3. BAHAN DAN METODE PENELITIAN 3.1. Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan dari bulan April – November 2011 di laboratorium Biokimia Pangan Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan IPB, laboratorium Bioteknologi SEAFAST IPB dan Laboratorium Parasitologi Balai Veteriner Bogor. 3.2.
Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan tongkol
(Auxis thazard), kerang hijau (Perna viridis) dan udang jerbung (Penaeus merguiensis) yang diperoleh segar dari pasar ikan Muara Angke, Jakarta Utara. Selain itu juga digunakan serum darah manusia dari 20 subyek penderita alergi dan satu subyek normal yang tidak memiliki riwayat alergi. Bahan-bahan kimia yang digunakan adalah bufer fosfat pH 7.5, KCl bufer fosfat pH 7.5, aprotinin/inhibitor proteinase (Sigma), tris buffer pH 8.8 dan pH 6.8, amonium persulfat (APS), β-merkaptoethanol, TEMED, akrilamida, N,N’ bis akrilamida, SDS (Sodium Dodesil Sulfat), commasie brilliant blue G-200, commasie brilliant blue R-250, asam fosfat, glisin, etanol 95%, metanol, asam asetat glasial, bufer karbonat bikarbonat pH 9.6, Tween 20, BSA (Serum Albumin Sapi) fraksi V (Sigma), susu bubuk skim, standar low molecular weight protein (LMW) yang mengandung 7 jenis protein standar (Fermentas®), antibodi sekunder (ICL Lab) yaitu antibodi anti IgE manusia berlabel enzim HRP (Horse Radish Peroxidase), substrat DAB (3,3´-diaminobenzidine tetrahydrochloride), substrat TMB (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine) dan bahan-bahan penunjang yang lain. Alat-alat yang digunakan adalah waring blender, sentrifuse, seperangkat alat elektroforesis mini (Bio-Rad), lempeng mikrotiter untuk ELISA, ELISA reader (MTX Lab Systems), spektrofotometer UV-VIS, pH meter, vortex, stirer, termometer, inkubator, timbangan analitik, water bath, mikropipet 5µl hingga 1000 µl, dan seperangkat perkakas blotting (Bio-Rad), membran nitroselulosa 0,45 μm (Sigma), kertas saring, lempeng immunoblotting dan peralatan gelas.
20
3.3. Metode Penelitian Secara umum, penelitian ini dibagi menjadi tiga tahap. Tahap pertama yaitu isolasi protein sampel melalui ekstraksi protein sarkoplasma dan miofibril dari sampel ikan tongkol, udang jerbung dan kerang hijau. Tahap kedua adalah karakterisasi ekstrak protein sarkoplasma dan miofibril dengan SDS-PAGE dan tahap ketiga dengan menguji alergenisitas protein sampel dengan menggunakan serum subyek penderita alergi dengan teknik immunoblotting dan ELISA. Ringkasan alur penelitian dapat dilihat pada Gambar 3. Sampel hasil laut segar (ikan tongkol, kerang hijau dan udang jerbung) terlebih dahulu diuji kadar protein awalnya dengan metode Kjedahl. Selanjutnya dilakukan tahapan isolasi protein sampel melalui ekstraksi daging ikan, udang dan kerang dengan penambahan bufer fosfat dan dihomogenisasi dengan blender. Ekstraksi dengan bufer fosfat dilakukan untuk pemisahan protein sarkoplasma dan miofibril. Fraksi protein sarkoplasma dihasilkan dari proses ekstraksi dengan kekuatan ion yang lebih rendah, yaitu bufer fosfat pada pH 7.5 dengan kekuatan ion 0.05. Fraksi protein miofibril diperoleh melalui ekstraksi dengan bufer fosfat pH 7.5 dan kekuatan ion 0.5. Kemudian dilakukan penentuan kadar protein ekstrak sampel dengan metode Bradford dan dikrakterisasi dengan teknik elektroforesis SDS-PAGE untuk mengetahui berat molekul protein yang diekstrak. Gel hasil elektroforesis ini kemudian akan digunakan untuk pengujian alergenisitas dengan teknik immunoblotting, dengan dipindahkan dalam suatu membran nitroselulosa. Uji alergenisitas ekstrak protein (ikan tongkol, kerang hijau dan udang jerbung) dilakukan dengan metode immunoblotting dan ELISA menggunakan serum subyek penderita alergi pangan. Penentuan subyek alergi melalui wawancara langsung seputar alergi yang diderita subyek. Dari 20 subyek penderita alergi pangan dan satu subyek normal, dilakukan pengambilan darah sebanyak 20 ml dan dilakukan melalui koordinasi dengan klinik terdekat di daerah Dramaga Bogor. Kemudian darah yang telah diperoleh dilakukan sentrifuse untuk memisahkan serum dari plasma darah. Serum yang terpisah dikumpulkan dan disimpan pada suhu beku -20°C. Serum ini digunakan sebagai sumber antibodi IgE untuk direaksikan dengan ekstrak protein yang diperoleh.
