3 HASIL DAN PEMBAHASAN Rendemen Ekstrak Kasar Buah Lindur Ekstraksi dilakukan untuk memisahkan komponen-komponen senyawa aktif dari suatu bahan campuran dan dapat dilakukan menggunakan pelarut. Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi dengan bantuan goncangan menggunakan orbital shaker. Tahap awal proses ekstraksi, yaitu pengecilan ukuran dan pengeringan buar lindur. Pengecilan ukuran dan goncangan dilakukan untuk memperbesar peluang terjadinya interaksi antara komponen aktif yang diinginkan dengan pelarut sehingga komponen tersebut larut. Pengeringan bertujuan mengurangi kadar air dalam bahan. Pengeringan yang baik ditandai dengan penurunan berat sebelum dan setelah dikeringkan. Berdasarkan BPOM (2005), nilai kadar air bahan yang baik untuk ekstraksi adalah kurang dari 10%. Kadar air rendah diduga dapat memperlancar proses ekstraksi karena komponen aktif lebih terkonsentrasi dan pelarut lebih mudah menarik senyawa aktif yang terkandung dalam suatu bahan. Hal ini juga akan mempermudah proses penguapan. Pelarut yang digunakan dalam proses ekstraksi adalah metanol. Pelarut metanol digunakan berdasarkan hasil penelitian Jacoeb et al. (2013) yang memiliki rendemen yang terbesar (7,85%) dibandingkan dengan heksana (0,05%), etil asetat (0,13%). Rendemen hasil ekstraksi yang diperoleh pada penelitian ini disajikan pada Tabel 1. Ekstrak metanol juga memiliki aktivitas antioksidan yang paling efektif (IC50 terendah = 9,42 ppm) dibandingkan dengan heksana (IC50 = 443,61 ppm) dan etil asetat (IC50 = 2256,13 ppm) (Jacoeb et al. 2013). Pelarut metanol juga merupakan pelarut yang aman/ramah (green solvent) dan memiliki titik didih yang rendah. Menurut Sarkar et al. (2012), pelarut yang ramah lingkungan dianjurkan penggunaannya dalam proses ekstraksi karena dapat mengurangi residu berbahaya terutama jika substansi hasil ekstrak akan digunakan sebagai bahan tambahan pangan. Tabel 1 Rendemen ekstrak kasar buah lindur (B. gymnorrhiza) Berat Buah Berat Volume Rendemen Warna rendemen lindur awal (g) pelarut (mL) (%) ekstrak (g) 25 100 2,4838 9,94% Cokelat Tua 25 100 1,7083 6,83% Cokelat Muda Pelarut dengan titik didih rendah dipilih untuk mempermudah proses ekstraksi karena pelarut akan menguap pada saat evaporasi. Proses ekstraksi dilakukan dengan memasukkan serbuk kering buah lindur sebanyak 25 g ke dalam labu Erlenmeyer 250 mL dan dibungkus dengan alumunium foil untuk menghindari interaksi komponen hasil ekstrak dengan cahaya. Ekstraksi dilakukan selama 2 hari. Pemilihan lama ekstraksi tersebut berdasarkan hasil penelitian Hardiningtyas (2012) yang menghasilkan bahwa waktu ekstraksi selama 1 hari dan 2 hari memiliki rendemen ekstrak yang berbeda nyata, tetapi 2 hari dan 3 hari menghasilkan rendemen ekstrak yang tidak berbeda nyata. Proses filtrasi dilakukan setelah maserasi.
12
Proses filtrasi dilakukan menggunakan kertas saring Whatman 42. Proses ini dilakukan untuk memisahkan residu dengan hasil ekstrak (filtrat). Filtrat yang diperoleh berwarna cokelat. Filtrat tersebut disimpan dalam wadah gelap tertutup pada suhu dingin sebelum dievaporasi. Proses maserasi dilakukan hingga filtrat yang diperoleh tidak berwarna (bening), yaitu sebanyak 7 kali penyaringan. Proses evaporasi dilakukan menggunakan rotary vacuum evaporator pada suhu 40 oC. Suhu tersebut diharapkan mampu menguapkan pelarut (metanol) pada kondisi vacuum sehingga komponen bioaktif yang terdapat dalam substansi tetap dalam kondisi baik. Komponen aktif memiliki sifat yang peka terhadap cahaya, oksidasi, dan suhu. Hasil evaporasi yang diperoleh merupakan ekstrak kasar yang berbentuk pasta/gel. Ekstrak tersebut kemudian dikering-bekukan (freeze dried) sehingga diperoleh ekstrak berupa padatan (kristal). Rendemen ekstrak yang diperoleh sebesar 9,94% (tua) dan 6,83% (muda). Buah lindur tua memiliki rendemen yang lebih besar dibandingkan dengan yang muda. Hal ini membuktikan bahwa komponen aktif yang terdapat dalam lindur tua lebih banyak daripada yang muda. Hasil ini didukung oleh penelitian Cai et al. (2008) yang menghasilkan bahwa tanaman Glycyrrhiza uralensis yang tua (kultivasi 3 tahun) memiliki kandungan flavonoid dan saponin yang tinggi. Penelitian Erturk et al. (2010) menghasilkan adanya peningkatan total fenol pada tunas teh yang dipanen pada bulan Mei (87,55 mgGAE/g) menjadi 252,09 mgGAE/g pada bulan September. Hasil ini juga sesuai dengan penelitian Khaerana et al. (2008) yang menghasilkan bahwa umur panen berpengaruh terhadap kandungan xanthorrizol rimpang temulawak. Kandungan xanthorrizol secara umum meningkat pada tanaman yang dipanen umur 7 bulan dibandingkan dipanen umur 5 bulan.
Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kasar Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron atau reduktan dan dapat menghambat berkembangnya reaksi oksidasi dengan mengikat radikal bebas dan molekul yang sangat reaktif. Keberadaan senyawa antioksidan dalam suatu bahan dapat dideteksi dengan melakukan uji aktivitas antioksidan. Uji aktivitas antioksidan ekstrak kasar buah lindur ditentukan melalui uji DPPH. Metode uji DPPH merupakan salah satu metode yang paling banyak digunakan untuk memperkirakan efektivitas kinerja substansi yang berperan sebagai antioksidan. Metode pengujian ini berdasarkan kemampuan substansi antioksidan tersebut dalam menetralisir radikal bebas. Radikal bebas yang digunakan adalah 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH). Radikal bebas DPPH merupakan radikal bebas sintetik yang stabil pada suhu kamar dan larut dalam pelarut polar, yaitu metanol atau etanol (Molyneux 2004). Sifat stabil tersebut dikarenakan radikal bebas ini memiliki satu elektron yang didelokalisir dari molekul utuhnya sehingga molekul tersebut tidak reaktif sebagaimana radikal bebas lainnya. Delokalisasi ini memberikan warna gelap dengan absorbsi maksimum pada panjang gelombang 517 nm dalam larut metanol atau etanol (Vattem dan Shetty 2006). Metode ini dipilih karena merupakan metode yang sederhana, mudah, cepat, peka, dan hanya memerlukan sedikit bahan. Suatu senyawa dikatakan memiliki
13
memiliki aktivitas antioksidan apabila senyawa tersebut mampu mendonorkan atom hidrogennya pada radikal bebas DPPH (Gambar 2). Hal ini ditandai dengan terjadinya perubahan warna ungu menjadi kuning pucat (Molynuex 2004). Perubahan warna tersebut terjadi pada bahan uji yang diberi larutan DPPH 1mM yang diinkubasi selama 30 menit pada 37 oC. Perubahan warna terjadi pada semua ekstrak yang digunakan dalam pengujian dan vitamin C sebagai kontrol positif (Gambar 3). Persen inhibisi pada peredaman radikal bebas merupakan kemampuan suatu bahan dalam menghambat radikal bebas yang berhubungan dengan konsentrasi bahan yang diuji, sedangkan IC50 merupakan parameter yang sering digunakan dalam menyatakan hasil dari pengujian DPPH. Nilai IC50 dapat didefinisikan sebagai besarnya konsentrasi yang dapat menghambat aktivitas radikal bebas sebesar 50%. Nilai IC50 yang semakin kecil menunjukkan aktivitas antioksidan pada bahan yang diuji semakin besar (Molyneux 2004).
Gambar 2 Reaksi antara radikal bebas DPPH dengan senyawa peredam radikal bebas (Noviana et al. 2007). Hasil pengujian aktivitas antioksidan buah lindur dan vitamin C disajikan pada Tabel 2 dan grafik persamaan garis linier dapat dilihat pada Lampiran 1. Tabel 2 Aktivitas antioksidan ekstrak buah lindur (B. gymnorrhiza) dan vitamin C Nilai IC50 Kategori Bahan uji Persamaan garis linier (ppm) antioksidan* Ekstrak buah lindur Tua Muda Vitamin C
y = 0,86 + 38,41 y = 0,22x + 32,13 y = 4,67x + 38,33
13,46 81,60 2,50
sangat kuat kuat sangat kuat
Keterangan: (*) = Molyneux (2004)
Buah lindur tua memiliki nilai IC50 yang lebih tinggi (13,46 ppm) dibandingkan dengan buah lindur muda (81,60), sedangkan vitamin C memiliki IC50 sebesar 2,50 ppm. Molynuex (2004) menyatakan bahwa nilai IC50 kurang dari 50 ppm tergolong antioksidan yang sangat kuat sehingga buah lindur tua dan vitamin memiliki aktivitas antioksidan yang sangat kuat. Buah lindur muda tergolong kuat dengan kisaran 50-100 ppm.
