BAHAN DAN METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan dari Juni 2000 sampai dengan Desember 2002 di laboratorium Bakteriologi Tumbuhan, Departemen Hama dan Penyakit Tumbuhan Fakultas Pertanian; laboratorium Kimia Terpadu Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam; laboratoriurn Rekayasa Bioproses, Pusat Penelitian Bioteknologi, dan di kebun percobaan Cikarawang-Darrnaga, Institut Pertanian Bogor.
Metode Penelitian
Percobaan I. Evaluasi Keefektifan Formulasi Bakteri Biokontrol dan Identifi kasi Senyawa Penghambat terhadap Penyakit Pustul Bakteri
1.1. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Penyebab Pustul Isolasi bakteri penyebab pustul dilakukan dengan teknik pencawanan (Lelliot dan Stead 1987) yang dimulai dengan cara menggunting daun kedelai varietas Wilis berumur 35 HST bergejala pustul asal daerah Cikarawang-Darmaga, Bogor. Potongan daun berukuran 5 x 5 mm didesinfeksi dengan cara perendaman dalam larutan NaOCl 0,5 % selama 2 menit kemudian dibilas dengan air destilata steril. Potongan-potongan daun bergejala pustul steril.
dimasukkan dalam 10 ml air destilata
Selanjutnya 0,l ml cairan yang mengandung bakteri patogen disebarkan di
medium agar Yeast flexhose Curbonate (YDC) dan diinkubasikan pada suhu 27" C
selama 24 jam.
Koloni bakteri yang tumbuh yang benvarna kuning dengan
permukaan mucord dimurnikan.
Pemurnian dilakukan dengan cara membuat
suspensi dari koloni tunggal bakteri benvarna kuning mucold dan menggoreskannya ke medium YDC yang baru. Biakan murni isolat patogen akan diuji sifat fisik kimianya (Schaad 1988), penguj ian patogenisitas pada kotiledon kedelai (Hwang et
a/. 1992), dan pengujian antagonisme agens biokontrol terhadap Xag m vitro ( van Chuyen 1982).
1.2. Isolasi dan Identifikasi Bakteri Calon Biokontrol Isolasi bakteri calon biokontrol menggunakan teknik pencawanan (Lelliot & Stead 1987). Bakteri calon biokontrol diisolasi dari rizosfer tanaman kedelai varietas Wilis sehat umur 35 HST yang di sekitarnya terdapat tanaman kedelai bergejala pustul. Selain itu bakteri calon biokontrol juga diisolasi dari rizosfer tanaman tomat di sekitar tanaman kedelai tersebut di atas. Suspensi yang terdiri atas 0,l gram butiran tanah dalam 10 ml air destilata steril dan dihomogenisasi berulang-ulang dengan vorteks masing-masing selama 2 detik,
diencerkan berseri hingga pengenceran
Dari masing-masing
pengenceran, diambil 0,I ml suspensi untuk ditumbuhkan di medium agar King's B yang telah ditambah dengan rifampisin 50 ppm dan diinkubasikan pada suhu 27' C selama 24 hingga 48 jam.
