8
Prosedur Analisis Data Analisis statisik yang digunakan adalah rancangan faktorial dalam Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan ulangan 3 kali dengan model linier yang digunakan (Matjik dan Sumertajaya 2002) adalah: Yij = µ + πi + ßj + εij µ = pengaruh rataan umum πi = pengaruh hidrolisis laktosa β-galaktosidase pada jam ke-i; ßj = pengaruh ulangan ke-j εij = pengaruh galat hidrolisis laktosa oleh β galaktosidase pada jam ke-i dan ulangan ke-j i= Jam ke-0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, dan 24, j = 1,2,3. Data yang diperoleh dianalisis dengan Analysis of Variance (ANOVA) pada tingkat kepercayaan 95% dan taraf 0.05. Analisis data dengan SPSS 10.0. Jika hasil uji berbeda nyata maka akan dilanjutkan dengan uji Duncan.
3 HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Optimasi Waktu Produksi Enzim Galaktosidase Waktu produksi ditentukan berdasarkan aktivitas enzim β-galaktosidase tertinggi, yaitu dari jam ke-24 sampai ke-36 dimana kurva pertumbuhan mengalami peningkatan dengan aktivitas total sebesar 27.669 U dan mengalami penurunan pada jam ke-42. Pemanenan dilakukan pada waktu produksi βgalaktosidase optimum yaitu pada waktu jam ke-24 dimana pada waktu tersebut aktivitasnya meningkat sebesar 26.605 U/ml. Dan bakteri tersebut menghasilkan β-galaktosidase pada fase eksponensial hingga jam ke-24 dengan nilai OD sebesar 1.984 atau setara dengan 1.81x10-8 sel/ml (Data Lampiran 6).
9 2E-08
30000 25000
1.6E-08
1.4E-08
20000
1.2E-08 1E-08
15000
8E-09 10000
6E-09 4E-09
Aktivitas(U/ml)
Jumlah sel/ml
1.8E-08
5000
2E-09 0
0 0
6
12
18
24
30
36
42
48
Jam ke-
Gambar 1 Kurva pertumbuhan BAL indigenos strain D-210(♦)dan kurva β-galaktosidase BAL indigenos strain D-210(■)Kurva pertumbuhan BAL indigenos strain D-210(♦)dan kurva β-galaktosidase BAL indigenos strain D-210(■) Produksi dan Purifikasi β-Galaktosidase Gambar Kurva pertumbuhan BAL indigenos strain D-210(♦)dan kurva β-galaktosidase BAL indigenos strain D-210(■) Berdasarkan hasil penelitian, aktivitas spesifik β-galaktosidase kasar yang diperoleh adalah sebesar 138.396 U/ml (Tabel 1). Purifikasi selanjutnya dilakukan pengendapan dengan amonium sulfat. Pengendapan dilakukan pada konsentrasi optimum yaitu 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%. Pada Gambar 2 menunjukkan bahwa pengendapan enzim dengan ammonium sulfat mempunyai aktivitas spesifik tertinggi pada fraksi 4050% (Data Lampiran 7). Aktivitas spesifik menurun pada fraksi lebih dari 50% karena pada fraksi tersebut lebih banyak enzim yang terendap bukan enzim β-galaktosidase. Aktivitas spesifik β-galaktosidase hasil semipurifikasi ammonium sulfat pada fraksi 40-50% adalah sebesar 238.438 U/mg. Aktivitas spesifik enzim kasar lebih rendah dibandingkan aktivitas spesifik enzim pengendapan dengan ammonium sulfat karena konsentrasi protein yang diperoleh pada enzim kasar lebih tinggi dibandingkan hasil pengendapan dengan ammonium sulfat sebesar 0.365 mg (Tabel 1). Tingkat kemurnian pengendapan dengan ammonium sulfat dan mengalami peningkatan dari 1 kali menjadi 2.97 kali dan rendemen sebesar 62.88%.
