III BAHAN DAN METODE PENELITIAN
3.1
Bahan dan Peralatan Penelitian
3.1.1 Bahan yang Digunakan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut : 1. Aquades 2. Sarang Lebah 3. Media Nutrien Agar 4. Spirtus 5. Lactose Broth
3.1.2 Peralatan yang Digunakan Alat yang akan digunakan dalam penelitian ini adalah sebagai berikut : 1. Osse 2. Cawan petri 3. Alat suntik 4. Kertas saring 5. Bunsen 6. Mortar 7. Mortir 8. Penggaris 9. Tabung Durham 10. Tabung Erlenmeyer 11. Autoclave
31 12. Pemanas Air 13. Oven 14. Gelas ukur 15. Timbangan 16. Tabung reaksi 17. Pipet 18. Bulb pipet 19. Batang pengaduk 20. Alumunium foil 21. Jangka sorong 22. Inkubator 23. Beker glass 24. Kapas 25. Kasa 26. Kertas Label 27. Pengikat 28. Pisau
3.2
Prosedur Penelitian Metode RODAC (the Replicate Organism Direct) merupakan suatu
metode penghitungan jumlah mikroba yang terdapat pada permukaan suatu bahan seperti lantai, peralatan, meja, dll (Lukman dan Soejoedono, 2009). Adapun prosedur kerja penelitian ini sebagai berikut :
32 3.2.1 Persiapan Alat Seluruh alat yang akan digunakan, dicuci dan kemudian dikeringkan dengan strerilisasi kering dalam oven bersuhu 1300C selama 30 menit.
3.2.2 Persiapan Media Nutrien Agar 1. Menimbang nutrien
agar sebanyak 23 gram, kemudian disimpan
dalam tabung Erlenmeyer. 2. Mengukur aquades sebanyak 1000 ml dan dimasukkan dalam tabung Erlenmeyer yang telah berisi nutrien agar. 3. Kemudian bahan dipanaskan diatas api kecil dengan diaduk hingga homogen. 4. Bahan dimasukkan dalam alat suntik hingga penuh. 5. Alat suntik disterilkan dengan metode sterilisasi basah menggunakan autoclav pada suhu 1210C selama 15 menit.
3.2.3 Persiapan larutan 1.
Sarang lebah ditimbang sebanyak 125 gram untuk konsentrasi 50%, 150 gram untuk konsentrasi 60% dan 175 gram untuk konsentrasi 70%.
2.
Masing-masing bahan disimpan dalam tabung erlenmeyer dan ditambahkan aquades sebanyak 250 ml.
3.
Larutkan hingga homogen.
33 3.2.4 Perhitungan Zona Hambat yang Dihasilkan Oleh Bakteri Permukaan Lantai 1. Lactos broth ditimbang sebanyak 13 gram dan disimpan dalam tabung erlenmeyer. 2. Aquades sebanyak 1 liter dimasukkan dengan perlahan dalam erlenmeyer dan dihomogenkan diatas api kecil. 3. Setelah homogen, erlenmeyer ditutup rapat dengan penutup dan disteriliasasikan dengan menggunakan aoutoclave dengan suhu 1210C selama 15 menit. 4. Kultur bakteri total ruang penyimpanan susu yang telah diinkubasikan dimasukkan dalam lactos broth dan dibiakkan selama 24 jam. 5. Nutrien agar steril dituangkan dalam cawan petri sebanyak ± 15 ml dan ditambahkan kultur bakteri sebanyak 1 ml. 6. Setelah nutrien agar membeku, lubangi nutrien agar dengan menggunakan tabung durham berdiameter 5 mm untuk membuat sumur. 7. Sumur ditetesi larutan sarang lebah sebanyak 1 tetes dan ditutupi dengan kertas saring steril. 8. Semua cawan petri diinkubasikan dengan suhu 370C selama 24 jam. 9. Hitung diameter zona bening yang terlihat disekitar kertas saring dengan menggunakan jangka sorong. 3.2.5 Pengambilan dan Perhitungan Total Bakteri Sampel Permukaan Lantai Ruang Penyimpanan Susu 1. Bagian ujung alat suntik yang telah berisi nutrien agar steril dibuka.
