38
BAHAN DAN METODE PENELITIAN Tempat dan Waktu Seluruh rangkaian penelitian, termasuk persiapan ekstraksi bahan, dan penyiapan kultur sel lestari BRIN-BD11, dilaksanakan selama 14 bulan, yaitu mulai bulan Juli 2004 s/d September 2005. Seluruh penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi, Pusat Studi Satwa Primata, LPPM, IPB. Bahan Penelitian Pada penelitian ini digunakan organ uji sel lestari penghasil insulin (clonal glucose-responsive insulin secreting cells) BRIN-BD11, pemberian Prof. Dr. dr. André Herchuelz, Laboratoire de Pharmacodynamie et de Thérapeutique, Université Libre de Bruxelles, Faculté de Médecine, Bruxelles, Belgium. Serbuk daun sambiloto (A.paniculata) dibeli dari Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat (BALITTRO) Bogor. Diazoxide dibeli dari Sigma, glibenklamid diberi oleh PT. Aventis Farma Indonesia, sedangkan verapamil diberi oleh PT.Dexa Medica. Bahan bahan komponen media tersedia di laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi, PSSP, LPPM, IPB.
Penyiapan Ekstraksi Sambiloto Tanaman sambiloto di dapat dari BALITTRO, dengan nomor aksesi Cimangu, merupakan salah satu dari tiga varietas unggul sambiloto yang dibudidayakan. Pembuatan serbuk kering sambiloto dilakukan di BALITTRO Bogor, dengan mengeringkan daun sambiloto dalam oven dengan suhu 400C selama 3 hari. Setelah kering dihaluskan dan di simpan untuk pembuatan ekstraksi. Pembuatan ekstraksi sambiloto dilakukan pada hari perlakuan. Untuk membuat larutan persediaan sambiloto dengan konsentrasi 40 mg/mL, dilakukan penimbangan 4 gr serbuk kering daun sambiloto, masukkan dalam 100 mL aquabidest yang sudah mendidih. Aduk dengan stirrer selama 15 menit, dilanjutkan dengan penambahkan aquabidest sampai volume mencapai 100 mL
39
seperti yang dilakukan oleh peneliti lain (Gray et al, 2000, Gray & Flatt, 1997). Bahan padatan dipisahkan dari larutan sambiloto dengan sentrifugasi kecepatan 2000 rpm selama 15 menit, berbeda dengan beberapa penelitian terdahulu yang menggunakan penyaringan dengan kertas saring Whatman no 1 untuk memisahkan bahan padatan. Ambil dan pisahkan larutan sambiloto sebagai larutan persediaan sambiloto untuk perlakuan selanjutnya sesuai dengan konsentrasi sambiloto yang diperlukan. Penyiapan berbagai media Media RPMI 1640. Bahan baku media RPMI 1640 didapat secara komersial. Untuk keperluan kultur BRIN-BD 11 harus ditambahkan 2mM L-glutamin, glukosa 11.1 mM dan antibiotika penisilin100 U/mL–streptomisin 100 μg/mL, serta 10% foetal bovine serum (FBS). Media modified Kreb-Ringer Buffer (KRB). Untuk memudahkan pembuatan larutan KRB, dilakukan pembuatan larutan persediaan masing masing komponen dalam konsentrasi 1M. Aquabidest didapat dari produksi laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi, PSSP, LPPM, IPB Bogor dengan menggunakan alat Water System milli RO dan milli Q produksi millipore, Germany. Larutan persediaan NaCl, KCl, CaCl2, KH2PO4 