BAHAN DAN METODE. Metode Penelitian

BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini berlangsung selama 7 bulan, dimulai dari bulan Juni sampai Februari 2012 di Laboratorium Bakteriologi Balai Besar Veteriner CimangguBogor. Uji Fitokimia dilakukan di Laboratorium Biokimia, Departemen Biokimia FMIPA IPB. Karakterisasi dengan GC-MS pyrolisis dilakukan di Laboratorium Hasil Hutan Balai Penelitian Dan Pengembangan Kehutanan, Sindang Barang Bogor. Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan adalah daun dan bunga Kitolod yang diambil dari daerah Pondok Cabe Pamulang-Tangerang, biakan bakteri Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumonia (Gram pos itif) , da n Pseudomonas aeruginosa, (Gram negatif) yang diperoleh dari koleksi bakteri Laboratorium BALITVET Cimanggu Bogor, desinfektan, glukosa, kloramfenikol 20%, etanol 70%, Mueller Hinton agar (MHA), darah domba, akuades, kloroform, NH4 OH, H2 SO4, CH3 COOH, pereaksi Dragendorf, pereaksi Meyer, pereaksi Wagner, Metanol 30%, pereaksi Lieberman Burchard, da n FeCl3 1% (b/v). Alat-alat yang digunakan antara lain adalah alat-alat gelas, jarum ose, cawan Petri, autopipet, lemari pendingin, pH meter, laminar air flow cabinet, pembakar bunsen, lup inokulasi, shaker mixer, kertas saring, penangas air, oven, autoklaf, eksikator, neraca analitik, rotary evaporator, inkubator, GC MS pyrolisis, aluminium foil, dan jangka sorong. Metode Penelitian Penetapan kadar air (AOAC 1995) Cawan porselen dimasukkan ke dalam oven bersuhu 105 0 C selama 20 menit, kemudian cawan porselen didinginkan dalam eksikator. Setelah dingin, cawan ditimbang. Sebanyak 2 gram serbuk daun dan bunga kitolod dimasukkan ke da lam masing- masing cawan porselen, kemudian masing- masing cawan porselen tersebut dimasukkan ke dalam oven selama 3 jam pada suhu 105 0 C. Setelah 3 jam cawan didinginka n dieksikator, selanjutnya cawan dan isinya

ditimbang. Perlakuan dilakukan sampai diperoleh bobot yang konstan. Kadar air dihitung dengan persamaan: % Kadar air = Bobot sampel – bobot kering x 100% Bobot sampel Preparas i Sampel daun kitolod Daun kitolod yang digunakan adalah daun yang tua (3-5 helai dari pucuk dengan bentuk daun yang sempurna dan berwarna hijau). Daun kitolod yang masih segar dicuci dengan air bersih dan ditiriskan dalam wadah yang berlubang agar sisa air yang tertinggal dapat dipisahkan. Setelah itu dikeringkan di udara terbuka yang tidak langsung terkena matahari. Daun kitolod kering kemudian dihaluskan dengan menggunakan blender menjadi bubuk halus. Preparasi sampel daun kitolod dilakukan dengan metode ekstraksi dengan cara maserasi. Ekstraksi daun kitolod Bubuk daun kitolod yang kering diekstraksi de ngan metode maserasi ya itu 39,13 gram serbuk daun kitolod direndam dalam 391,3 ml etanol 70% pada suhu ruang selama 3 x 24 jam dan ditutup dengan aluminium foil. Setiap 24 jam dilakukan penyaringan. Selanjutnya filtrat hasil penyaringan dipekatkan dengan rotavapor pada suhu 40 0 C, sehingga akan dihasilkan ekstrak etanolnya. Residu yang diperoleh ditimba ng dan ditentuka n rende mennya. Rendemen (%) = Berat rendemen x 100% Berat sampel awal Selanjutya ekstrak etanol dari daun kitolod dilarutkan dalam akuades steril dengan konsentrasi 200 mg/ml, lalu disimpan di cool room. Preparas i Sampel bunga Kitolod Bunga kitolod dipotong 2 cm di bawah mahkota bunganya yang masih segar dan mekar sempurna, ke mudian bunga kitolod dicuci dengan akuades, dan disaring menggunakan saringan stainless steel. Ditimbang 20,33 gram bunga kitolod yang sudah bersih, lalu dimaserasi dalam 203,3 ml etanol 70% pada suhu ruang selama 3 x 24 jam dan ditutup dengan aluminium foil. Setiap 24 jam dilakukan penyaringan. Selanjutnya filtrat hasil penyaringan dipekatkan dengan

rotavapor pada suhu 40 0 C, sehingga akan dihasilkan ekstrak etanolnya. Residu yang diperoleh ditimba ng dan ditentuka n rende mennya. Rendemen (%) = Berat rendemen x 100% Berat sampel awal Kemudian ekstrak etanol dari bunga kitolod dilarutkan da lam akuades steril dengan konsentrasi 200 mg/ml, lalu disimpan di cool room. Ekstrak etanol bunga dan daun kitolod ini yang akan ditentukan aktivitas anti bakterinya. Selanjutnya ditentukan konsentrasi hambat minimumnya dengan variasi konsentrasi