21 Analisis protein Metode Kjeldahl
Sampel segar (daging ikan,kerang dan udang)
Tahap Isolasi protein Ekstraksi dengan buffer fosfat (Hashimoto 1979)
Ekstrak protein sarkoplasma
Tahap Karakterisasi protein
Ekstrak protein miofibril
Elektroforesis
Tahap Penentuan alergenisitas
Analisis protein
Responden subyek alergi (20 org)
Immunoblotting IgE ELISA
Tidak
Sentrifuse
Positif ?
Darah subyek alergi
Rekaman sejarah alergi
ya Sesuai?
Potensial untuk Isolat alergen
Keterangan : Hasil yang diperoleh berupa informasi yang digunakan untuk proses selanjutnya Gambar 3. Diagram alir penelitian
22
3.3.1. Analisis Kadar Protein Metode Kjeldahl (AOAC 1995) Kadar protein awal sampel sebelum dilakukan ekstraksi ditentukan dengan menggunakan metode Kjedahl. Sejumlah sampel (100-250 mg) ditimbang ke dalam labu Kjedahl. Kemudian ditambahkan 1.9±0.1 g K2SO4, 40±10 mg HgO dan 2±0.1 mL H2SO4. Sampel didihkan selama 1-1.5 jam dengan kenaikan suhu secara bertahap sampai cairan menjadi jernih, lalu didinginkan. Sejumlah kecil akuades diteteskan perlahan lewat dinding labu kemudian labu digoyang pelan agar kristal yang terbentuk larut kembali. Isi labu kemudian dipindahkan ke dalam alat destilasi dan labu dibilas 5-6 kali dengan 1-2 mL akuades. Lalu ditambahkan 8-10 mL larutan 60% NaOH- 5% Na2S2O3 ke dalam alat destilasi. Erlenmeyer berisi 5 mL H3BO3 dan 2 tetes indikator metilen red-metilen blue diletakkan di bawah kondensor dengan kondisi ujung kondesor terendam di bawah larutan H3BO3. Destilasi dilakukan hingga diperoleh destilat sebanyak ± 15 mL. Destilat yang diperoleh selanjutnya diencerkan hingga ± 50 mL dan dititrasi dengan HCl terstandar sampai terjadi perubahan warna menjadi abu-abu keunguan. Perhitungan kadar protein sesuai dengan persamaan dibawah berikut.
3.3.2. Isolasi Protein Sampel (Hashimoto et al. 1979) Tahapan iolasi protein sampel dilakukan dengan ekstraksi fraksi sarkoplasma dan miofibril dari ikan tongkol, kerang hijau dan udang jerbung dilakukan berdasarkan metode Hashimoto et al. (1979). Masing-masing sampel daging segar berupa ikan, kerang dan udang, sebanyak 20 gram dipersiapkan bersama dengan penambahan 200 ml bufer fosfat pH 7.5, I: 0.05 dan inhibitor protease, lalu dihomogenisasi dengan waring blender. Selanjutnya dilakukan sentrifuse pada suhu 4°C kecepatan 4000 rpm selama 25 menit. Supernatan yang diperoleh dikumpulkan, sementara endapan
23
diekstraksi lagi dengan 200 ml bufer fosfat pH 7.5, I:0.05. Campuran supernatan pertama dan kedua ini merupakan ekstrak untuk fraksi protein sarkoplasma. Kemudian dari endapan pada ekstraksi kedua, dengan perlakuan dan penambahan bahan yang sama diperoleh ekstrak protein miofibril, yaitu melalui penggabungan antara supernatan ketiga dan keempat. pada ekstraksi protein miofibrilar terdapat perkecualian pada kekuatan ion bufer yang digunakan yaitu bufer fosfat dengan pH 7.5 kekuatan ion 0.5 melalui penambahan KCl. Diagram alir prosedur ekstraksi dapat dilihat pada Gambar 4 dibawah ini. Irisan daging ikan 20 gr
Homogenisasi dengan 200 ml Bufer posfat pH 7.5, I= 0.05 dan Inhibitor Protease Sentrifuse 4ºC, 4000 rpm, 25 menit
Supernatan
Penyaringan
Protein Sarkoplasma
Diulang 2x
Pelet
Homogenisasi dengan 200 ml Bufer KCl-posfat pH 7.5, I= 0.5 dan Inhibitor Protease Sentrifuse 4ºC, 4000 rpm, 25 menit
Supernatan
Diulang 2x
Pelet
Penyaringan
Protein Miofibril
Gambar 4. Ekstraksi Protein Sarkoplasma dan Miofibril (Hashimoto et al. 1979)
24
