BAB III BAHAN DAN METODE 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan September sampai Oktober 2009. Pengambilan sampel susu dilakukan di beberapa daerah di wilayah Jawa Barat yaitu Kabupaten Tasikmalaya, Kabupaten Sumedang, Kabupaten Bandung, Kabupaten Bogor, dan Kabupaten Cianjur. Pengujian sampel dilakukan di Balai Pengujian Mutu Produk Peternakan (BPMPP), jalan Pemuda no. 29A Kotamadya Bogor, Jawa Barat. 3.2 Alat dan Bahan Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah cawan petri, tabung reaksi, tabung sentrifus, labu ukur, gelas ukur, erlenmeyer, botol timbang, pipet volumetric, pipet graduasi, botol media, pengocok tabung, sentrifus, penangas air, lemari steril, homogenizer, autoklaf, lemari pendingin, freezer, timbangan analitik, inkubator, magnet pengaduk, pH meter, pipet mikro, jangka sorong, burner, ose, pinset, dan gunting. Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah susu segar, media agar (yeast ekstract, peptone, bacto agar, dextrose, beef extract, glucose), media cair heart infusion broth, larutan buffer (KH2PO4, Na2HPO4, H3PO4, NaOH, K2HPO4, HCl, NaCl), mikroorganisme (spora Bacillus stearothermophilus ATCC 7953, spora Bacillus cereus ATCC 11778, spora Bacillus subtillis ATCC 6633, vegetatif Kocuria rizophila ATCC 9341), larutan
baku
pembanding
(natrium
penisilin,
oksitetrasiklin
hidroklorida,
kanamisin sulfat, tilosin-tartrat), dan kertas cakram.
3.3 Metode Penelitian Metode pengujian yang digunakan dalam penelitian ini adalah metode uji tapis (screening test) residu antibiotika pada susu secara bioassay yang mengacu pada SNI No. 7424:2008. 3.3.1 Pengambilan dan Persiapan Sampel Sampel yang diuji adalah susu segar berupa sampel kandang yang diperoleh dari beberapa peternakan sapi perah di wilayah Jawa Barat (Kabupaten
Tasikmalaya,
Kabupaten
Sumedang,
Kabupaten
Bandung,
13
Kabupaten Bogor, dan Kabupaten Cianjur). Lima sampel diambil dari masingmasing kabupaten kemudian dibawa ke laboratorium dalam cooling box. 3.3.2 Persiapan Uji dan Pengujian Sampel Pemeriksaan residu antibiotika dalam susu dilakukan dengan metode uji tapis secara bioassay yang ditujukan terhadap empat golongan antibiotika, yaitu tetrasiklin, makrolida, aminoglikosida, dan penisilin. Secara umum, tahapan pengujian residu antibiotika dalam susu dengan metode ini yaitu sampel susu yang telah dihomogenisasi diteteskan pada kertas cakram lalu kertas cakram tersebut ditempelkan di atas permukaan media agar yang telah dicampur dengan biakan bakteri uji dan diinkubasikan pada suhu tertentu (tergantung jenis antibiotika yang akan diuji) selama 16-18 jam. Contoh susu dinyatakan positif mengandung residu antibiotika bila terbentuk zona hambatan di sekitar kertas cakram. 3.3.2.4 Persiapan Uji 3.3.2.1.1 Analisa Residu Golongan Penisilin Persiapan Media Agar Sebanyak 5 gram peptone, 12 gram yeast extract, 15-18 gram bacto agar, dan 1 gram dextrose dilarutkan dalam 1000 ml aquadest (pH 5.7 ± 0.1), didihkan, dan disterilisasi dengan otoklaf pada suhu 121 oC dengan tekanan 15 psi selama 15 menit. Persiapan Kultur Media Bakteri Bacillus stearothermophillus ATCC 7953 diinokulasikan ke dalam agar miring dan diinkubasi pada suhu 55 oC selama 1 minggu. Bakteri yang telah ditumbuhkan tersebut dipanen dan dimasukkan ke dalam larutan NaCl fisiologis steril 20 ml sebanyak 4 tabung. Larutan tersebut dipanaskan dalam penangas air pada suhu 65 oC selama 30 menit. Selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit dan supernatan dibuang. Kemudian, ditambahkan larutan NaCl fisiologis steril secukupnya lalu dikocok. Selanjutnya, dimasukkan ke dalam refrigerator dengan suhu 4 oC selama 18-24 jam. Larutan tersebut dipanaskan kembali dalam penangas air pada suhu 65 oC selama 30 menit. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit dan
14
diambil supernatannya. Hasilnya disimpan dalam refrigerator sebagai suspensi spora. 3.3.2.1.2 Analisa Residu Golongan Aminoglikosida Persiapan Media Agar Sebanyak 5 gram peptone, 3 gram beef extract, 18 gram bacto agar, dilarutkan dalam 1000 ml aquadest (pH 8.5 ± 0.1), didihkan, dan disterilisasi dengan otoklaf pada suhu 121 oC dengan tekanan 15 psi selama 15 menit.