14
Gambar 3 Hasil uji DPPH dari ungu menjadi kuning pucat: (kanan-kiri: blanko, 10 ppm, 20 ppm, 30 ppm, 40 ppm).
Kandungan Gizi Buah Lindur (B. gymnorrhiza) Buah lindur (B.gymnorrhiza) dimanfaatkan oleh masyarakat sebagai makanan pengganti nasi pada saat musim paceklik di Kepulauan Key, Maluku. Buah ini biasanya diolah dengan cara dikeringkan dan ditepungkan sehingga dapat disimpan pada waktu yang lama. Kandungan buah lindur tua ditentukan melalui uji proksimat. Kandungan gizi buah lindur yang diuji meliputi kadar air, kadar abu, kadar protein, dan kadar lemak. Kadar karbohidrat diperoleh dengan perhitungan by difference. Komposisi kimia buat lindur disajikan pada Tabel 3. Buah lindur yang digunakan dalam penelitian memiliki kandungan gizi yang tidak jauh berbeda dengan buah lindur yang digunakan oleh peneliti yang lain, yaitu Jacoeb et al. (2013) dan Fortuna (2005) (Tabel 3). Tabel 3 Kandungan gizi Brugueira gymnorrhiza dan Avicennia marina Avicennia Bruguiera gymnorrhiza marina Kandungan kimia Hasil Jacoeb et al. Fortuna Hardiningtyas penelitian (%) (2013) (%) (2005) (%) (2012) (%) 66,39 62,92 73,76 Kadar air 68,16 1,15 1,29 0,34 Kadar abu 4,45 2,11 2,11 1,13 Protein 3,67 1,07 0,79 1,25 Lemak 0,72 29,28 32,91 23,53 Karbohidrat 23,00 Kadar air buah lindur yang duji sebesar 66,39%. Persentase kadar air tersebut didukung oleh penelitian Jacoeb et al. (2013) dan Fortuna (2005), masing-masing sebesar 62,92% dan 73,76%. Penelitian mangrove jenis api-api putih (Avicennia marina) yang dilakukan Hardiningtyas (2012) menghasilkan kadar air sebesar 68,16%.
15
Analisis kadar air dapat digunakan untuk menentukan suatu bahan yang akan disimpan dalam selang waktu tertentu. Kadar air dalam suatu bahan merupakan media pertumbuhan bagi mikroorganisme. Kandungan air dalam suatu bahan juga ikut menentukan daya terima, kesegaran, dan daya tahan tersebut. Kadar air pada bahan pangan dapat dipengaruhi oleh habitat atau lingkungan dan jenis bahan yang diuji. Prinsip analisis kadar air yang dilakukan dalam penelitian ini adalah mengukur berat air bebas yang teruapkan dan tidak terikat kuat dalam jaringan bahan dengan bantuan panas. Air yang teruapkan ini merupakan air tipe III. Air tipe tersebut sering juga disebut air bebas dan merupakan air yang hanya terikat fisik dalam jaringan matriks bahan, yaitu membran, kapiler, serat dan lain sebagainya. Air ini dapat dimanfaatkan untuk pertumbuhan mikroba dan media bagi reaksi-reaksi kimia (Winarno 2008). Buah lindur yang diuji memiliki kadar lemak sebesar 1,07%. Persentase kadar lemak tidak jauh berbeda dengan hasil penelitian Jacoeb et al. (2013) dan Fortuna (2005), yaitu masing-masing sebesar 0,79% dan 1,25%. Kadar lemak yang rendah dapat disebabkan oleh kandungan kadar air yang cukup tinggi sehingga kadar lemak secara proporsional menurun. Yunizal et al. (1998) menyatakan bahwa kadar air umumnya berbanding terbalik dengan kadar lemak. Hubungan tersebut mengakibatkan semakin rendahnya kadar lemak jika kadar air yang terkandung dalam bahan memiliki jumlah yang tinggi. Kadar protein buah lindur sebesar 2,11%. Hasil ini sama seperti hasil penelitian Jacoeb et al. (2013), namun lebih tinggi daripada hasil penelitian Fortuna (2005), yaitu sebesar 1,13%. Perbedaan tersebut dapat disebabkan karena perbedaan habitat bahan baku yang digunakan. Kondisi nutrisi yang terkandung di habitat memberikan pengaruh terhadap komposisi kimia pada organisme yang hidup di wilayah tersebut (Megayana et al. 2012). Tanaman secara umum memiliki kandungan protein yang rendah dibandingkan dengan hewan, misalnya pada ikan gurame (Osphronemus