0.70
1.60
0.60
1.40
1.20
0.50
1.00
0.40
0.80 0.30
0.60
0.20
0.40
0.10
Total Protein (mg)
Total Aktivitas (U)
10
0.20
0.00
0.00 10
20 30 40 50 60 Fraksi Ammonium Sulfat %
70
Gambar 2 Hasil semipurifikasi dengan garam ammonium sulfat aktivitas total (■)dan total protein(●)
Tabel 1 Purifikasi Parsial dari BAL indigenos strain D-210 Tahapan
Total Aktivitas (U)
Enzim Kasar Pengendapan AmoniumSulfat 40%-50% Dialisis
138.396
Total Protein (mg)
Aktivitas Spesifik (U/mg)
Rendemen (%)
Kemurnian (kali)
1.729
80.043
100.00
1.00
87.030
0.365
238.438
62.88
2.97
50.420
0.207
243.574
36.43
3.04
Purifikasi parsial β-galaktosidase dari BAL Indigenos strain D-210 hasil penngendapan selanjutkan dilakukan dialisis. Β-galaktosidase hasil dialisis menunjukkan total aktivitas adalah sebesar 50.420 U, total protein sebesar 0.207 mg dan aktivitas spesifik sebesar 243.574 U/mg drngan tingkat kemurnian meningkat sebesar 3.04 kali. Rendemen yang dihasilkan sekitar 36.43% (Tabel 1). Karakterisasi β-galaktosidase Suhu Suhu merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi kinerja enzim. Gambar 3 menunjukkan aktivitas β-galaktosidase bebas dan teramobil optimum pada suhu 45 oC dan 40 oC dengan aktivitas sebesar 180.093 U/ml dan 43.194 U/ml, Bila kenaikan suhu jauh di atas suhu optimum maka enzim akan terdenaturasi. (Data Lampiran 8). Aktivitas relatif β-galaktosidase amobil pada
11
suhu 40 oC lebih rendah yaitu 7.85% dibandingkan aktivitas relatif β-galaktosidase bebas dapat bertahan sampai 75.05%.
Aktivitas Relatif(%)
120.00 100.00 80.00 60.00
40.00
Gambar 4a menunjukkan pengaruh suhu terhadap stabilitas β-galaktosidase 20.00
0.00 25
30
35
40 Suhu
45
50
55
Gambar 3 Profil pengujian pengaruh suhu terhadap aktivitas β-galaktosidase
Aktivitas Tersisa(%)
Enzim bebas relatif stabil setelahpengaruh diinkubasi selama 1 jam denganβ-suhu Gambar 1 1Gambar 3 Profil pengujian suhu terhadap aktivitas 25 sampai 40 oC dengan aktivitas tersisa masing-masing sebesar 0.22% dan galaktosidase 0.14% dari aktivitasnya. Gambar 4b menunjukkan pengaruh suhu terhadap stabilitas β-galaktosidase teramobil(■) yang relatif stabil setelah diinkubasi selama bebas (▲) dan teramobil 1 jam dengan aktivitas tersisa sebesar 7.75% dan 2.01%.
90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00
79.94
82.78
50.67
49.98
(b)
25
30
16.32
35
40 Suhu
(a) (a)
')
45
0.22
0.14
50
55
12
Aktivitas Tersisa(%)
100.00 80.00
88.15 64.82
76.66
69.49
60.00 31.08
40.00 20.00
7.75
2.01
0.00 25
30
35
40
45
50
55
suhu
(b) Gambar 4 Profil hasil pengujian pengaruh suhu terhadap stabilitas β- galaktosidase bebas (a) dan teramobil (b)
pH Beberapa keadaan yang mempengaruhi kinerja enzim salah satu diantaranya adalah pH dimana β-galaktosidase bebas mencapai optimum pada pH 6.5 dengan aktivitas tertinggi sebesar 252.341 U/ml, sedangkan β-galaktosidase amobil pada pH 6 dengan aktivitas sebesar 40.428 U/ml. Gambar 5 menunjukkan optimasi pH β-galaktosidase bebas cenderung lebih rendah yaitu pH 6.5 dengan aktivitas sebesar 252.341 U/ml sedangkan β-galaktosidase teramobil optimasi tertinggi dikisaran pH 6 dengan aktivitas sebesar 40.428 U/ml. Aktivitas relatif enzim amobil tercapai sampai 100%.
