BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Kebutuhan antibiotik baru masih sangat diperlukan untuk menangani masalah kesehatan. Untuk mendapatkan antibiotik baru, para peneliti telah banyak melakukan berbagai cara seperti biotransformasi senyawa-senyawa tertentu dengan bantuan mikrobia. Selain itu antibiotik baru dapat juga disintesis melalui mutasi strain penghasil antibiotik atau mencari senyawa antibiotik baru dari mikroba yang ada di alam (Baron, 1996). Mikrobia merupakan salah satu objek utama penelitian pengembangan bioteknologi terutama untuk menghasilkan produk baru. Sebagian besar mikrobia, khususnya bakteri tanah mempunyai potensi sebagai penghasil antibiotik berasal dari kelompok actinomycetes khususnya streptomyses (Black, 1999; Goddfellow et al., 1988). Sebagian besar antibiotik baru yang diperkenalkan merupakan antibiotik semisintetik, antara lain derivat penisilin (ampisilin, amoksisilin), sefalosporin (sefotaksim), kanamisin (amikasin, dibekasin), rifampisin dan sebagainya (Suwandi, 1993). Senyawa antibiotik alami masih terus dicari dan sangat diharapkan. Mikrobia merupakan sumber senyawa baru yang potensial. Bahkan selain menghasilkan senyawa yang memiliki aktivitas antibiotik, bakteri juga dapat dimanfaatkan sebagai sumber senyawa aktif farmakologis yang berguna di bidang medis (Prescott, 2005). Penelitian ini difokuskan pada bakteri yang terdapat di dalam gua, yang merupakan habitat kelelawar. Di dalam gua tersebut terdapat kotoran kelelawar yang disebut guano. Guano telah terbukti merupakan substrat pertumbuhan bakteri khususnya golongan aktinomicetes (Madigan et al, 2003). Oleh karena itu guano dipakai sebagai sumber bakteri dan digunakan sebagai substrat pertumbuhan bakteri untuk menghasilkan senyawa antibiotik berupa antibakteri, antifungi, bahkan antitumor. Aktivitas senyawa antitumor
1
yang terkandung dalam kultur bakteri dideteksi melalui berbagai teknik. Salah satu teknik yang digunakan dalam penelitian ini adalah dengan metode penghambatan angiogenesis (angiogenesis inhibition) (Marcela et al., 1998). Perkembangan angiogenesis yang merupakan proses terbentuknya pembuluh darah baru dari pembuluh darah yang telah ada (Lush et al., 2005) telah digunakan untuk mendeteksi aktivitas senyawa antitumor yang dihasilkan oleh bakteri. Penelitian terdahulu melaporkan bahwa angiogenesis berhubungan erat dengan pertumbuhan dan perkembangan jaringan tumor. Angiogenesis merupakan pertumbuhan pembuluh darah baru dari pembuluh darah yang telah ada. Angiogenesis terutama terjadi selama perkembangan embrio dan dapat juga terjadi pada hewan dewasa dengan cara teratur selama proses fisiologi seperti penyembuhan luka, ovulasi, menstruasi, inflamasi kronis, retinopati diabetik maupun pertumbuhan tumor lanjut (Folkman, 1996). Proses angiogenesis ini berperan pada pertumbuhan tumor karena pada tumor dipengaruhi oleh faktor angiogenik. Oleh karena itu, banyak penelitian berupaya menemukan cara paling tepat memblokir angiogenesis pada tumor. Pemblokiran angiogenesis pada tumor dapat mencegah pertumbuhan jaringan tumor yang ditandai dengan penghambatan pembentukan pembuluh darah sebagai jalur asupan nutrien bagi jaringan tumor tersebut (Macklins, 2006) Perkembangan tumor tergantung pada angiogenesisnya untuk tumbuh dan mengalami metastasi pada lingkungan yang tidak kondusif. Komponen tumor akan mengeluarkan dan menginduksi faktor-faktor angiogenik dan anti-angiogenik yang berperan sangat penting dalam regulasi proliferasi, migrasi, apoptosis, dan daya tahan sel-sel endothelial (endothelial cell) (Gupta dan Qin, 2003).
B. Rumusan Masalah
Permasalahan yang dihadapi dalam penelitian ini adalah: 1. Bakteri yang diisolasi dari goano yang manakah yang mampu menghasilkan senyawa antibiotik
2
2. Adakah antibiotik tersebut mampu berperan sebagai antitumor dengan menghambat angiogenesis 3. Bagaimana pengaruh ekstrak goano pada media terhadap aktivitas bakteri dalam menghasilkan senyawa antibakteri sebagai antitumor
C. Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah untuk: 1. Mendapatkan bakteri indigenous penghasil antibiotik yang hidup di guano 2. Mengetahui sifat antibiotik yang dihasilkan 3. Mempelajari pengaruh ekstrak guano terhadap aktivitas bakteri dalam menghasilkan senyawa antibiotik-antitumor.
3
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA DAN HIPOTESIS
A. Tinjauan Pustaka 1. Bakteri Guano Guano merupakan hasil dekomposisi kotoran kelelawar menjadi partikel-partikel yang lebih sederhana oleh aktivitas mikrobia. Guano juga merupakan tempat hidup berbagai mikrobia yang melakukan berbagai kegiatan yang menguntungkan dan merugikan bagi kehidupan makhlukmakhluk hidup lainnya (Sutedjo et al., 1996). Bakteri yang hidup di dalam guano tersebut berperan dalam menentukan karakteristik bau goano atau yang sering disebut dengan geosmin, serta sebagai decomposer yang mengkonsumsi senyawa karbon sederhana. Ada banyak jenis mikrobia yang hidup di guano, salah satunya adalah
bakteri,
misalnya
bakteri
yang
berasal
dari
kelompok
actinomycetes, khususnya Streptomyces dan bakteri lainnya (Black, 1999; Goddfellow et al., 1988). Bakteri yang terdapat di dalam guano, mendekomposisi sebagian besar substrat, akan tetapi lebih berperan dalam mendegradasi senyawa recalsitran seperti khitin dan selulosa. Bakteri ini aktif bekerja pada pH tanah yang tinggi. Bakteri tersebut mengkonversikan energi yang terkandung dalam materi organik yang ada pada guano menjadi senyawa yang berguna bagi organisme lain. Aktivitas bakteri, khususnya bakteri yang ada pada guano digunakan sebagai penghasil senyawa
antibiotik.
Antibiotik
digunakan
karena
aktivitas
yang
dimilikinya antara lain sebagai antibakteri, dan antitumor (Anonim, 2006; Ingham, 2006).
4
Dalam usaha menumbuhkan bakteri yang diperoleh dari guano secara in vitro digunakan teknik kultur diperkaya dengan media khusus yang mengandung unsur-unsur yang terkandung dalam guano (ekstrak guano) sebagai substrat pertumbuhan bakteri. Penggunaan media khusus dengan penambahan ekstrak guano diharapkan mampu mempengaruhi pertumbuhan bakteri dan aktivitas metabolismenya, terutama untuk menghasilkan metabolit sekunder berupa antibiotik (Pelczar, 1993). Dalam aktivitas metabolismenya, bakteri menghasilkan senyawasenyawa metabolit untuk pertahanan hidupnya. Salah satu metabolit yang dihasilkan
yaitu
antibiotik
yang
bertujuan
untuk
menghambat
pertumbuhan mikrobia lain. Antibiotika ini dihasilkan ketika cekaman lingkungan sangat ekstrim, misalnya sumber nutrien yang sedikit, kelembaban dan temperatur yang tidak sesuai. Di dalam laju pertumbuhan bakteri, produksi antibiotik biasanya terjadi ketika memasuki fase stationer, dimana ketersediaan nutrian yang mulai berkurang, perubahan pH medium, konsentrasi oksigen yang menurun dan akumulasi hasil metabolisme yang bersifat toksik sehingga menurunkan laju pertumbuhan mikrobia. Kurva pertumbuhan pada fase ini menunjukkan garis horizontal yang menunjukkan mikrobia berjumlah sama dalam beberapa waktu inkubasi (Pelczar, 1993).