dan MgSO4 dibuat satu hari sebelumnya, sedangkan larutan glukosa dan NaHCO3 dibuat pada hari perlakuan. Serbuk kering komponen KRB ditimbang dengan timbangan Ohauss, USA. Pembuatan 100 mL larutan persedian NaCl (BM= 58.5) dengan konsentrasi 1 M dilakukan dengan melarutkan serbuk NaCl seberat 5.85 gram ke dalam aquabidest sampai volume mencapai 100 mL. Larutan persediaan KCl (BM= 74) dengan konsentrasi 1M sebanyak 10 mL, dibuat dengan melarutkan 0.74 gr serbuk KCl ke dalam aquabidest sampai volume mencapai 10 mL. Larutan CaCl2 (BM=111) dengan konsentrasi 1M sebanyak 10 mL, dibuat dengan melarutkan 1.11 gr serbuk CaCl2 ke dalam aquabidest sampai volume mencapai 10 mL. Larutan persediaan MgSO4 dilakukan dengan menimbang 2.46 gr MgSO4.7H2O
40
(BM=246.48) dan dilarutkan dalam aquabidest sampai volume mencapai 10 mL. Larutan persediaan KH2PO4 (BM=136) dengan konsentrasi 1M, dibuat dengan melarutkan 1.36 gr serbuk KH2PO4 ke dalam aquabidest sampai volume mencapai 10 mL. Larutan persediaan glukosa (BM=180) dibuat dengan melarutkan 1.8 gr glukosa ke dalam aquabidest sampai volume mencapai 10 mL. Demikian juga larutan persediaan NaHCO3 (BM=84) dibuat dengan melarutkan 0.84 gr serbuk NaHCO3 ke dalam aquabidest sampai volume mencapai 10 mL. HEPES sudah tersedia dalam konsentrasi 1 M, disimpan dalam lemari pendingin dengan suhu 40C dan siap dipakai sewaktu waktu diperlukan. KRB mengandung komponen NaCl 115 mM, KCl 4.7 mM, CaCl2 1.3 mM, KH2PO4 1.2 mM, MgSO4 1.2 mM, NaHCO3 24 mM, HEPES 10 mM dan albumin dalam bentuk Bovine Serum Albumin (BSA) 1gr/L. Adapun konsentrasi glukosa tergantung pada kebutuhan sesuai kondisi yang dipergunakan pada saat perlakuan. Dalam penelitian ini dipergunakan 2 jenis KRB, yaitu KRB-1 dengan konsentrasi glukosa sebesar 1.11 mM, dan KRB-3 dengan konsentrasi glukosa 16.7 mM. Untuk membuat 200 mL larutan KRB-1, dilakukan pengisian aquabidest sekitar 50 - 100 mL ke dalam botol, perlakuan ini dimaksud untuk menghindari terjadinya perubahan bentuk larutan yang menjadi keruh bila pencampuran komponen dilakukan dalam konsentrasi pekat. Kemudian ke dalam aquabidest tersebut ditambahkan 23 mL larutan persediaan NaCl 1M, 0.94 mL larutan persediaan KCl 1M, 260 μL larutan persediaan CaCl2 1M, 240 μL larutan persediaan KH2PO4 1M, 240 μL larutan persediaan MgSO4 1M, 4.8 mL larutan persediaan NaHCO3 1M, 222 μL larutan persediaan glukosa 1M, 2 mL HEPES 1M. Selanjutnya ditambahkan aquabidest sampai mencapai volume 200 mL. Derajat keasaman media dengan pH sekitar 7.4 didapat dengan mengalirkan gas CO2 5% dalam O2 95% selama 20 menit. Setelah selesai aliran gas tersebut, masukkan 200 mg Bovine serum albumin (BSA) dan diamkan sejenak sampai seluruh BSA larut. Untuk menghindari terbentuknya busa yang berlebihan, larutan tersebut jangan dikocok, tetapi sebaiknya diaduk dengan menggunakan stirrer selama 5 menit. Pengukuran derajat keasaman, dilakukan dengan alat pH meter merk Orion, USA.
