A mitokondriális Ca2+ felvétel előrecsatolt szabályozása Doktori értekezés
Dr. Szanda Gergő Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Spät András egyetemi tanár, az MTA rendes tagja Hivatalos bírálók: Dr. Bánhegyi Gábor, egyetemi tanár, az MTA doktora Dr. Panyi György, egyetemi tanár, az MTA doktora Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:
Dr. Ádám Veronika, egyetemi tanár az MTA rendes tagja Dr. Kecskeméti Valéria, egyetemi tanár az MTA doktora Dr. Váradi András, egyetemi tanár az MTA doktora
Tartalomjegyzék Rövidítések jegyzéke .....................................................................................................................................2 Irodalmi háttér ..............................................................................................................................................4 A mitokondrium morfológiája és a mitokondriális membránpotenciál ...................................................... 5 A mitokondrium Ca2+ anyagcseréje............................................................................................................ 6 A mitokondriális Ca2+ uniporter (MCU) .................................................................................................... 9 A Ca2+ uniporter szabályozása.................................................................................................................. 12 A „gyors felvételi mód” (RaM) ................................................................................................................ 15 A mitokondriális ryanodin-receptor (mRyR) ........................................................................................... 16 A mitokondrium Ca2+ leadása. Ca2+ felvétel az „efflux transzportereken” keresztül ............................... 16 A mitokondriális permeabilitási tranzíciós pórus (mPTP)........................................................................ 19 A mitokondriális Ca2+ felvétel intakt sejten belüli tényezői. A mikrodomén elmélet. ............................. 20 A felhasznált modellsejtek és a megválaszolandó kérdések..................................................................... 23 Célkitűzések .................................................................................................................................................26 Módszerek ....................................................................................................................................................27 Oldatok ..................................................................................................................................................... 27 A H295R és HEK-293T sejtek tenyésztése és transzfekciója................................................................... 28 Konfokális mikroszkópia.......................................................................................................................... 29 A mitokondriális [Ca2+] mérése fluoreszcens mikroszkópiával................................................................ 31 A mitokondriális [Ca2+] és citoplazmatikus [ATP] mérése luminometriával ........................................... 32 Egyes sejtalkotók fluoreszcens jelölése.................................................................................................... 32 Western-blot és immuncitokémia ............................................................................................................. 34 Statisztika ................................................................................................................................................. 34 Eredmények I...............................................................................................................................................36 Különböző sejttípusok mitokondriális Ca2+ érzékenységének vizsgálata................................................. 36 A plazmamembrán alatti mitokondriumok Ca2+ felvételének vizsgálata.................................................. 37 Az ER-mitokondrium távolság hatása a mitokondrium Ca2+ felvételére intakt H295R sejtekben ........... 38 Az angiotenzin II mitokondriális Ca2+ felvételt gátló hatása .................................................................... 42 A p38 MAPK szerepének vizsgálata ........................................................................................................ 45 Az új (novel) típusú protein kináz C izoformák hatása a mitokondriális Ca2+ anyagcserére.................... 49 Az p38 MAPK és az nPKC izoformák egyidejű aktiválásának vizsgálata............................................... 52 Az p38 MAPK és az nPKC izoformák hatása a mitokondriális membránpotenciálra.............................. 54 A mitokondriális külső membrán szerepének vizsgálata.......................................................................... 57 Eredmények II. ............................................................................................................................................62 A perimitokondriális [Mg2+] hatása a mitokondrium Ca2+ anyagcseréjére............................................... 62 A citoplazma Mg2+ jelének leírása HEK-293T sejtben ............................................................................ 64 A Mg2+ forrásainak azonosítása HEK-293T sejtben................................................................................. 68 Megbeszélés..................................................................................................................................................72 Módszertani megfontolások ..................................................................................................................... 73 A mitokondrium térbeli helyzetének hatása a Ca2+ felvételre .................................................................. 75 A p38 MAPK szerepe a mitokondriális Ca2+ felvétel gátlásában ............................................................. 77 Az új típusú PKC izoformák szerepe........................................................................................................ 79 A gátlás hatása a mitokondriális Ca2+ válasz mintázatának létrehozásában ............................................. 81 A mitokondriális membránpotenciál szerepe a gátlás kialakításában....................................................... 83 A mitokondriális külső membrán mint a kinázok támadáspontja............................................................. 84 Összevetés az irodalommal ...................................................................................................................... 86 A citoszol [Mg2+] hatása a mitokondrium Ca2+ anyagcseréjére................................................................ 89 A [Mg2+] mérésének módszertani szempontjai......................................................................................... 90 A citoplazma Mg2+ jel és forrásai ............................................................................................................. 91 Következtetések ...........................................................................................................................................94 Összefoglalás ................................................................................................................................................95 Summary ......................................................................................................................................................96 Köszönetnyilvánítás.....................................................................................................................................97 Irodalomjegyzék ..........................................................................................................................................98 Saját közlemények jegyzéke .....................................................................................................................122
1
Rövidítések jegyzéke 12-HETE
12 hidroxi-eikoza-tetraenolsav
AA
arachidonát (arachidonsav)
AM
acetoxi-metilészter
AMFR
autokrin motilitási faktor receptor 1
ANT
adenozin nukleotid traszlokátor
ATCC
American Type Culture Collection
AII
angiotenzin II
BAPTA
aminofenoxietán-tetraacetát
BIS
bisindolil-maleimid 1
[Ca2+]c
citoplazma [Ca2+]
[Ca2+]m
mitokondrium mátrix [Ca2+]
DAG
diacilglicerin
∆Ψm
mitokondriális membránpotenciál
DLP-1
„dinaminszerű fehérje 1”
FCCP
p-trifluorometoxi-carbonil-cianid-phenyl-hidrazon
FCS
fetal calf serum; fötális borjúszérum
EC50
félmaximális aktivitáshoz szükséges koncentráció
EGTA
etilén-glikol-tetraacetát
ER
endoplazmás retikulum
GFP
zöld fluoreszcens fehérje
HCMD
magas Ca2+ koncentrációjú mikrodomén
IMM
belső mitokondriális membrán
ITS+
inzulin-transzferrin-szelén
IP3
inozitol 1,4,5 triszfoszfát
[Mg2+]c
citoplazma [Mg2+]
MCU
mitokondriális Ca2+ uniporter
mPTP
mitokondriális permeabilitási tranzíciós pórus
mRFP
monomer vörös fluoreszcens fehérje
2
MTDR
MitoTracker® Deep Red (mitokondriumot jelölő vörös festék) +
NAD(P)
NAD+ + NADP+
NAD(P)H
NADH + NADPH
nPKC
új típusú protein kináz C
OMM
külső mitokondriális membrán
p38 MAPK
p38 mitogén aktivált protein kináz
PBS
foszfát pufferelt fiziológiás sóoldat
Pi
anorganikus foszfát ion
PKC
protein kináz C
PKD
protein kináz D
PLC
foszfolipáz C
PMA
forbol-mirisztil-acetát
PDD
4α-forbol-didekanoát
iparvédelmi védjegy (jogi)
RaM
rapid uptake mode; gyors felvételi mód
ROI
region of interest; mérési terület
RuR
ruténium vörös
RyR
rianodin receptor
SER
szarkoplazmás retikulum
SERCA
szarko-endoplazmás retikulum Ca2+ ATPáz
STIM-1
sztrómális interakciós molekula 1
TIRF
total internal reflection fluorescence
TMRE
tetrametil-rodamin-etilészter
TRP
tranziens receptor potenciál
Vmax
maximális reakciósebesség
VDAC
feszültségfüggő anioncsatorna; porin
A könnyebb olvashatóság érdekében néhány helyen a szövegben is megadom a rövidítések jelentését.