2. Antibiotik dan Antitumor
Antibiotik adalah senyawa kimia yang dihasilkan oleh berbagai jenis mikrobia seperti bakteri dan fungi. Mikrobia ini menghambat pertumbuhan dan seterusnya memusnahkan mikrobia yang lain. Umumnya antibiotik adalah antibakteri yang tidak hanya dihasilkan oleh mikrobia tetapi juga bahan sintetik lainnya, seperti sulfonamid dan kuinolon. Penggunaan antibiotik dalam bidang medis sejak awal abad 19 telah berhasil menyembuhkan berbagai penyakit infeksi. Penisilin yang ditemui pada awal tahun sembilan puluhan oleh Alexander Flemming
5
adalah antibiotik yang paling banyak digunakan dalam bidang kesehatan. Produk senyawa antimikrobia menandakan satu era kemajuan dalam bidang farmakologi (Ismail, 2001). Berdasarkan daya hambatnya terhadap pertumbuhan mikrobia, antibiotik dapat dibedakan menjadi dua jenis, yaitu antibiotik yang bersifat spektrum luas (broad spectrum) dan spektrum sempit (narrow spectrum) (Prescott, 2005). Antibiotik yang bersifat spektrum luas adalah antibiotik yang mampu mengambat pertumbuhan mikrobia, khususnya bakteri, baik bakteri gram positif, maupun bakteri gram negatif, sedangkan antibiotik yang bersifat spektrum sempit hanya mampu menghambat pertumbuhan mikrobia khususnya bakteri gram positif atau gram negatif saja, seperti yang ditunjukkan oleh gambar 1.
(a)
Gram +
(b)
Gram -
Bs Ec Bs
Ec
Bs Sumber: http://soils.usda.gov/sqi/actino-streptomy_files/index.htm
Gambar 1. Disk sensitivity test untuk mengetahui potensi antibiotik dalam menghambat pertumbuhan bakteri. (a) Antibiotik menghambat pertumbuhan bakteri gram positif dan (b) menghambat pertumbuhan bakteri gram negatif yang ditandai dengan adanya zona hambat di sekitar paper disk yang diberi antibiotik (Baron, 1996). Banyak antibiotik yang sudah dikomersialisasikan diperoleh oleh jamur, dan bakteri terutama golongan aktinomisetes. Menurut Madigan, et al. (2000), beberapa diantara antibiotik yang telah berhasil dikomersialisasikan dapat dilihat pada tabel 1.
6
Tabel 1. Beberapa antibiotik yang diproduksi secara komersial ( Madigan, et al. 2000) Antibiotik
Mikrobia penghasil
Bacitracin
Bacillus licheniformi (EFB)
Cephalosporin
Cephalosporium sp (F)
Chloramphenicol
Chemical synthesis (formerly produced microbially by Streptomyces venezuelae) (A)
Cycloheximide
Streptomyces griseus (A)
Cycloserine
Streptomyces orchidaceus (A)
Erythromycin
Streptomyces erythreus (A)
Griseofulvin
Penicillium greseofulvin (F)
Kanamycin
Streptomyces kanamyseticus (A)
Lincomycin
Streptomyces lincolnensis (A)
Neomycin
Streptomyces fradiae (A)
Nystatin
Streptomyces noursei (A)
Penicillin
Penicillium chrysogenum (F)
Polymyxin B
Bacillus polymyxa (EFB)
Streptomycin
Streptomyces griseus (A)
Tetracycline
Streptomyces rimosus (A)
Keterangan : EFB : endospore-forming bacterium; F: fungus; A: actinomycete
Antibiotik yang dihasilkan oleh Actinomycetes secara garis besar terbagi menjadi tiga golongan. a. Golongan aminoglikosida. Golongan ini dinamakan aminoglikosida karena strukturnya mengandung amino dan glikosida. Paling sedikit golongan ini mempunyai satu aminoheksosa dan mempunyai pentosa pada gugus aminonya. Aminoglikosida bekerja secara langsung pada ribosom bakteri dan akan menghambat sintesa protein sehingga mengganggu translasi pesan genetik bakteri tersebut. Contoh-contoh
7
antibiotik
pada
golongan
ini
adalah
streptomisin,
neomisin,
peromomisin, kanamisin, gentamisin, dan tobramisin. b. Golongan makrolida. Struktur golongan ini terdiri atas cincin lakton yang besar dinamakan makrolid, gugus keton, dan glikosida. Cara kerja golongan makrolid di atas antara lain dengan menghambat sintesis protein. Contoh-contoh antibiotik pada golongan ini antara lain pikromisin,
eritromisin,
karbomisin,
oleandomisin,
spiramisin,
josamisin, dan tilosin. c. Golongan obat antitumor. Beberapa obat bioaktif yang dihasilkan oleh Actinomycetes dapat digunakan untuk kemoterapi kanker. Obat ini umumnya bersifat sitotoksik dengan mengganggu fungsi DNA (contoh: actinomycin D dan anthracyclines) atau cross linking agents (mitomycin
C),
menyebabkan
pecahnya
ikatan
rantai
DNA
(bleomycin, streptonigrin), atau interaksi dengan DNA (mithramycin, chromomycin, olivomycin) (Salas dan Mendez, 1998). Untuk mengetahui potensi bakteri dalam menghasilkan antibiotik dapat dilakukan dengan berbagai cara, beberapa diantaranya dapat menggunakan metode Disk sensitivity test seperti pada gambar 1, dan metode goresan (streak) seperti yang ditunjukkan oleh gambar 2.
Gambar 2. Teknik streak (goresan) untuk mendeteksi potensi antibiotik (A) Menumbuhkan koloni bakteri yang ingin dideteksi kemampuan antibiotiknya. (B) Penempatan kultur yang ingin diuji kualitas antibiotiknya (Madigan, 2000).
8
Antibiotik banyak digunakan dalam dunia medis sebagai antitumor. Bakteri sebagai penghasil antibiotik memiliki potensi sebagai antitumor. Kemampuan antibiotik sebagai antitumor dapat dideteksi dengan berbagai cara. Salah satu cara yang bisa digunakan untuk membuktikan antibiotik sebagai antitumor adalah dengan metode penghambatan angiogenesis (angiogenesis inhibition) (Fidler et al. 2002). Antitumor
diharapkan
memiliki
daya
hambat
terhadap
angiogenesis, artinya mampu menghambat pembentukan pembeluh darah baru dari pembuluh darah yang sudah ada sebagai jalur alternatif asupan nutrien. (Anderson, 2001; Ganiswara, 1995).