goramy) kadar protein berkisar antara 18,71-20,67% (Nurjanah et al. 2010). Protein hewani lebih banyak menyediakan asam amino-asam amino esensial dan karenanya disebut protein bermutu tinggi. Protein yang kekurangan satu atau lebih asam amino esensial mempunyai mutu yang rendah. Asam amino-asam amino yang biasanya sangat kurang dalam bahan makanan disebut asam amino pembatas. Tumbuhan serelia memiliki asam amino pembatas yaitu lisin, sedangkan pada kacang-kacangan biasanya asam amino metionin (Winarno 2008). Kandungan mineral pada buah lindur segar sebesar 1,15%. Kadar mineral tersebut tidak jauh berbeda dengan hasil penelitian Jacoeb et al. (2013) yaitu 1,25%, namun jauh lebih tinggi daripada hasil penelitian Fortuna (2005) sebesar 0,34%. Tanaman api-api putih yang diteliti oleh Hardiningtyas (2012) memiliki kandungan mineral yang tinggi (4,45%) dibandingkan dengan kandungan mineral pada buah lindur segar. Tinggi rendahnya kadar abu dapat disebabkan oleh perbedaan habitat atau lingkungan hidup dan spesies yang berbeda. Masingmasing organisme juga memiliki kemampuan yang berbeda-beda dalam meregulasi dan mengabsorbsi mineral sehingga hal ini nantinya juga berpengaruh terhadap kadar abu pada masing-masing bahan (Winarno 2008). Kadar karbohidrat (by difference) buah lindur sebesar 29,28%. Kadar tersebut tidak berbeda jauh dengan hasil penelitian Jacoeb et al. (2013) sebesar 32,91%, namun lebih tinggi daripada hasil penelitian Fortuna (2005) sebar
16
23,53%. Kadar karbohidrat pada api-api putih lebih rendah (23,00%) dibandingkan kadar karbohidrat buah lindur. Hasil perhitungan karbohidrat dengan metode by difference ini merupakan metode penentuan kadar karbohidrat dalam bahan secara kasar, serat kasar juga dihitung sebagai karbohidrat (Winarno 2008). Karbohidrat merupakan sumber energi utama bagi hampir seluruh penduduk dunia dan sumber kalori yang murah dibandingkan dengan protein dan lemak. Karbohidrat berperan dalam metabolisme tumbuhan dan hewan. Karbohidrat menghasilkan kalori sebanyak 4,2 kalori setiap gram (Ketaren 2008). Karbohidrat juga mempunyai peranan penting dalam menentukan karakteristik bahan makanan, misalnya rasa, warna, tekstur, dan lain-lain (Winarno 2008). Kandungan karbohidrat yang tinggi pada buah lindur dapat dijadikan sebagai bahan pangan pengganti untuk sumber karbohidrat yang lainnya ketika mengalami kekurangan.
Komponen Bioaktif Ekstrak Kasar Penentuan komponen bioaktif pada buah lindur tua dilakukan melalui uji fitokimia. Uji fitokimia yang dilakukan meliputi uji alkaloid, steroid, flavonoid, saponin, fenol hidrokuinon, dan tanin. Hasil uji fitokimia disajikan pada Tabel 4. Ekstrak kasar buah lindur tua terdeteksi beberapa senyawa fitokimia, yaitu steroid, flavonoid, dan tanin. Hasil ini sesuai dengan penelitian awal yang dilakukan oleh Jacoeb et al. (2013). Tabel 4 Komponen bioaktif ekstrak kasar buah lindur (B. gymnorrhiza) Komponen Biokatif Hasil Uji Keterangan Alkaloid Dragendorff Tidak terdapat endapan merah/jingga Meyer Tidak terdapat endapan putih Wagner Tidak terdapat endapan coklat Terjadi perubahan warna dari merah Steroid/triterpenoid + ke biru/hijau Lapisan amil alkohol berwarna Flavonoid + merah/kuning/hijau Saponin Tidak terbentuk busa Fenol hidroquinon + Terbentuk warna hijau Tanin + Terbentuk warna merah tua Steroid terdeteksi pada ekstrak kasar buah lindur tua. Steroid merupakan golongan senyawa triterpenoid. Steroid berupa padatan kristal yang berwarna putih dan dapat berbentuk jarum kecil, lembaran atau lempengan. Senyawa steroid pada mulanya hanya dipertimbangkan pada hewan saja, tetapi akhir-akhir ini juga ditemukan pada tumbuhan (Harborne 1987). Prekursor steroid merupakan senyawa non polar, yaitu kolesterol. Metanol merupakan pelarut polar yang juga dapat melarutkan sebagian dari komponen non polar maupun semi polar. Steroid yang terdeteksi pada buah lindur tua diduga lebih berfungsi sebagai efek peningkat stamina tubuh (aprodisiaka) dan anti-inflamasi dibandingkan sebagai