3
Irodalmi háttér Mitokondrium a legtöbb eukarióta sejtben található, ez az aerob anyagcsere központi sejtszervecskéje. A légzéssel felvett oxigén 98%-a a mitokondriumban használódik fel; az oxigén jelenlétéhez kötött lebontó biokémiai folyamatok ezen organellumban, a terminális oxidációban konvergálnak, kialakítva a mitokondrium membránpotenciálját s így lehetővé téve az ATP-szintézist, következményesen a sejt energia-ellátását, épségét és fennmaradását. Nem elhanyagolható „melléktermékként” pedig hő termelődik, mely esszenciális az élőlények testhőmérsékletének szabályzásához, ill. állandóan tartásához. A mitokondrium részt vesz továbbá az intracelluláris Ca2+anyagcserében, a sejten belüli szabadgyök termelésben [1], és nemcsak a lebontás, hanem több anabolikus reakció lépései is itt játszódnak le, mint pl. a zsírsavfelépítés kezdő reakciója, a hem-szintézis és a szteroidtermelés több lépése. Dolgozatomban alapvetően a mitokondrium Ca2+-felvételének mechanizmusával, ill. annak PhD munkám során vizsgált előre-csatolt (feed-forward) szabályzásával foglalkozom. (Mitokondriális Ca2+ felvételnek a nettó Ca2+ transzportot nevezem a mitokondriális mátrixba.) A folyamat biológiai jelentősége az utóbbi két évtizedben vált nyilvánvalóvá: mára már elfogadott, hogy az organellum nem csupán mint intracelluláris „Ca2+-puffer”, passzív módon vesz részt a sejt Ca2+-jelében, hanem a sejt Ca2+ anyagcseréjének integratív szervezője. Emellett a mitokondriális [Ca2+] ([Ca2+]m) szabályozza a piridin-nukleotidok redukcióját, az ATP-termelést
és, bizonyos
körülmények között, a sejtalkotó integritásának megszűnését és az apoptózist is kiválthatja. Érthető tehát, hogy a mitokondriális Ca2+ felvétel tanulmányozása mára a sejtélettan és sejtbiológia fontos területe. A mitokondriális Ca2+-felvétel mechanizmusának és szabályzásának megértéséhez elengedhetetlen a sejtalkotó funkcionális morfológiájának, biokémiájának alapszintű ismertetése. Ezek ismertetésénél egyben kitérek azon tényezőkre is, amelyek a Ca2+ felvétel tekintetében különösen fontosak. Ezt követően a Ca2+ felvételben részt vevő transzportmechanizmusokat és az intakt sejt (mitokondriális Ca2+ felvétel szempontjából lényeges) tulajdonságait tárgyalom. Az irodalmi háttér taglalása után, annak ismeretében ismertetem saját PhD munkám mitokondriális Ca2+ felvételre vonatkozó eredményeit. 4
A mitokondrium morfológiája és a mitokondriális membránpotenciál A legtöbb egysejtű élőlény és a többsejtűek legtöbb sejtfajtája tartalmaz mitokondriumot. Számuk, alakjuk és méretük sejtfajtától és a sejt aktivitásától, differenciáltságától függően változhat [2;3]. Humán májsejtek akár több ezret is tartalmazhatnak, szeroidtermelő sejtekben pedig a sejttérfogat közel felét is elfoglalhatják a mitokondriumok [2], ugyanakkor más (pl. mieloid) sejttípusokban számuk alacsony (510) és itt sokszor metabolikusan inaktívak is ezen sejtszervecskék [4]. A mitokondriumot két membrán, a külső és a belső mitokondriális membrán (OMM és IMM) határolja, átlagos átmérője 0,5-1 µm közé esik. A belső membrán határolta kompartment a mitokondriális mátrix, az OMM és az IMM között az intermembrán tér található. A külső membrán tömegének kb. 50%-át fehérjék adják, és köszönhetően a feszültségfüggő anion csatorna (VDAC vagy porin) jelenlétének, szabad diffúziót enged mintegy 3 kDa molekulaméretig [5]. Mivel a mitokondrium endoszimbióta sejtalkotó, a külső membrán lipid összetétele az eukarióta sejtre jellemző [6;7]. A belső membrán kb. 75%-a protein; ezek között legfontosabbak a légzési lánc komplexei, az F1FO ATPáz, az anion antiporterek (melyek az intermedier anyagcsere közti metabolitjait szállítják az organellumba, illetve onnan ki), valamint itt találhatóak a mitokondriális Ca2+-transzporterek is. A belső membrán permeabilitása ionokra a biológiai lipidmembránok között is igen alacsonynak számít. Az impermeabilitást a lipidtartalmának kb. 15-25%-át adó különleges glicerofoszfatid, a kardiolipin biztosítja (amely a mitokondriumokkal rokon Proteobacteriumokra is jellemző membránlipid). Az alacsony ionáteresztő-képesség alapvető a H+-grádiens fenntartásához és a Ca2+ is csak megfelelő csatornák és karrierek segítségével juthat be az organellumba, illetve onnan ki (a Ca2+-csorgás minden bizonnyal elenyésző). A mátrixban található több alapvető anyagcsere-folyamat enzimrendszere: a piruvát-dehidrogenáz, a Szent-Györgyi-Krebsciklus, a zsírsavak β-oxidációja, a hem-szintézis, az aminosavak oxidációja, (részben) az ornitin-ciklus és a szteroidszintézis enzimei. Az utóbbi évtizedben a mitokondrium ultrastruktúrájának finomabb elemzése a morfológiai szerveződés további szintjeit tárta fel. A korábbi felfogással (azaz az
5
intermembrán tér és a mátrix egy-egy egységes tereket alkot) ellentétben nagyfeloldású elektrontomográfiás felvételeken az intermembrán tér kompartmentalizációt mutat [8]. E kompartmentalizáció úgy jön létre, hogy a belső membrán mátrix irányába történő betüremkedéseinek szájadékánál (az ún. kriszta-junkciónál) fehérjék (feltehetőleg mitofilin és OPA-1 („optikus atrófia protein 1”) [9;10]) által szabályzott pórus található. Ezek alapján felmerült, hogy a belső membrán alkotta behúzódások esetleg a metabolitok belső membránhoz vagy belső membrántól való diffúzióját is befolyásolnák [11]. (Az apoptózis esélyét pl. bizonyítottan befolyásolják a kriszta-junkciók [10]). Nemcsak az intermembrán tér, hanem a mátrix kompartmentalizációjára utaló megfigyelések is vannak: fizikailag összefüggő mitokondriális hálózatokon belül olyan barrierek mutatkoznak, melyek meggátolták a Ca2+ organellumon belüli diffúzióját, ugyanakkor nem
képeznek
gátat
a
belső
membrán
mentén
tovaterjedő
mitokondriális
depolarizációnak [12]. Az IMM kardiolipin tartalma felelős a membrán jelentős ion-impermeabilitásáért és mint ilyen a proton-grádiens és a mitokondriális membránpotenciál (∆Ψm) fenntartásáért. Utóbbi kettőt a mitokondriális légzési lánc működése hozza létre. Ez az enzimrendszer teszi ki az emberi szervezet O2-fogyasztásának 98%-át, maga a lánc pedig tekinthető egy enzimatikusan kontrollált galvánelemnek, helyesebben sorba kapcsolt galvánelemek egységének. A folyamatot a NADH + H+ és a FADH2 táplálják elektronnal, az exergonikus oxidoredukciós lépéseket protonok a mátrixból az intermembrán térbe történő kipumpálása, mint endergonikus folyamat követi. Végül [H+]- és töltéskülönbség alakul ki, utóbbi a mitokondriális membránpotenciál (∆Ψm, izolált mitokondriumokban átlagosan 150-180 mV, belül negatív [13]). (A redukáló ekvivalensek hiányakor vagy a ∆Ψm esésekor az F1FO ATPáz képes a sejt ATPtartalmának kárára ún. fordított módban H+-t kifelé pumpálni, és így meggátolni vagy csökkenteni a további ∆Ψm csökkenést [14].)