200

mg/ml, 150 mg/ml, 100 mg/ml, 50 mg/ml, 25 mg/ml, da n 12,5 mg/ml, lalu dilakukan uji fitokimia dan dikarakterisasi senyawanya dengan menggunakan GCMS pyrolisis Analisis Fitokimia ( Harborne 2006). Penelitian ini menggunakan dua sampel yaitu ekstrak etanol bunga kitolod dan ekstrak etanol daun kitolod. Selanjutnya kedua sampel tersebut diuji fitokimianya. Uji fitokimia yang dilakukan dalam penelitian ini meliputi uji alkaloid, steroid, terpenoid, saponin, flavonoid, dan tanin. Uji Alkaloid. Sebanyak 1 ml sampel ditambah 5 ml kloroform dan beberapa tetes NH4 OH. Fraksi kloroform dipisahkan, da n diasamkan dengan 1 tetes H2 SO4 2M serta dikocok hingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan asam yang tidak berwarna dibagi menjadi 3 tabung, kemudian masing- masing tabung ditambahkan dengan pereaksi alkaloid yaitu pereaksi Dragendor f, Meyer dan Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya endapan putih kekuningan dengan pereaksi Meyer, endapan merah dengan pereaksi Dragendorf, dan endapan coklat dengan pereaksi Wagner. Uji Flavonoid. Sebanyak 1 ml sampel ditambahkan dengan 5 ml metanol 30%, kemudian dipanaska n pada suhu 50

0

C selama 5 menit, kemudian larutan tersebut

dihomogenkan dan ditetesi 5 tetes H2 SO4 (p). Adanya flavonoid ditandai dengan terbentuknya warna merah

Uji Steroid dan Triterpenoid Sebanyak 1 ml sampel ditambah dengan 2 ml kloroform, kemudian larutan ditambahkan 10 tetes asam asetat anhid rida dan 3 tetes H2 SO4 (p). Laruan dkocok perlahan dan dibiarkan beberapa menit. Uji positif ditandai dengan terbentuknya warna hijau (senyawa steroid) dan warna merah atau ungu (triterpe noid) Uji Saponin. Sebanyak 1 ml sampel ditambah de ngan 5 ml akuades kemudian dipanaskan pada suhu 50 0 C selama 5 menit, lalu dikocok selama 5 menit. Adanya saponin ditunjukkan dengan terbentuknya busa setinggi kurang lebih 1 cm secara stabil setelah didiamkan selama 15 menit dan tidak hilang pada penambahan 1 tetes HCl 2 N. Uji Tanin. Sebanyak 1 ml sampel ditambah dengan 5 ml akuades lalu dipa naska n pada suhu 50 0 C selama 5 menit. Larutan kemudian disaring da n filtratnya ditambahkan 5 tetes FeCl3 1% (b/v). Ada nya warna biru tua atau hijau kehitaman yang terbentuk menunjukkan adanya tanin. Regeneras i Bakteri Bakteri yang akan digunakan harus diregenerasi terlebih dahulu sebelum dipakai untuk uji antibakteri yaitu dengan memilih koloni-koloni yang terpisah dari masing- masing bakteri uji sebanyak 1 ose. Digoreskan biakan dari stok bakteri tersebut ke permukaan agar miring yang masih baru. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 24 jam. Biakan tersebut merupakan aktivitas awal dari stok bakteri yang telah disimpan pada suhu 4-5 0 C, dari biakan tersebut diambil 1 mata ose dan diinokulasikan ke tabung reaksi yang berisi 10 ml akuades, sehingga mempunyai kekeruhan sesuai dengan suspensi McFarland no.3 yaitu 9 x 10 9 sel/bakteri. Kemudian dari larutan suspensi tersebut dipipet 0,5 ml keda lam 4,5 ml akuades sehingga diperoleh konsentrasi 10-6 bakteri/ml.

