna diantara tes tube dibuka gambaran standar diatas. - Hasilnya dapat dibaca dalam mg/l HCHO untuk indikasi kartu standar
30
warna dari yang terpilih pada pembanding kaca atau jika perlu diperkirakan nilai tengahnya. (2) Analisis Protein Kasar (Yunizal et al. 1998) 1) Destruksi 1) Kedalam labu Kjeldhal 300 ml dimasukkan contoh yang telah dicacah kecilkecil dan homogen 1 hingga 2 g, kemudian ditambahkan campuran destruksi 3 g dan 20 ml asam sulfat pekat p.a. 2) Labu Kjeldhal tersebut dipanaskan di atas pemanas listrik hingga warna larutan semula hitam berubah menjadi warna jernih. Selama pemanasan pada ujung labu Kjeldhal dipasang corong untuk mencegah penguapan larutan asam sulfat pekat. 3) Setelah selesai destruksi, labu Kjeldhal didinginkan kemudian dipindahkan secara kuantitatif ke labu ukur 250 ml menggunakan aquades. 2) Destilasi 1) Filtrat ditampung dalam 25 ml larutan H2BO3 5% yang telah ditambah metil red 3 tetes dan bromokresol green. 2) Destilasi dihentikan setelah uap destilasi tidak bereaksi basa lagi (uji lakmus) atau warna cairan berubah biru. 3) Ujung kondensor dibilas dengan air suling. 3) Titrasi 1) Larutan kemudian dititrasi dengan HCl standar 0,01 N dengan metil red dan bromokresol green sehingga berwarna merah. 2) Perhitungan : Kadar Protein = (ml titrasi HCl x N HCl) x 14 x 6,25 x pengenceran x 100% ....................(1) 100 x berat contoh (g)
31
(3) Analisis Kadar Lemak (Crude Fat) (Yunizal et al, 1998) 1) Ke dalam selongsong lemak dimasukkan contoh sebanyak 2 g hingga 3 g yang telah dicacah kecil-kecil dan homogen. Dapat juga digunakan contoh kering yang diketahui kadar airnya. 2) Selanjutnya contoh dalam selongsong lemak ditutup dengan kapas bebas lemak. 3) Selongsong lemak tersebut dimasukkan ke dalam ruang ekstraktor tabung Soxlet, disiram dengan etil eter hingga permukaan. Setelah etil eter berpindah kedalam labu lemak, kemudian disiram kembali selongsong lemak di atas hingga permukaan separuh dari ruangan ekstraktor terisi dengan etil eter. 4) Labu lemak dan tabung Soxlet dipanaskan di atas pemanas listrik bersuhu sekitar 400C selama 6 jam. 5) Labu lemak dilepaskan dari tabung Soxlet, dituangkan etil eter yang berada dalam ruangan ekstraktor ke dalam labu lemak. 6) Etil eter dalam labu lemak didestilasikan dengan alat destilasi berputar hingga semua etil eter menguap, kemudian labu lemak dikeringkan dalam oven dengan suhu 1020C hingga 1050C sampai tercapai berat konstan. 7) Perhitungan : Kadar Lemak = Berat minyak pada labu lemak (g) x 100% ................................................(2) Berat contoh (g) (4) Penentuan Kadar Air (Yunizal et al. 1998). 1) Botol timbang yang bersih beserta tutupnya dipanaskan dalam oven bersuhu 1020C hingga 1050C selama kurang lebih 10 hingga 12 jam. 2) Botol timbang dikeluarkan dari dalam oven, kemudian didinginkan dalam desikator selama 30 menit. 3) Ke dalam botol timbang di atas dimasukkan contoh yang telah dicacah kecilkecil dan homogen sebanyak 1 hingga 4 gram, selanjutnya dikeringkan dalam oven 1020C hingga 1050C. 4) Pengeringan dalam oven dilakukan sampai tercapai berat konstan.
