BAHAN DAN METODE
Tempat dan Waktu Penelitian Survei penyakit mosaik dan koleksi sampel tanaman nilam sakit dilakukan di Kebun Percobaan Balai Tanaman Obat dan Aromatik (BALITTRO) di daerah Gunung Bunder dan Cicurug, Jawa Barat. Deteksi virus dilakukan di Laboratorium Virologi, Departemen Proteksi Tanaman, Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilakukan dari bulan Maret sampai Desember 2011.
Metode Penelitian Penyiapan Sampel Tanaman Sampel tanaman nilam yang memperlihatkan gejala mosaik dikoleksi dari dua lokasi Kebun Percobaan Balittro di daerah Cicurug, Sukabumi dan daerah Gunung Bunder, Bogor. Setiap sampel yang diambil didokumentasikan dengan melihat gejala pada daun nilam yang diindikasikan merupakan asosiasi dengan Fabavirus yakni, mosaik dan modifikasi gejalanya; mosaik ringan, bintik-bintik, belang, hingga malformasi seperti daun mengeriting dan daun melekuk. Selanjutnya sampel daun nilam sakit dari lapangan digunakan sebagai sumber inokulum pertama dan diuji secara serologi menggunakan berbagai antiserum termasuk antiserum terhadap Fabavirus. Deteksi Virus dengan Teknik Serologi DAS-ELISA Teknik serologi melalui DAS-ELISA menggunakan produk DSMZ (Germany), dengan prosedur seperti yang telah dijelaskan oleh Clark & Adams (1977): IgG atau antiserum diencerkan pada coating buffer (1.59 g sodium carbonate [Na2CO3], 2.93 g sodium bicarbonate [NaHCO3], dan 0.20 g sodium azide [NaN3] dilarutkan dalam 900 ml H2O dengan mengatur pH pada 9.6 menggunakan HCl, kemudian jadikan larutan hingga 1000 ml). Dengan menggunakan perbandingan 1:1000, larutan dimasukkan ke setiap well pada microplate sebanyak 100 µl, diinkubasi selama 2–4 jam pada suhu 37 °C. Plate
11 dicuci dengan PBST-Tween (8.0 g sodium chloride [NaCl], 0.2 g monobasic potassium phospate [KH2PO4], 1.15 g dibasic sodium phospate [Na2HPO4], 0.2 potassium chloride [NaN2], dilarutkan dalam 900 ml H2O (pH diatur 7,4 dengan NaOH dan HCl) kemudian larutan ditambahkan H2O hingga volume menjadi 1000 ml, selanjutnya ditambahkan 0.5 Tween 20), kemudian plate dikeringkan dengan membalikkan plate diatas kertas tissue. Pencucian diulang tiga kali. Sampel (diekstraksi dengan ekstrak buffer PBST + 2% PVP [sediakan PVP-15 polyvinyl pyrrolidone]) lalu dimasukkan ke dalam tiap well sebanyak 100 µl dilanjutkan dengan inkubasi semalam. Setelahnya plate dicuci dengan PBST sebanyak tiga kali. Antivirus conjugate dilarutkan pada conjugate buffer (PBST+2% egg albumin [Sigma A-5253] sesuai rekomendasi), ditambahkan 100 µl di setiap well, inkubasikan selama 4 jam pada suhu 37 °C. Plate dicuci dengan PBST tiga kali. Kemudian siapkan substrat baru; 10 mg p-nitrophenyl phospate (Sigma; Fluka) yang dilarutkan pada 10 ml substrate buffer (97 ml diethanolamine, 600 ml H2O, 0.2 g sodium azide [NaN3], pH diatur 9.8 dengan HCl, dan volume dijadikan 1000 ml). Substrat tersebut ditambahkan sebanyak 100 µl dalam tiap well, lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 30, 60 dan 90 menit. Selama waktu-waktu tersebut plat mikrotiter diuji secara kuantitatif menggunakan ELISA-reader (Bio-RAD 550) pada panjang gelombang 405 nm. Dalam setiap pengujian disertakan kontrol negatif, yaitu tanaman sehat dan buffer. Pengujian dikatakan positif jika nilai absorban sampel yang diuji menunjukkan nilai dua kali (2X) lebih besar daripada kontrol negatif tanaman sehat. Deteksi dan Identifikasi secara Molekuler Ekstraksi RNA total. RNA total diekstraksi dari jaringan daun tanaman nilam bergejala penyakit mosaik dengan menggunakan kit komersial Bench-Top Protocols for Xprep Plant RNA Mini Kit (PKT; Korea). Tanaman yang diekstraksi merupakan tanaman yang telah diuji menggunakan ELISA dan positif Fabavirus. Tahapannya adalah sebanyak 0,1 g sampel daun digerus dengan menggunakan mortar dan pistil steril dengan bantuan nitrogen cair. Hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 ml dan ditambahkan 450 µl buffer XPRB yang mengandung 1% mercaptoethanol, kemudian dihomogenkan. Sampel