41
Pembuatan 200 mL larutan KRB-3 dilakukan prosedur yang sama dengan penyiapan KRB-1, perbedaan hanya pada konsentrasi glukosa, di mana pada KRB-3 ditambahkan 3.34 mL larutan persediaan glukosa 1M. Selanjutnya larutan ini siap dipakai. Media sambiloto dalam KRB. Untuk menilai efek insulinotropik dan mempelajari mekanisme kerja sambiloto sebagai antidiabetes, dibuat larutan sambiloto berbagai konsentrasi dalam lingkungan KRB-1 dan KRB-3. Pembuatan 100 mL larutan sambiloto dengan konsentrasi 10 mg/mL dalam lingkungan KRB-1 (KRB1-S10) diawali dengan memasukkan 20 mL aquabidest dalam botol 100 cc. Tambahkan ke dalam aquabidest tersebut 11.5 mL larutan persediaan NaCl 1M, 0.47 mL larutan persediaan KCl 1M, 130 μL CaCl2 1M, 120 μL larutan persediaan KH2PO4 1M , 120 μL larutan persediaan MgSO4 1M, 2,4 mL larutan persediaan NaHCO3 1M, 111 μL larutan persediaan glukosa 1M, 1 mL HEPES 1M. Selanjutnya tambahkan 25 mL larutan sambiloto 40 mg/mL. Tambahkan aquabidest sampai mencapai volume 100 mL. Derajat keasaman media dengan pH sekitar 7.4 didapat dengan mengalirkan gas CO2 5% dalam O2 95% selama 20 menit. Setelah selesai aliran gas tersebut, masukkan 100 mg Bovine serum albumin (BSA) dan diamkan sejenak sampai seluruh BSA larut. Untuk menghindari terbentuknya busa yang berlebihan, larutan tersebut jangan dikocok, tetapi sebaiknya diaduk dengan menggunakan stirrer selama 5 menit. Pengukuran derajat keasaman, dilakukan pengukuran pH dengan alat pH meter merk Orion, USA. Pembuatan media KRB-1 dengan konsentrasi sambiloto 5 mg/mL (KRB1S5)
dilakukan dengan menambahkan 5 mL KRB-1 ke dalam 5 mL larutan
sambiloto 10 mg/mL dalam KRB-1 (KRB1-S10). Demikian seterusnya untuk konsentrasi sambiloto 2.5 mg/mL (KRB1-S2,5), tambahkan 7.5 mL KRB-1 ke dalam 2.5 mL larutan sambiloto 10 mg/mL sambiloto dalam KRB-1 (KRB1-S10), atau menambahkan 5 mL KRB-1 ke dalam 5 mL larutan sambiloto 5 mg/mL dalam KRB-1 (KRB1-S5). Untuk mendapatkan larutan sambiloto 1.25 mg/mL dalam KRB-1 (KRB1-S1.25), tambahkan 8.75 mL KRB-1 ke dalam 1.25 mL
42
larutan sambiloto 10 mg/mL dalam KRB-1 (KRB1-S10), atau tambahkan 5 mL larutan KRB-1 ke dalam 5 mL larutan sambiloto 2.5 mg/mL dalam KRB-1 (KRB1-S2.5). Untuk mendapatkan larutan sambiloto 0.625 mg/mL dalam KRB-1, tambahkan 9.375 mL KRB-1 ke dalam 0.625 mL larutan sambiloto 10 mg/mL dalam KRB-1 (KRB1-S10) atau tambahkan 5 mL KRB-1 ke dalam 5 mL larutan sambiloto 1.25 mg/mL dalam KRB-1 (KRB1-S1,25). Penyiapan larutan sambiloto dalam KRB-3, dilakukan dengan prosedur yang sama kecuali konsentrasi glukosa, di mana pada KRB-3 ditambahkan 1.67 mL larutan persediaan glukosa 1M. Penyiapan media KRB dengan kandungan 25 meq kalium. Pembuatan 100 mL media KRB-1 dengan kandungan kalium sebesar 25 meq dilakukan pengisian 30 mL aquabidest ke dalam botol. Kemudian ke dalam aquabidest tersebut ditambahkan 9.2 mL larutan persediaan NaCl 1M, 2.5 mL larutan persediaan KCl 1M, 130 μL larutan persediaan CaCl2 1M, 120 μL larutan persediaan KH2PO4 1M , 120 μL larutan persediaan MgSO4 1M, 2.4 mL larutan persediaan NaHCO3 1M, 111 μL larutan persediaan glukosa 1M,.1 mL HEPES 1M. Tambahkan aquabidest sampai mencapai volume 100 mL. Derajat keasaman media dengan pH sekitar 7.4 didapat dengan mengalirkan gas CO2 5% dalam O2 95% selama 20 menit. Setelah selesai aliran gas tersebut, masukkan 100 mg Bovine serum albumin (BSA) dan diamkan sejenak sampai seluruh BSA larut. Untuk menghindari terbentuknya busa yang berlebihan, larutan tersebut jangan dikocok, tetapi sebaiknya diaduk dengan menggunakan stirrer selama 5 menit. Pengukuran derajat keasaman, dilakukan pengukuran pH dengan alat pH meter merk Orion, USA. Untuk membuat media ini dalam KRB-3 dilakukan prosedur yang sama kecuali konsentrasi glukosa, di mana pada KRB-3 ditambahkan 1.67 mL larutan persediaan glukosa 1M. Penyiapan media KRB dengan kandungan 500 μM Diazoxide Buat larutan persediaan diazoxide pekat dalam NaOH, karena diazoxide tidak larut dalam air, dan hanya larut dalam DMSO dan NaOH. Untuk menghindari penggunaan NaOH dalam jumlah besar yang dapat mengubah