32
Perhitungan: Kadar Air = Berat pada butir 3) – Berat pada butir 4) x 100% ......................(3) Berat contoh (5) Analisa Abu Total (Yunizal et al. 1998) 1) Cawan abu porselin dipijarkan sampai merah dalam tungku pengabuan bersuhu 6500C selama 1 jam (kenaikan suhu tungku pengabuan harus bertahap). 2) Setelah suhu tungku pengabuan turun sekitar suhu kamar, cawan abu porselin didinginkan dalam desikator selama 30 menit, dan berat cawan abu porselin kosong ditimbang. 3) Ke dalam cawan abu dimasukkan kira-kira 2 gram contoh yang telah dicacah kecil-kecil dan homogen, kemudian dimasukkan ke dalam oven sampai hampir kering. 4) Selanjutnya cawan yang berisi contoh diabukan dalam tungku pengabuan sampai kira-kira 6500C dan dibiarkan pada suhu ini selama 1 jam (cawan abu menjadi merah), lalu didinginkan dalam desikator hingga beratnya konstan. Perhitungan : Kadar Abu = Berat pada butir 3) - Berat pada butir 4) x 100% ....................(4) Berat contoh (gram) (6) Uji Cepat Sianogen (Bradburry et al. 1999) Metode analisis sianogen yang sering digunakan antara lain adalah metode argentometri. Metode tersebut kurang efisien terlebih untuk jumlah contoh yang banyak. Uji cepat sianogen merupakan metode penetapan kadar tiga fraksi sianogen (linamarin, aseton sianohidrin, dan HCN/CN-) yang bersifat sederhana, murah dan datanya dapat diandalkan. Metode ini menggunakan asam pikrat (2,4,6-trinitrofenol) sebagai senyawa pengikat sianogen setelah glukosida sianogenik terurai. Pengikatan tersebut akan membentuk kompleks berwarna jingga-coklat, yaitu asam iso purpurat. Semakin tinggi kadar sianogen yang terikat maka warna kertas pikrat dibandingkan langsung dengan kartu standar sianogen
33
(ppm). Cara ini merupakan cara penetapan yang paling cepat. Adapun cara kedua yaitu
diukur
serapannya
dengan
spektrofotometer
pada
λ
510
nm
(Bradbury et al. 1999). Faktor-faktor yang mempengaruhi serapan kompleks asam isopurpurat antara lain yaitu kadar sianogen, jumlah asam pikrat yang tersedia, pH sistem, waktu inkubasi dan suhu (Wiliams et al. 1980 dalam Bradbury et al. 1999). Aseton sianohidrin dalam kondisi asam akan bersifat stabil dan akan segera terurai menjadi sianida dalam suasana basa. Proses hidrolisis linamarin menjadi sianida akan berlangsung sempurna pada pH 8 dan suhu 25-30oC (Egan et al. 1998 dalam Bradbury et al. 1999). Waktu inkubasi yang digunakan untuk penetapan kadar total sianogen adalah 16-24 jam (Bradbury et al. 1999). 1) Pembuatan Kertas Pikrat Sebanyak 1,4000 g asam pikrat dilarutkan dalam 100 ml larutan Na2CO3 2,5%. Kertas Whatman No. 3 MM dicelupkan ke dalam larutan tersebut selama 20 detik, lalu diangin-anginkan sampai kering. Kertas pikrat kering dipotongpotong dengan ukuran 1x3 cm dan dilekatkan pada kertas transparansi yang juga telah dipotong-potong dengan ukuran 1 x 4,5 cm. Kertas pikrat tersebut disimpan dalam wadah tertutup sebelum digunakan untuk menghindari debu dan terkena sinar matahari. 2) Preparasi contoh daging biji Picung (Pangium edule Reinw) Setiap daging biji diiris halus dan dicampur merata, contoh ditimbang sebanyak 100 mg dengan timbangan analitik untuk ditetapkan kadar total sianogennya. 3) Penetapan kadar total sianogen (sianogen potensial) 1) Sebanyak 100 mg dari setiap contoh masing-masing dimasukkan ke dalam botol kit. 2) Kemudian ditambahkan 0,5 ml akuades, selanjutnya ditambahkan 0,5 ml buffer fosfat 1 M pH 8. 3) Kertas pikrat yang sudah dilekatkan pada kertas transparansi dimasukkan dengan segera setelah semua bahan bercampur, lalu botol kit ditutup rapat
34