A mitokondrium Ca2+ anyagcseréje A jelátvitelben a Ca2+ az egyik legszerteágazóbb funkcióval rendelkező és legjobban tanulmányozott másodlagos hírvivő [15], melynek koncentrációja a
6
citoplazmában ([Ca2+]c) a legtöbb biológiai funkcióra hatással van. Szabályozza az izomkontrakciót [16], a neurotranszmitterek leadását [17], a fehérje- és szeroidhormonok [18] elválasztását, a génexpressziót [19] és alapvető jelentőségű a nekrotikus és az apoptotikus sejthalál folyamataiban [20;21]. A [Ca2+]c ennek megfelelően az egyik legszigorúbban szabályzott élettani paraméter: az eukarióta sejtek összetett Ca2+ transzporter és [Ca2+]-érzékelő fehérjepalettával rendelkeznek [22]. A [Ca2+]c kialakításában nyugalmi körülmények között és hosszú távon a plazmamembránon keresztüli Ca2+-mozgások a meghatározóak [23;24], azonban rövid távú változások (pl. Ca2+ jel során a [Ca2+]c emelkedése) az intracelluláris Ca2+ raktárak és a mitokondrium részvételével is létrejöhetnek. Ugyan a szarko-endoplazmás retikulum (SER, ill. ER) tekinthető a fő intracelluláris Ca2+ raktárnak, a Golgi-apparátusról [25], a peroxiszómáról [26], a lizoszómáról [27], az endoszómákról [28] és a szekretoros vezikulákról [29] is kimutatták, hogy Ca2+-forrásként és -raktárként is működhet. Mindezen sejtszervecskék mellett is, a mitokondrium Ca2+ anyagcserében betöltött szerepe különösen sokrétű, mert: a mitokondrium Ca2+ akkumuláló képessége kiemelkedően nagy [30] és az ionfelvétel nem igényeli új ATP szintézisét [31]; a mitokondrium mozgékony sejtalkotó [32] és mozgása Ca2+ függő [33]; a mitokondriális Ca2+ felvétel a Ca2+ jel és a biológiai válasz energetikai követelményeihez hangolja a sejt anyagcseréjét
[34-36];
a
mitokondriális
Ca2+
felvétel
további
Ca2+-
transzportmechanizmusokat szabályoz [37]; a [Ca 2+]m szabályozza az intramitokondriális dehidrogenázokat, a citrát-kör bizonyos enzimeit és az ATP-szintázt [38-41]; a Ca2+ felvétel mértéke befolyásolja a sejt túlélését vagy halálát [1]. A [Ca2+]m kialakításáért a Ca2+ felvételben és leadásban szerepet játszó transzpormechanizmusok és az organellum anorganikus foszfát (Pi) háztartása együtt felelős. Funkcionális szempontból a mitokondriális Ca2+ uniporter (MCU) a legjobban jellemzett transzporter [13;42;43], annak ellenére, hogy ez az egyetlen, melyet máig nem sikerült fehérje szinten azonosítani [44]. Jól definiált körülmények között a Ca2+ felvétel megvalósulhat az un „gyors felvételi módon” („rapid uptake mod” vagy RaM) és a mitokondriális ryanodin receptoron (mRyR) keresztül is. A Ca2+ leadása két mechanizmussal, a Ca2+/H+ és a Ca2+/Na+ kicserélőkön keresztül valósulhat meg; ezen transzporterek, speciális esetben, a Ca2+ felvételben is részt vehetnek. A mindenkori Ca2+
7
felvétel és leadás, valamint az intramitokondriális Ca2+-Pi komplexképződés sebessége határozza meg a [Ca2+]m-t. (Fiziológiás körülmények között a mitokondriális permeabilitási tranziciós pórus (mPTP) szerepe a Ca2+ felvételben, ill. leadásban nem általánosan elfogadott.) A Ca2+ felvétel és [Ca2+]m közötti összefüggés megértéséhez feltétlen szükséges az organellum anorganikus foszfát ion (Pi) háztartásának ismerete. A Pi a belső membránban elhelyezkedő, elektroneutrális foszfát-transzporteren keresztül [45-48], mint H3PO4 lép be a mátrixba. (Ez formálisan megegyezik H2PO4-/OH- antiporttal vagy H2PO4-/H+ kotranszporttal.) A felvett Pi elengedhetetlen az oxidatív foszforilációhoz (a foszfát-transzporter génjének mutációja perinatálisan letális [49]), valamint a Pi komplexet képez a mitokondriumba felvett Ca2+-nal. A Pi és a Ca2+ felvételének sztöchiometriája arra enged következtetni, hogy a mátrixban (ismeretlen arányban) [Ca5(PO4)3OH] és [Ca3(PO4)2] keletkezik. A keletkezett komplexek biológiailag és ozmotikusan inert Ca2+ raktárként foghatóak fel. A Ca2+ felvétel mértéke és hatására létrejött tényleges [Ca2+]m-változás tehát nem egyenesen arányos. (Ezt szépen érzékelteti, hogy a mitokondrium teljes Ca2+-tartalmának ötvenszeres emelése a szabad ionkoncentrációt csupán 50%-kal fokozza [30].) A foszfát-transzporter kapacitása nagy [49], valamint a citoszolban a szabad Pi koncentrációja több tíz mM-ra tehető, tehát feleslegben rendelkezésre áll. A komplexképződés és -oldódás sebessége így leginkább a mitokondrium mátrix szabad Ca2+-koncentrációját, valamint a hidroxiapatit oldhatóságát jelentősen befolyásoló mátrix pH-t követi. A pH csökkenése ugyanis a komplexek oldhatóságának növekedéséhez vezet: a mátrix pH a nyugalminak tekintett 8-ról 7,8-ra csökkenve a szabad Ca2+koncentrációt kb. ötvenszeresre emeli [30]. Az Pi és Ca2+ komplexe tehát felfogható egyfajta nagy kapacitású puffernek, melynek segítségével a mitokondrium mind a citoplazmatikus Ca 2+ jel kezdeti, mind pedig a lecsengési szakaszát (amikor a mátrix pH csökkenése [50] miatt a Ca2+-Pi komplex oldhatósága növekszik) nagyban befolyásolja [37].
8
A mitokondriális Ca2+ uniporter (MCU) A mitokondriális Ca2+ felvétel leírása a ’60-as évekből származik [51], a ’70-es években az ionfelvétel részletes funkcionális jellemzése mitokondriális szuszpenzión végzett kísérletekkel megtörtént. A Ca2+ felvételéért felelős, belső membránban elhelyezkedő fehérjét azóta az irodalom „ruténium vörös érzékeny mitokondriális Ca2+uniporter” elnevezéssel illeti (a ruténium vörös (RuR) az uniporter klasszikus gátlószere). Az MCU-n keresztüli Ca2+ transzport az ionfelvétel legáltalánosabb útjának tekinthető: eddig minden vizsgált gerinces sejt mitokondriumában sikerült kimutatni a Ca2+ felvétel olyan módját, melynek kinetikai és farmakológiai tulajdonságai megfeleltek az MCU-nak [42]. (Növények, gombák és a filogenézis alacsonyabb szintjén álló állatok mitokondriuma is képes a Ca2+ felvételre, azonban a transzport módja nagyban eltérhet az MCU-ra jellemzőtől [52]). Az MCU funkcionális szempontból uniporter, vagyis a Ca2+ felvétel nem kapcsolt egyéb töltött részecske felvételéhez vagy leadásához. (K+-ionofór valinomycin jelenlétében vizsgálva a Ca2+-felvételt az ionok mozgására 1Ca2+/2K+ sztöchiometriai arány adódott [53], továbbá semmilyen eddig vizsgált ion kotranszportját nem sikerült kimutatni [54;55]). Az ionfelvétel továbbá jól követi a Goldman-féle fluxus egyenlettel számolt értékeket [31]. Csupán ezen adatok alapján azonban (szekvencia és térszerkezet hiányában) még nem eldönthető, hogy az MCU karrier avagy ioncsatorna (lásd később). Az MCU-n keresztüli Ca2+ felvétel sebessége szigmoid összefüggést mutat a perimitokondriális [Ca2+]-val [56;57]. A kooperativitás mértékét kifejező paraméter a Hill-koefficiens, melynek értéke a legkülönfélébb szövetekből származó mitokondriumok esetében 2 körülinek adódik [31]. A Hill-koefficiens 2-es értéke ma általánosan elfogadott, köszönhetően többek között annak a felismerésnek is, hogy az MCU két Ca2+ kötőhellyel, egy felvételi és egy allosztérikus aktivátor hellyel rendelkezik [58-60]. Az MCU továbbá egyéb bivalens kationokat (Sr2+ és Mn2+) is képes szállítani, ezek transzportját a Ca2+ fokozza [61]. Az MCU Ca2+-on keresztüli aktivációja az intermembrán tér felé eső oldalról, s nem pedig a mátrix Ca2+ által történik. Ezt szépen példázza, hogy az organellumok Ca2+nal való töltése után a ∆Ψm megszűntetése Ca2+ effluxhoz vezet, azonban csak külső Ca2+