3.3.3. Analisis Kadar Protein Metode Bradford (Bradford 1976) Penentuan kadar protein ekstrak sarkoplasma dan miofibril dilakukan dengan metode Bradford menggunakan serum albumin sapi (BSA) sebagai standar. Sampel (filtrat ekstrak protein) direaksikan dengan pewarna coomasie briliant blue sebagai komponen utama pereaksi bradford. Pereaksi Bradford dibuat dengan melarutkan 100 mg coomasie briliant blue G-200 ke dalam 50 ml etanol 95%. Kemudian ditambahkan 100 ml asam fosfat 85% (w/v) dan volume akhir larutan dibuat menjadi 1 liter, lalu disaring. Standar dibuat dengan melarutkan 100 mg serum albumin sapi (BSA) ke dalam 50 ml air destilata, kemudian diencerkan sampai volumenya mencapai 100 ml (konsentrasi 1 mg/ml). Dari konsentrasi 1 mg/ml, dibuat satu seri pengenceran larutan standar. Untuk penetapan protein diperlukan sebanyak 0,1 ml larutan standar dari masing-masing seri konsentrasi, 0,1 ml sampel dan 0,1 ml air destilata sebagai blanko. Ke dalam masing-masing larutan, ditambahkan 5 ml pereaksi bradford. Setelah didiamkan selama 5 menit, larutan dibaca absorbansinya pada panjang gelombang 595 nm. Konsentrasi protein ditentukan berdasarkan kurva standar serum albumin sapi (BSA). 3.3.4. Penentuan Karakteristik Ekstrak Protein dengan Elektroforesis SDSPAGE (Laemmli 1970) Elektroforesis SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) dilakukan dengan metode Laemmli (1970), untuk menentukan berat molekul protein ekstrak protein sampel. Analisis SDS-PAGE dilakukan menggunakan gel akrilamid dengan konsentrasi separating gel 12% dan stacking gel 5%. Sampel yang dielektroforesis adalah ekstrak protein sarkoplasma dan miofibril hasil ekstraksi dari sampel ikan tongkol, udang jerbung dan kerang hijau. Beberapa tahapan utama yang harus dilakukan dalam melakukan elektroforesis SDS-PAGE adalah 1) pembuatan separating gel, 2) pembuatan stacking gel, 3) persiapan sampel, 4) running gel, 5) pewarnaan gel, 6) destaining gel, dan 7) penentuan berat molekul protein-protein yang terpisahkan. Pembuatan larutan stok dan larutan kerja untuk analisis SDS-PAGE dapat dilihat pada Lampiran 2.
25
a. Pembuatan separating gel Dua lempengan kaca (mini slab) yang akan digunakan sebagai cetakan gel dirangkai sesuai dengan petunjuk pemakaian. Sebanyak 4 ml larutan A dipipet ke dalam gelas piala, kemuadian ditambakan 2.5 ml larutan B dan 3.5 ml akua-biodestilat.
Campuran
kemuadian
diaduk
perlahan
dengan
menggoyangkan gelas piala. Selanjutnya, sebanyak 50 µl APS 10% dan 5 µl TEMED ditambahkan ke dalam campuran dan diaduk kembali dengan perlahan. Campuran dimasukkan ke dalam lempengan kaca (mini slab) tanpa menimbulkan gelembung udara dengan menggunakan mikro pipet sampai sekitar 1 cm dari atas lempengan. Bagian yang tidak diisi gel diberi akuades untuk meratakan gel yang terbentuk. Gel kemudian dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30-60 menit. b. Pembuatan stacking gel Air dibuang dari atas separating gel dan dikeringkan dengan menggunakan tissue. Akua-biodestilat, larutan A dan larutan C masing-masing sebanyak 0.67 ml dan 1.0 ml dicampurkan ke dalam gelas piala dan diaduk perlahan dengan cara menggoyangkan gelas piala. Selanjutnya, sebanyak 30 µl APS 10% dan 5 µl TEMED ditambahkan ke dalam campuran dan diaduk kembali dengan perlahan. Campuran dimasukkan ke dalam mini slab, kemudian sisir dimasukkan dengan cepat tanpa menimbulkan gelembung udara. Stacking gel dibiarkan mengalami polimerisasi selama 30-60 menit. Setelah gel berpolimerisasi, sisir diangkat dari atas gel dengan perlahan dan slab ditempatkan ke dalam wadah elektroforesis. Bufer elektroforesis dimasukkan ke dalam wadah elektroforesis di bagian dalam dan luar agar gel terendam. c. Preparasi dan injeksi sampel Sebanyak 40 µl sampel dimasukkan tabung Eppendorf dan ditambahkan 10 µl bufer sampel. Tabung kemudian dipanaskan selama 5 menit dalam air mendidih 100°C. Sampel kemudian siap diinjeksikan ke dalam sumur menggunakan mikropipet sebanyak 10 µl. Salah satu sumur diinjeksikan protein marker sebanyak 7.5 µl protein marker.