dengan cepat. Posisi kertas pikrat menggantung diatas larutan sehingga tidak bersentuhan dengan larutan tersebut. 4) Selanjutnya sistem diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam. 5) Setelah melewati waktu inkubasi, kertas pikrat diambil dan dilepaskan plastiknya, lalu dibandingkan langsung dengan kartu standar sianogen untuk ditetapkan kadar sianogennya. 6) Selanjutnya kertas pikrat dilarutkan dalam 5 ml akuades selama 30 menit sambil sekali-sekali digoyangkan. 7) Larutan pikrat-sianogen yang terbentuk diukur intensitas warnanya dengan spetrofotometer double beam Hitachi 150-20 pada panjang gelombang 510 nm. 8) Membandingkan kertas pikrat terhadap kartu standar sianogen hanya digunakan sebagai verifikasi terhadap kemungkinan adanya kekeliruan dalam pengukuran dengan spektrofotometer dan pengukuran ini bersifat semi kuantitatif. Data hasil pengukuran dengan spektrofotometer lebih teliti (kuantitatif). 9) Standar yang digunakan adalah KCN dengan konsentrasi beragam. Setiap contoh yang diukur, nilai absorbansinya diplot terhadap kurva standar CN-. 10) Blanko dibuat dengan cara yang sama seperti contoh, tetapi tidak menyertakan contoh. 11) Kadar total sinaogen dapat dirumuskan : Perhitungan : Total sianogen (ppm) = Bobot CN (μg) ……………..(5) Bobot contoh (g) (7) Analisis Kadar Tanin (AOAC 1984) 1) Pereaksi Folin Denis 1) Kedalam 750 ml air suling ditambahkan 100 g Natrium tungstat (Na2VO4) 20 g asam phospomolibdat dan 50 ml asam phosphat 85%. 2) Direfluk 3 jam, didinginkan dan ditetapkan sampai 1 liter dengan air suling.
35
2) Larutan Na2CO3 jenuh anhidrat Ditambahkan 35 gram Na2CO3 anhidrat ke dalam 100 ml air suling pada suhu 70o-80oC kemudian diaduk sampai larut/jenuh dan ditepatkan lalu didinginkan semalam. 3) Larutan standar asam tanat 100 gram asam tanat dimasukkan ke dalam 100 ml air suling kemudian dikocok dan diencerkan sampai 1 liter (1 ml + 0,1 mg asam tanat) dibuat larutan segar setiap kali digunakan. 4) Persiapan kurva standar 1) Ditambahkan 2 cc pereaksi Folin Denis ke dalam labu takar 100 ml yang telah diisi 50-70 ml air suling 2) kemudian dipipet 0,3 ; 0,6 ; 0,9 : 1,2 dan 1,3 ml larutan standar asam tanat lalu ditambahkan 5 ml larutan Na2CO3 jenuh ke dalam masing-masing labu dan ditepatkan hingga 100 ml dengan air suling setelah itu dikocok dan dibiarkan selama 40 menit 3) kemudian dibaca absorbansinya pada λ 725 nm dan dibuat kurva standar. 5) Persiapan contoh 1) Ditimbang + 2 gram contoh yang telah dihaluskan dan dimasukkan ke dalam labu didih 500 cc, 2) lalu ditambahkan 350 ml air suling dan direfluk selama 3 jam (dipanaskan dengan pipa pendingin tegak) 3) kemudian disaring dan dipindahkan secara kuantitatif ke dalam labu ukur 500 ml ditepatkan kemudian dipipet 2 ml filtrat kedalam labu ukur 100 ml dan ditambahkan 2 ml pereaksi Folin Denis serta 5 ml Na2CO3 jenuh lalu ditepatkan dan dibiarkan selama 40 menit 4) kemudian diukur absorbansinya λ 725 nm Perhitungan : Dengan menggunakan regresi linier dapat ditambahkan kadar tanin dalam mg yaitu : y = a + bx untuk memperoleh harga a x b, diplotkan jadi y sebagai absorbansi standar dan x sebagai konsentrasi standar kemudian dapat diperoleh % tanin sampel dengan rumus :
36
%Tanin (mg/100 gr) = fp X xmg X 100 ……………..……………...…(6) B Keterangan : fp = faktor pengenceran B = berat contoh (gram) (8) Penentuan Nilai Total Volatile Base / TVB (DSN, 1991) Prinsip kerjanya adalah menguapkan basa-basa menguap (volatile bases)(ammonia, mono-, di-, trimetilamin dan lain-lain) yang terdapat dalam ekstrak daging ikan yang bersifat basa pada suhu 35oC selama 2 jam atau pada suhu kamar selama semalam. Senyawa tersebut diikat oleh asam borat kemudian dititrasi dengan larutan HCl 0,02 N. 1) Tahap persiapan contoh Contoh dicacah hingga halus, kemudian ditimbang
+ 25 gram dan
dimasukkan ke dalam blender lalu ditambahkan 75 ml larutan trichloro acetic acid (TCA) 7% dan diblender selama 1 menit. Larutan tersebut disaring dengan kertas saring sehingga diperoleh filtrat yang jernih. Sebelum dianalisis, filtrat dapat disimpan dalam kulkas. 2) Tahap analisa TVB 1) Larutan asam borat dipipet sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke bagian dalam (inner chamber) cawan Conway, dengan menggunakan mikro pipet 1 ml yang lain, filtrat contoh dimasukkan ke bagian luar (outer chamber) cawan Conway sebelah kiri, kemudian ditambahkan 1 ml K2CO3 jenuh pada bagian luar (outer chamber) cawan Conway sebelah kanan dan cawan Conway segera ditutup rapat (bagian pinggir cawan Conway dan tutupnya harus sudah diolesi dengan vaselin agar diperoleh penutupan yang rapat). 2) Pada pembuatan blanko, filtrat contoh diganti dengan larutan TCA 7% dan dikerjakan dengan prosedur yang sama. Setiap contoh dan blanko dikerjakan secara duplo.