9
jelenlétében [59]. Ez az efflux gátolható az MCU polikationos gátlószerének, a ruténium vörösnek alacsony koncentrációjával, feltételezhetően tehát az uniporteren keresztül valósul meg [59;62]. Sikerült továbbá olyan mitokondriális fehérjefrakciót izolálni, mely rekonstruált lipidmembránokban a Ca2+-t a klasszikus, elsőrendű reakciót mutató enzimekre jellemző hiperbolikus kinetikával veszi fel [63], valamint egy olyat, melynek uniporter aktivitása nem volt gátolható a RuR sejtpermeábilis származékával, Ru360-nal [64]. Valószínűsíthetően az allosztérikus kötőhely és a RuR kötőhely tehát nem ugyanazon fehérjén vannak, mint a transzporter-kötőhely [64]. Ezen adatok kompatibilisek azzal az elmélettel, mely szerint az uniporter egy multiprotein-komplex [13]. Ellentétben a Hill-koefficienssel, az MCU-ra jellemző EC 50 (félmaximális sebességű ionfelvételhez tartozó perimitokondriális [Ca2+]) a vonatkozó irodalomban igen széles tartományban mozog. A EC50 értékre publikált adatok az 1-180 µM-os [Ca2+], többnyire a 10-5 M-os tartományban mozognak [13;65-67]. Ennek a nagyfokú szórásnak ugyan több feltételezett oka lehet, azonban a legvalószínűbb, hogy a magas perimitokondriális [Ca2+]-val kiváltott Ca2+ felvétel során a ∆Ψm disszipálódik, s ilyen körülmények között a Ca2+ felvétel sebességét a légzési lánc aktivitása, és nem az uniporter kapacitása szabja meg [13;42]. Erre utal az is, hogy magas EC50 értékeket olyan körülmények között találtak, ahol a maximális transzportsebesség (Vmax) is magas értéket mutatott [13]. Minthogy a légzési lánc enzimeinek foszforiláltságában és emiatt aktivitásában [68] az egyes sejttípusok között jelentős eltérés lehet, valamint a kísérleti körülmények messzemenően befolyásolhatják a ∆Ψm-t [69-71], az EC50 nagyfokú bizonytalansága részben származhat a kísérleti felállások paramétereinek különbségeiből is. Az EC50 pontos értékének bizonytalansága ellenére kijelenthető, hogy az MCU-n keresztüli Ca2+ felvétel alacsony affinitású folyamat (~ 10 -5 M), különösen annak fényében, hogy a citoszol egészére jellemző ún. „globális” [Ca2+]c a 10-7-10-6 M tartományban mozog. A mitokondriális szuszpenzión mért EC50 értékek ismeretében sokáig kérdéses is volt, hogy a sejten belüli nyugalmi ionkoncentráció, illetve a µM alatti, szubmikromoláris Ca2+ jelek mellett az ion egyáltalán bejut-e az organellumba [65;72]. A fiziológiás, 0,5-1 µM-os citoplazma Ca2+ jelek mitokondriális felvétele továbbra is az
10
MCU legnagyobb „kihívása”, segédhipotézisek és alternatív transzporterek segítségével próbáljuk a jelenséget megmagyarázni. Az
elmúlt
években
a
külső
membrántól
megfosztott
mitokondriumon
(mitoplaszton) végzett elektrofiziológiai mérések az MCU-t merőben új megítélés alá helyezték. David Clapham és munkacsoportja mitoplasztok patch-clamp vizsgálatával egy befelé rektifikáló, erősen Ca2+-szelektív áramot írt le, melynek farmakológiai tulajdonságai az uniporterével egyeztek [73]. Legutóbb pedig humán szívizomsejt mitokondriumából származó mitoplasztokon két rokonítható, befelé rektifikáló Ca2+ áramot írtak le [74], részben megerősítve ezzel Clapham és munkatársai méréseit. Patch-clamp módszerrel a Ca2+ felvétel kinetikai, szelektivitási és farmakológiai tulajdonságai közvetlenül vizsgálhatóak, azonban ezen kísérletek eredményei számos helyen nem, vagy csak részben egyeztethetőek össze a korábbi szuszpenzión vagy permeabilizált sejten végzett kísérletekével. Például az elektrofiziológiai mérésekben mutatkozott erős befelé rektifikálás [73] meggátolná az MCU-n keresztüli Ca2+ effluxot, holott az régóta ismert, hogy az MCU-n keresztül gyors Ca2+ leadás lehetséges [59;62]. Emellett az erős Ca2+-szelektivitás nehezen egyeztethető össze a számos esetben közölt Sr2+- és Mn2+-konduktivitással. Az MCU-n keresztüli Ca2+ felvétel nagyfokú hőmérséklet-függése a szuszpenziós kísérletek alapján is inkább csatornára jellemző [75], de az ionfluxus (~2 x 104 Ca2+/s [42]) messze elmarad a patch-clamp felállással mért értékekhez képest (~5 x 106 Ca2+/s [73]). Szembeötlő különbség a szuszpenzión kapott adatokhoz képest az is, hogy patch clamp mérésekből a EC50 mintegy 15-20 mM-nak adódott [73;74], szemben a korábban publikált 1-180 µM-os, mitokokondriumszuszpenzióra jellemző értékekkel (lásd fent). Elektrofiziológiai mérésekben a transzport elsőrendű kinetikát mutatott (Hill-koefficiens = 0,6, mitokondriális szuszpenzión ez 2 körüli). És végül: elektrofiziológiai mérések alapján a csatorna denzitása az IMM-ban nagy [73], holott az MCU-izolálás egyik legnagyobb gátjának a fehérje kis mitokondriális mennyiségét tekintjük [13]. A mitokondriális szuszpenzión végzett kinetikai mérések és a mitoplasztok közvetlen elektrofiziológiai vizsgálata között azonban olyan, lényeges metodikai különbségek vannak, melyek részben magyarázhatják a látszólagos ellentmondásokat. Elektrofiziológiai mérések során a ∆Ψm Ca2+ felvétel hatására létrejövő csökkenése
11
(voltage-clamp felállásban) nem jön létre [73], így a Ca2+ felvételt valóban a csatorna konduktanciája és nem a ∆Ψm limitálja. Lényeges eltérés továbbá, hogy az elektrofiziológia mérések során az OMM nincs jelen, így minden tényező, mely a külső membránban vagy azon keresztül hat a Ca2+ felvételre, értelemszerűen kiesik. Mindenesetre az MCU klónozásáig és szerkezetvizsgálatáig várnunk kell annak végleges eldöntésével, hogy az MCU transzporter vagy ioncsatorna, ill., hogy az elektrofiziológiai vizsgálatokkal leírt csatorna azonos-e az uniporterrel.