Pada kegiatan isolasi ini lebih ditekankan untuk
memperoleh koloni tunggal benvarna kuning kehijauan dan berpendar di bawah lampu ultraviolet (266 nrn) yaitu P. ,fluorescens dan koloni tunggal benvarna putih
yaitu H. subtrlw. Tiap koloni yang tumbuh diisolasi dan dibuat biakan murni sebagai bakteri calon biokontrol. Koloni murni bakteri benvarna kuning kehijauan dibiakkan di medium selektif agar King's B yang ditambah dengan rifampisin 50 ppm dan koloni mumi bakteri benvarna putih dibiakkan di medium agar darah 0,4 % yang ditambah dengan rifampisin 50 ppm. Isolat bakteri yang diduga berpotensi sebagai agens biokontrol diidentifikasi sifat fisik kimianya untuk menentukan spesies Pseudomonas spp. atau Bacrllus spp. Identifikasi Hacrllus subtrlrs diantaranya reaksi Gram, pewarnaan endospora untuk mendeteksi bentuk dan letak spora di dalam sel, pertumbuhan sel pada suhu 45' dan 65'' C, pertumbuhan pada NaCl 7%, penggunaan sitrat,
perubahan asam dari
arabinosa, manitol, dan silosa, uji hidrolsis pati, serta penggunaan asentoin (Leary dan Chun 1988, Cowan 1974). Identifikasi adanya endospora di tengah sel menunjukkan bahwa bakteri tersebut adalah H. subtrlw. Cara identifikasi endospora yaitu menfiksasi satu lup isolat bakteri uji umur 96 jam pada gelas obyek
selama 3 menit, menggenanginya
dengan lamtan malachrte green selama 10 menit, membilasnya dengan air destilata, meniriskan dan menggenangi dengan safranin selama 30 menit. Setelah pembilasan dengan air destilata, gelas obyek dikering udarakan selama 5 menit. Setelah kering, gelas obyek diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000 x. Endospora benvarna hijau sedangkan sel vegetatif bakteri benvarna merah. Identifikasi penggunaan sitrat dilakukan dengan menumbuhkan satu lup bakteri uji ke medium agar simmons sitrat. Medium agar simmons sitrat terdiri dari
MgSOj 0,2 g/l NH4H2P041,0 gll. K2HP04 2,O gll. NaN07 2,O d l , NaCl 5,O g/l ; bromtimol biru 0,08 g/l dan agar 15 gll
.
Agar simmons sitrat yang semula benvarna
hijau akan berubah menjadi biru pada suhu 27" C selama 24 jam inkubasi apabila bakteri menggunakan sitrat. Cara identifikasi pembentukan asam yaitu membiakkan bakteri uji dalam silosa, arabinosa, manitol hroth benvarna merah yang berisi tabung Durham. Biakan diinkubasi pada suhu 27OC selama 24 jam sehingga terjadi perubahan warna medium menjadi kuning dan terbentuk gelembung udara yang menunjukkan terbentuknya asam. Pengujian hidrolisis pati untuk menganalisis produksi enzim amilase oleh H. suhtrlrs. Pengujian dilakukan dengan cara membiakkan bakteri uji dalam medium
pati kemudian ditetesi dengan lug01 berwarna biru, dinkubasi pada suhu 27' C. Di sekeliling bakteri penghidrolisis pati akan mengalami perubahan warna biru menjadi bening setelah 24-48 jam inkubasi. Uji pembentukan asentoin pada medium Voges Proskauer warna merah dilakukan untuk menentukan kemampuan bakteri memproduksi asentoin (asetil metil karbinol) yaitu senyawa metabolit sekunder dalam metabolisme karbohidrat.
Asetil
metil karbinol dengan adanya KOH dan udara teroksidasi menjadi diasetil. Diasetil bereaksi dengan alfa naftol dan asam amino yang terdapat dalam medium membentuk warna merah muda yang menunjukkan bahwa bakteri memproduksi asetoin. Identifikasi sifat bakteri Pseuu'omonas ,fluorescens diantaranya reaksi Gram, pembentukan asam dari arabinosa, galaktosa, trehalosa, sukrosa, sorbitol dan inositol, serta pencairan gelatin (Hildebrand et ul. 1988).
Cara identifikasi pembentukan
asam yaitu membiakkan bakteri uji dalam arabinosa, galaktosa, trehalosa, sukrosa, sorbitol, dan inositol broth benvarna merah yang berisi tabung Durham. Biakan diinkubasi pada suhu 27"
selama 24 jam sehingga terjadi perubahan warna medium
menjadi kuning dan terbentuk gelembung udara yang menunjukkan terbentuknya asam.
1.3. Pengujian Inaktivasi Xag in vitro oleh Filtrat dan Suspensi Bakteri Calon Biokontrol Bakteri calon biokontrol hasil isolasi dari pertanaman kedelai dan tomat dievaluasi daya inaktivasinya terhadap Xug menggunakan metode kertas cakram (van Chuyen et a/. 1982).