Aktivitas Relatif(%)
120.00 100.00 80.00 60.00 40.00 20.00 0.00
5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
pH
Gambar 5 Profil hasil pengujian pengaruh pH terhadap aktivitas β-galaktosidase bebas(▲) dan teramobil(■)
13
45.00
39.42
Aktivitas Tersisa(%)
40.00 35.00
41.32
40.83
35.11
34.75
31.12
30.00 25.00 17.36
20.00 15.00
10.00 5.00 0.00 5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
9.47
10.63
7.5
8.0
pH
(a) 80.00
Aktivitas Tersisa(%)
70.00
67.64
65.71
69.18 60.7
60.00 50.00
43.37
40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 5.0
5.5
6.0
6.5
7.0
pH
(b)
Gambar 6 Profil hasil pengujian pH terhadap stabilitas bebas (a) dan teramobil (b)
β-galaktosidase
Enzim β-galaktosidase bebas relatif stabil setelah diinkubasi selama 1 jam pada pH 5.0 sampai 8.0 karena masih menyisakan aktivitas 40% (Data Lampiran 9). Gambar 6a dan 6b aktivitas β-galaktosidase masih relatif stabil dengan aktivitas tersisa pada β-galaktosidase bebas sebesar 40.83% dan β-galaktosidase teramobil sebesar 43.37%.
14
Aktivator dan Inhibitor Kation Hg2+ dan Cu2+ merupakan inhibitor kuat β-galaktosidase dari BAL Indigenos strain D-210 karena dapat menurunkan aktivitas sebesar 26.35% dan 53.97% dari kontrol (yaitu enzim yang tidak mendapatkan penambahan kation). Kation Ca2+, Co2+, Zn2+ dalam penelitian ini juga meningkatkan aktivitas β-galaktosidase dari kontrolnya sebesar 76.56%, 73.64% dan 61.5% (Data Lampiran 10). Beda halnya dengan Mn2+ dan Mg2+ memiliki masing – masing aktivitas dari kontrol sebesar 102 % dan 114 %.
400.000 337.116
350.000
Aktivitas (U/mL)
300.000 250.000 200.000
301.147
294.946 225.488 216.186 180.217
150.000 100.000 50.000
19.008
3.532
0.000 Kontrol
Ca
Co
Zn
Cu
Mn
Hg
Mg
Ion - ion Logam
Gambar 7 Aktivator dan inhibitor β-galaktosidase dari BAL Indigenos strain D-210
Parameter Kinetik . Penentuan nilai KM dan Vmaks dilakukan dengan pemetaan data dengan persamaan Lineweaver Burk (gambar 9). Persamaan Lineweaver Burk adalah y = 5.286x + 10.75 dengan nilai R2 sebesar 0.971 sehingga kecepatan maksimum aktivitas β-galaktosidase sebesar 0.093 µmol/menit dan nilai KM sebesar 0,491 mM. Pada β-galaktosidase teramobil terjadi peningkatan konsentrasi substrat dan peningkatan kecepatan reaksi. Untuk persamaan reaksi Lineweaver Burk untuk β-galaktosidase teramobil adalah y= 3.74x+2.106 diperoleh nilai 1/Vmaks = 2.106 dan nilai KM/Vmaks = 32.74. Maka nilai Vmaks = 0.474 µmol/menit dengan nilai KM sebesar 15.54 mM (Data Lampiran 12).
1/V
15
180.000 160.000 140.000 120.000 100.000 80.000 60.000 40.000 20.000 0.000 0.000
y = 5.286x + 10.75 R² = 0.971
(a)
5.000 10.000 15.000 20.000 25.000 30.000 35.000 1/S
(a) 25.000
(a)
20.000
y = 32.74x + 2.106 R² = 0.962
1/V
15.000 10.000
5.000 0.000 0.00
0.10
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
1/S
(b) Gambar 8 Kurva lineweaverBurk dari beta-galaktosidase bebas (a) dan teramobil (b) Optimasi Konsentrasi Alginat dan CaCl2 untuk Amobilisasi sel dan amobilisasi β-galaktosidase Bakteri Asam Laktat Indigenos Strain D-210 Interaksi dengan berbagai variasi jumlah beads dan konsentrasi alginat menghasilkan produk ONP yang berbeda nyata, dengan 4 variasi konsentrasi alginat yang berbeda yaitu 2%, 3%, 4% dan 5% (b/v) dengan inkubasi selama 1 jam konsentrasi alginat untuk sel amobilisasi yang diperoleh adalah sebesar 2% dengan jumlah beads 57 Konsentrasi alginat 2%, 3%, 4% dan 5% dengan variasi konsentrasi CaCl2 0.1 M, 0.3 M, 0.5 M terlihat bahwa untuk sel konsentrasi CaCl2 optimum pada konsentrasi 0.1 M untuk natrium alginat 2% sedangkan enzim untuk konsentrasi CaCl2 optimum pada konsentrasi 0.1 M dan natrium alginat 3%.