37
3) Penyusunan cawan Conway pada rak inkubator dilakukan secara hati-hati, kemudian cawan digoyang secara perlahan-lahan selama 1 menit dan diinkubasi pada suhu 35oC selama pada suhu kamar selama semalam. 4) Setelah inkubasi selesai, larutan asam borat pada inner chamber blanko dititrasi dengan larutan HCl 0,02 N sehingga warna larutan asam borat berubah menjadi merah muda. 5) Selanjutnya larutan asam borat pada inner chamber dari contoh dititrasi dengan larutan HCl 0,02 N sampai diperoleh warna merah muda yang sama dengan blanko. Nilai TVB dihitung dengan menggunakan rumus perhitungan : Nilai TVB (mg N%) = (ml titrasi contoh-ml titrasi blanko) x N HCl x 14,007 x 100 ………...(7) ml contoh (9) Analisis Kadar TMA /Trimetil (DSN 1991) Prinsip kerjanya adalah daging ikan diekstrak dengan larutan trichloro acetic dan campuran ini disentrifuse atau disaring melalui kertas saring. Untuk penentuan kadar TMA, ke dalam filtrat ditambahkan formaldehida dan kalium karbonat sehingga dibebaskan senyawa TMA yang mudah menguap diserap oleh asam borat yang terdapat dalam ekstrak daging ikan yang bersifat basa pada suhu 35oC selama 2 jam atau pada suhu kamar selama semalam. Senyawa tersebut diikat oleh asam borat kemudian titrasi dengan asam khlorida 0,02 N dengan campuran metil merah dan bromcresol green sebagai indikator. 1) Tahap persiapan contoh Contoh dicacah hingga halus, kemudian ditimbang
+ 25 gram dan
dimasukkan ke dalam blender lalu ditambahkan 75 ml larutan trichloro acetic acid (TCA) 7% dan diblender selama 1 menit. Larutan tersebut disaring dengan kertas saring sehingga diperoleh filtrat yang jernih. Sebelum dianalisis, filtrat dapat disimpan dalam kulkas.
