35
METODE PENELITIAN
Tempat dan Waktu Penelitian Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode eksperimen laboratorium. Penelitian ini
dilakukan di
Laboratorium Riset
Fakultas
Teknobiologi UNIKA Atmajaya Jakarta mulai bulan Agustus 2010 hingga bulan April 2012.
Bahan Penelitian Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah sampel Tempe yang berasal dari beberapa daerah (Jawa Barat, Jawa Timur dan luar JawaAmbon), Isolat Klebsiella 135 (Hanjaya 2001), Bacillus GR9 (Wati 2011), Klebsiella pneumoniae ATCC 35657 (Koleksi Fakultas Teknobiologi-UNIKA Atmajaya Jakarta) dan Bacillus cereus ATCC10876 (Koleksi IPBCC, Bogor).
Pengambilan Sampel Sampel diambil dari delapan pengrajin dari empat daerah yaitu di Jawa Barat (Bogor), Jawa Timur (Malang dan Sidoarjo) dan Maluku (Ambon). Sampel tempe diambil dari dua produsen di tiap-tiap daerah. Proses pembuatan tempe pada setiap produsen dicatat dan dirangkum sebagai data penunjang dalam penelitian ini.
Penyiapan Sampel Sampel tempe sebanyak 1.5 Kg diambil dari rak yang berbeda pada produsen dan dipotong menjadi potongan-potongan kecil. Tempe dalam wadah selanjutnya diaduk dan ditimbang 25 g untuk 3 ulangan. Tempe yang ditimbang selanjutnya diberikan 225 ml larutan garam fisiologis dan diblender selama 30 detik, dibiarkan selama satu menit dalam posisi terbalik dan kemudian diblender lagi selama 30 detik (Dry and wet mill, National Omega MX-T2GN). Slurry tempe yang dihasilkan selanjutnya diambil sebanyak 9 ml dengan cara diambil sambil diaduk untuk mendapatkan partikel slurry yang seragam. Slurry tempe
36
selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 800xg (Sorval Legend Micro 17R Centrifuge) selama 1 menit dan supernatan diambil untuk selanjutnya disentrifugasi lagi dengan kecepatan 13,000xg untuk diambil peletnya. Pelet yang diperoleh selanjutnya dicuci dengan larutanTris-EDTA (TE) pH 8.0 dan disentrifugasi lagi pada 13,000xg. Supernatan dibuang dan selanjutnya pelet siap diekstraksi dengan menggunakan kit ekstraksi komersil sesuai prosedur yang dijelaskan oleh perusahaan (Fermentas DNA purification Kit (FDEK) dan Power Food Microbial DNA Isolation Kit MOBIO (PFMDIK)).
Ekstraksi dengan Metode Fermentas DNA Purification Kit (FDEK) Tahapan ini dilakukan dengan melakukan ekstraksi dan purifikasi DNA dari sampel tempe yang diambil dengan menggunakan metode Fermetas DNA purification kit. Pelet hasil pencucian dengan TE selanjutnya diresuspensikan dengan 200 μl TE dan selanjutnya ditambahkan 400 μl lysis solution dan diinkubasi pada 650C selama 5 menit. Kloroform selanjutnya ditambahkan sebanyak 600 μl, dibolak-balik sebentar dan selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 10,000xg (Sorval Legend Micro 17R Centrifuge) selama 2 menit. Fase bagian atas selanjutnya dipindahkan ke tabung eppendorf baru dan ditambahkan 800 μl precipitation solution 1x dan dibiarkan pada suhu ruang selama 1-2 menit. Sentrifugasi selanjutnya dilakukan dengan kecepatan 10,000xg selama 2 menit. Supernatan selanjutnya dibuang dan pellet dilarutkan dalam 100 μl NaCl. Campuran divortex cepat dan ditambahkan etanol absolut sebanyak 300 μl. Campuran diinkubasi pada suhu -200C selama 10 menit. Sentrifugasi selanjutnya dilakukan pada kecepatan 10,000xg selama 3-4 menit. Supernatan dibuang dan pellet dicuci dengan ethanol 70% satu kali dan dikeringanginkan. Pelet DNA selanjutnya dilarutkan dalam 100 μl ddH2O. Konsentrasi dan kemurnian DNA yang dihasilkan selanjutnya diukur dengan menggunakan NanoDrop 2000 Spectrophotometer (Thermo Scientific).