12 dipipet, lalu dimasukkan ke dalam filter column putih dan ditempatkan pada tabung koleksi 2 ml, lalu disentrifuse pada kecepatan 12000 rpm selama 2 menit. Supernatan dipipet tanpa menyentuh pelet dalam tabung koleksi, ukur volume supernatan yang diperoleh lalu dipindahkan ke dalam tabung mikro 2 ml baru. Kemudian ethanol 96% ditambahkan (sebanyak setengah dari volume supernatan) dan dicampur dengan rata. Sampel dimasukkan ke dalam XPPLR mini column merah, kemudian ditempatkan pada tabung koleksi 2 ml lalu disentrifuse pada kecepatan 12000 rpm selama 1 menit. Cairan yang terdapat pada tabung koleksi dibuang, kemudian ditambahkan 500 µl wash buffer 1 ke dalam XPPLR mini column, lalu ditutup dengan baik dan disentrifuse pada kecepatan 12000 rpm selama 1 menit. Cairan yang terdapat pada tabung koleksi dibuang, kemudian ditambahkan 700 µl wash buffer 2 ke dalam XPPLR mini column, lalu ditutup dengan baik dan disentrifuse pada kecepatan 12000 rpm selama 1 menit. Cairan yang terdapat pada tabung koleksi dibuang, kemudian untuk mengeringkan XPPLR
mini column disentrifuse selama 3 menit pada 12000 rpm. Untuk
meyakinkan bahwa tabung column telah kering, column dipindahkan pada tabung koleksi baru. Selanjutnya, 50 µl RNAse free water ditambahkan ke dalam pusat membran XPPLR mini column, didiamkan selama 1 menit lalu disentrifuse pada kecepatan 12000 rpm selama 2 menit. Siapan RNA total ini digunakan sebagai template dalam reaksi RT-PCR. Sintesis cDNA. Total RNA didenaturasi dengan pemanasan 5 menit pada suhu 95 °C. RNA hasil ekstraksi selanjutnya ditranskripsi balik menjadi cDNA (complementary DNA) dengan menggunakan teknik Reverse Transcription (RT) selama 1 jam pada suhu 42 °C. RNA. Konsentrasi reagensia yang digunakan dalam reaksi RT pada Tabel 1 dicampurkan dalam microtube. Reaksi RT dilakukan dalam sebuah mesin Automated Thermal cycler Gene Amp PCR System 9700; PE Applied Biosystem, USA) yang diprogram untuk satu siklus pada suhu 25 °C selama 5 menit, 42 °C selama 60 menit, dan 70 °C selama 15 menit. Hasil RT berupa cDNA digunakan sebagai DNA template dalam reaksi PCR.
13 Tabel 1 Komposisi reagensia Reverse Transcription (RT) (Promega; USA) untuk reaksi sintesis complementary DNA terhadap RNA genom Fabavirus isolat nilam Cicurug dan Gunung Bunder Volume (µl) a
Volume (µl) b
H2O
2,20
8,80
Buffer RT 5
2,00
4,00
DTT 50 mM
0,35
1,40
dNTP 10 mM
2,00
8,00
M-MuLV Rev
0,35
1,40
RNAse inhibitor
0,35
1,40
Oligo d(T) 10 mM
0,75
3,00
RNA template
2,00
8,00
Total volume (µl)
10,00
40,00
Komponen
a
Volume total yang diperlukan sebanyak 10 µl untuk 1X reaksi; bVolume total yang diperlukan sebanyak 40 µl untuk 4X reaksi
Amplifikasi DNA.
Total RNA hasil ekstraksi RNA dipakai sebagai
template untuk amplifikasi sebagian genom Fabavirus. Amplifikasi gen penyandi coat protein Fabavirus dilakukan dengan teknik RT-PCR menggunakan pasangan primer spesifik digunakan untuk mendeteksi Fabavirus yang terdiri dari forward primer
dan
reverse
primer,
yaitu
[BBWVVSSP
(5‟-
GTBTCDAGTGCTYTDGAAGG-3‟, B = C, G, atau T; D = A, G, atau T; Y = C atau T) dan BBWVKMRM (5‟-TDGWDCCATCVAGICKCATTTT-3‟, W = A atau T; V = A, C, atau G; I = Inosine; K = G atau T)] dengan prediksi ukuran produk 322 bp mencakup wilayah dari C-terminal dari large coat protein (LCP) ke N-terminal small coat protein (SCP) (Kondo et al. 2005). Selanjutnya cDNA yang dihasilkan dari proses RT diamplifikasi pada reaksi campuran dengan sejumlah pereaksi yang disajikan pada Tabel 2.