38
2) Tahap analisa TMA 1) Larutan asam borat dipipet sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke bagian dalam (inner chamber) cawan Conway, dengan menggunakan mikro pipet 1 ml yang lain, filtrat contoh dimasukkan ke bagian luar (outer chamber) cawan Conway sebelah kiri, kemudian ditambahkan 1 ml K2CO3 jenuh pada bagian luar (outer chamber) cawan Conway sebelah kanan serta ditambahkan 0,5 ml formaldehida pada bagian luar (outer chamber) di antara filtrat dan K2CO3 jenuh dan cawan Conway segera ditutup rapat (bagian pinggir cawan Conway dan tutupnya harus sudah diolesi dengan vaselin agar diperoleh penutupan yang rapat). 2) Pada pembuatan blanko, filtrat contoh diganti dengan larutan TCA 7% dan dikerjakan dengan prosedur yang sama. Setiap contoh dan blanko dikerjakan secara duplo. 3) Penyusunan cawan Conway pada rak inkubator dilakukan secara hati-hati, kemudian cawan digoyang secara perlahan-lahan selama 1 menit dan diinkubasi pada suhu 35oC selama 2 jam atau pada suhu kamar selama semalam. 4) Setelah inkubasi selesai, larutan asam borat pada inner chamber blanko dititrasi dengan larutan HCl 0,02 N sehingga warna larutan asam borat berubah menjadi merah muda. 5) Selanjutnya larutan asam borat pada inner chamber dari contoh dititrasi dengan larutan HCl 0,02 N sampai diperoleh warna merah muda yang sama dengan blanko. Nilai TMA dihitung dengan menggunakan rumus perhitungan: Nilai TMA = (ml titrasi contoh-ml titrasi blanko) x 0,2x100/1x 100/25 mgN..............(8) (10) Analisis Nilai pH (Yunizal et al. 1998) Nilai pH diukur dengan alat pH meter pada suhu 25oC. Cara kerjanya adalah 10 gram contoh yang sudah dihaluskan dilarutkan dengan 25 ml aquades dalam erlenmeyer, kemudian elektroda dicelupkan ke dalam larutan contoh. Nilai
39
pH dibaca pada layar. Elektroda harus dibilas aquades setiap kali akan dilakukan pengukuran contoh berikutnya. (11) Analisis Kadar Garam (Yunizal et al. 1998) 1) Ke dalam erlemeyer 300 ml dimasukkan contoh sebanyak 0,5 – 1 g contoh basah (0,3 – 0,5 g contoh kering). 2) Ke dalam erlemeyer tersebut ditambahkan larutan standar AgNO3 0,1 N sebesar volume tertentu (misal 25 ml), untuk mengendapkan semua khlorida sebagai AgCl dan kemudian ditambahkan 20 ml larutan HNO3 (1:1). 3) Pipa kaca pendingin dipasang tegak pada erlemeyer yang panjangnya 1,5 m, kemudian dipanaskan perlahan-lahan di atas pemanas listrik hingga seluruh contoh larut kecuali AgCl, biasanya memakan waktu kurang lebih 15 menit. 4) Setelah dingin ke dalam erlemeyer tersebut ditambahkan 50 ml aquades dan 5 ml indikator amonium ferrisulfat jenuh. Larutan dititrasi dengan larutan 0,1 N kaliumthiocyanat 0,1 N sampai larutan berwarna coklat terang (light brown color). 5) Blanko dibuat seperti prosedur analisis di atas, tetapi tidak menggunakan contoh. Perhitungan : Kadar Garam NaCl = 58,45 (A – B) x C x 100% x FP ..................................(9) 1000 x D A = ml KCNS blanko B = ml KCNS contoh C = Normalitas KCNS D = Berat contoh 3.3.2.2 Analisis Mikrobiologi (1) Penentuan Hitungan Bakteri Total/TPC ( Ditjen Perikanan 1988) Media yang digunakan adalah Nutrien Agar (NA), caranya dengan melarutkan 28 gr bubuk NA dalam 1 liter air destilasi di dalam labu erlenmeyer ukuran besar. Larutan tersebut kemudian disterilkan dalam “ autoclave ” selama
40
15 menit pada tekanan 1 atm dan suhu 1210C. Setelah disterilisasi suhu media dipertahankan pada 45 – 550C dalam oven. Sebanyak 25 g contoh yang telah dipotong halus dilarutkan dalam 225 ml larutan garam fisiologis 0,9% steril, sehingga didapatkan pengenceran 10-1. Dari larutan contoh tersebut diambil 1 ml dengan pipet, kemudian dimasukkan ke dalam botol yang berisi 9 ml garam fisiologis steril untuk memperoleh pengenceran 10-2. Demikian seterusnya sampai diperoleh pengenceran kelima. Kemudian ke dalam setiap cawan petri ditambahkan 1 ml larutan sampel yang telah diencerkan dan 10 ml media NA, kemudian cawan petri digoyang-goyang agar NA merata, dibiarkan beberapa menit agar membeku. Setelah media membeku dituangkan lagi 5 ml media NA ddan dibiarkan membeku, lalu cawan petri disimpan dalam posisi terbalik di dalam inkubator pada suhu 370C selama 48 jam. Cara perhitungan dipilih cawan petri yang mempunyai koloni antara 30 – 300 buah. Jika perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut <2, maka nilai yang diambil adalah rata-rata dari kedua nilai tersebut dengan memperhatikan pengencerannya. Jika hasil perbandingannya >2, maka diambil hasil pengenceran yang terendah atau terkecil. (2) Analisis Enterobacter media VR BG agar dengan Overlay Media yang digunakan adalah Violet Red Bile Glukosa agar (VRBG) agar, caranya dengan melarutkan 38,5 g bubuk VRBG dalam 1 liter air destilasi di dalam labu erlenmeyer ukuran besar. Larutan tersebut kemudian dipanaskan pada suhu 100oC selama 5 menit. Setelah dipanaskan suhu media dipertahankan pada 45 – 550C dalam oven. Sebanyak 25 g contoh yang telah dipotong halus dilarutkan dalam 225 ml larutan garam fisiologis 0,9% steril, sehingga didapatkan pengenceran 10-1. Dari larutan contoh tersebut diambil 1 ml dengan pipet, kemudian dimasukkan ke dalam botol yang berisi 9 ml garam fisiologis steril untuk memperoleh pengenceran 10-2. Demikian seterusnya sampai diperoleh pengenceran kelima.