17
antioksidan. Dugaan tersebut didukung oleh hasil penelitian Juniarti et al. (2009) bahwa hasil ekstrak daun saga (Arbus precatorius L.) yang mengandung senyawa steroid, namun tidak memiliki aktivitas antioksidan. Hasil penelitian Silva et al. (2002) bahwa komponen steroid yang diekstrak dari daun Agave attenuate memiliki aktivitas anti-inflamasi. Komponen bioaktif lainnya yang terdapat dalam ekstrak kasar buah lindur tua adalah flavonoid. Waji dan Sugrani (2009) menyatakan bahwa mekanisme penghambatan radikal bebas oleh flavonoid adalah ketika flavonoid bereaksi dengan radikal bebas, flavonoid mendonorkan protonnya dan menjadi senyawa radikal, tetapi elektron tidak berpasangan yang dihasilkan didelokalisasi oleh resonansi. Hal ini membuat senyawa flavonoid radikal mempunyai energi yang sangat rendah untuk menjadi radikal reaktif. Prasad et al. (2009) menyebutkan bahwa flavonoid sebagai salah satu kelompok senyawa alami yang paling beragam dan tersebar luas. Flavonoid merupakan golongan fenol terbesar. Senyawa ini memiliki spectrum aktivitas kimia dan biologi yang luas termasuk penangkapan radikal bebas. Meenakshi et al. (2009) menambahkan bahwa kapasitas flavonoid sebagai antioksidan bergantung pada struktur molekulnya. Posisi grup hidroksil dan ciriciri struktur kimia lainnya pada flavonoid sangat berpengaruh terhadap aktivitas antioksidan dan penangkapan radikal bebas. Ekstrak kasar buah lindur tua juga terdeteksi senyawa bioaktif fenol hidrokuinon. Senyawa fenol merupakan senyawa yang dapat larut dalam senyawa polar dan sedikit polar. Fenol meliputi berbagai senyawa yang berasal dari tumbuhan dan mempunyai ciri yang sama, yaitu cincin aromatik yang mengandung satu atau dua gugus hidroksil. Senyawa fenol dapat berupa flavonoid, fenol monosiklik sederhana, fenilpropanoid, dan kuinon fenolik. Kuinon adalah senyawa berwarna dan mempunyai kromofor dasar, yaitu kromofor pada benzokuinon yang terdiri atas dua gugus karboksil yang berkonjugasi dengan dua ikatan rangkap karbon-karbon (Harborne 1987). Senyawa fenol yang terdapat dalam ekstrak kasar buah lindur tua memiliki kemampuan sebagai antioksidan dan antitumor. Hal ini didukung oleh hasil penelitian Escudero et al. (2008) bahwa komponen polifenol yang diisolasi dari daun Piper aduncum L. memiliki aktivitas antioksidan dan menurunkan kadar hidrogen peroksida secara in-vivo. Ekstrak kasar buah lindur tua juga terdeteksi komponen bioaktif yaitu tanin. Tanin merupakan komponen zat organik turunan polimer glikosida yang terdapat dalam bermacam-macam tumbuhan, terutama tumbuhan berkeping dua atau dikotil. Ekstrak tanin terdiri campuran senyawa polifenol yang sangat kompleks dan biasanya tergabung dengan karbohidrat rendah (Linggawati et al. 2002). Tanin diharapkan mampu menstubstitusi gugus fenol dan resin fenol formaldehid untuk mengurangi pemakaian fenol sebagai sumberdaya alam tak terbaharukan. Tanin, polifenol, dan flavonoid merupakan senyawa yang berfungsi antioksidan karena ketiga senyawa tersebut adalah senyawa-senyawa fenol, yaitu senyawa dengan gugus –OH yang terikat pada cincin aromatik. Senyawa-senyawa ini distabilkan oleh resonansi dan tidak reaktif dibandingkan kebanyakan radikal bebas yang lain (Jati 2008).