26
d. Running SDS-PAGE Katup elektroda dipasang dengan arus mengalir ke anoda. Sumber listrik dinyalakan dan dijaga konstan pada 70 V. Running dilakukan selama 180 menit sampai migrasi dye tersisa sekitar 0.5 cm dari dasar. Setelah selesai, aliran listrik dimatikan dan katup elektroda dilepaskan, lalu plat gel dipindahkan dari elektroda. e. Pewarnaan gel Gel diangkat dari slab dan dipindahkan ke dalam wadah tertutup yang telah berisi pewarna coomasie briliant blue (kurang lebih 20 ml). kemudian didiamkan selama 20 menit. f. Destaining gel Gel diangkat dan dicuci menggunakan akuades beberapa kali. Larutan penghilang warna ditambahkan (destaining solution) dan digoyangkan sekali hingga latar belakang pita protein menjadi terang. Selanjutnya, larutan penghilang warna dibuang dan gel siap dianalisis. g. Penentuan berat molekul protein yang terpisahkan Berat molekul protein sampel dapat dihitung dari persamaan regresi antara mobilitas relatif protein marker (penanda protein) dengan logaritma dari berat molekul marker yang diketahui. Mobilitas relatif protein dihitung dengan membandingkan jarak migrasi protein diukur dari garis awal separating gel sampai ujung pita protein yang dibandingkan dengan jarak migrasi tracking dye. Mobilitas relatif tersebut dirumuskan sebagai persamaan berikut : Rf =
jarak migrasi protein jarak migrasi tracking dye
h. Analisis gel elektroforesis Gel hasil elektroforesis SDS-PAGE tersebut di dokumentasikan dalam bentuk gambar. Hasil dalam bentuk gambar ini kemudian dianalisis densitas pita proteinnya dengan menggunakan perangkat lunak Image J. Program membaca tebal pita per kolom yang dipilih sebagai kurva berfluktuasi.
27
3.3.5. Serum Subyek Alergi Serum dari 20 orang penderita alergi diperoleh melalui wawancara langsung seputar alergi yang diderita subyek meliputi jenis, penyebab, gejala apabila sedang terkena alergi. Subyek sasaran adalah penderita alergi makanan. Serum satu orang subyek yang normal (tidak menderita alergi) digunakan sebagai kontrol negatif. Pengambilan darah dilakukan melalui kooordinasi dengan klinik dengan menggunakan jarum suntik steril (syringe/spuilt) 10 cc (ml). Dari ke-21 subyek, 20 ml darah diambil untuk dipisahkan serum dari plasmanya. Darah yang telah diperoleh segera diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 menit, lalu disentrifuse selama 20 menit pada kecepatan 2500 rpm. Supernatan yang didapat merupakan serum yang diduga banyak mengandung IgE. 3.3.6. ELISA (Ishikawa et al. 1997) Enzyme-linked
immunosorbent
assay
(ELISA)
dilakukan
dengan
menggunakan lempeng polistiren dengan 96 sumur. Teknik ini dilakukan berdasarkan metode yang pernah dilakukan Ishikawa et al. (1997) dengan beberapa modifikasi pada jenis substrat, larutan pemblok dan panjang gelombang pembacaan sesuai dengan jenis subtrat yang digunakan. Konfigurasi ELISA yang dipilih adalah ELISA tidak langsung yang melibatkan interaksi protein alergen (antigen), antibodi primer (IgE serum subyek alergi), antibodi sekunder yaitu anti IgE anti manusia berlabel enzim HRP (Horseradish Peroksidase) dan substrat TMB (3,3´-tetramethylbenzidine). Formula beberapa larutan untuk uji ELISA diantaranya seperti coating buffer, blocking buffer dan washing buffer (Lampiran 3). 3.3.6.1. Penentuan IgE Total Serum Subyek Alergi (kualitatif) Sebanyak 100 µl serum subyek pada pengenceran 1:5 dan 1:10, dilapiskan ke dalam lempeng mikrotiter. Inkubasi dilakukan selama semalam pada suhu 4°C, lalu sisa serum dalam lempeng dibuang dan dilakukan pencucian dengan PBS Tween-20 0.05% 5 kali sebanyak 200 µl/well. Kemudian, sebanyak 200 µl BSA 3% dalam PBS ditambahkan ke dalam lempeng mikrotiter dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C. Setelah dicuci sebanyak 5 kali dengan PBS Tween20 0.05%, dilakukan penambahan dengan antibodi anti IgE manusia berlabel