Persiapan Kultur Media Bakteri Bacillus subtillis ATCC 6633 diinokulasikan ke dalam agar miring dan diinkubasi pada suhu 36
o
C selama 1 minggu. Bakteri yang telah
ditumbuhkan tersebut dipanen dan dimasukkan ke dalam larutan NaCl fisiologis steril 20 ml sebanyak 4 tabung. Larutan tersebut dipanaskan dalam penangas air pada suhu 65 oC selama 30 menit, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit dan supernatan dibuang. Kemudian ditambahkan larutan NaCl fisiologis steril secukupnya lalu dikocok. Selanjutnya, dimasukkan ke dalam refrigerator dengan suhu 4-8 oC selama 18-24 jam. Larutan tersebut dipanaskan kembali dalam penangas air pada suhu 65oC selama 30 menit. Kemudian, disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit dan diambil supernatannya. Hasilnya disimpan dalam refrigerator sebagai spora. 3.3.2.1.3 Analisa Residu Golongan Tetrasiklin Persiapan Media Agar Sebanyak 6 gram peptone, 1.5 gram beef extract, 3 gram yeast extract, 15-18 gram bacto agar, dan 1.35 gram KH2PO4 dilarutkan dalam 1000 ml aquadest (pH 5.7 ± 0.1), didihkan, dan disterilisasi dengan otoklaf pada suhu 121 oC dengan tekanan 15 psi selama 15 menit. Persiapan Kultur Media Bakteri Bacillus cereus ATCC 11778 diinokulasikan ke dalam agar miring dan diinkubasi pada suhu 30 oC selama 1 minggu. Kemudian bakteri yang telah ditumbuhkan tersebut dipanen dan dimasukkan ke dalam larutan NaCl fisiologis steril 20 ml sebanyak 4 tabung. Larutan tersebut dipanaskan dalam penangas air pada suhu 65 oC selama 30 menit, selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan
15
3000 rpm selama 10 menit dan supernatan dibuang. Kemudian ditambahkan larutan NaCl fisiologis steril secukupnya lalu dikocok. Selanjutnya, dimasukkan ke dalam refrigerator dengan suhu 4-8 oC selama 18-24 jam. Larutan tersebut dipanaskan kembali dalam penangas air pada suhu 65 oC selama 30 menit, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 5 menit dan diambil supernatannya. Hasilnya disimpan dalam refrigerator sebagai spora. 3.3.2.1.4 Analisa Residu Golongan Makrolida Persiapan Media Agar Sebanyak 6 gram peptone, 1.5 gram beef extract, 3 gram yeast extract, 1 gram glucose, dan 15-18 gram bacto agar dilarutkan dalam 1000 ml aquadest (pH 8.5 ± 0.1), didihkan, dan disterilisasi dengan otoklaf pada suhu 121 oC dengan tekanan 15 psi selama 15 menit. Persiapan Kultur Media Bakteri Kocuria rizophillia ATCC 9341 diinokulasikan ke dalam agar miring dan diinkubasi pada suhu 18-24 jam. Sebanyak 1 ose kuman biakan Kocuria rizophillia ATCC 9341 diambil, kemudian dimasukkan ke dalam 10 ml media Heart Infusion Broth (HIB). Kemudian diinkubasikan selama 18-24 jam dalam inkubator dengan suhu 36 oC. Kuman siap digunakan untuk pengujian. 3.3.2.5 Persiapan Larutan Dapar Sebanyak 6 gram KH2PO4 dan 18.9 gram Na2HPO4 dilarutkan dalam 1000 ml aquadest lalu larutan disterilisasi dengan otoklaf pada suhu 121 oC dengan tekanan 15 psi selama 15 menit.
