BAB III BAHAN DAN METODE 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian
ini
dilaksanakan
di
Laboratorium
Bioteknologi
dan
Laboratorium Akuakultur Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran. Penelitian dilaksanakan dalam dua tahap yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian utama. Penelitian pendahuluan dilaksanakan pada bulan Maret 2013 sedangkan Penelitian utama dilaksanakan pada bulan April 2013.
3.2 Bahan dan Alat Penelitian 3.2.1 Bahan Penelitian Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah : 1) Ikan Uji yang digunakan adalah ikan mas (Cyprinus carpio) ukuran sangkal (8-12cm) sebanyak 225 ekor dengan padat penebaran 15 ekor per akuarium yang berasal dari Kabupaten Cianjur. 2) Daun Sukun yang berasal dari Gedung Dekanat Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran. 3) Bakteri yang digunakan adalah Aeromonas hydrophila yang berasal dari Balai Riset Perikanan Budidaya Air Tawar, Bogor dengan kode isolat AHL-13. 4) Medium Bakteri yang digunakan untuk kultur dan uji patogenitas adalah Triptic Soy Agar (TSA) merk dagang DIFCO dengan dosis pembuatan 40 gram/L aquades. 5) NaCl Teknis digunakan untuk membuat larutan NaCl fisiologis 0,85%, yang berfungsi sebagai larutan suspensi bakteri. 6) Pakan yang digunakan merupakan pakan komersil tipe FF-999 sebanyak 3 kg.
13
14
3.2.2 Alat-alat Alat-alat yang digunakan dalam penelitian adalah: 1) peralatan yang digunakan untuk uji potensi ekstrak daun sukun terhadap bakteri (in vitro):
Autoclave untuk mensterilkan media bakteri dan peralatan lainnya.
Hot plates dan Stir plates untuk memanaskan media bakteri.
Magnetic stirrer untuk mengaduk larutan media bakteri.
Petri dish sebanyak 10 buah sebagai wadah uji.
Jarum ose sebanyak 1 buah untuk mengambil dan menginokulasikan bakteri.
Kertas saring Whatman no.42 dengan diameter 12,5 mm yang berfungsi sebagai kertas cakram untuk menentukan zona bening.
Parafilm sebagai segel cawan petri untuk mencegah kontaminasi.
Pembakar bunsen untuk mensterilkan udara pada saat inokulasi bakteri.
Inkubator untuk inkubasi bakteri.
Jangka sorong digital dengan ketelitian 0,1 mm sebanyak 1 buah untuk mengukur zona bening yang terbentuk.
Laminar flow sebagai ruang untuk menginokulasi bakteri.
Timbangan digital merk Scout Pro dengan ketelitian 0,01 gram untuk menimbang berat ekstrak daun sukun dan media agar TSA.
Mikro pipet merk Eppendorf dengan ketelitian 100µL-1000µL.
Disposable mikro pipet tips untuk mengambil bakteri pada larutan fisiologis.
Rak tabung reaksi untuk menyimpan tabung reaksi.
Kapas sebagai penutup tabung reaksi.
Alumunium foil untuk menahan panas dan menjaga kesterilan alat dan bahan.
Plastik tahan panas untuk untuk menahan panas ketika sterilisasi.
Plastik wrap untuk menutup rapat beberapa peralatan yang digunakan.
15
2) Peralatan yang digunakan untuk uji in vivo:
Akuarium sebagai wadah penelitian sejumlah 10 buah, masing masing berukuran 38cm x 23cm x 20cm.
Bak fiber volume 500L sebanyak 2 buah digunakan untuk penampung ikan.
Bak fiber volume 1000L sebanyak 1 buah digunakan untuk wadah penampung air.
Aerator, selang aerasi dan batu aerasi untuk memasok O2 pada setiap akuarium dan bak fiber.
Serokan sebanyak 1 buah untuk mengambil ikan mas.
Timbangan digital untuk menimbang berat ikan dan ekstrak daun sukun.
3) Peralatan yang digunakan dalam penelitian utama uji tantang:
Akuarium sebagai wadah penelitian sebanyak 20 buah, masing-masing berukuran 38cm x 23cm x 20cm.