Filtrat bakteri calon biokontrol diperoleh dengan
mensentrifugasi suspensi bakteri
umur 48 jam dengan kerapatan 1o8 CFUIml
menggunakan sentrifus (High Speed Micro Refrigerator Centrifuge MRX-151 Induction Drive) kecepatan 11000 rpm selama 30 menit. Supernatan disaring dengan membran nitroselulosa berporositas 0,2 ym Uji inaktivasi Xug oleh filtrat bakteri calon biokontrol dilakukan dengan cara mencelupkan kertas saring steril berbentuk cakram berdiameter 6 mm ke dalam filtrat bakteri. Setelah itu, kertas saring dikering udarakan selama 5 detik dan diletakkan pada medium agar Yeast Llextrose (,'arbonute
yang telah diinfestasi
dengan Xug 4 jam sebelumnya. Diameter zone hambatan berupa daerah bening yang terbentuk di sekeliling kertas cakram yang mengandung filtrat bakteri calon biokontrol diukur dengan kertas milimeter. Berdasarkan diameter zone bening yang terbentuk, dihitung persen inaktivasi patogen dengan cara membandingkan diameter
zone bening dengan diameter cawan petri yang ditumbuhi seluruhnya oleh patogen. Persen inaktivasi patogen diamati selama 1 hingga 10 hari inkubasi. Uji inaktivasi Xug juga dilakukan dengan menggunakan suspensi bakteri calon biokontrol. Metode yang digunakan sama dengan pengujian dengan menggunakan filtrat bakteri calon biokontrol. Penghitungan perbedaan diameter zone hambatan yang dibentuk oleh masingmasing isolat bakteri calon biokontrol diuji dengan menggunakan rancangan acak lengkap dengan tiga ulangan, dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan pada taraf kepercayaan 1 dan 5 %.
1.4. Analisis Senyawa Inaktivasi dalam Filtrat Bakteri Calon Biokontrol
Mekanisme inaktivasi bakteri Xug oleh filtrat bakteri calon biokontrol disebabkan oleh metabolit yang terkandung dalam filtrat yang diproduksi oleh bakteri calon biokontrol. Metabolit yang dapat berfungsi sebagai biokontrol antara lain adalah biosurfaktan, hidrogen sianida, dan siderofor.
Oleh karenanya dilakukan
analisis ketiga metabolit tersebut. Analisis produksi senyawa biosurfaktan dilakukan dengan kromatografi cair kinerj a tinggi (HPLC) (Ohno et a/. 1 995).
Preparasi dipersiapkan
dengan
mengasamkan suspensi bakteri calon biokontrol dengan HCl hingga pH 2. Suspensi disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 30 menit hingga diperoleh endapan yang kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 45".
Endapan diekstraksi
dengan metanol dan disimpan pada suhu 5' C semalam.
Selanjutnya larutan
disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama 10 menit dan supernatan yang diperoleh disaring dengan membran nitroselulosa berporositas 0,2 pm sehingga diperoleh suatu filtrat.