3.3.2.6 Persiapan Larutan Baku Penisilin Pengenceran larutan baku dibuat dengan larutan dapar hingga konsentrasi 0,01 IU/ml.
16
Larutan baku konsentrasi 1000 IU/ml Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar Konsentrasi menjadi 100 IU/ml Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar Konsentrasi menjadi 10 IU/ml Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar Konsentrasi menjadi 1 IU/ml Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar Konsentrasi menjadi 0,1 IU/ml Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar Konsentrasi menjadi 0.01 IU/ml (sebagai larutan standar) Tetrasiklin (Oksitetrasiklin), Aminoglikosida (Kanamisin), dan Makrolida (Tilosin) Pengenceran larutan baku dibuat dengan larutan dapar hingga konsentrasi 1.0 g/ml. Larutan baku konsentrasi 1000 g/ml. Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar Konsentrasi menjadi 100 g/ml. Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar Konsentrasi menjadi 10 g/ml. Diambil 2 ml + 18 ml larutan dapar Konsentrasi menjadi 1.0 g/ml (sebagai larutan standar) 3.3.2.4 Cara Pengujian Sampel Susu Kultur media disiapkan untuk masing-masing golongan antibiotika. Tiap cawan petri berisi lima lembar kertas cakram, yang terdiri dari tiga kertas cakram masing-masing ditetesi 75 µl sampel yang akan dianalisa, satu kertas yang ditetesi 75 µl dari larutan baku pembanding sebagai kontrol positif, dan satu kertas yang ditetesi larutan dapar fosfat sebagai kontrol negatif (Gambar 1). Kertas cakram tersebut diletakkan di atas permukaan kultur media. Cawan petri ditutup dan diinkubasi pada suhu yang berbeda tergantung golongan antibiotika. Kultur media untuk golongan tetrasiklin diinkubasi pada suhu 30 oC ± 1, golongan penisilin pada suhu 55
o
C ± 1, sedangkan golongan makrolida dan
aminoglikosida pada suhu 36 oC ± 1, masing-masing selama 16-18 jam. Untuk
17
mendapatkan data yang akurat maka pengujian sampel dilakukan dengan tiga kali pengulangan sehingga setiap jenis golongan antibiotika menggunakan tiga cawan petri. Hasil uji ditentukan dengan mengamati dan mengukur diameter zona hambatan yang terbentuk di sekeliling kertas cakram menggunakan jangka sorong. Apabila di sekitar kertas cakram terdapat zona hambatan maka susu yang diperiksa dinyatakan positif mengandung antibiotika, namun apabila di sekitar kertas cakram tidak terdapat zona hambatan maka susu yang diperiksa dinyatakan negatif mengandung residu antibiotika. Konsentrasi antibiotika yang berada dalam sampel dapat ditentukan secara semi kuantitatif. Semakin luas zona hambatan di sekitar kertas indikator maka semakin tinggi konsentrasi residu antibiotika dalam sampel. Berikut adalah salah satu gambar hasil pengujian residu antibiotika pada sampel (Gambar 1). 2
5 1 3
4 Gambar 1 Contoh hasil uji residu antibiotika menggunakan metode bioassay. Sampel 1 (1), sampel 2 (2), sampel 3 (3), kontrol positif (4), dan kontrol negatif (5)