Bak fiber volume 500L sebanyak 2 buah digunakan untuk wadah penampung air.
Aerator, selang aerasi dan batu aerasi untuk memasok O2 pada setiap akuarium dan bak fiber.
Serokan sebanyak 1 buah untuk mengambil ikan mas.
Timbangan digital untuk menimbang berat ikan dan ekstrak daun sukun.
Suntikan dengan ketelitian 0,1ml digunakan untuk menginfeksikan bakteri pada ikan.
Kamera digital untuk dokumentasi penelitian (Lampiran 3).
4) Peralatan yang digunakan untuk pengukuran kualitas air:
Termometer dengan ukuran 0oC-100oC sebanyak 1 buah untuk mengukur suhu air.
pH meter merk Lutron pH-/44 untuk mengukur derajat keasaman.
DO meter merk Hanna HI-3810 untuk mengukur oksigen terlarut.
16
3.3 Metode Penelitian Penelitian ini menggunakan metode eksperimental Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan empat perlakuan dan tiga ulangan. Untuk perlakuan pemberian ekstrak daun sukun adalah sebagai berikut : 1.
Perlakuan A : perlakuan kontrol tanpa pemberian ekstrak daun sukun 0 ppm
2.
Perlakuan B : pemberian ekstrak daun sukun sebanyak 70 ppm.
3.
Perlakuan C : pemberian ekstrak daun sukun sebanyak 100 ppm.
4.
Perlakuan D : pemberian ekstrak daun sukun sebanyak 130 ppm.
5.
Perlakuan E : pemberian ekstrak daun sukun sebanyak 160 ppm. Model umum rancangan yang digunakan adalah: Xij = µi + τj + εij (Gasperz 1991)
Keterangan: Xij = Hasil pengamatan pada perlakuan ke-i ulangan ke-j µi = Rata-rata umum τj
= Pengaruh perlakuan ke-i
εij = Pengaruh faktor random perlakuan ke-i ulangan ke-j
3.4 Prosedur Penelitian 3.4.1 Penelitian Pendahuluan 3.4.1.1 Pembuatan Ekstrak Daun Sukun Pembuatan ekstrak daun sukun dilakukan untuk mendapatkan stok ekstrak yang digunakan dalam penelitian pendahuluan dan penelitian utama. Tahapan yang dilakukan dalam pembuatan ekstrak daun sukun adalah sebagai berikut: 1. Daun sukun dalam bentuk kering di giling blender sampai halus (bubuk) seberat 887 gr 2. Daun sukun yang telah bubuk kemudian direndam ke dalam maserator yang sudah dalam larutan alkohol 96% secukupnya selama 24 jam dan kemudian di maserasi. Perendaman terus dilakukan sampai supernatan yang diperoleh agak bening dari warna aslinya
17
3. Setelah 24 jam supernatan disuling dari maserator. Supernatan kemudian dievaporasi dengan evaporator pada suhu ± 40oC dengan kecepatan 120 x per menit 4. Ekstrak daun sukun yang dihasilkan siap dipakai untuk penelitian pendahuluan dan utama
3.4.1.2 Uji in vitro zona daya hambat Uji zona daya hambat dilakukan untuk mengetahui kemampuan dari ekstrak daun sukun sebagai antibakteri dalam menghambat metabolisme Aeromonas hydrophila. Uji sensitivitas obat dilakukan dengan menggunakan kertas cakram diameter 0,5cm dibuat dari kertas saring Whatman no.42 dan direndam dalam ekstrak daun sukun dengan selama 24 jam dengan dosis yang ditentukan setela penelitian pendahuluan. Peralatan dan bahan yang digunakan untuk uji zona daya hambat disterilisasi terlebih dahulu dengan autoclave. Metode pengerjaan dilakukan secara steril di ruang laminar flow untuk mencegah kontaminasi. Kertas saring Whatman no.42 dipersiapkan dan diletakkan diatas media petri dish agar TSA yang telah diinokulasi dengan bakteri Aeromonas hydrophila sebanyak 150 µl, selanjutnya petri dish diinkubasi selama 24 jam pada suhu 32oC dalam inkubator. Diameter zona hambatan yang dihasilkan pada uji ini kemudian diamati.