Standar biosurfaktan yang digunakan adalah surfaktin yang
diproduksi oleh B. subtzlrs ATCC-2 1332 (Sigma Laboratories). Analisis produksi senyawa hidrogen sianida (Wey et al. 1990) dilakukan dengan cara menginfestasikan satu lup bakteri biokontrol berumur 48 jam dengan kerapatan 10' CFUI rnl pada medium agar Trzptlc Soy yang ditambah dengan glisin 4,4 g/l. Kertas saring steril dicelupkan ke dalam larutan asam pikrat (yaitu campuran asam pi krat 2,5 g/l dan Na2C03 12,5 g 11 air) dan diletakkan pada bagian dalam tutup cawan petri. Perubahan warna kertas saring diamati 2 hingga 6 hari inkubasi pada suhu 2 7 ' ~ . Produksi HCN diukur secara kualitatif dengan mengamati perubahan warna
kertas saring kuning menjadi coklat muda (sedikit HCN), coklat (HCN
sedang), merah bata (HCN banyak), dan tetap kuning (tidak menghasilkan HCN). Analisis produksi senyawa siderofor (Scher dan Baker 1982) dilakukan dengan menumbuhkan bakteri calon biokontrol atau bakteri patogen pada medium cair dengan kadar besi (FeC13)rendah (komposisi medium cair adalah 20 g sukrosa, 2 g L asparagin, 1 g K2HP04, 0,5 g MgS04 .7H20dalam 1 1 air destilata dengan pH 7,O). Suspensi bakteri diinkubasikan pada suhu 27" C selama 24 jam. Selanjutnya suspensi disentrifugasi dengan sentrifus (High Speed Micro Refrigerator Centrifuge
MRX- 151 Induction Drive) kecepatan 11000 rpm selama 30 menit. Supernatan disaring dengan membran nitroselulosa berporositas 0,2 pm. Siderofor dalam supernatan dideteksi dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 350, 380, 4 10,440,470, dan 500 nm. Tiga ml supernatan yang diduga mengandung siderofor
ditambah dengan 1 ml FeC13 lo-' M sebagai sumber senyawa besi yang terbatas, sedangkan untuk pembanding digunakan 3 ml supernatan tanpa ditambah dengan senyawa besi.
1.5. Formulasi Bakteri Biokontrol selama Penyimpanan Bahan pembentuk formulasi cair yang digunakan adalah molase yaitu limbah cair industri gula tebu (Pabrik Gula Tersana Barn, PT Rajawali 11, Kabupaten Cirebon) dan limbah cair tahu (Pabrik Tahu di Gunung Batu, Kota Bogor). diencerkan hingga konsentrasi
Molase
1 % berdasarkan kesamaan nilai tegangan
permukaannya dengan limbah cair tahu. Tegangan permukaan bahan pembentuk formulasi diukur dengan alat tensiometer Du Nuoy CSC 70545. Molase 1 % atau limbah cair tahu disaring dengan kertas saring untuk memisahkan kotoran. Sebelum diinfestasi dengan bakteri biokontrol, molase 1% atau limbah cair tahu disterilisasi pada suhu 121' C selama 30 menit. Analisis kandungan kimia molase 1 % dan limbah cair tahu dilakukan dengan metode gravimetri (Hadimuljono dan Soetikno 1990). Berdasarkan hasil analisis senyawa penghambat yang diproduksi oleh bakteri calon biokontrol dan kemampuan inaktivasi Xug yang tertinggi maka dipilih bakteri biokontrol untuk pembuatan forrnulasi. Pembuatan forrnulasi cair dilakukan dengan mensuspensikan bakteri biokontrol dari dua cawan agar nutrien umur 24 jam ke dalam 5 ml air destilata steril dengan kerapatan 10" CFUlml.
Suspensi ini
ditambahkan ke dalam 20 ml molase 1 % atau 20 ml limbah cair tahu. Fomulasi
dua atau tiga jenis bakteri biokontrol dibuat dengan cara mencampur bakteri biokontrol dengan perbandingan 1:1. Kerapatan masing-masing bakteri 1o6CFU /ml. Umur simpan formulasi cair dievaluasi dengan mekanisme antagonisme formulasi cair biokontrol setelah penyimpanan 7, 30, 60, 90, 180, dan 360 hari. Mekanisme antagonisme formulasi cair biokontrol terhadap Xug diantaranya dianalisis melalui jumlah senyawa biosurfaktan, kerapatan bakteri
tegangan permukaan formulasi,
biokontrol dalam formulasi, dan pH formulasi.