41
Kemudian ke dalam setiap cawan petri ditambahkan 1 ml larutan sampel yang telah diencerkan dan 10 ml media VRBG, lalu cawan petri digoyang-goyang agar VRBG merata, dibiarkan beberapa menit agar membeku. Setelah media membeku tuangkan lagi 5 ml media VRBG dan dibiarkan membeku, kemudian cawan petri disimpan dalam posisi terbalik di dalam inkubator pada suhu 370C selama 48 jam. Cara perhitungan dipilih cawan petri yang mempunyai koloni antara 30 – 300 buah. Jika perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut <2, maka nilai yang diambil adalah rata-rata dari kedua nilai tersebut dengan memperhatikan pengencerannya. Jika hasil perbandingannya >2, maka diambil hasil pengenceran yang terendah atau terkecil. (3) Analisis H2S producer dengan Overlay Media yang digunakan adalah formula agar dengan cara melarutkan : 9
beef extract 3,0 g
9
yeast extract 3,0 g
9
peptone (protease) 5,0 g
9
tryptone 15,0 g
9
ferric citrate 0,3 g
9
cysteine HCl 0,4 g
9
NaCl 5,0 g
9
Sodium thiosulphate.5H2O 0,5 g
9
Agar 15 g
dalam 1 liter air destilasi di dalam labu erlenmeyer ukuran besar. Larutan tersebut kemudian disterilkan dalam “ autoclave ” selama 15 menit pada tekanan 1 atm dan suhu 1210C. Setelah disterilisasi suhu media dipertahankan pada 45 – 550C dalam oven. Sebanyak 25 g contoh yang telah dipotong halus dilarutkan dalam 225 ml larutan garam fisiologis 0,9% steril, sehingga didapatkan pengenceran 10-1. Dari larutan contoh tersebut diambil 1 ml dengan pipet, kemudian dimasukkan ke dalam botol yang berisi 9 ml garam fisiologis steril untuk memperoleh
42
pengenceran 10-2. Demikian seterusnya sampai diperoleh pengenceran kelima. Kemudian ke dalam setiap cawan petri ditambahkan 1 ml larutan sampel yang telah diencerkan dan 10 ml media formula H2S producer, kemudian cawan petri digoyang-goyang agar media formula H2S producer merata, dibiarkan beberapa menit agar membeku. Setelah media membeku dituangkan lagi 5 ml media formula H2S producer dan biarkan membeku, kemudian cawan petri disimpan dalam posisi terbalik di dalam inkubator pada suhu 370C selama 48 jam. Cara perhitungan dipilih cawan petri yang mempunyai koloni antara 30 – 300 buah. Jika perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari kedua pengenceran tersebut <2, maka nilai yang diambil adalah rata-rata dari kedua nilai tersebut dengan memperhatikan pengencerannya. Jika hasil perbandingannya >2, maka diambil hasil pengenceran yang terendah atau terkecil. 3.2.3.3 Uji organoleptik (SNI 01-2346-1991) Uji organoleptik yaitu uji dengan menggunakan indera manusia, kadangkadang disebut uji sensorik karena penilaiannya didasarkan pada rangsangan sensorik pada organ indera (Soekarto 1985). Uji organoleptik secara hedonik juga dilakukan terhadap produk ikan kembung segar yang menggunakan campuran biji picung dan garam, dengan kriteria mutu yang dinilai meliputi rupa, warna, tekstur, aroma dan rasa (DSN 1991). Pengujian dilakukan dengan menggunakan panelis sebanyak 10 orang. Uji hedonik disebut dengan uji kesukaan, pengujian ini bertujuan mengetahui tanggapan panelis terhadap semua produk yang dihasilkan berikut produk kontrol dan tingkat kesukaannya. Penilaian oleh orang dewasa dilakukan menurut skala hedonik dengan kategori penilaian sebagai berikut: 9 1 = sangat tidak suka 9 2 = tidak suka 9 3 = biasa 9 4 = suka 9 5 = sangat suka