34 2. Alat suntik didorong hingga agar menonjol keluar hingga setebal ± 5 mm, lalu agar tersebut ditempelkan pada lantai yang akan diambil bakterinya. 3. Selanjutnya dengan pisau steril agar dipotong dan dimasukkan ke dalam cawan petri steril dan ditutup. Bagian agar yang kontak dengan lantai menghadap ke atas. 4. Kemudian larutan sarang lebah dioleskan pada lantai yang akan diambil sampel bakteri 5. Setelah 10 menit agar ditempelkan kembali ke lantai yang telah diberi sarang lebah, dipotong dengan ketebalan 5 mm dan dimasukkan dalam cawan petri steril. Peosedur diatas dilakukan pada berbagai macam konsentrasi dan lantai yang digunakan sesuai dengan tata letak percobaan. 6. Semua cawan petri diinkubasikan pada suhu 370C selama 24 jam (posisi cawan tidak dibalik). 7. Diamati adanya pertumbuhan mikroba, dihitung dan dinyatakan jumlah koloni per 100 cm2. Dengan menggunakan rumus sebagai berikut :
8. Perhitungan presentase penurunan jumlah bakteri ruang penyimpanan susu dilakukan dengan perhitungan berikut :
35 3.3
Metode Penelitian
3.3.1 Peubah yang diamati Adapun peubah yang diamati dalam penelitian ini adalah sebagai berikut : 1. Zona hambat 2. Penurunan jumlah bakteri
3.3.2 Rancangan Percobaan dan Analisis Statistika Penelitian ini dilakukan secara eksperimental
laboratorium dengan
menggunakan Rancangan Acak Lengkap/ RAL (Completely Randomized Design) yang terdiri dengan empat perlakuan konsentrasi sarang lebah, yaitu P1 = 50%, P2 = 60% dan P3 = 70%. Masing masing perlakuan diulang sebanyak enam kali. Data hasil pengamatan yang telah diperoleh diuji dengan menggunakan analisis sidik ragam, kemudian dilanjutkan pengujian dengan menggunakan uji Tukey untuk mengetahui pengaruh antar perlakuan. Model persamaan matematik yang digunakan menurut Gaspersz (1995) adalah: Yij = + i + ij Keterangan : Yij = Respon atau nilai pengamatan dari perlakuan larutan sarang lebah ke-i ulangan ke-j (1,2,3,4,5,6) = Nilai tengah umum (rata-rata) i = Pengaruh perlakuan larutan sarang lebah ke-i (50%, 60%, dan 70%) ij = Galat percobaan dari perlakuan ke-i ulangan ke-j Asumsi : 1. Bersifat aditif.
36 2. Nilai ij ~ NID (0, σ2) artinya ԑij menyebar secara normal dengan nilai tengah = 0 dan ragam sebesar σ2.
Bentuk hipotesis yang diuji adalah : H0 : P2 ≤ P1 ≤ P3 H1 : P2 > P1 > P3 atau minimum ada satu perlakuan yang tidak sama memberikan pengaruh dan perlakuan tersebut. Tabel 2. Daftar Sidik Ragam Sumber Keragaman dB
JK
KT
Perlakuan (P)
(p – 1) = 2
JKP
KTP
Galat (G)
p(u – 1) = 15
JKG
KTG
Total
(u.p – 1) = 17
JKT
Fhit
F0,05
Keterangan : DB = Derajat bebas JK = Jumlah kuadrat KT = Kuadrat tengah G = Galat P = Perlakuan (P1, P2, P3) U = Ulangan (U1, U2, U3, U4, U5, U6. Kaidah keputusan : Jika, P < 0,05, Tolak H0 , berbeda nyata (signifikan) Jika, P ≥ 0,05, Terima H0 , tidak berbeda nyata (non signifikan) Apabila terdapat perbedaan antar perlakuan, maka dilakukan pengujian menggunakan Uji Tukey adalah sebagai berikut : HSD = qα (p,fe)sγ
37 Keterangan : HSD = Honestly Significant Difference Qα = Nilai tabel untuk uji tukey P = Jumlah perlakuan fe = Derajat bebas galat sγ = Galat baku nilai tengah KTG = Kuadrat Tengah Galat R = Banyaknya ulangan
Kaidah keputusan : Bila d ≤ HSD, maka tidak berbeda nyata Bila d > HSD,maka berbeda nyata
38 Pada penelitian ini dilakukan pengacakan setiap unit percobaan memiliki peluang yang sama pada kondisi pengambilan sampel bakteri terhadap perlakuan. Tata letak percobaan diperoleh dari hasil pengacakan menggunakan Tabel Daftar Acak sebagai berikut (Gaspersz, 1995) Tabel 3. Tata letak percobaan dilakukan seperti ilustrasi sebagai berikut : 1
2 P2
7
3 P2
8 P3
13
P1 9
P3 14
P1
4 P1 10 P2
15 P3
5 P1 11 P3
16 P1
Keterangan : P1 : Perlakuan dengan konsentrasi 50% P2 : Perlakuan dengan konsentrasi 60% P3 : Perlakuan dengan konsentrasi 70%
6
12 P2
17 P2
P3
P1 18
P3
P2