disusun dalam rancangan
Percobaan
acak lengkap dan dilanjutkan dengan uji beda
menggunakan uji jarak berganda Duncan pada taraf kepercayaan 1 dan 5 %. Jumlah senyawa biosurfaktan dalam formulasi dianalisis dengan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) (Ohno et ul. 1995). Cara analisis biosurfaktan dalam formulasi sama seperti yang dilakukan pada analisis biosurfaktan dalam filtrat bakteri calon biokontrol. Tegangan permukaan
formulasi cair dengan bahan pembentuk formulasi
berupa molase atau limbah cair tahu diukur dengan alat tensiometer Du Nuoy CSC 70545. Cara pengukuran dilakukan dengan mengangkat cincin dari dalam formulasi secara perlahan dengan cara memutar sekrup pada alat, sehingga skala penunjuk pada alat mengalami kenaikan (sebelum pengukuran, cincin berada
2 cm di bawah
permukaan formulasi cair). Pengukuran tegangan permukaan dihentikan jika cincin terlepas dari permukaan formulasi. Tegangan permukaan formulasi dilihat pada skala yang terbaca pada tensiometer. dynelcm atau mN/m.
Tegangan permukaan dinyatakan dalam
Tegangan permukaan menunjukkan jurnlah gaya yang
dibutuhkan untuk melepaskan cincin dari lapisan permukaan cairan formulasi.
Kerapatan bakteri
biokontrol dalam forrnulasi
dihitung dengan metode
pencawanan bakteri pada medium selektif. Medium agar King's B digunakan untuk formulasi yang berisi P. ,fluorescens GI34, agar Tryplic Soy untuk H. suhlilis BBO 1, serta pencawanan pada medium agar King's B dan Tryptic Soy yang dilakukan sekaligus untuk formulasi yang berisi campuran bakteri biokontrol (Lelliot dan Stead 1987). Pengukuran pH formulasi molase atau limbah cair tahu dilakukan dengan pH meter.
Percobaan 11. Evaluasi Keefektifan Bakterisida Botani Asal Enam Jenis Tanaman dan Analisis Senyawa Penghambat terhadap Penyakit Pustul Bakteri
11.1. Ekstraksi Bahan Bakterisida Botani Enam macam bahan tanaman calon bakterisida botani yaitu daun kipahit, daun paku papila, daun matoa, daun sereh wangi, rimpang lengkuas merah, dan buah kelapa sawit seberat 3000 gram dikeringudarakan di tempat teduh hingga 5 hari. Bahan-bahan tanaman tersebut dipotong kecil dan digiling menjadi tepung. Tepung tanaman sebanyak 1500 gram direndam dalam etano195 % (Merck) (wlv 1:5) selama 48 jam dan disaring dengan kertas saring steril. Filtrat diuapkan dengan vakum rotarievaporator tipe 34912 (J Bibby Science Product Limited) berkecepatan 5500 rpm, suhu 45' C dan vakum bertekanan 45 cmHg sehingga terbentuk ekstrak.
11.2. Pengujian Inaktivasi Xag in vitro oleh Bakterisida Botani Ekstrak enam bahan tanaman calon bakterisida masing-masing sebanyak I mg dilarutkan dalam 10 ml air destilata steril (konsentrasi 10%) atau 5 ml air destilata steriI (konsentrasi 20%). Potongan kertas saring steril berbentuk cakram berdiameter 6 mm dicelupkan ke dalam larutan ekstrak botani pada masing-masing konsentrasi.
Kertas saring mengandung ekstrak botani diinfestasikan pada medium agar Yeast
Ijextrose Carbonate yang 4 jam sebelumnya telah diinfestasi dengan Xug. Diameter zone penghambatan yang terbentuk diukur dengan kertas milimeter (Van Chu yen et ul. 1982). Berdasarkan diameter zone bening yang terbentuk, dihitung persen inaktivasi Xag dengan cara membandingkan diameter zone bening dengan diameter cawan petri yang ditumbuhi seluruhnya oleh Xag. Persen inaktivasi Xag diamati selama 1 hingga 14 hari inkubasi. Untuk mengetahui perbedaan persen inaktivasi Xag oleh bakterisida botani, percobaan disusun dalam rancangan acak lengkap dengan tiga ulangan. Uji beda penghambatan antar jenis bakterisida botani menggunakan uji jarak berganda Duncan pada taraf kepercayaan 1 dan 5 %.