3 Angiogenesis
Angiogenesis merupakan pertumbuhan pembuluh darah baru dari pembuluh darah yang telah ada. Angiogenesis terutama terjadi selama perkembangan embrio dan dapat juga terjadi pada hewan dewasa dengan cara sangat teratur. Angiogenesis dapat terjadi baik secara fisiologis maupun patologis seperti penyembuhan luka, ovulasi, menstruasi, inflamasi kronis, retinopati diabetik, maupun pertumbuhan tumor lanjut (Folkman, 1996; Christofamili et al., 2002). Angiogenesis sangat berperan pada pertumbuhan tumor karena dipengaruhi oleh faktor angiogenik yang dihasilkan oleh sel tumor yang disebut Tumor Angiogenesis Factor (TAF) (Folkman, 1996; Christofamili et al., 2002). Angiogenesis muncul bila terjadi peningkatan kebutuhan aliran darah lokal untuk mensuplai nutrien dan oksigen, serta membuang produk sisa (Anonim, 2005: Ganiswara, 1995; Macklins, 2006). Proses angiogenesis melibatkan suatu urutan tahapan yang sangat kompleks. Angiogenesis sebenarnya dimulai ketika sel-sel tumor menghasilkan molekul-molekul angiogenik dan mengirimkan sinyal ke jaringan normal yang ada di sekitarnya. Singyal-sinyal yang diberikan
9
mengaktifkan beberapa gen tertentu pada jaringan inang, dan membentuk protein yang merangsang pembentukan pembuluh darah baru (Anonim, 2005) Faktor pertumbuhan angiogenik berikatan dengan reseptor spesifik yang terletak pada sel endotel pembuluh darah di dekatnya. Faktor pertumbuhan angiogenik berikatan dengan reseptor spesifik yang terletak pada sel endotel tersebut. Sinyal dikirim dari permukaan sel ke nukleus, dan sel endotel kemudian berproliferasi dan bermigrasi ke arah luar melalui membran basal. Molekul khusus yang disebut molekul adesi atau interin mempunyai fungsi sebagai kait pemegang untuk membantu penyebaran pembuluh darah baru (Gambar 1.) (Anonim, 2002). Faktor pertumbuhan angiogenik antara lain Vascular Endothelial Cell Growth Factor (VEGF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), dan Epidermal Growth Factor (EGF) (Cristofanili et al., 2002; Tan et al., 2003).
Gambar 3. Angiogenesis: pembentukan pembuluh darah baru dari pembuluh darah yang telah ada ditunjukkan oleh tanda panah Faktor angiogenik tersebut mengaktifkan sel endotel sehingga memicu sekresi dan aktivitas matrix metallo proteinase. Hal ini mengakibatkan terjadi degradasi membran basal sehingga memungkinkan sel endotel mengadakan migrasi ke dalam stroma jaringan perivasikular menuju sumber stimulus dan menginvasi jaringan di sekitarnya. Selama migrasi sel endotel mengalami proliferasi yang distimulasi oleh bFGF dan
10
VEGF serta diferensiasi membentuk pembuluh darah baru. Akhirnya sel endotel membentuk membran basal baru dan mensekresi growth factor antara lain Platelet-Derived Growth Factor (PDGF) yang menarik sel penyokong untuk menguatkan pembuluh darah baru tersebut (Schor and Schor, 1983; Anonim, 2000). Inisiasi angiogenik distimulasi oleh sekresi Metogenic Growth Factor (MGF) (faktor pertumbuhan mitogenik) antara lain lain PlateletDerived Growth Factor (PDGF), Fibroblas Growth Factor (FGF), dan Vascular Endotelial Growth Factor (VEGF). Produk MGF sangat rendah pada sel normal, tetapi akan meningkat pada sel tumor (King, 2000). Penghambatan angiogenesis, akan mengurangi asupan nutrien, dan darah ke dalam jaringan tumor, sehingga dapat mencegah pertumbuhan tumor. Penghambatan angiogenesis merupakan terapi terbaru dalam pengobatan tumor. Untuk mengetahui respon angiogenesis akibat induksi jaringan normal maupun jaringan tumor, serta agensia yang diduga sebagai antitumor, dilakukan dengan mengimplantasi jaringan atau agensia tersebut pada membran korio alantois (MKA) embrio ayam. Secara anatomis, MKA embrio ayam sangat sesuai sebagai media uji angiogenesis karena Sangay kaya akan pembuluh darah. Pengatamatan respon angiogenesis dapat dilakukan secara makroskopis dan mikroskopis terhadap pembuluh darah baru yang mengumpul ke arah implan. Berdasarkan pengamatan tersebut, dapat ditentukan apakah implan tersebut bersifat merangsang ataukah menghambat angiogenesis. Apabila terjadi penghambatan angiogenesis, diharapkan agensia tersebut dapat mengurangi dan mencegah pertumbuhan tumor. Hal ini disebabkan karena agensia antiangiogenesis akan menghentikan pembentukan pembuluh darah baru di sekitar tumor (Folkman, 1996). Ikatan senyawa pertama yang berhasil diidentifikasi sebagai senyawa penghambat angiogenesis adalah collagenase inhibitor yang ditemukan di tulang rawan. Selain collagenase inhibitor, senyawasenyawa
lain
yang
berpotensi
11
menhambat
angiogenesis
adalah
corticosteroid dikombinasikan dengan heparin, protamin, sulfated polysaccharide-peptidoglycan complex yang diperoleh dari dinding bakteri dan senyawa-senyawa lainnya (Lush et al., 2005)
B. Hipotesis
Bakteri yang hidup di guano diduga merupakan bakteri penghasil antibiotik. Antibiotik yang dihasilkan mampu menghambat angiogenesis yang merupakan salah satu sifat antitumor. Penambahan ekstrak guano pada media pertumbuhan bakteri mampu memacu aktivitas bakteri dalam menghasilkan antibiotik-antitumor
12
BAB III
BAHAN DAN CARA KERJA
Penelitian ini meliputi serangkaian kerja di lapangan yang meliputi pengambilan sampel tanah gua sebagai sumber bakteri dan data lingkungan dimana sampel diambil. Penelitian dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarka,
meliputi
serangkaian kerja untuk mendapatkan bakteri yang mampu menghasilkan antibiotik yang berpotensi sebagai antitumor dengan metode penghambatan angiogenesis (angiogenesis inhibition). Proses penghambatan angiogenesis ini diuji antagonistik langsung terhadap embrio ayam di Laboratorium Anatomi Hewan Fakultas Biologi UGM. . A. Alat dan Bahan
1. Alat a. Alat untuk analisis Alat yang dipakai untuk analisis hasil penelitian adalah inkubator (Memmert) untuk menyimpan isolat bakteri; kamera digital (KODAK Easy Share V550) untuk memotret sel bakteri pada mikroskop; mikroskop dipakai untuk mengamati morfologi sel bakteri; ultrasonikator yang digunakan untuk memecah sel bakteri.
b. Alat pemeliharaan kultur Alat yang dipakai untuk pemeliharaan kultur bakteri inkubator (Memmert) untuk menyimpan isolat bakteri.
13
c. Alat penyiapan media Alat yang dipakai untuk penyiapan media adalah timbangan (CENT-0-GRAM OHAUS)
untuk menimbang komposisi bahan yang
akan digunakan dalam pembuatan media; autoklaf (ALP- Type STMN-Y222 Japan) untuk mensterilkan alat dan medium.
d. Alat pendukung lainnya Alat-alat laboratorium lain yang digunakan dalam penelitian ini adalah lampu spritus, botol kaca, saringan tanah, jarum ose, gelas benda dan rak tabung.