37
Ekstraksi dengan Metode Power Food Microbial DNA Isolation Kit MOBIO (PFMDIK). Tahapan ini diawali dengan melakukan ekstraksi dan purifikasi DNA dari sampel tempe yang diambil dengan menggunakan metode PFMDIK. Ekstraksi dengan kit ini dimulai dengan meresuspensikan pelet pada 450 μl solution PF1 yang telah dihangatkan pada suhu 550C. Suspensi kemudian dipindahkan ke tabung MicroBead dan diletakkan secara horizontal pada vortex serta dilakukan pengadukkan selama 10 menit dengan kecepatan maksimum (2500 rpm-Heidolp REAX control). Sentrifugasi selanjutnya dilakukan pada kecepatan 13,000xg selama 1 menit, supernatan yang diambil dan dipindahkan pada tabung baru serta diberi 100 μl larutan PF3 yang dicampur dengan cara divortex. Inkubasi dilakukan pada suhu 40C selama 5 menit dan selanjutnya disentrifugasi lagi dengan kecepatan 13,000xg selama 1 menit. Supernatan diambil dan ditambah dengan 900 μl larutan PF3 serta divortex. Campuran selanjutnya dipipet dan dimasukkan ke tabung spin filter untuk selanjutnya dilakukan sentrifugasi selama 1 menit. Tahapan ini diulang sampai semua campuran habis. Spin filter selanjutnya dipindahkan pada tabung yang baru dan diteteskan larutan PF4 sebanyak 650 μl dan disentrifugasi lagi pada 13,000xg selama 1 menit. Larutan yang terbuang melalui filter dibuang dan filter kembali ditetesi 650 μl larutan PF5 dan dilakukan sentrifugai lagi pada kecepatan 13,000xg selama 1 menit. Larutan yang terbuang melalui filter selanjutnya dibuang dan dilakukan sentrifugasi lagi selama 2 menit pada kecepatan 13,000xg. Spin filter selanjutnya dipindahkan pada tabung baru yang bersih dan ditetesi 100 μl larutan PF6. Sentrifugasi dilakukan lagi dengan kecepatan 13,000xg selama 1 menit. DNA yang diperoleh selanjutnya disimpan pada suhu -200C.
Analisis Kuantitas dan Kualitas DNA Hasil Ekstraksi Pada kedua metode diatas, kualitas DNA dicek dengan elektroforesis pada 1% (w/v) gel agarose-buffer TAE (Tris-Acetate EDTA, pH 8.0) dan konsentrasi seta kemurniab DNA dikuantifikasi dengan menggunakan NanoDrop 2000 Spectrophotometer (Thermo Scientific). Hasil DNA yang diperoleh dengan
38
kualitas yang baik harus menunjukkan rasio absorbansi 260/230 nm dan 260/280 nm lebih besar atau sama besar dengan 1.80 (Sambrook et al. 1998)
Analisis Inhibitor PCR Pada analisis inhibitor PCR, amplifikasi gen 16S rRNA dilakukan dengan menggunakan primer 1387r dan 63f (Marchesi et al. 1998) dengan kondisi PCR: pradenaturasi 940C, 5 menit; denaturasi 940C, 30 detik; pelekatan primer 550C, 30 detik pemanjangan 720C, 1 menit dan tahap akhir 720C, 20 menit dengan 35 siklus PCR (C1000TMThermal Cycler-BIORAD). Amplifikasi dilakukan dengan menggunakan GoTaq Green Master Mix (Promega) dan hasil amplifikasi dilarikan pada gel agarose dengan konsentrasi 1%.