11.3. Analisis Asam Galat dalam Bakterisida Botani Kandungan asam galat dalam ekstrak enam macam bahan tanaman calon bakterisida botani
dianalisis dengan metode Hammerschrnidt dan Pratt (1978).
Ekstrak tanaman sebanyak 50 mg dilarutkan dalam 2,5 ml etanol 95 % (Merck). Larutan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 g selama 10 menit dan disaring
dengan kertas saring steril (Whatman 41). Supernatan sebanyak 1 ml dicampur dengan 1 ml etanol 95 % (Merck), 5 ml air destilata steril, dan 0,5 ml reagen Folin Ciocalteau 50 % (Sigma Chemical Co) menjadi larutan benvarna biru tua. Larutan didiamkan 5 menit, ditambah dengan 1 ml Na2C03 jenuh, dihomogenkan dengan vorteks dan disimpan ditempat gelap selama 1 jam. Sarnpel dihomogenisasi lagi sesaat sebelum pengukuran dengan spektrofotometer (Shimadzu V260) pada panjang gelombang 725 nm. Sebagai standar analisis digunakan asam galat (Fisher Scientific Co) dalam etanol95 %. Rancangan percobaan yang digunakan untuk menganalisis perbedaan kandungan asam galat bakterisida botani yaitu rancangan acak lengkap dengan tiga ulangan. Uji beda antar perlakuan menggunakan uji jarak berganda Duncan pada taraf kepercayaan 1 dan 5 %.
Percobaan 111. Analisis Keefektifan dan Keefisienan Pengendalian Pustul Bakteri dengan Kombinasi Pola Tumpangsari atau Monokultur dan Aplikasi Bakteri Biokontrol atau Bakterisida botani Benih kedelai varietas Wilis (dari Balai Penelitian Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Cimanggu, Bogor) masing-masing dua biji per lubang ditanam dengan jarak tanam 40 x 20 cm pada masing-masing petak perlakuan berukuran 3 x 4 m. Pemupukan dengan Urea 30 kglha diberikan sekaligus pada saat tanam. Pupuk SP36 90 kglha dan KC1 90 kglha masing-masing diberikan 113 bagian saat tanam dan 213 bagian sisanya 21 hari setelah tanam bersamaan dengan penanaman jagung.
Jagung varietas Bisma (dari Laboratorium Teknologi Benih Departemen Budidaya Pertanian Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor) ditanam tiga minggu setelah penanaman kedelai dengan jarak tanam 100 x 80 cm.
Pemupukan
jagung dengan Urea, SP36, dan KC1 masing-masing sebanyak 30 kglha diberikan sekaligus pada
28 hari sesudah tanam.
Pemupukan kedelai maupun jagung
dilakukan secara tugal dengan jarak 7 cm di samping kiri kanan lubang tanam dan kedalaman 10 cm. Percobaan aplikasi agens biokontrol dilakukan pada petak percobaan yang berbeda dengan percobaan aplikasi bakterisida botani, tetapi lapangan di
terletak pada satu
kebun percobaan Cikarawang, Darmaga, Bogor.
Denah petak
percobaan disajikan pada Lampiran I . Bakteri biokontrol yang digunakan berupa P.fluorescens GI34, B29, dan B. subtrlls BBOl berbentuk formulasi cair umur 1 hingga 50 hari penyimpanan.
Kerapatan bakteri biokontrol pada saat pembuatan lo6 CFUIml formulasi. Formulasi yang digunakan berisi satu jenis bakteri dan campuran dua atau tiga jenis bakteri biokontrol. Cara aplikasi bakteri biokontrol adalah (I) perlakuan setiap kg benih kedelai sebelum tanam dengan formulasi bakteri biokontrol konsentrasi 20 mlll air dilanjutkan dengan penyemprotan konsentrasi 20 mlll pada daun umur 30 dan 40 HST dan (2) tanpa perlakuan benih tetapi hanya penyemprotan formulasi bakteri biokontrol di daun dengan konsentrasi 20 mlll cairan semprot pada tanaman kedelai 28, 35, dan 42 HST.