A Ca2+ uniporter szabályozása Az MCU-szekvencia (ha multiprotein-komplexben gondolkodunk, az MCUösszetétel) ismeretének hiányában a Ca2+ felvétel szabályozásának is csupán kevés módja leírt. A Ca2+ felvétel módosítása alapvetően három úton történhet: egyrészt szolubilis faktorokon, másrészt poszttranszlációs módosításon, továbbá közvetetten, a ∆Ψm-on keresztül. A Mg2+ a Ca2+ transzport általános inhibitorának tekinthető: gátolja a feszültségfüggő Ca2+ csatornákat [76-78], a TRP csatornákat [79], az IP3-receptort [73] és csökkenti a Ca2+ transzportáló karrierek Ca2+ affinitását is [80]. Mitokondriális szuszpenzión végzett vizsgálatokkal már a ’70-es években igazolták a Ca2+ felvétel extramitokondriális Mg2+-on keresztüli gátlását [78;81;82]. A Mg2+ gátló hatása feltehetőleg nem a pórusba történő „beülésen” keresztül valósul meg, ugyanis proteázemésztéssel a gátló hatás megszűntethető [82]. Kiemelendő, hogy ezen kísérletekben a [Mg2+] meghaladta az intakt sejt citoplazmájára jellemző értéket [83]. A citoplazmában fiziológiásan is előforduló [Mg2+] mellett a Mg2+ hatásai a Ca2+ felvételre nem ismertek, ennek is köszönhető, hogy a Mg2-t nem tekintjük a mitokondriális Ca2+ felvétel szabályozójának. Mivel azonban az utóbbi évek vizsgálatai alapján a citoplazma [Mg2+]c finoman szabályzott és egyáltalán nem állandó paraméter [83], a Mg2+ lehetséges mitokondriális hatásai feltétlen figyelmet érdemelnek. Az adenozin nukleotidok ionfelvételt gátló hatását (ATP>ADP>AMP) is több sejttípus mitokondriumán kimutatták, ez a hatás emésztéssel nem befolyásolható [82]. Az eukarióta sejtek ubiquiter poliaminja, a spermin is csökkenti az ionfelvétel EC50 értékét 12
[84], az ozmolit taurin is hasonló hatással bírt [85]. A sperminről továbbá kiderült, hogy a később tárgyalt különleges Ca2+-felvételi módot, a „rapid uptake”-et (RaM) is aktiválja, az efflux mechanizmusra pedig gátlólag hat [86]. Gyakorlatilag azonban nem áll rendelkezésre megbízható adat arra vonatkozóan, hogy fiziológiás, ill. patológiás körülmények között a fent említett szolubilis faktorok koncentrációja változik-e a citoplazmában, s ha igen, a változások befolyásolják-e (vagyis szabályozzák-e) a Ca2+ felvételt. A Ca2+ felvétel poszttranszlációs módosításon keresztüli szabályozására saját kísérleteink kezdete előtt csak kevés és közvetett adat állt rendelkezésre. HeLa sejtekben a protein kináz C (PKC) β és δ izoformáinak túlexpressziója gátolta, míg a PKC ζ csökkentette a Ca2+ felvételt [87]. Mivel a PKC mennyisége a sejtben normálisan megtalálhatót jóval meghaladta, az endogén PKC izoformák szabályzó szerepét ez a megfigyelés nem bizonyítja. Ugyancsak HeLa sejtben, a p38 mitogén aktivált protein kináz (p38 MAPK) gátlószere, az SB202190 fokozta a mitokondrium Ca2+ felvételét [88]. Ezekben a kísérletekben az SB202190 hatásához nem volt szükség ATP jelenlétére és egyéb p38 MAPK gátlók nem fokozták a Ca2+ felvételt [88;89], a szerzők így direkt MCU-aktivációt feltételeztek az SB202190 esetében. Hasonló hatást tulajdonítottak néhány növényi flavonoidnak is [89]. Parekh és munkacsoportja permeabilizált RBL-1 sejteken, farmakológiai megközelítéssel a mitokondrium Ca2+ felvételének kalmodulinon (de nem foszforiláción) keresztüli aktiválását írta le [90]. Ugyancsak ebben a munkában közlik a Ca2+ felvétel „Ca2+-előkezeléssel” történő deszenzitizációját. Kívánatos lenne más sejttípuson, intakt sejten, genetikai módszerekkel vagy más munkacsoport által megerősíteni a megfigyelést. (A Parekh és munkacsoportja által közölt Ca2+ hatására létrejövő deszenzitizáció egyébként a később tárgyalt RaM-mal mutat erős hasonlóságot.) Mivel a mitokondriális Ca2+ felvétel nem elektroneutrális, minden tényező, amely a ∆Ψm-t megváltoztatja, befolyásolja a Ca2+ felvételt is. Ez a hatás nagyobb lehet, mint az a ∆Ψm változásból egyedül következne: a ∆Ψm–Ca2+-fluxus összefüggés ugyanis nem lineáris [13;91]. A ∆Ψm megváltozásának in vivo számos oka lehet, ezek közül az egyik több oldalról is bizonyított és látványos példa a mitokondriális Ca2+-aktivált K+ csatorna. A [Ca2+]m emelkedése a K+ csatorna nyitási küszöbét negatív ∆Ψm értékek irányába tolja
13
el, ez a csatorna nyitásának és következményesen a ∆Ψ m csökkenésének kedvez. Ez csökkenti a mitokondriális Ca2+ felvételt és a Ca2+ „túltöltés” (lásd mPTP) veszélyét [92]. A mechanizmus bizonyítottan kardioprotektív [93], de szívizmon kívül máshol nem leírt. A citoplazma Ca2+ jel közvetlenül [94;95] és a [Ca2+]m emelésén keresztül is fokozhatja a mitokondriális piridin nukleotidok redukcióját [34;38;39;96], így a légzési lánc szubsztrátellátását [36] és a H+-kidobást a mátrixból, végső soron növelheti a ∆Ψm-t. Maga a Ca2+ jel ilymódon akadályozhatja vagy késleltetheti a ∆Ψ m disszipációját, ezáltal potencírozhatja
saját
felvételét
a
mitokondriumba.
A
fiziológiásnál
nagyobb,
szupramikromoláris [Ca2+]c emelkedések azonban már olyan mértékű mitokondriális Ca2+ felvételt és depolarizációt váltanak ki, amely nem kompenzálható a légzési lánc fokozott működésével. Ilyen körülmények között a Ca2+ felvétel maximális mértékét nem a [Ca2+]c emelkedése, hanem a légzési lánc aktivitása limitálja [42]. Ca2+ mobilizáló agonstával történő ingerlés során a citoplazma pH-ja átmenetileg csökkenhet (0,1-0,2 pH egységgel), ezt követően pedig enyhe, de hosszan tartó alkalózis következhet be [97]. Az extramitokondriális acidózis a mátrix savanyodását is magával vonja, ez pedig csökkenti a ∆Ψm-t és bizonyítottan a Ca2+ felvétel csökkenésével jár [50]. A Ca2+ felvétel ilyen körülmények közötti csökkenésének másik oka, hogy a mátrix savanyodása a [Ca2+]m emelkedését [50] és ennek köszönhetően az ionfelvétel hajtóerejét is csökkenti. A folyamat fordítva is igaz: a β-sejt metabolikus aktiválása aminosavakkal a ∆Ψm és a mátrix pH emelkedésével jár, ezek pedig, feltehetőleg részben a hatékonyabb mitokondriális Ca2+ felvételen keresztül, fokozzák az ATP-termelést és az inzulinszekréciót [98]. A ∆Ψm kialakításáért felelős légzési lánc enzimek több foszforilációs helyet tartalmaznak [68], melyek lehetőséget adnak poszttranszlációs módosításon keresztüli szabályzásra. Szívizomsejtekben pl. hypoxia hatására a PKCε transzlokálódik a mitokondriumba és fokozza a IV. komplex aktivitását [99]. A PKCε továbbá fehérjefehérje kölcsönhatásban lehet a feltételezett mitokondriális ATP-szenzitív K+ csatornával [100], melyet aktiválhat és így ∆Ψm csökkenést okozhat [101]. Ezzel összhangban a PKC ε fokozott expressziója kardioprotektív egér iszkémia-reperfúziós modellen [102]. Ugyanakkor a ∆Ψm-csökkenésen alapuló kardioprotekció független lehet a mitokondriális ATP-szenzitív K+ csatornától, mert: ahol a csatorna farmakológiai aktivátorai hatékonyan
14
csökkentették a ∆Ψm-t, a fehérje nem volt kimutatható [103]; a csatorna aktivátorai protonofórként is hathatnak [104]; szétkapcsoláson alapuló kardioprotekció a csatorna hiányában is működhet [105]. Láthatóan tehát számos tényező megváltoztatja a ∆Ψ m-t és következésképpen a 2+
Ca
felvételt. Ezen folyamatok azonban nem tekinthetőek a Ca2+ felvétel specifikus
szabályzásának. A fent tárgyalt mechanizmusok így pusztán elvi lehetőségeket jelentenek a Ca2+ felvétel szabályozására, a Ca2+ felvételre kifejtett tényleges hatás megléte vagy hiánya minden esetben kísérletes bizonyítást igényel.