Analisis Keragaman Komposisi Mikroorganisme Analisa ARISA dilakukan dengan menggunakan metode yang dijelaskan oleh Cardinale et al. (2004) dengan menggunakan primer ITSF dan ITSFReub untuk kelompok bakteri (B-ARISA) dan primer 2234C dan 3126T untuk kelompok fungi (F-ARISA) (Ranjard et al. 2001) sampai ditemukan profil ARISA yang maksimum dan konsisten Untuk primer ITSF/ITSFReub (B-ARISA) dan primer 2234C dan 3126T (F-ARISA), diamplifikasi dalam reaksi yang mengandung 1 x buffer PCR, 1.5 U Taq DNA polymerase, 0.2 mM (masing-masing) dNTP dan 0.25 μM (masingmasing) primer dalam volume akhir 25 μl. Campuran direaksikan pada 940C selama 3 menit, diikuti 30 siklus amplifikasi dengan kondisi pradenaturasi 94 0C selama 45 detik, annealing 56.80C selama 1 menit Untuk B-ARISA dan 60.70C untuk F-ARISA, dan pemanjangan 720C selama 2 menit dengan reaksi akhir dilakukan pada 720C selama 7 menit. Jumlah standar dari produk PCR (antara 0.5 dan 1 μl) bersama dengan 0.8 μl internal size standard, 1000 atau 2500 ROX ditambahkan ke 13 μl formamide deionized dan campuran didenaturasi pada 950C selama 5 menit diikuti 2 menit pendinginan di es. Fragmen sampel kemudian dipisahkan dengan menggunakan ABI 310 genetic analyzer (Perkin-Elmer), dimana DNA dielektroforesis dalam
39
tabung kapiler yang diisi dengan electrophoresis polymer POP-4 (Applied Biosystem). Sampel dilarikan pada kondisi ABI 310 denaturing elektrophoresis selama 1 jam untuk masing-masing sampel, dan data dianalisa menggunakan GeneScan 3.1 software program (Perkin-Elmer). Keluaran program berupa sejumlah puncak (electropherogram), ukurannya diestimasi melalui perbandingan terhadap internal size standard. Software GeneScan akan menghitung tinggi dan area puncak yang proporsional dengan kuantitas DNA dalam fragment. Semua perlakuan ARISA di ulang sebanyak tiga kali. Reprodusibilitas masing-masing sampel DNA makanan diukur sebagai rata-rata dan standar deviasi relatif dari jumlah puncak yang dikalkulasi dari 3 ulangan percobaan yang tidak saling terkait. Data profil ARISA selanjutnya diedit dan diolah untuk melakukan perhitungan karakter ekologi yaitu nilai keragaman. Fragmen DNA dengan ukuran berbeda yang muncul sebagai peak dalam ARISA type didefinisikan sebagai OTU (Operational Taxonomic Unit) (Hewson & Fuhrman 2004; Ramete 2009). Nilai indeks Shannon-Wiener dan Index Simpson selanjutnya dihitung dengan rumus yang digunakan oleh Hewson & Fuhrman (2004). Karakter OTU yang ada pada profil komunitas bakteri dan fungi selanjutnya dianalisis dengan menghitung Sorensen’s Index (Lampiran 4 dan 5). Analisis pengelompokan dilakukan dengan metode unweighted-pair-group mean-average (UPGMA) dan software MEGA5.1 (Hewson & Fuhrman 2004; Nimnoi et al. 2010)
Kloning dan Sequencing Gen 16S rRNA Kloning gen 16S rRNA dilakukan dengan melakukan amplifikasi gen 16S rRNA dari dua produsen tempe (SDJD dan EMP) menggunakan primer 63f dan 1387r (Marchesi et al. 1998). Gen hasil amplifikasi selanjutnya dikloning ke vector pGEM T-Easy (Promega) dan ditransformasi ke E. coli DH5α sesuai dengan metode yang dikemukakan oleh Sambrook et al. (1998). Verifikasi plasmid rekombinan selanjutnya dilakukan dengan mengamplifikasi gen 16S rRNA yang terkloning menggunakan primer M13f dan M13r. Hasil kloning gen 16S rRNA selanjutnya disekuens untuk 30 sampel dari tiap tempe. Sequencing DNA dilakukan pada PT. Genetika Sains. Identifikasi sekuen gen 16S rRNA
40
dilakukan dengan mencari kesamaan sekuen pada data base National Center for Biotechnology Information (NCBI).
Analisis Isolat Tunggal dengan ARISA Analisis ini dikerjakan dengan melakukan ekstraksi genom isolat tunggal beberapa bakteri yang diperoleh langsung dari tempe: Klebsiella 135 ( Hanjaya, 2001) dan Bacillus GR9 (Wati, 2011) maupun yang merupakan isolat ATCC: Klebsiella pneumoniae ATCC 35657 (Koleksi FTB-UNIKA Atmajaya Jakarta) dan Bacillus cereus ATCC10876 (Koleksi IPBCC, Bogor). Amplifikasi daerah intergenik gen 16S-23S rRNA dilakukan dengan menggunakan primer ITSF/ITSFReub dan analisis ARISA dilakukan sesuai kondisi yang dikemukakan oleh Cardinale et al. (2004). Analisis ini dilakukan di PT. Wilmar Benih Indonesia-Cikarang, Jawa Barat . Reprodusibilitasnya diukur sebagai rata-rata dan standar deviasi relatif dari jumlah puncak yang dihitung dari 3 ulangan percobaan yang tidak saling terkait.