43
komponen elektrolit dan pH larutan, maka dilakukan pembuatan larutan pekat diazoxide dalam NaOH 1M dan selanjutnya diencerkan 1000 kali. Untuk maksud tersebut, dilakukan penimbangan 57.68 mg diazoxide (BM=230.70) dengan timbangan analitik merek Mettler, USA dan masukkan dalam wadah (snap cap) 1 mL. Tambahkan NaOH 1M sampai volume mencapai 0.5 mL, aduk dengan alat pengocok vertex sampai terbentuk larutan yang jernih. Untuk mendapatkan 100 mL KRB dengan kandungan 500 μM diazoxide, tambahkan 100 μL larutan pekat diazoxide dalam NaOH 1M. Kristalisasi diazoxide dapat dihindari dengan cara
penambahan larutan
pekat diazoxide ke dalam KRB secara bertahap dan dilakukan setetes demi setetes sambil sekaligus mengaduk albumin dengan strirrer. Pemeriksaan derajat keasaman, dilakukan pengukuran pH dengan alat pH meter merk Orion, USA. Penurunan pH dapat dikoreksi dengan pemberian HCl pekat. Penyiapan media KRB dengan kandungan 100 μM Verapamil Penyiapan media yang mengandung verapamil jauh lebih mudah, karena verapamil larut dalam air. Untuk menghindari kesalahan dalam pengenceran, maka dilakukan pembuatan larutan pekat verapamil dalam air, baru kemudian diencerkan 1000 kali dalam larutan KRB yang dikehendaki. Pembuatan larutan pekat verapamil dilakukan dengan menimbang 49.10 mg verapamil (BM=491.07) dengan timbangan analitik.merek Mettler, USA. Masukkan serbuk verapamil ke dalam wadah plastik (snap cap) 1.5 mL. Tambahkan aquabidest sampai volume 1 mL. Kocok dengan alat vertex sampai terbentuk larutan jernih. Untuk mendapatkan larutan KRB dengan kandungan 100 μM verapamil, tambahkan 100 μL larutan pekat verapamil ke dalam 100 mL KRB setetes demi setetes sambil dilakukan pengadukan albumin dalam KRB dengan stirrer sampai tidak terlihat adanya kristal. Derajat keasaman diukur dengan alat pH meter merk Orion, USA.
44
Penyiapan media KRB dengan kandungan 100 μM Glibenklamid Penyiapan media yang mengandung glibenklamid sedikit lebih sulit karena glibenklamid tidak larut dalam air dan NaOH, tetapi mudah larut dalam DMSO. Untuk menghindari kesalahan dalam pengenceran, maka dilakukan pembuatan larutan pekat glibenklamid dalam DMSO, baru kemudian diencerkan 1000 kali dalam larutan KRB yang dikehendaki. Pembuatan larutan pekat glibenklamid dilakukan dengan menimbang 49.40 mg glibenklamid (BM=494.00) dengan timbangan analitik merek Mettler, USA. Masukkan serbuk glibenklamid ke dalam wadah plastik (snap cap) 1.5 mL lalu tambahkan DMSO sampai volume 1 mL. Kocok dengan alat vertex sampai terbentuk larutan jernih. Untuk mendapatkan larutan KRB dengan kandungan 100 μM glibenklamid, tambahkan setetes demi setetes 100 μL larutan pekat glibenklamid ke dalam 100 mL KRB, sambil dilakukan pengadukan dengan stirrer sampai tidak terlihat adanya kristal. Derajat keasaman diukur dengan alat pH meter merk Orion, USA. Penyiapan media sambiloto dalam KRB dengan kandungan 500 μM Diazoxide Setelah penyiapan 100 mL media sambiloto dalam KRB yang dikehendaki, baik KRB-1 maupun KRB-3, masukkan setetes demi setetes 100 μL larutan pekat diazoxide dalam NaOH 1M sambil diaduk dengan stirrer sampai larutan terlihat jernih dan tidak terlihat adanya kristal. Untuk memastikan derajat keasaman, dilakukan pengukuran pH dengan alat pH meter merk Orion, USA. Penyiapan media sambiloto dalam KRB dengan kandungan 100 μM Verapamil Setelah penyiapan 100 mL media sambiloto dalam KRB yang dikehendaki, baik KRB-1 maupun KRB-3, masukkan setetes demi setetes 100 μL larutan pekat verapamil dalam air, sambil diaduk dengan stirrer sampai larutan terlihat jernih dan tidak terlihat adanya kristal. Untuk memastikan derajat keasaman, dilakukan pengukuran pH dengan alat pH meter merk Orion, USA.