Penggunaan bakteri biokontrol dibandingkan dengan
streptomisin sulfat ( 2 g streptomisin sulfat dalam 1 1 air) dan molase 1 % ( 20 ml molase dalam 1 1 air). Bakterisida botani yang digunakan adalah ekstrak daun matoa, daun kipahit, daun paku papila, daun sereh wangi, rimpang lengkuas merah, dan buah kelapa sawit dengan konsentrasi 100 mg ekstrak bakterisida botani1500 ml air. Sebagai pembanding digunakan ekstrak daun mimba (produk formulator) konsentrasi 2 g/l air, streptomisin sulfat (2 g streptomisin sulfat dalam 1 1 air), dan molase 1 % (20 ml molase dalam 1 1 air). Aplikasi bakterisida botani adalah (1) perlakuan benih kedelai sebelum tanam dengan ekstrak bakterisida botani dilanjutkan dengan penyemprotan pada daun umur 30 dan 40 HST, dan 2) tanpa perlakuan benih tetapi hanya penyemprotan ekstrak bakterisida botani di daun pada tanaman kedelai 28,35, dan 42 HST. Rancangan percobaan yang digunakan yaitu petak petak terbagi dilanjutkan dengan uji beda antar perlakuan menggunakan uji jarak berganda Duncan pada taraf kepercayaan 1 dan 5 %. Petak utama adalah pola tanam (P) terdiri atas tumpangsari kedelai-jagung dan monokultur kedelai. Anak petak adalah jenis agens pengendalian (A) meliputi penggunaan bakteri biokontrol, bakterisida botani, bakterisida kimia, molase I %, dan tanpa pengendalian. Anak anak petak adalah cara pengendalian (B) yaitu perlakuan benih kedelai sebelum tanam dilanjutkan dengan penyemprotan pada daun kedelai umur 30 dan 40 HST dan tanpa perlakuan benih, tetapi penyemprotan di daun kedelai 28,35, dan 42 HST.
hanya
Model statistika yang digunakan adalah : Yijkl= + Ri + Pj + ai; + Ak + (PA);k + Pijk+ B1+ (PB)jI+ (AB )kl + (PAB)jkl +EiSkl nilai tengah perlakuan = tiga kali ulangan = pola tanam (2 cara budidaya) a = galat pola tanam A = jenis agens pengendalian (10 jenis) (PA) = interaksi pola tanam dengan jenis agens p = galat jenis agens pengendalian B = cara aplikasi agens pengendalian (2 cara aplikasi) (PB) = interaksi pola tanam dengan cara aplikasi (AB) = interaksi jenis agens dengan cara aplikasi (PAB) = interaksi cara aplikasi, jenis agens, dan pola tanam E = galat cara aplikasi
Keterangan: p R P
=
Pengamatan di lapangan meliputi keparahan penyakit pustul bakteri, populasi bakteri biokontrol yang telah disemprotkan dan bertahan hidup di perrnukaan daun kedelai, kandungan asam galat daun kedelai yang tidak disemprot dengan bakterisida botani maupun yang disemprot dengan bakterisida botani, jumlah polong kedelai, persen polong hampa kedelai, berat biji kedelai serta berat biji jagung per tanaman. Keparahan penyakit diukur dengan menggunakan rumus Townsend dan Hueberger (dalam Unterstenhofer 1973):
Kp =
1=0
ZxN Keterangan : KP = ni = vi = Z =
N
=
x 100%
keparahan penyakit jumlah tanaman yang terserang pada setiap kategori nilai numerik masing-masing kategori serangan nilai numerik kategori serangan tertinggi jumlah tanaman yang diamati
Kategori serangan tampak pada Gambar 2 dengan ketentuan: 0
=
I 2 3 4
= = =
=
tidak ada gejala bercak berdiameter 0,1 - 0,5 mm, antara 0 < X < 10 % bercak berdiameter > 0,5-1,O mm, antara 10 < X 5 30 % bercak berdiameter > 1,O - 2,O mrn, antara 30 < X < 50 % bercak berdiameter > 2,O mm, lebih dari 50 %
(jambar 2 Kategori Serangan X. a. pv. glycines ( Sumber: Can. Plant Dis. Surv. 1971 dimodifikasi j
Selanjutnya dari keparahan penyakit dihitung laju perkembangan penyakit (r) dengan rumus sebagai berikut (Zadoks dan Schein 1979):
Keterangan: r = laju infeksi t2-tl = selang waktu pengamatan (pengamatan ke 2 - pengamatan ke 1) x2 = keparahan penyakit pengamatan ke 2 x = keparahan penyakit pengamatan ke 1
Populasi bakteri biokontrol di perrnukaan daun kedelai dihitung antara 1 hingga 14 hari setelah penyemprotan menggunakan teknik pencawanan (plating) (Lelliot dan Stead 1987).