A „gyors felvételi mód” (RaM) A gyors felvételi mód a mitokondriális Ca2+ felvétel egy különleges módja, melyet olyan kísérleti felállásban mutattak ki, ahol rövid „Ca 2+-négyszögimpulzusok” alkalmazása mellett nagy időbeli feloldással vizsgálható a pulzusszélesség és a nettó ionfelvétel összefüggése [106]. Az adatok alapján a Ca2+ impulzusok legelején nagyon gyors nettó Ca2+ felvétel történik, a jelenség innen kapta nevét is: „rapid uptake mode” vagyis gyors felvételi mód. A RaM egyik legszembetűnőbb tulajdonsága a nagyon gyors inaktiváció [31] és a gyors reaktiválhatóság [106]. A RaM igen érzékeny továbbá a Ca2+ impulzus előtti, nyugalmi [Ca2+]-ra, ha ez meghaladja a 150 nM-os értéket, úgy a rákövetkező Ca2+emelkedést már nem kíséri RaM [106]. (A Mg2+ azonban nem gátolja a RaM-ot, ellentétben a „klasszikus” MCU-val.) A RaM érvként szolgálhat amellett, hogy az uniporter valójában ioncsatorna. A mitoplasztok platch clamp vizsgálatakor tapasztalt 0,6-os Hill-érték [73] ugyanis származhat abból, hogy a Ca2+ gyorsan inaktiválja a RaM-ot [31]. Fontos továbbá a RaM azon tulajdonsága, hogy olyan alacsony koncentráció értékeknél is működik (300-400 nM), ahol az irodalom szerint az uniporter még nem aktív, tehát az alacsony szubmikromoláris Ca2+ jelek felvételéhez ideális alternatívát nyújtana az alacsony affinitású MCU-val szemben. Eddig azonban a RaM-ot csak szívizomsejtben sikerült kimutatni [31], és számos más sejttípuson a szubmikromoláris Ca2+ jelek mitokondriális felvételéhez nem szükséges RaM [107].
15
A mitokondriális ryanodin-receptor (mRyR) Egy uniporterétől biztosan különböző felvételi mód lehet a ryanodin-receptoron (RyR) keresztüli mitokondriális Ca2+ felvétel. Izolált mitokondriumokon immunelektronmikroszkópiával kimutatták a RyR 1-es izoforma jelenlétét a belső membránban, kötési próbákkal igazolták az izolált organellumok RyR aktivitását, a csatorna gátlószereivel, ryanodinnal és dantrolennel pedig mind a Ca2+-felvételt, mind pedig a következményes
mitokondrium-duzzadást
lehetett
csökkenteni
[108;109].
Ezen
megfigyeléseket genetikai módszerekkel is megerősítették. Eddig szívizomsejten kívül csak endotheliumon (RyR3 [110]) sikerült kimutatni mitokondriális lokalizációban a RyR-t, sőt, több sejttípusban, köztük ingerlékeny sejtekben a ryanodin nem befolyásolja a mitokondrium Ca2+-felvételét [111].
A mitokondrium Ca2+ leadása. Ca2+ felvétel az „efflux transzportereken” keresztül A mitokondrium Ca2+ felvételének hatása a [Ca2+]c-ra és a [Ca2+]m-ra csak a Ca2+ leadás figyelembe vételével érthető. Saját eredményeink megbeszéléséhez is a Ca2+ leadás fontosabb jellemzőinek említése feltétlen indokolt. A Na+/Ca2+ antiporteren keresztül történő ionleadást felfedezése [112] óta több sejttípusban kimutatták, de csak a legutóbbi időben sikerült fehérje szinten is azonosítani a kicserélőt [113]. Ingerlékeny sejtekben (szívizom, neuron, glomerulóza stb.) a Na+/Ca2+ cserét tartjuk a fő ionleadási mechanizmusnak [43]. Ugyan az első leírásokban a folyamat elektroneutrálisnak (2Na+/Ca2+) mutatkozott [112], a korai kísérletek megismétlésekor az ionarány 3:1-nek adódott [114], vagyis a transzport elektrogén. Ezzel összhangban a depolarizáció gátolja a Na+/Ca2+ antiportert [62] (Az ioncsere a Na+ kilépésével zárul: a mátrixba belépett Na+-t a Na+-H+-kicserélő juttatja vissza a citoplazmába [115]). Számos, orvosi gyakorlatban is kiterjedten használt farmakonról tudjuk, hogy a mitokondriális Na+/Ca2+ kicserélőt is gátolja. Ilyen inhibitor többek között a clonazepam, a benzothiazepin CGP-37157 vagy néhány amilorid-származék [43;116].
16
A Na+ független Ca2+ leadásért a mitokondriális Ca2+/H+ kicserélő felelős, ez a nem ingerlékeny sejtek legfontosabb Ca2+ leadásért felelős transzportere. A közelmúltban sikerült a Ca2+/H+ kicserélő azonosítása: a fehérje a humán letm1 gén terméke [80]. Érdekes módon a Ca2+/H+ kicserélő az OPA-1 fehérjén keresztül a mitokondriális morfológiát és az apoptózist is szabályozza [117], hiánya okozza a neuromuszkuláris tünetekkel, epilepsziával kísért Wolf-Hirschhorn-szindrómát. Eredetileg a transzport elektroneutrálisnak mutatkozott [118], de néhány újabb eredmény azonban elektrogén, 1:1 arányú (Ca2+:Na+) sztöchiometriára utal [80]. Az utóbbi időben merült fel, hogy bizonyos körülmények között a Ca2+ leadásért felelős antiporterek az ionfelvételért is felelősek lehetnek. A Na+/Ca2+ kicserélő szívizomban hipoxiás körülmények között, tehát mikor a ∆Ψ m csökkent és a [Ca2+]c emelkedett [119], felelős lehet a Ca2+ felvétel egy részéért [120]. Intakt sejtben és fiziológiás körülmények között, figyelembe véve a ∆Ψ m-t, ez a „fordított” transzport vélhetőleg nem jön létre vagy elenyésző. A Ca2+/H+ cserélő Ca2+ felvételben játszott esetleges szerepe (azaz a „fordított” működés) kérdéses és spekulatív. A korábbi irodalmi adatok alapján elektroneutrálisnak tekintjük a transzportot (Ca2+:H+ =1:2) [13]. Ezt figyelembe véve állandó pH grádiens mellett (~ 1 nagyságrend, mátrixban lúgos) Ca2+ felvétel akkor jön létre a Ca2+/H+ cserélőn keresztül, ha a citoplazma [Ca2+] több mint tízszer nagyobb a [Ca2+]m-nál. Ez nagyon gyors, szupramikromoláris [Ca2+]c emelkedéseknél képzelhető el, mikor a [Ca2+]m „lemarad” a [Ca2+]c-hoz képest (vagyis mikor magas koncentrációjú mikrodomén jöhet létre; lásd később). Más a helyzet, ha a Ca2+/H+ kicserélőt elektrogénnek tekintjük (Ca2+:H+ = 1:1; [80]). Ebben az esetben, egy nagyságrendnyi ∆pH és 180 mV-os ∆Ψm mellett, 10-5 M-os (vagy a 10-4 M-t megközelítő) [Ca2+]m eléréséig Ca2+ felvétel jön létre. A letm1 gén terméke emellett képes a 100 nM-os [Ca2+] tartományban is működni [80], tehát elvileg felelős lehet a szubmikromoláris Ca2+ jelek mitokondriális felvételéért. Ez a lehetőség azonban mindaddig spekulatív marad, míg a letm1 gén termékének ionszelektivitását és kinetikai tulajdonságait nem vizsgálják meg Mg2+ és adenin nukleotidok jelenlétében is. Ezek ugyanis nagyban befolyásolhatják a transzporter Ca2+ affinitását [44;80].
17
A Ca2+ leadásért felelős kicserélők Ca2+ felvételben játszott szerepének megítélésekor mindenképp ki kell emelni, hogy mind a Na+/Ca2+, mind a Ca2+/H+ kicserélő
kapacitása
messze
elmarad
az
uniporterétől:
3-30
Ca2+/mg
nmol
protein/perc[112;121] és 1-1,5 nmol Ca2+/mg protein/perc [118] szemben az uniporterre jellemző 300-1700 nmol Ca2+/mg protein/perc értékkel [13]. Ezek alapján pedig az aktív MCU-rel rendelkező sejtekben a Na+/Ca2+ és Ca2+/H+ kicserélő ionfelvételben játszott szerepe
fiziológiás
körülmények
között
elenyésző
lehet.