2. Bahan a. Bakteri Bakteri penghasil antibiotik diisolasi dari goano. Selain itu, juga digunakan Eschericia coli (perwakilan gram negatif), dan Bacillus sp. (perwakilan gram positif) sebagai bakteri model untuk mendeteksi kemampuan bakteri goano dalam menghasilkan antibiotik
b. Medium 1) Medium seleksi Untuk menseleksi isolat bakteri dari total bakteri yang diisolasi dari goano, digunakan media khusus yang diperkaya, yakni media Starch Casein Agar
yang mengandung Cycloheximide
dan
Nystatin
(Sembiring, 2000) dengan komposisi (g/1000 ml): 10,0 Starch; 2,0 KNO3; 0,3 Casein; 2,0 NaCl; 2,0 K2HPO4; 0,05 MgSO4.7H2O, 0,02 CaCO3; 0,01 FeSO4.7H2O; 15,0 agar (Atlas, 1995)
2) Medium pemeliharaan Isolat yang didapat dipelihara dengan menggunakan medium Starch Casein cair dengan komposisi medium sama dengan medium seleksi, tanpa penambahan agar.
14
3) Medium untuk mendeteksi antibiotik Medium yang dipakai untuk mendeteksi bakteri penghasil antibioti adalah medium Nutrien Agar (NA) dengan dan tanpa penambahan ekstrak goano.
c. Bahan kimia lainnya Bahan kimia lain yang dipakai adalah larutan Ringer
untuk
pengenceran seri dengan komposisi (g/1000ml): 6,0 NaCl; 0,075 KCl, 0,1 CaCl2; 0,1 NaHCO3, dan 1000 ml aquades (Atlas, 1995). Untuk pengecatan gram digunakan cat Hucker dan kristal violet, larutan Mordan Lugol dan Iodin, larutan peluntur : aceton-alkohol, dan larutan cat Safranin, dan alkohol 70 % (Johnson dan Case, 1998).
d. Bahan untuk mendeteksi antitumor Bahan yang diperlukan untuk pengujian senyawa antitumor adalah membran korio alantois embrio ayam berusia 9 hari (Iurlaro et al. 1998)
C. Cara Kerja Alur kerja secara keseluruhan disajikan pada gambar 4.
15
sample guano dari Gua Semuluh Gunung Kidul DIY
Pengenceran seri dengan aquades 10-1 – 10-4
Inokulasi 0,1 ml suspensi dari masing-masing pengenceran diambil dan ditumbuhkan pada medium Starch Casein Agar selama 2-3 hari
Koloni yang tumbuh terpisah diamati dan dipilih 4 isolat (ARS-1, ARS-4, AR S-5, dan ARS-8 yang memiliki zona jernih paling luas
Uji daya antibiotik
Uji antibiotik keempat isolat terhadap bakteri gram – (E.coli), dan gram + (Bacillus sp.)
Keempatnya memiliki daya antibiotik yang bersifat spektrum luas
Preparasi dan karakterisasi
Buat preparasi keempat isolat: intact cell, supernatant, dan ekstrak sel, serta dilakukan pengecatan gram, dan uji sifat biokimianya
Teteskan ketiga preparasi pada membrane korio alantois embrio ayam berusia 9 hari, inkubasikan selama 3x24 jam Uji daya antitumor Perkembangan bentuk pembuluh darah diamati
Merangsang pembentukan pembuluh darah baru
16
Menghambat pembentukan pembuluh darah baru
Gambar 4. Alur kerja penelitian
1. Pengambilan sampel dan pengumpulan data lingkungan Sampel goano sebagai sumber bakteri diambil dan dikumpulkan dari Gua Simeluh Kabupaten Gunung Kidul Propinsi Daerah Istimewa Yogyakarta. Sampel dimasukkan kedalam kantong plastik dan dibawa ke laboratorium untuk diteliti lebih lanjut. Data lingkungan dimana sampel diambil dikumpulkan dengan mengukur suhu goano menggunakan termometer; pH goano menggunakan pH meter; dan ketinggian wilayah. Data tersebut kemudian ditabulasi.
2.
Isolasi bakteri penghasil antibiotik Goano yang diambil dari gua, disaring dengan menggunakan
saringan tanah dengan ukuran 250 mesh. Kemudian kandungan air ditentukan dengan mengukur berat basah dan berat kering tanah. Guano dimasukkan ke dalam botol timbang yang telah diketahui berat keringnya, berat botol yang berisi tanah ditimbang kembali. Kemudian botol beserta tanah yang ada di dalamnya diinkubasikan selama beberapa jam sampai mencapai berat yang konstan. Bakteri diisolasi dari guano yang diambil dari Gua Semuluh melalui teknik kultur diperkaya dengan sistem sekali unduh (batchwise system culture). Sampel tanah diambil sebanyak 10 gram, lalu dimasukkan ke dalam 90 mL larutan Ringer (pengenceran 1:10), lalu digojok sampai homogen dengan menggunakan vorteks. Kemudian diambil 1 mL dari pengenceran 1:10 tadi, dan dipindahkan ke dalam erlenmeyer yang berisi 99 mL larutan Ringer (pengenceran 1:10-3), begitu seterusnya sampai pengenceran 1:10-4 (Thom, 1967) Isolasi dilakukan dengan teknik pour plate setelah pengenceran seri dengan memasukkan 0,1 ml suspensi bakteri dari pengenceran 10-1, 10-2, 10-3 dan 10-4 ke dalam cawan petri steril yang diberi label, kemudian ditambahkan
medium
Starch
Casein
Agar
yang
mengandung
Cyclohexamie dan Nystatin, lalu diratakan, serta dibiarkan menjendal.
17
Setelah medium menjendal, semua kultur diinkubasikan pada suhu kamar selama 3-7 hari. Setelah bakteri tumbuh yang ditandai dengan tumbuhnya koloni bakteri di pernukaan medium, jumlah koloni dihitung dan dicatat. Dari sekian banyak koloni bakteri yang terpisah, dipilih 10 koloni berdasarkan karakter spesifik yang dimiliki oleh masing-masing koloni terutama kemampuannya dalam menghambat pertumbuhan bakteri lain yang ditunjukkan oleh adanya zona hambat disekeliling koloni tersebut. Setelah ditentukan koloni yang akan diisolasi, maka koloni tersebut diunduh dengan menggunakan jarum ose dan dikulturkan kembali pada media agar yang sama dengan metode streak untuk mendapatkan kultur murninya.
3. Seleksi bakteri penghasil antibiotik Semua isolat yang diperoleh dideteksi berdasarkan kemampuan menghambat pertumbuhan E. coli, dan Bacillus sp. dengan metode streak. Isolate-isolat bakteri ditumbuhkan pada medium nutrient agar dengan penambahan ekstrak guano dan tanpa penambahan ekstrak guano. Kemampuan menghasilkan antibiotik ini ditandai dengan terbentuknya zona hambat (zona jernih) terhadap pertumbuhan bakteri model. Isolat yang mampu menghasilkan zona jernih yang paling luas, dikulturkan kembali untuk memperoleh intact cell, supernatan dan ekstrak selnya (Banson, 1994)
4. Ekstraksi sel bakteri Sebelum dilakukan ekstraksi sel bakteri, terlebih dahulu bakteri ditumbuhkan pada medium nutrient cair dengan penambahan ekstrak guano, yang dikombinasikan, yaitu media padat pada bagian dasar dengan media cair di atasnya (submerged culture). Pemberian media dengan penambahan ekstrak guano, dan perlakuan submerged culture ini bertujuan untuk memicu bakteri dalam menghasilkan metabolit sekunder, dan diinkubasikan selama 5-7 hari. Ada 3 jenis preparasi bakteri yang akan digunakan, yaitu supernatan hasil sentrifugasi kultur cair bakteri dengan
18
kecepatan 8000 rpm selama 10 menit, intact cell, dan ekstrak sel bakteri. Sedangkan untuk mendapatkan ekstrak sel bakteri, terlebih dahulu dilakukan pemecahan sel bakteri dengan menggunakan ultrasonikator selama
6 x 30 detik yang diselingi dengan pendinginan yang berulang
dengan mengunakan es.