28
enzim HRP. Sebelumnya antibodi anti IgE manusia berlabel enzim HRP diencerkan 1:6000 dalam PBS Tween-20 0.05% . Inkubasi dilakukan pada suhu 37°C selama 1 jam. Setelah dicuci dengan PBS Tween-20 0.05% ditambahkan sebanyak 100 µl substrat TMB dan dibiarkan 5 menit. Kemudian dihentikan reaksinya dengan penambahan 25 µl H2SO4 2N. Hasil reaksi dapat dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 450 nm. 3.3.6.2. Penentuan Sifat Alergenisitas Ekstrak Protein Sebanyak 100 µl ekstrak protein sarkoplasma dan miofibril sampel (ikan, udang dan kerang) dilarutkan dalam coating buffer (konsentrasi 10 µg/100µl) dilapiskan pada dasar lempeng mikrotiter. Kemudian diinkubasi pada suhu 4°C selama semalam, lalu dicuci dengan PBS Tween-20 0.05% (200 µl/well) sebanyak 5 kali. Selanjutnya dilakukan pemblokan dengan larutan BSA 3% dalam PBS sebanyak 200 µl/sumur dan diinkubasi selama 1 jam suhu 37°C. Setelah itu dicuci dengan PBS Tween-20 0.05% sebanyak 5 kali. Serum subyek yang telah diencerkan (perbandingan 1:5 atau 1:10) dalam PBS Tween-20, dilapiskan pada lempeng mikrotiter sebanyak 100 µl/sumur. Selanjutnya serum subyek diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C, lalu dicuci sebanyak 5 kali dengan PBS Tween-20 0.05%. Penambahan antibodi anti IgE dilakukan setelah mengencerkan 1:6000 dalam PBS Tween-20 0.05%. Kemudian sebanyak 100 µl/sumur anti IgE manusia berlabel enzim HRP ditambahkan dan diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C. Setelah inkubasi, dicuci dengan PBS Tween-20 0.05% sebanyak 5 kali, lalu ditambahkan sebanyak 100 µl substrat TMB dan dibiarkan 5 menit. Kemudian dihentikan reaksinya dengan penambahan 25 µl H2SO4 2N. Hasil reaksi dapat dibaca dengan ELISA reader pada panjang gelombang 450 nm. 3.3.7. Immunoblotting (Towbin et al. 1979) Gel hasil elektroforesis yang tidak diwarnai, ditransfer ke membran nitroselulosa (0,45µm) dalam buffer transfer yang disusun dalam alat transblotting (metode sandwich). Blotting dilakukan selama 1.5 jam pada 90 Volt.
29
Membran selulosa dipotong sesuai gel dan membran yang berisi marker direndam dalam pewarna amido black (untuk mengetahui apakah gel sudah tertransfer ke membran). Selanjutnya, membran yang berisi sampel protein diblok dengan susu skim 5%, diinkubasi selama 1 jam sambil digoyang, kemudian membran dicuci dengan PBS Tween-20 0.05% selama 5 menit sebanyak 3 kali. Selanjutnya dilakukan penambahan serum subyek alergi yang diencerkan 1:10 dalam PBS Tween-20 0.05% dan diinkubasi selama satu jam pada suhu kamar sambil digoyang. Pencucian dilakukan lagi dengan PBS Tween-20 0.05% selama 5 menit sebanyak 3 kali, lalu diberi antibodi IgE anti manusia yang berlabel enzim HRP pengenceran 1:3000 dalam PBS Tween-20 0.05%. kemudian diinkubasi selama 1 jam dengan shaker atau digoyang-goyang. Membran kemudian dicuci kembali 3 kali menggunakan PBS Tween-20 0.05% selama 5 menit. Hasil deteksi kompleks protein alergen (ikan, udang dan kerang) dengan IgE serum subyek terlihat, setelah diberikan substrat DAB (3,3´-diaminobenzidine tetrahydrochloride). Deteksi positif ditandai dengan terjadinya kompleks warna (coklat) yang diinginkan pada kertas nitroselulosa.