18
Pemisahan Senyawa Bioaktif Ekstrak Kasar Kromatografi digunakan untuk memisahkan substansi campuran menjadi komponen-komponennya menjadi senyawa murni. Pemisahan senyawa biasanya menggunakan beberapa teknik kromatografi. Pemisahan ekstrak kasar buah lindur tua meliputi fraksinasi ekstrak kasar buah lindur dengan pelarut metanol menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi kolom. Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat kelarutan senyaa yang dipisahkan. Semua kromatografi memiliki fase diam dapat berupa padatan atau kombinasi cair-padat dan fase gerak berupa cairan atau gas. Fase gerak mengalir melalui fase diam dan membawa komponen yang terdapat dalam campuran. Komponen-komponen yang berbeda bergerak dengan laju yang berbeda. Pemisahan senyawa menggunakan teknik kromatografi lapis tipis dilakukan untuk memisahkan senyawa yang ada pada ekstrak kasar buah lindur. Kromatografi ini digunakan untuk mencari eluen sesuai untuk memisahkan komponen yang terdapat dalam ekstrak. Ekstrak kasar yang digunakan yaitu ekstrak yang memiliki aktivitas antioksidan terbaik, yaitu buah lindur tua dengan nilai IC50 sebesar 13,46 ppm. Eleun yang diperoleh, yaitu metanol:air (4:1). Kedua larutan pengembang tersebut merupakan pelarut polar. Fraksinasi menggunakan KLT dan pengamatan menggunakan lampu UV dengan panjang gelombang 254 nm menghasilkan 3 bercak senyawa dengan nilai Rf yang berbeda (Gambar 4). Nilai Rf buah lindur tersebut disajikan pada Tabel 5 dan contoh perhitungan dapat dilihat pada Lampiran 2. Hasil fraksinasi tersebut menggambarkan bahwa ekstrak kasar buah lindur dengan pelarut metanol diduga memiliki 3 fraksi yang terdeteksi. Warna yang dihasilkan dengan sinar UV berupa cokelat tua. Hasil ini sesuai dengan Harborne (1987) bahwa warna flavonoid dengan sinar ultraviolet berwarna cokelat atau hitam. Tabel 5 Nilai Rf KLT ekstrak kasar dengan eluen metanol:air (4:1) Bercak pada Jarak tempuh Jarak tempuh Nilai Rf KLT pelarut (cm) komponen (cm) I 8,00 2,50 0,31 II 8,00 2,70 0,34 III 8,00 3,60 0,45 Pengukuran nilai Rf berdasarkan pada jarak tempuh larutan pengembang (pelarut) dan jarak tempuh bercak masing-masing komponen. Fase diam yang digunakan dalam KLT adalah gel silika. Gel silika merupakan bentuk silikon dioksida. Atom silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Atom silikon berikatan pada gugus –OH di permukaan gel silika sehingga di permukaan gel silika terdapat ikatan Si-O-H dan Si-O-Si. Permukaan gel silika bersifat sangat polar dan karenanya gugus –OH dapat membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa di sekitarnya. Hasil penelitian Patra et al. (2012) juga menggunakan eluen untuk pemisahan senyawa antioksidan berupa pelarut polar, yaitu n-butanol:asam asetat : air (4:1:1) pada ekstrak metanol daun tanaman Excoecaria agallocha. Hasil KLT tersebut menghasillkan dua fraksi dengan Rf 0,17 dan 0,29. Eluen berupa pelarut polar (n-butanol:asam asetat:air)
19
dengan perbandingan 4:1:1 juga digunakan untuk memisahkan komponen flavonoid secara umum (Harborne 1987). Penelitian Peng et al. (2006) juga menggunakan pelarut polar untuk memisahkan senyawa golongan flavonoid (isovitexin), yaitu n-butanol dan air dengan perbandingan 1:1 serta n-butanol, etanol, dan air dengan perbandingan 4:1:4.
Gambar 4 Kromatogram KLT ekstrak kasar buah Bruguiera gymnorrhiza. Eluen yang terbaik pada pemisahan KLT kemudian digunakan sebagai pelarut dalam kromatografi kolom. Pemisahan tersebut menghasilkan 3 fraksi (Gambar 5). Fraksi yang telah terkumpul tersebut kemudian dikering-bekukan (freeze dried) sehingga diperoleh fraksi dalam bentuk padat. Masing-masing fraksi tersebut diuji aktivitas antioksidannya untuk menentukan fraksi terbaik yang memiliki aktivitas antioksidan paling efektif. Metode pengujian sama dengan pengujian aktivitas antioksidan pada ekstrak kasar.