5. Identifikasi Bakteri Tanah Isolate
bakteri
guano
diidentifikasi
berdasarkan
sifat
karakteristik morfologinya yang meliputi morfologi koloni, morfologi sel, dan sifat biokimia yang mengacu pada Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology (Holt et al., 1994). Pengamatan morfologi bakteri dilakukan dengan pengecatan sel bakteri dengan menggunakan metode pengecatan gram.
6. Uji senyawa antitumor Uji ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas senyawa yang dihasilkan oleh bakteri goano dengan metode embrionik angiogenesis, yang menggunakan telur ayam yang berisi embrio berusia 9 hari, Kemudian dibuat rongga udara pada telur dengan menyedot udara pada bagian dalam telur, sehingga posisi embrio turun (berada di bawah). Hal ini dilakukan agar pada saat meneteskan intact cell, supernatant, ataupun ekstrak sel bakteri yang diperoleh dari guano tersebut, tidak sampai melukai membrane korio alantois embrio ayam. Kemudian dibuat lubang yang lain untuk meneteskan intact cell, supernatan, dan ekstrak sel bakteri guano tersebut. Semua lubang ditutup dengan parafin dan diinkubasikan kembali selama 3x24 jam pada suhu 40oC.
19
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A.
Hasil analisis lingkungan dan isolasi bakteri
Goano (hasil perombakan kotoran kelelawar), yang diambil dari Gua Semuluh Gunung Kidul memiliki karakteristik fisik, kimia, dan mikrobiologis seperti yang tertera pada tabel 2, lampiran 1.
Tabel 2. Karakter fisik, kimia, serta mikrobiologis goano Lokasi
Karakter fisik goano Warna
Bau
Tekstur
Gua Coklat tanah Simeluh kehitaman Gunung Kidul, Yogyakarta .
halus
suhu 28oC
Karakter kimia pH 7,5
Mikrobiologis Populasi bakteri 195,5 x 101 / gram berat kering
Bau tanah merupakan karakteristik bahwa pada guano tersebut terdapat bakteri Actinomycetes . Populasi bakteri guano (195,3 x 101 sel/gr berat kering) meliputi berbagai macam bakteri dengan bentuk koloni yang berbeda (Tabel 3, Gambar 5).
Tabel 3. Karakter koloni bakteri guano setelah tumbuh pada medium agar Lokasi Gua Simeluh Gunung Kidul, Yogyakarta
Populasi (sel/gr)
Morfologi koloni 1
195,5 x 10
Warna Bentuk Ukuran Krem, dan Irregular, Besar, putih susu circular, dan sedang, dan curlet. kecil
20
ARS-1
ARS-3 ARS-2 ARS-4
ARS-5 ARS-9 ARS-6
ARS-10
ARS-7
ARS-8
Gambar 5. Populasi koloni bakteri yang tumbuh pada medium Starch Casein Agar setelah diinkubasi 2x24 jam Gambar 5 menunjukkan bahwa pada pengenceran seri pertama -1
(10 ), populasi bakteri yang tumbuh masih sangat banyak. Hal ini ditandai dengan tumbuhnya koloni-koloni dengan berbagai bentuk dan ukuran, demikian juga dengan pengenceran seri kedua (10-2). Pada pengenceran seri ketiga (10-3), populasi bakteri sudah mulai berkurang, dan dapat dilihat dengan jelas koloni mana saja yang memiliki zona hambat (zona jernih) di sekitar koloninya, dan sama halnya dengan pengenceran seri
21
keempat (10-4) dimana populasi bakteri yang tumbuh jauh lebih sedikit jika dibandingkan dengan pengenceran sebelumnya. Populasi bakteri penghasil antibiotik diperoleh setelah melalui teknik kultur diperkaya, yaitu suatu teknik mengkultur mikrobia pada media pertumbuhan dengan menambahkan unsur-unsur yang penting, misalkan vitamin, dan asam-asam amino yang sangat diperlukan dalam merangsang pertumbuhan mikrobia tersebut. Dari sejumlah koloni yang tumbuh, dipilih 10 bakteri isolat (ARS-1, ARS-2, ARS-3, ARS-4, ARS-5, ARS-6, ARS-7, ARS-8, ARS-9, dan ARS-10) yang memiliki daya hambat (zona jernih disekitar koloninya) terhadap mikrobia lain. Hasil pengamatan terhadap koloni isolat-isolat tersebut, didapatkan beberapa karakter dari tiap isolat seperti yang tertera pada Tabel 4.
Tabel 4. Karakteristik isolat bakteri tanah hasil isolasi No
Kode isolat
Morfologi koloni Warna
Bentuk
Ukuran
1 ARS-1
Krem
Circuler
Kecil
2 ARS-2
Krem
Circuler
Kecil
3 ARS-3
Krem
Irreguler
Kecil
4 ARS-4
Krem
Circuler
Sedang
5 ARS-5
Putih susu
Curlet
Sedang
6 ARS-6
Krem
Irreguler
Kecil
7 ARS-7
Putih susu
Circuler
Sedang
8 ARS-8
Putih susu
Circuler
Besar
9 ARS-9
Krem
Circuler
Besar
10 ARS-10
Krem
Circuler
Besar
Setelah melalui kultur diperkaya, bakteri goano penghasil antibiotik berhasil diisolasi dan ditumbuhkan pada media nutrien agar yang mengandung ekstrak goano. Hasil seleksi dan skrining bakteri penghasil antibiotik diperoleh 4 bakteri isolat (ARS-1, ARS-4, ARS-5, dan ARS-8) yang mempunyai zona penghambatan pertumbuhan bakteri paling luas.
22
ARS-1
ARS-4
ARS-5
ARS-8
Gambar 6. Kultur murni 4 isolat bakteri (ARS-1, ARS-4, ARS-5, dan ARS-8)
B.
Hasil deteksi kemampuan isolat menghasilkan antibiotik
Keempat bakteri tersebut diseleksi kembali berdasarkan kemampuan menghambat pertumbuhan bakteri gram negatif (E.coli) dan bakteri gram positif (Bacillus sp.), dan ternyata semuanya mampu menghambat pertumbuhan kedua model bakteri. Dengan demikian keempat bakteri tersebut menghasilkan antibiotik bersifat spektrum luas. Antibiotik bersifat spektrum luas adalah antibiotik yang mampu menghambat pertumbuhan bakteri gram negatif dan bakteri gram positif (Baron, 1996), seperti yang terlihat pada gambar 7.