16
Produk oNP (µmol)
50
47.56
46.63
40
33.3
29.58
30
32.06
20.74
21.67 15.62 11.91
20.12
20
14.54
10
5.075
0 2 Calsium klorida 0,1M
3
4
Konsentrasi alginat Calsium klorida 0,3M
5 Calsium klorida 0,5M
(a)
Produk oNP(µmol)
60 50 40
51.59
49.42
41.98
44.31
33.45
33.45
30
20.58 14.23
15.93
20
22.14 11.59
8.18
10 0 2 Calsium klorida 0,1M
3 4 Variasi konsentrasi alginat (%) Calsium klorida 0,3 M
5
Calsium klorida 0,5 M
(b) Gambar 9 Variasi konsentrasi alginat dan CaCl2 untuk penggunaan enzim amobil (a) dan sel amobil (b) Gambar 9a menunjukkan bahwa konsentrasi alginat untuk amobilisasi pada enzim adalah 2% dengan konsentrasi CaCl2 0.1 M dengan jumlah produk yang dihasilkan sebesar 47.56 µmol ONP, CaCl2 0.3 M sebesar 20.74 µmol ONP dan CaCl2. 0.5 M sebesar 29.58 µmol ONP. Gambar 9b menunjukkan bahwa konsentrasi alginat untuk amobilisasi pada sel adalah 3% dengan konsentrasi CaCl2 0.1 dengan jumlah produk yang dihasilkan sebesar 49.42 µmol ONP, CaCl2 0.3 M dan CaCl2 0.5 M jumlah produk ONP yang dihasilkan masingmasing sebesar 41.98 µmol dan 8.8 µmol.
17
Produk ONP(µmol)
120 46.63 47.56 100 20.12 80 51.59 49.42 Interaksi dengan berbagai variasi jumlah beads dan konsentrasi21.67 alginat 60 44.31 33.45 40 20 0 2 3 4 5 Konsentrasi alginat (%)
Gambar 10 Optimasi konsentrasi alginat untuk amobilisasi sel (♦)dan amobilisasi enzim(■)
Optimasi Konsentrasi Enzim β-galaktosidase dan Sel Untuk Amobilisasi Pada Hidrolisis Laktosa Variasi penggunaan konsentrasi alginat pada β-galaktosidase dapat dilihat pada gambar 11 terdapat 3 variasi bobot yaitu 5%, 10% dan 20% . Pada bobot konsentrasi alginat 5 % cenderung lebih kecil produk yang dihasilkan yaitu sebesar 40.202 µmol sedangkan untuk bobot konsentrasi alginat 10% diperoleh produk sebesar 55.626 µmol. . 91.752
Produk (μmol)
100 80 60
55.626 40.202
40 20 0 5%
10%
20%
Konsentrasi Alginat
Gambar 11 Variasi Penggunaan konsentrasi alginat untuk amobilisasi β-galaktosidase pada hidrolisis laktosa Hasil penelitian menyatakan semakin banyak konsentrasi alginat pada enzim β-galaktosidase untuk amobilisasi pada hidrolisis laktosa maka semakin banyak
18
produk yang dihasilkan yaitu pada konsentrasi alginat 20% jumlah produk ONP sebesar 91.752 µmol. Konsentrasi alginat yang dipergunakan pada sel amobil untuk hidrolisis laktosa adalah sebesar 4%, 8% dan 12% (b/v).