Aktivitas Antioksidan Fraksi Fraksi berbentuk padat yang diperoleh dari pemisahan dengan kromatografi masing-masing diuji aktivitas antikosidannya dengan konsentrasi 10, 20, 30, dan 40 ppm. Hasil uji tersebut disajikan pada Tabel 6. Masing-masing fraksi memiliki nilai aktivitas antioksidan yang berbedabeda. Fraksi III (Rf 0,45) memiliki aktivitas antioksidan terbaik, yaitu sebesar 26,69 ppm. Ketiga fraksi tersebut tergolong dalam kategori antioksidan yang sangat kuat yaitu dengan IC50 di bawah 50 ppm. Hasil pengujian tersebut menghasilkan perbedaan antara ekstrak kasar dan fraksi. Hal ini sama dengan hasil penelitian Prasad et al. (2005) juga menghasilkan aktivitas antioksidan fraksi yang dihasilkan memiliki aktivitas antioksidan yang lebih rendah dibandingkan
20
ekstrak metanol, yaitu dengan EC50 masing-masing sebesar (83±1,02) µg.mL-1 dan (58±2,60) µg.mL-1. Hardiningtyas (2012) juga menghasilkan fraksi I (fraksi terbaik) dengan aktivitas antioksidan yang lebih rendah dibandingkan ekstrak etil asetat, yaitu masing-masing dengan IC50 sebesar 207,37 ppm dan 181,73 ppm.
I
I
II
III
III
Gambar 5 Kromatogram KLT penentuan fraksi I, II, dan III. Tabel 6 Aktivitas antioksidan fraksi Bahan uji Fraksi I Fraksi II Fraksi III
Persamaan garis linier
Nilai IC50 (ppm)
Kategori antioksidan*
y = 1,48x + 0,58 y = 1,28x + 0,45 y = 2,17x - 7,99
33,50 38,79 26,69
sangat kuat sangat kuat sangat kuat
Keterangan: (*) = Molyneux (2004)
Perbedaan aktivitas antioksidan tersebut dapat disebabkan adanya efek sinergisme antara senyawa aktif yang terdapat dalam ekstrak buah lindur sehingga ketika senyawa tersebut dipisahkan, maka mengalami penurunan aktivitas. Hal ini didukung oleh Moure et al. (2001), bahwa gabungan komponen antioksidan yang sinergis menghasilkan efektivitas antioksidan yang lebih tinggi dibandingkan dengan aktivitas pada komponen tunggal. Mu et al. (2007), juga menghasilkan kombinasi komponen flavonoid dan triterpenoid yang memiliki efek neuroprotektif, aktivitas antioksidan, dan anti-inflamantori yang lebih efektif dibandingkan dengan komponen tunggalnya. Penelitian Santos et al. (2010) menghasilkan efek sinergisme antara komponen flavonoid dan quinonemetida triterpen dalam memberikan efek antioksidan.
21
Identifikasi Senyawa Kimia Fraksi Terbaik (Fraksi III) Identifikasi senyawa kimia yang terdapat pada fraski dengan aktivitas antioksidan terbaik, yaitu fraksi III dengan IC50 sebesar 26,69 ppm dilakukan menggunakan NMR. Spektrum NMR fraksi buah lindur dapat dilihat pada Gambar 6. Berdasarkan pada Gambar 6 dapat dilihat bahwa masih terdapat banyak senyawa yang terdeteksi pada spektrum tersebut, yaitu gugus aromatik, glikosida, dan asam lemak. Tipe proton pada perkiraan konsentrasi (δ) 0,9 ppm dan 1,4 ppm merupakan gugus alkana (CH3, CH2), 2-5 ppm (hidroksi, OH), 5-6 ppm (gugus aromatik, C=C-H), dan 4-7 ppm (aromatik hidroksi, Ar-OH) (Hunt 2006). Adapun dugaan struktur senyawa yang terdapat dalam fraksi antioksidan terbaik dapat dilihat pada Gambar 7. Senyawa flavonoid memiliki peranan yang kuat sebagai senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan pada buah lindur. Golongan flavonoid yang diduga terdapat dalam buah lindur adalah golongan flavonol, glikosilfalvon, dan flavon. Keberadaan senyawa flavonol, glikosilflavon, dan flavon yang terdapat pada fraksi buah lindur diperkuat oleh uji-uji yang dilakukan sebelumnya. Senyawa golongan flavonoid terdeteksi dalam uji fitokimia. Larutan pengembang yang digunakan dalam pemisahan KLT menggunakan senyawa polar (metanol, air) dengan bercak pada plat silika gel berwarna cokelat. Hal ini sesuai dengan Harborne (1987) bahwa senyawa glikosilflavon dan flavon bergerak dengan pengembang air dengan bercak berwarna cokelat dan memiliki Rf 0,43 (mirisetin) dan Rf 0,41 (viteksin).
Gambar 6 Spektrum NMR fraksi terbaik ekstrak buah lindur (B. gymnorrhiza).