45
Penyiapan media sambiloto dalam KRB dengan kandungan 25 meq kalium Pembuatan 100 mL larutan sambiloto dengan konsentrasi 2.5 mg/mL dalam KRB-1 yang mengandung KCl 25 meq dilakukan dengan cara masukkan 20 mL aquabidest ke dalam botol. Kemudian ke dalam aquabidest tersebut ditambahkan 9.2 mL larutan persediaan NaCl 1M, 2.5 mL larutan persediaan KCl 1M, 130 μL larutan persediaan CaCl2 1M, 120 μL larutan persediaan MgSO4, 120 μL larutan persediaan KH2PO4 1M, 2.4 mL larutan persediaan NaHCO3 1M, 111 μL larutan persediaan glukosa 1M, 1 mL HEPES. Tambahkan 25 mL larutan sambiloto dengan konsentrasi 10 mg/mL. Selanjutnya tambahkan aquabidest sampai mencapai volume 100 mL. Derajat keasaman media dengan pH sekitar 7.4 didapat dengan mengalirkan gas CO2 5% dalam O2 95% selama 20 menit. Setelah selesai aliran gas tersebut, masukkan 100 mg Bovine serum albumin (BSA) dan diamkan sejenak sampai seluruh BSA larut. Untuk menghindari terbentuknya busa yang berlebihan, larutan tersebut jangan dikocok, tetapi sebaiknya diaduk dengan menggunakan stirrer selama 5 menit. Pemeriksaan derajat keasaman, dilakukan pengukuran pH dengan alat pH meter merk Orion, USA.
Penyiapan BRIN-BD11 Transportasi BRIN-BD11 dari Brussels. Sebelum BRIN-BD 11 dibawa ke Indonesia, dilakukan subkultur pada tiga hari sebelum hari kepulangan. BRIN-BD11 dikultur dengan media RPMI 1640 (GIBCO) yang diperkaya dengan 11.1 mM glukosa dan 2 mM L-Glutamin (Akbarsha et al, 1990), serta 100 U/mL antibiotika Penisilin dan 100 μg/mL Streptomisin, inkubasi dalam inkubator dengan aliran gas CO2 5% dan suhu 370C. Pada hari ketiga atau hari kepulangan, terlihat pertumbuhan BRIN-BD11 mencapai sekitar 75% dari tempat yang disediakan Flask T25 (botol 25cc). Setelah media lama dibuang, diganti dengan media baru sampai penuh sekali kemudian ditutup rapat, kemudian botol bisa dibawa dalam saku baju selama transportasi antara 24 sampai 36 jam. Setibanya di Indonesia, media lama segera dibuang dan diisi kembali dengan 10 mL RPMI 1640 yang telah diperkaya untuk
46
melanjutkan prosedur kultur dalam upaya memperbanyak BRIN-BD11. Subkultur dilakukan secara teratur sampai sel terlihat cerah, sehat dan bahagia dengan laju pertumbuhan sel seperti semula. Setelah tercapai kondisi seperti ini, maka sel sudah dapat dipakai untuk perlakuan dalam penelitian, atau dibekukan kembali bila belum diperlukan. Pemeliharaan BRIN-BD11. Pemeliharaan dengan cara subkultur BRIN-BD11 tidak berbeda dengan pemeliharaan sel jenis monolayer lainnya, kecuali media yang dipakai disini adalah RPMI 1640 (GIBCO cat no. 23400-021). Setelah Flask T25 dikeluarkan dari inkubator dan dipindahkan ke dalam Biological Safety Cabinet Class II, media lama dibuang dari flask sampai habis. Diikuti dengan pencucian / pembilasan dengan cairan PBS sebanyak 3 kali. Prosedur
penglepasan
sel
dari
dinding
botol,
dilakukan
dengan
menambahkan 5 mL Trypsin 0.25% kedalam flask sampai menutupi seluruh permukaan sel, dan dilanjutkan inkubasi kembali didalam inkubator selama 5-10 menit dalam suhu 37 oC. Pengamatan dilakukan dibawah inverted microscope untuk memastikan seluruh sel sudah terlepas dari dinding botol. Bila sebagian besar sel masih menempel dengan kuat, maka bisa dimasukkan kembali ke dalam inkubator. Penglepasan sel dari dasar botol juga dapat dibantu dengan cara membilas dasar botol dengan suspensi sel tadi secara berulang ulang menggunakan pipet transfer, atau dengan memukulkan botol ke atas lantai Biological Safety Cabinet Class II. Setelah dipastikan bahwa semua sel BRINBD11 sudah terlepas dari dinding botol, ditambahkan media RPMI 1640 sebanyak 2 mL untuk menghentikan aktivitas enzim tripsin yang ada. Seluruh suspensi sel dipindahkan ke dalam tabung sentrifus dan lakukan sentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 10 menit (Beckman, GS 6R). Supernatant dibuang kemudian ditambahkan 5 mL media RPMI 1640 ke dalam tabung sentrifus yang berisi endapan sel, dilakukan pengocokan sehingga terjadi suspensi sel yang homogen. Pengocokan harus dilakukan secara hati hati dan teliti, karena sel monolayer sangat mudah menggumpal. Selanjutnya lakukan perhitung jumlah sel. Setelah