3.4.1.3 Uji in vivo LC50 (Lethal Concentration 50%) Perendaman Ekstrak Daun Sukun Uji LC50 perendaman ekstrak daun sukun dilakukan untuk mendapatkan konsentrasi dengan mortalitas ikan mas sebanyak 50% selama 24 jam. Perlakuan pada uji LC50 dilakukan dengan dua ulangan yaitu 0 ppm, 150 ppm, 200 ppm, 350 ppm, 450 ppm dan 600 ppm. Sebelum dilakukan uji LC50 ikan mas terlebih dahulu diaklimatisasi selama 2 hari dalam bak fiber dengan volume 100 liter diberi pakan pelet secara adlibitum. Ikan uji disortir untuk mendapatkan ukuran dan berat yang seragam.
18
Kemudian dimasukkan kedalam akuarium dengan padat penebaran 10 ekor/akuarium. Akuarium diisi larutan ekstrak daun sukun sesuai perlakuan. Kelangsungan hidup ikan dalam uji LC50 dianalisis melalui program Probit Analysis menggunakan software dari US Environmental Protection Agency (US EPA).
3.4.2 Penelitian Utama Prosedur yang dilakukan selama penelitian adalah sebagai berikut: 1.
Persiapan akuarium sebanyak 15 buah.
2.
Akuarium diisi dengan air sebanyak 15L, yang berasal dari bak penampungan air.
3.
Penempatan perlakuan ekstrak daun sukun dilakukan secara acak (Lampiran 4).
4.
Ikan uji dimasukkan kedalam akuarium yang telah disiapkan dengan kepadatan 15 ekor per wadah dan diaklimatisasi selama 5 hari.
5.
Penginfeksian bakteri Aeromonas hydrophila sebanyak 0,1 ml dengan cara menyuntikan pada tubuh ikan secara intramuscular.
6.
Pengamatan gejala klinis pada ikan mas dilakukan setelah terjadi perubahan tingkah laku ikan, kemudian direndam dengan larutan ekstrak daun sukun.
7.
Pada masa perendaman, pergantian air dan ekstrak daun sukun dilakukan setiap 24 jam sekali sebanyak 100% dari total volume air didalam wadah perlakuan.
8.
Pemberian pakan pelet komersil secara ad libitum dengan frekuensi dua kali sehari yaitu pukul 08.00 dan 16.00 WIB.
9.
Pengamatan kelangsungan hidup dilakukan setiap hari selama masa perendaman dan masa pemeliharaan selama 14 hari.
10. Pengontrolan kualitas air dengan suhu optimal 25-28 oC, pH 6,5-9 dan kandungan oksigen terlarut > 4mg/L selama 3 hari sekali.
19
3.5 Parameter Pengamatan 3.5.1 Gejala Klinis Pengamatan gejala klinis dilakukan dengan mengamati kerusakan organ tubuh ikan dan perubahan tingkah laku ikan yang mencakup uji refleks, respon terhadap pakan, keseimbangan tubuh ikan dan pergerakan renang (aktif/pasif).
3.5.2 Kelangsungan Hidup Kelangsungan hidup ikan mas diamati dengan cara menghitung jumlah ikan yang hidup setiap hari. Persentase kelangsungan hidup ikan mas setelah terinfeksi Aeromonas hydrophila diperoleh dengan menggunakan metode Royce (1972) dalam Effendie (1979). Nt
SR = No x 100% Keterangan: SR = Survival Rate (%) Nt = Jumlah ikan mas yang hidup pada akhir pengamatan (ekor) No = Jumlah ikan mas pada awal pengamatan (ekor)
3.6 Analisi Data Pengaruh perlakuan perendaman ikan mas dalam ekstrak daun sukun terhadap kelangsungan hidup dianalisis menggunakan ANOVA uji F dengan taraf kepercayaan 95% dan jika terdapat perbedaan nyata antar perlakuan pada uji F maka dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan pada taraf kepercayaan 95% (Gasperz 1991). Analisis hubungan kelangsungan hidup dengan konsentrasi dalam percobaan dianalisis dengan menggunakan analisis regresi (Sudjana 1994). Gejala klinis yang terjadi dianalisis secara deskriptif.