14 Tabel 2 Komposisi reagensia Polymerase Chain Reaction (PCR) (Promega; USA) amplifikasi gen coat protein (CP) Fabavirus isolat nilam Cicurug dan Gunung Bunder Volume(µl)a
Volume(µl)b
H2O
9,5
38
Go Tag Green Master Mix 2x
12,5
50
Primer BBWVVSSP
1
4
Primer BBWVKMRM
1
4
cDNA
1
4
Total Volume
25
100
Komponen
a
Volume total yang diperlukan sebanyak 25 µl untuk 1X reaksi; bVolume total yang diperlukan sebanyak 100 µl untuk 4X reaksi
Program PCR diatur untuk mengamplifikasi cDNA yang didahului dengan tahap denaturasi awal pada suhu 95 °C selama 5 menit. Dilanjutkan dengan 35 siklus yang terdiri dari denaturasi pada 95 °C selama 1 menit, penempelan primer (annealing) pada 51 °C selama 1 menit, dan pemanjangan (extention/elongation) pada 72 °C selama 1 menit. Khusus untuk siklus terakhir, ditambahkan 5 menit pada 72 °C untuk tahapan sintesis, dan siklus berakhir pada suhu 4 °C. Setelah dilakukan PCR, maka hasil yang diperoleh dapat dielektroforesis. Elektroforesis. Visualisasi hasil RT-PCR dilakukan dengan elektroforesis gel agarosa 1%. Sebanyak 0,3 gr agarosa dimasukkan ke dalam tabung Erlenmeyer 100 ml, lalu ditambahkan 30 ml buffer Tris-Borate EDTA (TBE) 0,5x (0,045 M Tris-Borate, 0,01 M EDTA), untuk pembuatan gel agarose. Kemudian dipanaskan dalam microwave oven selama 2 menit atau sampai agarose larut. Larutan agar didinginkan terlebih dahulu selama kurang lebih 15 menit, ditambahkan 1,5 µl ethidium bromida kemudian diaduk. Siapkan cetakan dan „sisir‟ gel yang diletakkan di bagian atas pencetak gel kemudian larutan agarose dituang ke dalam cetakan. Gel didiamkan sampai mengeras (30-45 menit). Setelah mengeras, gel diambil dan diletakkan ke dalam bak elektroforesis yang berisi buffer TBE 0,5 kali. DNA hasil PCR dimasukkan ke dalam sumur gel elektroforesis sebanyak 5 µl dan 100 bp DNA ladder dimasukkan pada sumuran gel elektroforesis yang berada di posisi sebelah kiri sebanyak 5 µl. Elektroforesis
15 dilakukan dengan tegangan 100 volt selama 25 menit. Hasil elektroforesis dilihat di bawah UV transluminator. Pita DNA yang terbentuk pada hasil elektroforesis tersebut didokumentasikan dengan kamera digital. Analisis sikuen nukleotida. Sampel yang terdeteksi positif terinfeksi Fabavirus pada tanaman nilam uji kemudian dianalisis sikuen nukleotidanya. Perunutan susunan nukleotida menggunakan sequencer machine ABI-Prism 3100Avant Genetic Analyzer. Hasil sikuen nukleotida dianalisis menggunakan software Blast yang dapat diakses di situs web National Center for Biotechnology Information (NCBI) [www.ncbi.nlm.nih.gov] untuk memperoleh kesamaan nukleotida yang didapatkan dan untuk mendapatkan file dalam format fasta berupa database nukleotida dari virus yang diindikasikan sama dengan virus yang sedang dianalisis. BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) merupakan alat yang tersedia untuk mencari database sehingga didapatkan sikuen yang sama pada sebuah penggunaan sequence query supplied. Analisis sikuen dilakukan setelah mendapatkan database nukleotida dari virus tersebut kemudian dianalisis menggunakan BioEdit Sequence Alignment Editor untuk mendapatkan database nukleotida dari Fabavirus yang dianalisis berdasarkan coat protein Fabavirus tersebut. Perunutan sikuen merupakan landasan bioinformatika berupa variabel yang telah dikonversi dan digunakan sebagai dasar database metode filogeni (Higgs & Attwood 2005). Metode filogeni secara molekuler menggunakan sikuen molekuler untuk membangun sebuah pohon evolusi. Informasi secara tipikal yang dikembangkan dari sebuah teori evolusionari dipaparkan dalam bentuk diagram pohon sehingga dapat diinterpretasikan dengan baik berupa diagram bercabang-cabang yang dapat dikonstruksi berdasarkan kesamaan atau perbedaan sifat fisik maupun genetik seperti sikuen DNA, sikuen asam amino (protein), dan lainnya. Metode filogeni dapat menggunakan program Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA 4.0 or newer version) dengan memasukkan hasil multi-alignment untuk memperkirakan
tingkat
evolusi
molekuler
evolusionarinya (Higgs & Attwood 2005).
dan
pengujian
hipotesis