47
diketahui konsentrasi sel, lakukan pemindahan sejumlah sel ke dalam flask yang sudah disiapkan. Selama dalam pemeliharaan harus selalu dilakukan pemeriksaan setiap hari untuk mendeteksi kemungkinan kontaminasi. Pemeriksaan dibawah mikroskop dilakukan setiap 3 hari untuk menilai kepadatan sel dalam botol untuk proses subkultur berikutnya.
Cara perhitungan jumlah sel BRIN-BD11. Penghitungan sel dilakukan dengan mengambil sejumlah suspensi sel ke dalam lempeng 96 sumur untuk persiapan perhitungan jumlah sel. Dengan mikropipet, ambil 50 μL Trypan Blue 0.1% ke dalam salah satu sumur lempengan, dan tambahkan pula 50 μL suspensi sel. Penghitungan jumlah sel dilakukan dengan alat kamar hitung sel Improved Neubauer. Hitung sel yang berada di dalam dua corner square atau16 kotak kecil yang terletak pada sudut kiri atas dan sudut kanan bawah. Hitung seluruh sel hidup, yang terlihat cerah dan terang dan tidak berwarna gelap (sel yang mati akan mengambil zat warna Trypan Blue) termasuk sel sel yang menyentuh garis pada tepi atas dan tepi kiri tetapi tidak termasuk yang menyentuh tepi bawah dan tepi kanan atau lakukan hitungan termasuk sel yang menyentuh garis tengah pada tepi bawah dan tepi kanan tetapi tidak termasuk sel sel yang menyentuh garis tengah pada tepi atas dan tepi kiri. Perhitungan sel dilakukan dengan persamaan sebagai berikut:
Jumlah sel =
X xZ 2 x10 4 Z1
Keterangan : Jumlah sel
dalam satuan sel/mL
X
= Jumlah sel terhitung dalam corner square.
Z1
= Jumlah corner square, yang dipakai untuk menghitung jumlah sel.
Z2
= Faktor Pengenceran
48
Contoh: Dalam perhitungan menggunakan 2 corner square, yang terletak di ujung kiri atas dan ujung kanan bawah, berarti: X = jumlah sel yang terhitung dalam ke dua kotak corner square tersebut, misalnya 48 buah sel Z1 = 2 (karena menggunakan 2 buah corner square. Z2 = 2 (pengenceran 2 kali) Maka jumlah sel per mL adalah :
48 x 2 x10 4 = 48.104 sel 2
Proses pembekuan dan pencairan kembali BRIN-BD11.
Bila BRIN-BD11 belum diperlukan maka dapat dilakukan penyimpanan jangka panjang dengan membekukannya kembali. Proses ini diawali dengan prosedur subkultur dan dilanjutkan dengan perhitungan sel. Masukkan BRINBD11 ke dalam media RPMI 1640 yang telah diperkaya dan sudah ditambahkan DMSO 10%. Simpan suspensi sel dengan konsentrasi 2 juta sel per mililiter dalam wadah khusus, dan simpan dalam lemari pendingin dengan suhu -70 0C selama 24 jam. Setelah itu pindahkan ke dalam tempat pendingin dengan nirogen cair pada suhu -196 0C. Penyimpanan dapat berlangsung lama. Bila diperlukan maka ambil wadah dari pendingin dan letakkan pada suhu ruangan sampai seluruh media mencair, jangan dipanaskan dengan penangas air. Setelah mencair, pindahkan seluruh media dan sel di dalamnya ke dalam tabung sentrifus. Lakukan sentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 5 menit (Beckman GS 6R). Supernatan dibuang dan tambahkan 5 mL media RPMI 1640 yang telah diperkaya. Kocok suspensi sel BRIN-BD11 dengan hati hati sampai homogen, kemudian pindahkan ke dalam botol T25 yang sudah terisi 5 mL RPMI 1640 yang telah diperkaya. Inkubasi dalam inkubator dengan suhu 37 0C dan dialiri gas CO2 5%.