23
Ec
Ec Bs Ec
Bs
Ec Bs
ARS-1
Bs
Ec
Ec Bs
Bs Bs Ec
ARS-4
Ec Bs
Ec Bs
Ec
Bs Bs
ARS-5
Bs
Ec
Ec Bs Ec
Bs
Bs
ARS-8
Gambar 7. Kemampuan isolate bakteri dalam menghasilkan antibiotic yang ditandai dengan adanya zona hambat pertumbuhan Bacillus sp. dan E.coli pada medium tanpa penambahan ekstrak guano (kiri) dan dengan penambahan ekstrak guano (kanan)
24
Keempat isolat mampu tumbuh dengan cepat pada medium yang mengandung ekstrak goano yang ditunjukkan dengan waktu generasi ratarata 0,3825 jam, dan laju pertumbuhan rata-rata 1,8125 x 103 sel/jam, jika dibandingkan dengan pertumbuhan pada medium tanpa penambahan ekstrak guano yang memiliki waktu generasi rata-rata 0,37 jam, dengan laju pertumbuhan rata-rata 1,8 x 103 sel/jam. Kecepatan pertumbuhan isolat bakteri pada medium yang ditambahkan ekstrak guano dan tanpa penambahan ekstrak guano dapat dilihat pada gambar 8 dan gambar 9, serta lampiran 2 dan lampiran 3.
jumlah sel bakteri (CFU/ml)
400 350 300 ARS-1
250
ARS-4
200
ARS-5
150
ARS-8
100 50 0 1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16
waktu (jam)
Gambar 8. Pertumbuhan isolat bakteri pada medium dengan penambahan ekstrak goano untuk menunjukkan waktu generasi Gambar 8 menunjukkan bahwa masing-masing isolat yang ditumbuhkan pada media dengan penambahan ekstrak guano dapat tumbuh dengan cepat. Hal ini dapat dibuktikan dengan fase lag yang singkat. Isolat ARS-5 lebih cepat mencapai fase stationer, disusul oleh ARS-1, ARS-4, dan ARS-8,
dimana fase tersebut mulai terbentuk
metabolit sekunder, yaitu antibiotik.
25
jumlah sel bakteri (CFU/gr)
350 300 250
ARS-1
200
ARS-4
150
ARS-5 ARS-8
100 50 0 1
2
3
4
5 6
7
8
9 10 11 12 13 14 15 16
waktu (jam)
Gambar 9. Pertumbuhan bakteri yang ditumbuhkan pada medium pertumbuhan tanpa penambahan ekstrak guano
Gambar 7 menunjukkan bahwa isolat bakteri yang ditumbuhkan pada medium tanpa penambahan ekstrak goano, pertumbuhannya lebih lama yang ditunjukkan dengan fase lag yang lebih panjang, meskipun tidak terlalu signifikan. Ini kemungkinan disebabkan karena isolat tersebut harus menyesuaikan diri terlebih dahulu dengan media pertumbuhannya yang tidak sesuai dengan habitat aslinya, yakni guano. Hal ini berarti bahwa, pertumbuhan bakteri pada medium dengan penambahan ekstrak guano lebih cepat dari pada pertumbuhan bakteri pada medium tanpa penambahan ekstrak guano, karena guano diduga mengandung senyawa yang dapat memacu pertumbuhan bakteri.
C.
Hasil deteksi daya antitumor. Keempat isolat yang telah pasti mampu menghambat pertumbuhan
bakteri model juga mampu menghambat angiogenesis
khususnya untuk ekstrak kultur isolat bakteri seperti yang ditunjukkan oleh gambar 8.
26
Gambar 10. Profil pembuluh darah pada membran korio alantois embrio ayam setelah ditetesi dengan ekstrak sel bakteri goano dari isolat ARS-1, ARS-4, dan ARS-5 setelah inkubasi selama 3x24 jam. Ekstrak sel isolat ARS-8 bersifat degradatif terhadap membran korio alantois termasuk embrio ayam.
27
Gambar 11. Profil pembuluh darah pada membran korio alantois setelah diteteskan intact cell isolat ARS-1
Gambar 11 menunjukkan bahwa dengan meneteskan intact sel isolat bakteri pada membran korio alantois embrio ayam, mampu mendegradasi embrio kecuali intact cell dari isolat ARS-1 yang menunjukkan penghambatan angiogenesis dengan jelas, demikian pula dengan pemberian supernatan isolat bakteri, hanya supernatan yang berasal dari kultur isolat ARS-1 yang menunjukkan adanya penghambatan angiogenesis dengan jelas (Gambar 12), sementara yang lainnya bersifat
28
degradatif terhadap seluruh componen yang ada di dalam telur ayam tersebut.
Gambar 12. Profil pembuluh darah pada Corio Alanthois Membranne (CAM) setelah diinjeksikan supernatan isolat ARS-1
29
Gambar 13. Profil telur ayam setelah ditetesi dengan supernatan dan intact cell dari isolat bakteri yang ditumbuhkan pada medium dengan penambahan ekstrak guano Gambar 13 menunjukkan embrio ayam (berusia 9 hari), mengalami degradasi akibat aktivitas kultur bakteri. Dengan demikian, bakteri tersebut mempunyai daya penghambatan angiogenesis (Soesilo, 2007 komunikasi pribadi). Penghambatan angiogenesis merupakan salah satu sifat antitumor (Lush et al, 2005). Hal ini terjadi mungkin dikarenakan bakteri telah mengeluarkan molekul-molekul antiangiogenik (angiogenik
30
inhibitor), sehingga pembentukan pembuluh darah baru terblokir oleh antiangiogenik tersebut, seperti yang dinyatakan oleh Anonim (2005). Dengan terblokirnya pembentukan pembuluh darah baru, maka asupan nutrien terhambat. Karena
asupan nutrien terhambat menuju
embrio, maka embrio tidak akan berkembang, mengecil, kemudian mati. Keterhambatan pembentukan pembuluh darah baru menunjukkan bahwa kultur
bakteri
mengandung
senyawa
yang
dapat
menghambat
pembentukan pembuluh darah baru (antiangiogenik). Kemampuan bakteri dalam menghambat angiogenesis inilah yang mengindikasikan bahwa senyawa tersebut mampu menghambat pertumbuhan tumor (antitumor). Penelitian ini didukung oleh hasil penelitian terdahulu yang membuktikan bahwa penghambatan pembentukan pembuluh darah baru (angiogenesis inhibition) dapat dijadikan salah satu cara untuk menghentikan pertumbuhan tumor (Dewanti, 2006). Jenis senyawa metabolit antitumor dari bakteri yang diisolasi dari goano tersebut perlu dideteksi lebih lanjut dan diidentifikasi. Bakteri tersebut kemungkinan memiliki senyawa antiangiogenik (angiogenik inhibitor) berupa sulfated polysaccharide-peptidoglycan complex yang diperoleh dari dinding bakteri seperti yang dikemukakan oleh Lush et al. (2005).