22
Flavonoid merupakan kelompok besar fitokimia yang bersifat melindungi dan banyak terdapat pada tanaman. Flavonoid sering dikenal sebagai bioflavonoid yang berperan sebagai antioksidan. Antioksidan dapat menetralkan atau menginaktifkan reaksi yang tidak stabil atau reaksi yang tidak wajar pada molekul yang disebut sebagai radikal bebas yang dapat menyerang sel tubuh setiap saat. Terdapat beberapa jenis flavonoid dan masing-masing berperan dalam menjaga kesehatan. Senyawa-senyawa flavonoid termasuk di dalamnya resveratrol, anthocyanin, kuercitin, hesperidin, tangeritin, kaemferol, mirisetin, dan apigenin (Winarsi 2007). Flavonol merupakan senyawa flavonoid yang tersebar luas dalam tumbuhan, baik sebagai kopigmen antosianin dalam daun dan bunga maupun dalam daun tumbuhan tinggi. Beberapa senyawa yang tergolong dalam flavonol, yaitu kaemferol, kuersetin, dan mirisetin. Tumbuhan juga banyak mengandung glikosida flavonol, misalnya glikosidan kuersetin (rutin) (Harborne 1987). Hasil penelitian Teffo et al. (2009) menemukan adanya senyawa kaemferol yang diisolasi dari daun Dodonaea viscosa yang bersifat sebagai antioksidan dan memiliki aktivitas antibakteri. Dua jenis senyawa kaemferol glikosida juga ditemukan pada ekstrak daun Cinnamomum osmophloeum (Rao et al. 2009). Mirisetin dapat ditemukan pada tanaman-tanaman tropis yang dapat dikonsumsi, misalnya pada brokoli, bawang, teh, dan pepaya. Mirisetin juga dapat ditemukan pada Lumnitzera racemosa yang diekstrak metanol dan memiliki aktivitas antibakteri (D’Souza et al. 2010). Flavon berbeda dengan flavonol karena flavon tidak terdapat penyulihan 3-hidroksi. Hal ini mempengaruhi serapan UV, gerakan kromatografi, dan reaksi warnanya. Senyawa flavon yang umum, yaitu apigenin dan luteolin. Senyawa tersebut memiliki pola hidroksilisasi yang serupa dengan kaemferol dan kuersitin. Flavon juga terdapat sebagai glikosida, tetapi jenis glikosidanya lebih sedikit daripada jenis glikosida pada flavonol. Jenis yang paling umum adalah 7-glikosida, misalnya luteolin 7-glikosida (Harborne 1987). Senyawa apigenin juga merupakan flavonoid yang memiliki aktivitas antioksidan. Senyawa apigenin dapat ditingkat aktivitas antioksidannya dengan proses sintesis menjadi 5-prenyloxy apigenin (Liu et al. 2012), sedangkan luteolin dapat ditemukan pada bunga Teucrium orientale dan memiliki pengambatan radikal bebas sebesar 80,00% yang diekstrak menggunakan eseton (Cakir et al. 2006). Luteolin juga dilaporkan memiliki aktivitas antitumor dengan menghambat proses proliferasi sel, menginduksi aktivitas DNA topoisomerase II, dan menghambat pembentukan sel kanker (Leung et al. 2006). Glikosilflavon merupakan kelompok khusus dari flavonoid glikosida yang memiliki ciri khusus, yaitu glikosida pada gula terikat dengan kerangka dasar flavon. Kelompok senyawa ini dapat ditemukan semua tanaman dan memiliki efek menguntungkan bagi kesehatan manusia. Senyawa glikosilflavon merupakan senyawa flavonoid yang mengandung gula yang terikat melalui ikatan C–C. Senyawa ini juga ditemukan pada serelia misalnya padi, gandung, dan jagung serta merupakan komponen mayor (Du et al. 2010). Hasil penelitian Velozo et al. (2009) menunjukkan bahwa senyawa vicenin 2 yang termasuk ke dalam kelompok C-glikon flavon, berasal dari tanaman Peperomia blanda memiliki aktivitas antioksidan dengan IC50 90,5 μM. Senyawa isovitexin ditemukan pada Patrinia villosa dan memiliki aktivitas antioksidan (Peng et al. 2006).
23
Flavonol Kaemferol: R1= H Mirisetin: R1= OH
Flavon
Apigenin: R1= H Luteolin: R1= OH
Glikosilflavon Vicenin 2: R1= C-xyl R3=C-glc R2=OH R4=H Isovitexin: R1= C-glc R3=C’α-L-ara R2=OH R4=H
Gambar 7 Dugaan struktur senyawa pada fraksi terbaik ekstrak metanol buah lindur (B. gymnorrhiza).