49
Metode Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dalam tiga tahap, yaitu:
1.
1.
Efek insulinotropik sambiloto pada BRIN-BD11.
2.
Pengaruh sambiloto pada sekresi insulin fase cepat BRIN-BD11.
3.
Mekanisme kerja sambiloto sebagai insulin sekretagog.
Efek Insulinotropik sambiloto pada BRIN-BD11.
Untuk dapat menilai efek insulinotropik sambiloto pada BRIN-BD11, dilakukan inkubasi BRIN-BD11 dalam berbagai konsentrasi sambiloto. Setelah jumlah sel BRIN-BD11 dalam botol kultur sudah mencukupi, dilakukan inkubasi BRIN-BD11 (passage 40-50) selama 24 jam pada lempeng plastik dengan 24 buah sumur merek Costar, USA, dengan konsentrasi 300.000 sel di dalam masing masing sumur dalam media RPMI 1640 sama dengan media yang dipakai selama kultur. Setelah inkubasi selama 24 jam, diharapkan sudah terjadi penempelan BRIN-BD11 pada dinding dasar sumur. Selanjutnya dilakukan pembilasan sebanyak 3 kali dengan 1 mL larutan segar Modified Kreb Ringer Buffer (KRB)-1 ( NaCl 115 mM, KCl 4.7 mM, CaCl2 1.3 mM, KH2PO4 1.2 mM, MgSO4 1.2 mM, NaHCO3 24 mM, HEPES 10 mM, BSA (Bovine Serum Albumin) 1 g/L, glukosa 1.11 mM, dan dialiri gas CO2 5%, O2 95% selama 15 menit). Sebelum perlakuan dimulai dilakukan preinkubasi selama 40 menit dengan 1 mL larutan KRB-1 dalam inkubator pada suhu 370C dan dialiri 5% gas CO2. Untuk penentuan efek insulinotropik sambiloto, dilakukan inkubasi dalam inkubator pada suhu 370C dan dialiri gas CO2 5% selama 60 menit dengan 1 mL larutan ekstrak sambiloto konsentrasi 0.625, 1.25, 2.5, 5, dan 10 mg/mL dalam KRB-3 (Modified Kreb Ringer Buffer berkadar glukosa 16.7 mM) dan KRB-1. Selanjutnya media dipanen dan dimasukkan dalam wadah 1.5 mL, dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 5 menit untuk memisahkan sel BRIN-BD11 yang terlepas dalam media tersebut. Lakukan pemeriksaan kadar insulin dengan Kit Mercodia Rat Insulin ELISA.
50
2.
Pengaruh sambiloto pada sekresi insulin fase cepat BRIN-BD11.
Untuk menilai efek insulinotropik sambiloto pada sekresi insulin fase cepat BRIN-BD11, dilakukan tahapan sama seperti di atas, hanya lama inkubasi dalam inkubator selama 20 menit saja dengan 1 mL larutan ekstrak sambiloto konsentrasi 0.625, 1.25, 2.5, 5, dan 10 mg/mL dalam KRB-3 ( Modified Kreb Ringer Buffer berkadar glukosa 16.7 mM) dan KRB-1. Selanjutnya media dipanen dan dimasukkan dalam wadah 1.5 mL, dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 5 menit untuk memisahkan sel BRIN-BD11 yang terlepas dalam media tersebut. Lakukan pemeriksaan kadar insulin dengan Kit Mercodia Rat Insulin ELISA. 3.
Mekanisme kerja sambiloto sebagai insulin sekretagog
Untuk mempelajari mekanisme kerja sambiloto sebagai insulin sekretagog, dilakukan tahapan sama seperti di atas, tetapi lama inkubasi hanya 20 menit. Perbedaan terletak pada jenis media, yaitu KRB-1 yang ditambahkan dengan 0.5 mM Diazoxide (aktifator K+ATP), 0.1 mM Verapamil (inhibitor kanal kalsium VDCC tipe-L), dan perlakuan dalam media dengan kandungan KCl 25 mEq. Selanjutnya media dipanen dan dimasukkan dalam wadah 1.5 mL, dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 5 menit untuk memisahkan sel BRIN-BD11 yang terlepas dalam media tersebut. Perhitungan kadar insulin menggunakan KIT Mercodia Rat Insulin ELISA.