A
maximális
transzportsebességek nagy különbségéből következik az is, hogy intakt sejten belül a [Ca2+]c emelkedésekor a mitokondriális Ca2+ felvétel sebessége hamar meghaladja a leadásét, így a [Ca2+]m emelkedik [122]. A mitokondrium Ca2+ anyagcseréjének tényezőit mutatja az alábbi séma:
Ca2+
MCU1
Na+
H+ MCU2
H+ MCU1
Ca2+ MCU2
Ca2+
Ca2+ Na+
Ca2+ Ca2+
Ca2+
H+ ADP
-180 mV
ATP
Ca2+
H+ VDAC
A Ca2+ felvétel fő útja a Ca2+ uniporter (MCU), amely a legutóbbi vizsgálatok alapján egy [73] vagy két [74], hasonló elektrofiziológiai tulajdonságokkal rendelkező csatorna (MCU1 és MCU2). A leadás útja a Ca2+/Na+ és Ca2+/H+ kicserélő, a Ca2+ kidobás során beáramlott Na+-t a Na+/H+ antiporter távolítja el. A külső membrán nagy Ca2+ konduktivitásáért a VDAC felelős. Az összes endergonikus transzport energiaforrása a légzési lánc által létrehozott kb. 180 mV-os membránpotenciál. (Bizonyos körülmények között az ionfelvétel a gyors felvételi móddal (RaM) és a ryanodin-receptorral (mRyR) is végbemehet. További részletek a szövegben.)
18
A mitokondriális permeabilitási tranzíciós pórus (mPTP) A mPTP egy nagy konduktivitású (mintegy 1,6 kDa méretig áteresztő) csatorna, mely mindkét mitokondriális membránt átéri, s amely Ca2+ számára szabadon átjárható (természetesen az elektrokémiai grádiens meghatározta iránynak megfelelően). Az mPTP nyitásakor a mitokondrium vizpermeabilitása megnő, duzzad, a külső membrán épsége megszűnik, a ∆Ψm disszipálódik és a citoplazmába jutó pro-apoptotikus faktorok (AIF, citokróm c) beindítják a programozott sejthalál mitokondriális útvonalát. Nem meglepő tehát, hogy felfedezése óta [123] az mPTP az orvosbiológiai kutatások egyik fő célpontja, a legjelentősebb kardio- és cerebrovaszkuláris kórképekben (miokardiális infarktus [124], stroke [125]) pedig szerepe bizonyítottnak tekinthető. Az általánosan elfogadott nézet szerint az adenozin nukleotid transzlokátor (ANT) a belső, a feszültségfüggő anioncsatorna (VDAC) a külső membránban képezi az mPTPcsatorna részét. Ugyancsak része a komplexnek a cyclophilin D, ennek köszönhető, hogy a cyclosporin A gátolja a csatornát. Az antiapoptotikus Bcl-2 és a perifériás típusú benzodiazepin receptor kapcsolódhat az mPTP-hoz, és hasonlót feltételeznek a kreatinkinázról is [1]. Amíg a cyclophilin D szerepe az mPTP-felépítésében genetikai bizonyítékokkal is alátámasztott [124], addig ANT- és VDAC-knock-out állatokból származó mitokondriumok mPTP aktivitása nem különbözött a vad típustól [126;127]. (Ez meglepő, mert az ANT-t gátló bongkrekát az mPTP klasszikus gátlószerének számít [1].) Kísérleti felállástól, speciestől és szövettől függően az mPTP nyitásához vezető elsődleges ok különböző lehet [128;129]}. Az mPTP aktiválásához vezető tényezők: magas [Ca2+]m [130], szabadgyök-terhelés [131], ATP-hiány, a mitokondrium nagyfokú depolarizációja [1;132], extrém NADH-fogyás [125] és O2-hiány vagy ezek kombinációja [133]. Az
mPTP
kinyílása
irreverzibilis
és
a
membránpotenciál
végleges
megszűnéséhez, az organellum duzzadásához, apoptózishoz vezet. Ismertek azonban olyan megfigyelések is, melyek szerint a mPTP-nak lehet egy rövid ideig fennmaradó, kis konduktivitású, reverzibilisen nyitott állapota, amely intakt sejtekben is létrejöhet, s amely nem jár duzzadással és a citokróm c elvesztésével [134;135]. Amennyiben ez
19
valóban megtörténik, úgy, figyelembe véve az elektrokémiai grádienst, a mPTP-on keresztül leginkább ionfelvétel történhet. Ezen folyamat jelentősége ellen szól azonban az az általános megfigyelés, mely szerint RuR jelenlétében nem történik Ca2+ felvétel az organellumba (pedig ez a gátlószer az mPTP-t az alkalmazott koncentráció-tartományaban nagy valószínűséggel nem gátolja [133]), ill., hogy cyclophilin D hiányában a Ca2+ felvétel nem csökken intakt mitokondriumba [124].
A mitokondriális Ca2+ felvétel intakt sejten belüli tényezői. A mikrodomén elmélet. A szuszpenzión végzett korai kísérletek a mitokondriális Ca2+ felvételi folyamatot egyöntetűen alacsony affinitásúnak mutatták, ti. az EC50 a 10-5 M-os [Ca2+] tartományba esett. Ennek ismeretében a ’80-as évek közepére elfogadottá vált, hogy a mitokondriális Ca2+ felvétel fiziológiás körülmények között nem jön létre, csak ún. Ca2+ „túlterhelés” esetén, amikor a [Ca2+]c jóval a fiziológiás érték fölé emelkedik [72]. Annak ellenére vált ez a nézet elfogadottá, hogy ismert volt: a [Ca2+]m emelkedése 3 kulcsfontosságú enzim (a piruvát-, citrát- és 2-oxoglutarát-dehidrogenáz) aktivitását fokozza [38;136]. Ezzel összhangban intakt sejtekben a citoplazma Ca2+-jelét a mitokondriális piridin-nukleotidok (NAD(P)H) redukciója párhuzamosan követte [34;96;137]. Végül sikerült a [Ca2+]m közvetlen mérésével egyértelműen igazolni, hogy a mitokondriális Ca2+ felvétel intakt sejten belül, fiziológiás körülmények között is megtörténik [138;139]. A Ca2+-jelet követő mitokondriális ATP-termelés fokozódásának kimutatásával [36] a mitokondriális Ca2+ felvétel könnyen értelmezhető, általános metabolikus jelentőséget is kapott. A szuszpenzión tapasztalt alacsony affinitás [13;42;73] és az intakt sejtben mégis létrejövő, metabolikus [36] és endokrin [34;96] funkciókban tényleges biológiai jelentőséget hordozó mitokondriális Ca2+ felvétel azonban továbbra is szembeötlő ellentmondást jelentett. Ezen ellentmondás feloldásának reményében született meg a „high Ca2+ microdomain”, röviden mikrodomén elmélet [140]. A „high Ca2+ microdomain” (HCMD) az a szűk (< 100 nm) tér, amely a mitokondrium és a Ca2+ forrás (ER-membrán vagy plazmamembrán) között helyezkedik el, s melyben a Ca2+ felszabadulás vagy beáramlás alatt a [Ca2+] akár több nagyságrenddel meghaladja a [Ca2+]c átlagát (vagyis a citoplazma egészére jellemző, ún. „globális” [Ca2+]-t). Így rövid 20
ideig a lokális [Ca2+] a Ca2+ csatornák szájadékával szemben elhelyezkedő mitokondrium környezetében elegendően magas lehet az alacsony affinitású Ca2+ felvétel aktiválásához [141]. Ahhoz, hogy HCMD ténylegesen létrejöhessen, bizonyos fizikokémiai előfeltételeknek is érvényesülnie kell [141]. Ezek: a Ca2+ forrás és az OMM közötti kis tér; gyors Ca2+ felszabadulás; a felszabaduló Ca2+ elégségesen nagy mennyisége; a citoplazma nagy Ca2+-pufferkapacitása és emiatt a Ca2+ limitált diffúziója. Ha ezek érvényesülnek, akkor a Ca2+-csatornák szájadéka és a szemben elhelyezkedő membrán (OMM) között rövid ideig magas [Ca2+] jöhet létre [142], ez a magas [Ca2+] pedig a HCMD-re korlátozódik. A HCMD elmélet mára már általánosan elfogadott hipotézis, egészen az elmúlt évig azonban még nem állt rendelkezésre olyan metodika, melynek segítségével megbízhatóan és közvetlenül mérhető lett volna a [Ca2+] a HCMD-ben. Számos funkcionális és morfológiai adat azonban eddig is utalt a HCMD meglétére az ER- és a plazmamembrán-mitokondrium [143;144] kapcsolatban. Az eredeti megfigyelés szerint permeabilizált HeLa sejtekben a perimitokondriális [Ca2+] 3 µM fölé emelése kevésbé volt hatékony ingere a mitokondriális ionfelvételnek, mint az IP3 hatására létrejött, 1 µM alatti citoplazma jelek [140]. Eszerint IP3-inger alatt tehát a perimitokondriális [Ca2+] meghaladhatta a 3 µM-t, annak ellenére, hogy a [Ca2+]c 1 µM vagy az alatti maradt. Permeabilizált RBL-1 sejteken pedig az IP3 által kiváltott Ca2+ jel nagyságrenddel hatékonyabb ingere volt a [Ca2+]m emelkedésnek, mint a Ca2+ pufferrel
kiváltott
összemérhető
[Ca2+]c
emelkedés
[145].