Uji

Aktivitas

Antibakteri

Metode

Difusi

Agar

terhadap

bakteri

Staphylococcus aureus dan Pseudomonas aeruginosa (Denyer & Hugo 1991; Garriga et al. 1993). Cawan Petri yang berisi media agar Mueller Hinton yang masih cair sebanyak 20 ml didinginkan hingga memadat. Kemudian setelah media memadat, diberi bakteri uji yang telah diregenerasi sebanyak 1 ml dan diratakan ke dalam cawan petri dengan metode pour plate. Media dibiarkan selama 10 menit, lalu sisa bakteri uj i diambil dengan menggunakan pipet mikro steril. Kertas cakram steril de ngan diameter 6 mm dicelupkan dalam 200 mg/ml ekstrak etanol daun kitolod atau bunga kitolod selama 15 menit, kertas cakram juga dicelupkan dalam kloramfenikol 20% sebagai kontrol positif, lalu kertas cakram dimasukkan kedalam cawan petri yang be risi media Mueller Hinton agar yang telah membeku, tiap cawan berisi 3 kertas cakram. Selanjutnya biakan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0 C di dalam inkubator. Daerah bening disekitar paper disk menunjukkan uji positif. Diameter zona hambat (bening) yang terjadi diuk ur de ngan jangka sorong. Masing- masing perlakuan dilakuka n tiga kali ulangan. Uji Aktivitas Antibakteri Metode Difusi Agar te rhadap bakteri Streptococcus pneumonia (Denyer & Hugo 1991; Garriga et al. 1993). Sebanyak 18 ml Media agar Mueller Hinton yang masih cair da n 1 ml darah domba dimasukkan ke dalam cawan petri dan dibiarkan memadat pada suhu ka mar. Setelah media memadat, lalu diberi bakteri Streptococcus pneumonia yang telah diregenerasi sebanyak 1 ml dan diratakan ke dalam cawan petri dengan metode tebar (pour plate) dan dibiarka n selama 10 menit. Sisa bakt eri uji diambil dengan menggunakan pipet mikro steril. Kertas cakram steril de ngan diameter 6 mm dicelupkan dalam 200 mg/ml ekstrak etanol daun atau bunga kitolod selama 15 menit, kertas cakram juga dicelupkan dalam kloramfenikol 20% sebagai kontrol positif, lalu kertas cakram tersebut dimasukkan kedalam cawan petri yang berisi media agar yang telah memadat, tiap cawan berisi 3 kertas cakram. Selanjutnya biaka n dimasukk an ke da lam bejana anaerob unt uk menciptakan suasana anaerob. Lalu bejana anaerob yang be risi biakan dalam cawan petri tersebut diinkubasi selama 24 jam pada suhu

37 0 C di dalam inkubator. Daerah bening disekitar paper disk menunjukkan uji positif. Diameter zona hambat (bening) yang terjadi diukur dengan jangka sorong, lalu diba ndingka n dengan senyawa standar antibiotik kloramfenikol 20% sebagai kontrol positif. Selanjutnya kedua sampel tersebut ditentukan konsentrasi hambat minimumnya. Masing- masing perlakuan dilakuka n tiga ka li ulangan. Penentuan konsentras i hambat Minimum (MIC) metode David & Stout (1971) Sampel (ekstrak etanol bunga dan daun kitolod) yang mempunyai aktivitas antibakteri disiapkan dengan berbagai ko nsentrasi 200 mg/ml, 150 mg/ml, 100 mg/ml, 50 mg/ml, 25 mg/ml, da n 12,5 mg/ml. Secara steril kertas cakram dengan diameter 6 mm dicelupkan dalam sampel dengan berba gai variasi ko nsentrasi tersebut selama 15 menit, kemudian kertas cakram tersebut dimasukka n dalam cawan petri yang berisi media agar Mueller Hinton yang telah diinok ulasi bakteri uji sebanyak 1 ml, tiap cawan berisi 6 kertas cakram. Selanjutnya biakan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 0 C di dalam inkubator. Masing- masing perlakuan dilakukan tiga ka li ulangan. MIC diperoleh dari konsentrasi terendah (mg/ml) ekstrak yang disebarkan pada media agar yang memperlihatkan terbe ntuknya zona bening terkecil. Analisis GC-MS Pyrolisis (Shimadzu 2004) Identifikasi senyawa akt if yang berperan sebagai anti bakteri dilakukan dengan menggunakan GC-MS Pyrolisis. Jumlah senyawa yang terdapat dalam ekstrak ditunjukkan oleh jumlah puncak (peak) pada kromatogram, sedangkan nama/jenis senyawa yang ada diinterpretasikan berdasarkan data spektra dari setiap puncak tersebut dengan menggunakan metode pendekatan pustaka pada database GC-MS Pyrolisis. Sampel yang diidentifikasi senyawa kimanya adalah sampel yang mempunyai aktivitas anti bakteri penyebab konjungtivitis. Sebanyak 2 µl Sampel dimasukkan ke dalam pyrolyzer, lalu diidentifika si dengan GC-MS Pyrolisis. Karakteristik GC-MS Pyrolisis untuk analisis ini adalah GCMS-QP2010S Shimadzu, Jenis ko lom Rtx-5MS, panjang kolom 30 m, diameter kolom 0,25 mm, temperatur limit dari 80 o C- 300 o C dengan kenaikan suhu 10 o C/menit, laju alir

1ml/menit, Suhu oven 70 0 C- 290 0 C, suhu interface 280 0 C, dan gas pembawa Helium dengan tekanan sebesar 22 kPa.