Pemeriksaan Kadar Insulin
Analisis insulin bisa langsung dikerjakan, atau bila dilakukan lebih dari 24 jam pasca panen, harus disimpan dalam suhu -20 0C. Pada penelitian ini analisis insulin dikerjakan langsung segera setelah selesai perlakuan. Pemeriksaan kadar insulin menggunakan Kit Mercodia Rat Insulin Eliza buatan Mercodia, dengan teknik direct sandwich.
51
Tahap persiapan.
Siapkan lempeng mikrotiter khusus (bagian dari KIT yang telah disediakan) yang mempunyai sumur yang telah diberi anti-insulin (mouse monoclonal antiinsulin) pada dasar sumur. Untuk pemeriksaan 6 baris (6 X 8 sumur), siapkan larutan konjugat dengan cara menambahkan 250 μL larutan persediaan konjugat anti-insulin yang sudah berikatan dengan enzim peroksidase (Peroxidase conjugated mouse monoclonal anti-insulin) yang tidak berwarna, ke dalam 2.5 mL larutan penyangga konjugat (conjugate buffer) yang diberi warna biru. Tahap pelaksanaan.
Tahap berikutnya adalah memasukkan 25 μL cairan standar insulin dengan konsentrasi 0, 0.15, 0.4, 1, 1.5, 3 dan 5.5 μg/L ke dalam masing masing sumur pada baris pertama lempengan yang telah disiapkan di atas, mulai pada sumur ke dua dari atas. Sumur pertama dipakai sebagai koreksi blanko. Tambahkan 25 μL sampel ke dalam sumur pada baris baris berikutnya. Tambahkan 50 μL larutan konjugat (Peroxidase conjugated mouse monoclonal anti-insulin) yang telah disiapkan sebelumnya ke dalam sumur sumur yang telah diberi standar insulin maupun sampel, kecuali pada sumur blanko. Inkubasi di atas shaker selama 2 jam pada suhu ruang. Sambil menunggu inkubasi dapat disiapkan cairan pencuci, yaitu dengan melarutkan 1 bagian detergen konsentrat ke dalam 20 bagian aquabidest. Setelah 2 jam inkubasi, lakukan pencucian dengan larutan deterjen yang telah disiapkan, menggunakan alat pencuci otomatis merek Bio Rad sebanyak 6 kali. Setelah diyakini tidak ada cairan tertinggal dalam sumur sumur tersebut, tambahkan 200 μL tetramethylbenzidine (TMB) sebagai substrat dari enzim peroksidase. Inkubasi selama 15 menit pada suhu ruangan, dan terhindar dari cahaya. Tambahkan 50 μL stop solution H2SO4. Taruh pada alat pembaca kepadatan optik Spectrophotometer Microplate Reader BioRad model 3550 dengan panjang gelombang 450 nM. Alat ini secara otomatis akan mengguncang rak selama 5 detik sebelum pembacaan.
52
Perhitungan kadar insulin.
Intensitas warna yang terbaca oleh alat spectrophotometer menggambarkan konsentrasi insulin, makin tinggi intensitasnya makin tinggi konsentrasi yang terdeteksi. Perhitungan kadar insulin dalam satuan μg/L, diawali dengan pembuatan fungsi grafik antara kadar insulin standar sebagai sumbu X dan intensitas kepadatan warna sebagai sumbu Y. Dengan menggunakan program Microsoft Office Excel akan didapat persamaan grafik fungsi hubungan intensitas warna dan kadar insulin standar 0, 0.15, 0.4, 1, 1.5, 3 dan 5.5 μg/L, dari berbagai bentuk fungsi yang ada, fungsi yang terbaik dengan nilai r2 mendekati satu, biasanya berbentuk fungsi kuadrat Y = aX2 + bX + q. Dengan melanjutkan perhitungan, persamaan akan menjadi 0 = aX2 + bX + c di mana c = q – Y. Selanjutnya X dapat dihitung dengan: X1.2 = [- b + (b2 - 4ac)1/2] : 2a . Perhitungan Statistik
Perhitungan statistik untuk menilai perbedaan jumlah sekresi insulin pada berbagai perlakuan, digunakan student t test tidak berpasangan.