43
3.4 Analisis Data Rancangan percobaan yang digunakan untuk penelitian hasil analisis kimia dan mikrobial adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan tiga kali ulangan. Perlakuan penambahan picung dan garam masing-masing dengan dua taraf dan tiga kali ulangan. Pengaruh perlakuan dianalisis dengan memakai uji F. Konsentrasi garam terdiri dari: α1 = 2% dan α2 = 3% 1) Konsentrasi picung terdiri dari: β1 = 2%, β2 = 4% dan β3 = 6% Model rancangan percobaan tersebut menurut Steel dan Torrie (1993) dan Gaspersz (1991) adalah sebagai berikut : Yijk = υ + αi + βj + (αβ)ij + Εijk Keterangan: Yij
= Nilai pengamatan (respon) pada satuan perlakuan ke-k, yang memperoleh kombinasi perlakuan ij (taraf ke-i dari faktor α dan taraf ke-j dari faktor β)
υ
= Nilai rata-rata pengamatan
αi
= Pengaruh aditif/penambahan garam taraf ke-i (i = 0, 1, 2, 3,4, 5)
βj
= Pengaruh aditif/penambahan picung taraf ke-j (j = 0, 2, 4, 6, 8, 10)
(αβ)ij = Pengaruh interaksi antara perlakuan α taraf ke-i dan perlakuan β taraf ke-j Εijk
= Pengaruh galat dari satuan percobaan ke-k yang memperoleh kombinasi perlakuan ij
Hipotesa : Ho : u1 = u2 = u3 H1 : u1 ≠ u2 Kriteria uji : - bila F hitung > atau = F tabel, maka Ho ditolak pada taraf α % - bila F hitung < F tabel, maka tidak ditolak Ho pada taraf α % Bila uji F berbeda nyata maka rata-rata hasil pengamatan dari perlakuan dilakukan uji lanjutan yaitu dengan uji t dan Uji Duncan atau dilanjutkan dengan uji Beda Nyata jujur (BNJ) kriteria uji : Jika d ≤ BNJ α = tα/2 (dbs) x V KTS ; Ho diterima
44
n d > BNJ α = tα/2 (dbs) x V KTS ; Ho ditolak n d = Ixi.-xi.I d = harga mutlak dari beda dua nilai tengah perlakuan yang di uji Untuk pengujian secara statistik data organoleptik diuji dengan metode non parametrik dengan uji Kruskal Wallis dengan formula sebagai berikut : H =
1 {ε i Ri2 S2
- N ( N + 1)2}
rI
4
Keterangan : H
= Nilai pengamatan respon
εi RI
= banyaknya ulangan pada perlakuan ke-i
N
= banyaknya nilai pengamatan
εi RI
= semua perlakuan mempunyai ulangan yang sama sebanyak r
S2
= 1
{ ε ij R2ij – N (N + 1)2 }
N-1 Rij
4
= pangkat dari satuan percobaan ulangan ke j dari perlakuan ke-I
Hipotesa : Ho : u1 = u2 = u3
H1 : u1 ≠ u2
Kriteria Uji : - bila H < X2 tabel, maka Ho ditolak pada taraf α % - bila H > X2 tabel, maka Ho tidak ditolak pada taraf α % Apabila hasil uji berbeda nyata maka harus dilakukan uji lanjut dengan menggunakan uji lanjut Multiple Comparison dengan kriteria uji sebagai berikut : [ Ri - Rj] >< Z α/2p ((n +1))k/6)0,5 P = K(k – 1)/2 dimana k adalah banyaknya perlakuan Analisis statitika dilakukan menggunakan program SPSS versi 13.0 dan analisis dilakukan secara deskriptif terhadap data yang akan dihasilkan.
45