Produk (μmol)
58.884
53.02
60 37.25
40 20 0
4%
8% 12% Konsentrasi Alginat
Gambar 12 Variasi penggunaan konsentrasi alginat untuk amobilisasi sel pada hidrolisis laktosa Gambar 12 menunjukkan bahwa konsentrasi alginat untuk amoblisasi pada hidrolisis laktosa untuk bobot konsentrasi alginat 4% paling rendah dibandingkan bobot alginat 8%. Untuk konsentrasi alginat 4% yaitu sebesar 37.25 µmol dan kosentrasi 8% sebesar 53.02 µmol. Konsentrasi alginat 12% adalah konsentrasi dengan jumlah produk yang tertinggi sebesar 58.884 µmol. Potensi Hidrolisis Laktosa pada Susu UHT Potensi hidrolisis sel bebas dan amobil dilakukan dengan sistem batch selama 24 jam pada suhu 45 oC selama 24 jam dan sampling dilakukan tiap 3 jam serta analisis laktosa terhidrolisis Pada gambar 14a hasil hidrolisis laktosa oleh sel BAL Indigenos strain D-210 pada sel teramobil meningkat yaitu pada jam ke-6 dengan aktivitas relatif sebesar 76.72% dengan jumlah laktosa terhidrolisis sebesar 0.366 g. Aktivitas relatif enzim teramobil tertinggi mencapai 62.68% dan mencapai optimum pada jam ke-18 dengan laktosa terhidrolisis sebesar 0.299 g (Data Lampiran 13). 90.00
Aktivitas relatif(%)
80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 0
3
6
9
12
15
18
21
24
jam ke-
Gambar 13 Potensi hidrolisis laktosa sel teramobil (a)
Aktivitas hidrolisis relatif(%)
19
70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 0
3
6
9
12
15
18
21
24
Jam ke
Aktivitas hidrolisisRelatif(%)
Gambar 14 Potensi hidrolisis laktosa enzim teramobil (b)
100.00 90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 0
3
6
9
12
15
18
21
24
Jam Ke-
Gambar 15 Potensi hidrolisis laktosa sel bebas (■) dan enzim bebas(♦) Pada gambar 15 menunjukkan bahwa potensi hidrolisis laktosa pada sel bebas dan enzim bebas mencapai aktivitas relatif masing-masing sebesar 73.37% dan 89.93% dengan jumlah laktosa terhidrolisis masing-masing sebesar 0.350 g dan 0.429 g. Analisis statistik terlihat bahwa aktivitas relatif sel teramobil dengan enzim teramobil terdapat perbedaan nyata (α=0.05) terhadap lamanya waktu aktivitas relatif dan tidak ada perbedaan nyata terhadap aktivitas hidrolisis relatif untuk sel bebas dan enzim bebas.
Penggunaan Berulang Sel Amobil dan Enzim Amobil Pemilihan amobilisasi dengan natrium alginat dipandang lebih aman dan murah Penggunaan berulang sel dan enzim setelah diamobilisasi adalah untuk memisahkan antara enzim dan produk yang dihasilkan. Sehingga enzim dapat dipakai berulang kali dan aktivitas tetap stabil. Sel amobil dan enzim amobil
20
Aktivittas Hidrolisis Relatif(%)
dimasukkan kedalam susu UHT lalu diinkubasi goyang untuk sel amobil pada suhu 40 oC dan enzim amobil pada suhu 45 oC kemudian dianalisis dengan menggunakan kit enzimatik GOD-POD. Penggunaan berulang butiran gel dilakukan sebanyak 6 kali dan terlihat penurunan aktivitasnya untuk sel dan enzim teramobil masing-masing sebanyak 42.35% dan 53.68%. Pada gambar 16a menunjukkan aktivitas hidrolisis relatif sel teramobil untuk pemakaian ulangan ke-6 masih menyisakan aktivitas sebesar 39.53% .Pada gambar 16b pemakaian ulangan ke-6 menyisakan aktivitas hidrolisis relatif sebesar 57.65% dari aktivitas awalnya sebesar 100%. 120.00
100.00
100.00 76.19
80.00
52.86
60.00
47.71
46.66
4
5
40.00
39.52
20.00 0.00 1
2
3
(a)
6
Ulangan ke-
Aktivitas hidrolisis Relatif(%)
(a)
120.00 100.00 100.00 80.00
64.01
62.83
60.76
3
4
60.00
54.86
53.68
5
6
40.00 20.00 0.00 1
2
Ulangan ke-
(b) Gambar 16 Penggunaan berulang sel teramobil (a) dan enzim teramobil (b)