Dari setiap aplikasi bakteri biokontrol diambil tiga
tanaman contoh dan masing-masing diambil tiga daun trifoliat ( tanaman bagian atas, tengah, dan bawah). Helai daun digunting dengan ukuran 5 x 5 mm dan dicampurkan dalam 20 ml bufer fosfat steril. Selanjutnya suspensi bakteri dalam bufer fosfat diencerkan hingga lo-'.
Dari masing-masing pengenceran, diambil 0,l ml dan
dibiakkan pada medium selektif berupa agar King's B yang ditambah dengan rifampisin 50 ppm dan atau agar triptlc soy yang ditambah dengan rifampisin 50 ppm. Rancangan percobaan yang digunakan untuk menganalisis perbedaan jumlah populasi bakteri biokontrol yang bertahan di permukaan daun kedelai yaitu rancangan acak lengkap dengan tiga ulangan.
Uji beda antar jenis bakteri biokontrol
menggunakan uji jarak berganda Duncan pada taraf kepercayaan 1% dan 5 %. Kandungan asam galat daun kedelai dianalisis dengan metode Hammerschmidt dan Pratt (1978). Ekstrak daun kedelai sebanyak 50 mg dilarutkan dalam 2,5 ml etanol 95 % (Merck). Larutan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 g selama 10 menit dan disaring dengan kertas saring steril (Whatman 4 1).
Supernatan sebanyak
1 ml dicampur dengan 1 ml etanol 95 % (Merck), 5 ml airdestilata steril, dan 0,5 ml reagen Folin Ciocalteau 50 % (Sigma Chemical Co) menjadi larutan benvarna biru tua.
Larutan didiamkan 5 menit, ditambah dengan 1 ml Na2C03 jenuh,
dihomogenkan dengan vorteks dan disimpan ditempat gelap selama I jam. Sampel dihomogenisasi lagi sesaat sebelum pengukuran dengan spektrofotometer (Shimadzu
V260) pada panjang gelombang 725 nm. Sebagai standar analisis digunakan asam
galat (Fisher Scientific Co) dalam etanol95 %. Rancangan percobaan yang digunakan untuk menganalisis perbedaan kandungan asam galat daun kedelai yaitu rancangan acak lengkap dengan tiga ulangan. Uji beda antar penyemprotan jenis bakterisida terhadap kandungan asam galat daun kedelai menggunakan uji jarak berganda Duncan pada taraf kepercayaan 1 dan 5 %. Keefektifan pola tumpangsari dibandingkan dengan monokultur berdasarkan analisis produktivitas lahan. Produktivitas lahan dihitung dengan nisbah kesetaraan lahan (NKL) (IRRI 1973) sebagai berikut :
NKL
Keterangan : Xi Xj Yi Yj
=
= = = =
xi -+Xj
Y, Y,
produksi jagung pada tumpangsari produksi jagung pada monokultur produksi kedelai pada tumpangsari produksi kedelai pada monokultur
Keefisienan komponen pengendalian penyakit pustul bakteri pada usahatani kedelai dianalisis dengan R/C rasio yang merupakan pendapatan usahatani kedelai yang diterima untuk setiap rupiah yang dikeluarkan untuk memproduksi kedelai (Sundrum 1974 dan Tim IPB 1979).