D. Hasil identifikasi bakteri Empat isolat teripilih telah diidentifikasi meskipun hanya berdasarkan ciri morfologi koloni, sel, dan beberapa sifat biokimia. Isolat bakteri tersebut kemunginan masuk ke dalam kelompok actinomycetes, (Tabel 5, Gambar 14)
31
Tabel 5. Beberapa karakter isolat bakteri yang mirip dengan aktinomisetes
No
Kode
Morfologi Koloni
Isolat
bentuk
warna
Morfologi Sel ukuran
bentuk
Sifat Biokimia
Sifat
spora
gram
Fermentasi
Fermentasi
pH
glukosa
air susu
medium
1
ARS-1
Circuler
Krem
Kecil
Coccus
Positif
Ada
+
+
8
2
ARS-4
Circuler
Krem
Sedan
Batang
Positif
Ada
+
+
8
g
pendek
Putih
Sedan
Filament
Positif
Ada
+
+
8
susu
g
ous
Putih
Besar
Batang
Positif
Ada
+
+
8
3
4
ARS-5
ARS-8
Curlet
Circuler
susu
filament ous
Keterangan : + menunjukkan karakter dari isolat
ARS-1
ARS-4
ARS-5
ARS-8
Gambar 14 : Morfologi sel bakteri dengan pengecatan gram (ARS-1, ARS4, ARS-5, dan ARS-8)
32
Gambar 14 menunjukkan bahwa keempat isolat bersifat gram positif. Sifta gram positif ini ditunjukkan dengan sel bakteri yang warna ungu kebiruan. Menurut Caldwell (1995), hal ini disebabkan oleh dinding sel bakteri secara morfologi yang terdiri dari peptidoglikan yang lebih tebal dibandingkan dengan bakteri gram negatif, sehingga pada saat dibubuhkan larutan cat Hucker dan kristal violet komponen penyusun dinding sel tidak mengalami lisis, sehingga pada saat pengecatan dengan larutan cat safranin, tidak bereaksi membentuk warna merah seperti sifat gram negatif, melainkan berwarna ungu kebiruan.
33
BAB V.
KESIMPULAN DAN SARAN
A. Kesimpulan
Dari uraian di atas, dapat disimpulkan bahwa 1.
Berdasarkan kemampuan menghasilkan antibiotik, diperoleh 4 isolat bakteri indigenous yang hidup di guano (ARS-1, ARS-4, ARS-5, dan ARS-8) yang memiliki sifat morfologi sel, pengecatan gram dan beberapa sifat biokimia, mirip dengan bakteri-bakteri kelompok Aktinomisetes.
2.
Antibiotik yang dihasilkan bersifat spektrum luas dan memiliki potensi sebagai antitumor yang ditandai dengan kemampuannya menghambat angiogenesis.
3.
Ekstrak
guano
menstimulasi
bakteri
menghasilkan
senyawa
antibiotik yang menghambat angiogenesis.
B. Saran
Adapun penelitian ini belum sepenuhnya selesai dikerjakan. Untuk itu perlu adanya penelitian lebih lanjut untuk mengidentifikasi
jenis
bakteri yang mampu menghasilkan antibiotik yang berpotensi sebagai antitumor, dan jenis antibiotik bakteri goano tersebut sehingga bisa diaproduksi secara komersial untuk meningkatkan masyarakat di kemudian hari.
34
kesejahteraan
DAFTAR PUSTAKA
Anderson R.N. 2001. Deaths: Leading causes for 1999. National Vital Statistics Reports. Hyattsville,Maryland; National Center for Health Statistics. 49:11 Anonim. 2005. Understanding Cancer Series: Angiogenesis. http://www.cancer.gov/cancertopics/understandingcancer/angiogenes is/Slide4 [accessed online August 29th, 2007]. Anonim. 2006. The Principles of Classification of Microorganisms. http://www.soilandhealth.org [accessed online April 22nd, 2007) Atlas, R M. 1995. Handbook of media for environmental microbiology. CRC Press. New York. P.66 Baron, Samuel (1996). Medical Microbiology, 4th ed.. The University of Texas Medical Branch at Galveston. ISBN 0-9631172-1-1. Benson, H.J. 1994. Microbiological Applications. WCB McGraw-Hill. New York. USA Black, J.G. 1999. Microbiology, Principles and Exploration. 4th edition. Prentice Hall International, Inc. New Jersey. USA. Bolontrade, M.F., M.C.Stern., R.L.Binder., J.C.Zenklusen., I.B.G.Conti., and C.J.Conti. Angiogenesis is early event in the development of chemically induced skin. Carcinogenesis. Vol.19 no.12 Caldwell, D.R. 1995. Microbial Physiology and Metabolism. Wm.C. Brown Publisher. USA. Cristofanilli, M.C. Charsangavej and G.N. Hortobagyo. 2002. Angiogenesis Modulation in Cancer Research: Novel Clinical Approach. Nature Rev.1:415-426 Dewanti, E. 2006 . Angiogenesis pada Membran Korio Alantois Embrio Ayam Aibat Implantasi Tumor Payudara Tikus (Rattus novergicus L.) dan perlakuan eksrtak benalu Teh (Scurrula atropurpurea. Tesis. Program Pasca Sarjana Biologi UGM. Fidler, I.J., R.S. Kerbel, L.M. Ellis. 2002. The Prognostic Significance of Tumor Angiogenesis. Overview of Antiangiogenic Strategies. Biology of Cancer:Principles & Practice of Oncology Folkman, J. 1996. Fighting cancer by attacking its blood supply. Sci.Amer.9:116-119. Ganiswara, G.S. 1995. Farmakologi dan Terapan. Ed. IV. Bagian Farmakologi, Fakultas Kedokteran.Universitas Indonesia. Jakarta. hal: 110-113 Goddfellow, M., Williams, S.T. and Mordarski, M., Eds. 1988. Actinomycetes in Biotechnology. Academic Press. London. Gupta, M.K. and Qin R.Y, 2003. Mechanism and its regulation of tumorinduced angiogenesis. World J Gastroenterol. Jun, 9 (6): 1145-55 Ingham, E.R. 2006. The Soil Biology Primer. http://soils.usda.gov/sqi/concepts/soil_biology/bacteria.html [accessed online April 17th, 2007]
35
Iurlaro, M., A. Vacca, M. Minischetti, D. Ribatti, A. Pellegrino, A. Sardenelli, F. Giaccheta, F. Dammaco. 1998. Antiangiogenesis by cyclosporine. Experimental Hematology 26:1215 – 1222. Johnson, T.R., and C.L. Case. 1998. Laboratory experiments in microbiology. 5th ed. The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. California.USA. King, R.J.B., 2000. Cancer Biology. Second Edition. Person Education. England Lush, R.M., M.A. Rubek, W.D. Figg. 2005. Review of Three New Agents That Target Angiogenesis, Matrix Metalloproteinases, and CyclinDependent Kinases. http://www.moffitt.usf.edu/pubs/ccj/v6n5/article3.htm [accessed online March 3rd, 2007] Macklins, P. 2006. Angiogenesis Inhibition. www.math.uci.edu/~pmacklin/CancerPrimer.html [accesed online April 27th, 2007] Madigan, M.T., J.M. Martinko, J. Parker. 2000. Brock Biology of Microorganisms. 10th ed. Prentice Hall.USA. Madigan, M.T., J.M. Martinko, J. Parker. 2003. Brock Biology of Microorganisms. 10th ed. Prentice Hall.USA. Marcela, F.B., C.S. Mariana, R.L. Binder, J.C. Zenklusen, I.B. GimenezConti, and Claudio J.C. 1998. Angiogenesis is an early event in the development of chemically induced skin tumors. Carcinogenesis. Vol.19. no.12 pp.2107-2113. Pelczar, M. J., E. C. S. Chan and N.R. Krieg. 1993. Microbiology. 5th Edition. Tata McGraw-Hill. New Delhi
Prescott, L.M., J.P. Harley and D.A. Klein. 2005. Microbiology. 5th edition. Mc Graw Hill. New York. Sembiring, L. 2000. Selective isolation and characterization of streptomycetes associated with the rhizosphere of the tropical legume, Paraserianthes falcataria (L). Nielsen. Ph.D Thesis. Departemen of Agricultural and Environmental Science. University of Newcastle upon Tyne. UK Sutedjo, M.M., A.G. Kartasapoetra, R.D. Sastroadmodjo. 1996. Mikrobiologi Tanah. Penerbit Rineka Cipta. Jakarta. Indonesia. Suwandi, U. 1993. Skrining Mikroorganisme Penghasil Antibiotik. Pusat Penelitian dan Pengembangan P. T. Kalbe Farma, Jakarta; Cermin Dunia Kedokteran 89:47 Thom, C. 1967. A Practical Manual of Soil Microbiology Laboratory Methods. Food and Agriculture Oganization of the United Nations, Rome
36
LAMPIRAN
37
Lampiran 1. Tabel pertumbuhan populasi bakteri tanah
Ulangan
Pengenceran 1
2
CFU
CFU
10-1
215
195,5
195,5
10-2
184
157
157
10-3
82
74,5
74,5
10-4
32
35,5
35,5
0
Kontrol
Rata-rata
Jumlah Populasi Bakteri
195,5 x 101
0
Kriteria perhitungan jumlah populasi bakteri: 1. Koloni yang tumbuh minimal berjumlah 30, dan maksimal berjumlah 300 2. Jika hasil bagi rata-rata antara pengenceran seri yang lebih tinggi dengan pengenceran seri yang lebih rendah >2, maka yang dipakai adalah rerata pada pengenceran yang lebih rendah 3. Jika hasil bagi rerata antara pengenceran seri yang lebih tinggi dengan pengenceran seri yang lebih rendah <2, maka yang dipakai untuk menentukan jumlah populasi bakteri adalah hasil rerata dari keseluruhan jumlah populasi bakteri yang ada pada setiap seri pengenceran.
Perhitungan : 35,5 x 104 -----------74,5 x 103
74,5 x 103 ------------
= 4,76
38
= 4,74
157 x 102
Karena setiap hasil perhitungan jumlahnya lebih besar dari 2, maka yang dipakai adalah hasil rerata dari pengenceran seri pertama dengan jumlah populasi bakteri sebesar 195,5 x 101 CFU/gr guan
157 x 102
------------195,5 x 101
= 8,03
Lampiran 2.
Tabel laju pertumbuhan isolat bakteri pada medium dengan penambahan ekstrak guano No
Kode isolat
1
A
Lama inkubasi (jam) 4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
2
4
11
36
71
159
211
278
302
310
301
289
267
211
179
115
1
6
18
37
76
127
209
264
287
303
292
278
259
209
189
155
4
11
32
75
112
214
299
367
364
278
212
198
155
149
140
132
1
3
8
24
37
65
138
179
213
298
319
265
218
198
125
113
x 10-5
2
B x 10-5
3
C x 10
4
-5
D x 10
-5
Keterangan : A: ARS-1; B: ARS-4; C: ARS-5, dan D: ARS-8 Fase lag terjadi selama 6 jam, sementara fase eksponensial terjadi selama 18 jam, dimulai dari jam ke-6 sampai jam ke-22, yang kemudian dijadikan acuan untuk menghitung kecepatan pertumbuhan dan laju generasi masing-masing isolat.
Waktu generasi dan kecepatan pertumbuhan spesifik dapat ditentukan berdasarkan rumus Monods (1942) sebagai berikut : Log Xt – Log X0
0,6933
K = --------------------
g = ------------
0,301 t
µ
µ = 0,6933.K Keterangan :
39
Xt : jumlah sel pada waktu tertentu
g : waktu generasi
X0 : jumlah sel pada waktu t = 0 µ : kecepatan tumbuh spesifik (sel jam-1)
Perhitungan laju pertumbuhan isolat bakteri yang tumbuh pada medium dengan penambahan ekstrak guano untuk isolat ARS-1:
untuk isolat ARS-4
Log 278x105 – Log 4x105
Log 264x105 – Log 6x105
K = ------------------------------
K = ------------------------------
0,301 x 2
0,301 x 2
5,4 – 3,6
5,42 – 3,78
= -----------------------------
= -----------------------------
0,602
0,602
= 2,99
= 2,72
µ = 0,6933.K
µ = 0,6933.K
= 0,6933 x 2,99 = 2,07 sel/jam
0,6933
= 0,6933 x 2,72 = 1,88 sel/jam
0,6933
0,6933
g = ------------ = --------------- = 0,33 jam µ
2,99
untuk isolat ARS-5
µ
1,88
untuk isolat ARS-8
Log 299x105 – Log11x105
Log 213x105 - Log 8x105
K = ------------------------------
K = --------------------------------------
0,301 x 2
0,301 x 2
5,47 – 4,04
5,34 – 3,90
= -----------------------------
= ---------------------
0,602
0,602
= 2,37
= 2,39
µ = 0,6933.K
µ = 0,6933.K
= 0,6933 x 2,37 = 1,64 sel/jam
0,6933
0,6933
g = ------------ = --------------- = 0,37 jam
= 0,6933 x 2,39 = 1,66 sel/jam
0,6933
40
g = ------------ = --------------- = 0,42 jam µ
0,6933
1,64
0,6933
g = ------------ = --------------- = 0,41 jam µ
1,66
Lampiran 3.
Tabel laju pertumbuhan isolat bakteri pada medium tanpa penambahan ekstrak guano
No
Kode isolat
1
ARS
Lama inkubasi (jam) 4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
32
34
0
2
7
20
43
89
167
211
279
283
277
246
219
198
156
116
0
3
8
22
45
93
187
245
267
279
256
223
211
195
173
135
0
5
11
24
52
99
198
300
311
287
214
198
155
149
140
132
0
1
3
11
23
49
95
179
181
200
196
175
118
98
75
63
1
2
ARS 4
3
ARS 5
4
ARS 8
Perhitungan laju pertumbuhan isolat bakteri yang tumbuh pada medium tanpa penambahan ekstrak guano untuk isolat ARS-1:
untuk isolat ARS-4
Log 283x105 – Log 7x105
Log 279x105 – Log 8x105
K = ------------------------------
K = ------------------------------
0,301 x 2
0,301 x 2
5,45 – 3,84
5,45 – 3,90
= -----------------------------
= -----------------------------
0,602
0,602
= 2,67
= 2,57
41
µ = 0,6933.K
µ = 0,6933.K
= 0,6933 x 2,67 = 1,85 sel/jam
0,6933
= 0,6933 x 2,57 = 1,78 sel/jam
0,6933
0,6933
g = ------------ = --------------- = 0,37 jam µ
g = ------------ = --------------- = 0,38 jam
1,85
untuk isolat ARS-5
µ
1,78
untuk isolat ARS-8
Log 311x105 – Log 11x105
Log 200x105 - Log 3x105
K = ------------------------------
K = -------------------------------------
0,301 x 2
0,301 x 2
5,49 – 4,04
5,30 – 3,47
= -----------------------------
= ---------------------
0,602
0,602
= 2,41
= 3,04
µ = 0,6933.K
µ = 0,6933.K
= 0,6933 x 2,41 = 1,67 sel/jam
0,6933
= 0,6933 x 3,04 = 2,11 sel/jam
0,6933
0,6933
g = ------------ = --------------- = 0,41 jam µ
0,6933
0,6933
g = ------------ = --------------- = 0,33 jam
1,67
µ
42
2,11
43