Permeabilizált
szívizomsejtekben Ca2+ pufferekkel (EGTA, BAPTA) a RyR-on keresztül kiváltott [Ca2+]c emelkedés nagymértékben csökkenthető volt, eközben a [Ca2+]m változatlan maradt [146;147]. A mikrodomén funkcionális jelentőségére pedig olyan megfigyelések utaltak, melyek a mitokondriális anyagcsere hatékonyabb fokozását mutatták IP3 által kiváltott Ca2+ jelek esetében mint a plazmamembránon keresztüli Ca2+-beáramláskor (azonos [Ca2+]c-k mellett) [148]. Több próbálkozás történt megfelelően irányított („targetált”) Ca2+-érzékeny fehérjékkel a Ca2+ csatornák közelében, tehát a potenciális HCMD-ben létrejövő [Ca2+] mérésére. Raktárszabályzott Ca2+ beáramlás során a plazmamembrán alatt a globális [Ca2+]c-t jóval meghaladó, több 10 µM-os [Ca2+] volt mérhető vaszkuláris simaizom
21
sejtekben [149] és HEK-293 sejtekben [150]. (Azt mindenesetre meg kell említeni, hogy, hasonló metodikával mérve, több sejttípusban a plazmamembrán alatt mért [Ca2+] alig néhány 10-100 nM-lal haladta csak meg a globális [Ca2+]c-t [151;152].) A mikrodomén elmélet alapján tehát a Ca2+-forrás és a mitokondrium között szoros funkcionális kapcsoltság van. A funkcionális kapcsoltság morfológiai hátterét az jelenti, hogy az ER és a mitokondrium közötti tér kicsi, behatárolt. Az régóta ismert, hogy az ER bizonyos frakciója koszedimentálható a mitokondriummal [153], a térbeli közelséget (10-100 nm) azonban mikroszkópos technikákkal is sikerült kimutatni. Míg lézer konfokális [154] és elektrontomográfiás vizsgálatok [155] gyakorlatilag csak megerősítették a ’70-es években elektronmikroszkópiával már leírt ER-mitokondrium „összefekvéseket” [156], addig az ER és a mitokondrium közötti elektrondenz „kapcsok” kimutatása [65;157] már specifikus horgonyzó fehérjék szerepének lehetőségét is felvetette a HCMD stabilizálásában. Az ER és mitokondrium közötti „fehérjehorgonyok” megléte szoros, tartós, akár kovalens kapcsolatot is jelenthet, mely a HCMD morfológiai előfeltétele lehet [141;157]. Eddig a grp75 hősokk fehérjéről [158], a mitofusin-2-ről (homodimerként vagy mitofusin-1-gyel heterodimerként) [159], és egy multiproteinkomplexről (Mmm-1/Mdm-10/Mdm-12/Mdm-34) [160] mutatták ki, hogy a két organellumot egymáshoz horgonyozzák. Érdekesség, hogy az Alzheimer-kórban leírt tau mutáció (P301L) hatására a mutáns tau fehérje felhalmozódik az ER-membránban és az ER-mitokondrium „összefekvések” kiterjedése drasztikusan megnő [161]. Az ER és mitokondrium egymástól vett távolságának szabályzása azonban nemcsak
horgonyzófehérjéken
keresztül
valósulhat
meg.
Az
organellumok
a
mikrotubuláris (mitokondrium) és aktin-citoszkeletális (ER) hálózathoz vannak kapcsolva, egymáshoz való térbeli viszonyuk dinamikusan változik [162]. A térbeli viszonyuk szabályozásában már több fehérje szerepét igazolták. Ilyen a DLP-1 [163], az AMFR [164] vagy a PACS-2 és a BAP-31 [165]. Mivel az organellumok közötti térbeli viszony befolyásolja a kettejük közötti Ca2+ mozgásokat is [33;166], a fenti fehérjék egyben a mitokondrium Ca2+ anyagcserére is hatással vannak, feltehetőleg a HCMD kiterjedésének és életidejének szabályzásán keresztül [167]. Számos funkcionális és morfológiai megfigyelés szól a HCMD mellett, ennek ellenére számos kísérletes adat nem egyeztethető össze a HCMD-nel. Nem minden
22
esetben van szükség HCMD-re a mitokondriális Ca2+ felvételhez, néhány sejttípus mitokondriuma különösen érzékeny a [Ca2+] emelkedésére. A RaM során például a Ca2+pulzusok sokszor 200 nM alattiak és mégis van nettó mitokondriális Ca2+ felvétel [106]. Glomerulóza és luteális sejtekben a lassan kialakuló, még a 200 nM [Ca2+]c-t sem meghaladó raktár mediált Ca2+ jelek során a [Ca2+]m jól mérhetően emelkedik, ami a mitokondriális piridin nukleotidok fokozott redukcióját is kiváltja [34;168]. Vaszkuláris simaizomban pedig a mitokondriális Ca2+ felvétel hozzájárul a citoplazma jel módosításához még az alacsony szubmikromoláris [Ca2+]-tartományban is [169]. Permeabilizált luteális és INS-1 inzulinoma sejtek mitokondriuma is képes az alacsony, néhány száz nM-os [Ca2+]-emelkedésre válaszolni [107], ráadásul az intakt sejt citoplazmájában jelen lévő, a Ca2+ felvételt fokozó tényezők (taurin, spermin, [84;170]) hiányában is. Hasnyálmirigy β-sejtekben a mitokondriumok szubsztráttal kiváltott hiperpolarizációja a [Ca2+]m emelkedését váltja ki [171], ilyen esetben pedig nincs is Ca2+ jel, ergo HCMD sem elképzelhető. Ugyanakkor Ca2+ jel során a subplazmalemmális és perimitokondriális térben, tehát a potenciális HCMD-ben a [Ca2+] nem feltétlen éri el az elmélet által jósolt több 10 vagy éppen több 100 µM-os értéket [151;152;172].
A felhasznált modellsejtek és a megválaszolandó kérdések Kísérleteink túlnyomó részét NCI-H295R humán immortalizált adrenokortikális sejten végeztük. Erre a sejttípusra több okból esett a választásunk: i) Endokrin sejttípusról van szó, és érdekes módon az endokrin vagy endokrin-eredetű sejtek mitokondriuma különösen érzékeny a [Ca2+] emelkedésére [107;168]. ii) Szteroidtermelő sejt lévén, a mitokondrium Ca2+ felvétele nemcsak a sejt metabolikus aktivitását szabályozza, hanem egy sejtspecifikus, fiziológiás funkciót, a hormontermelést is [18;173]. iii) Képes IP3mediált, raktárszabályzott és feszültségfüggő Ca2+ csatornán keresztül kiváltott Ca2+ jeleket is létrehozni, így a különböző eredetű Ca2+ jelek mitokondriális hatása összevethető. iv) Tónusos és gyors, akut stimulusokra is képes hormontermeléssel válaszolni: az extracelluláris [K+] emelkedése és az angiotenzin II is Ca2+ jelet vált ki és fokozza a hormontermelést [174;175]. v) Immortalizált modell birtokában nincs szükség kísérleti állatokra.
23
H295R sejtben (akárcsak primer megfelelőjében, a glomerulóza sejtben) a citoplazma Ca2+ jelének több lehetséges forrása is van [18]. A Ca2+ mobilizáló hormon AII IP3-képzésen keresztül a belső raktárakból szabadítja fel az iont. Ilyenkor a citoplazma Ca2+ jel elején az ion forrása tehát elsődlegesen az endoplazmás retikulum, ugyanakkor a raktárak [Ca2+]-jának csökkenése kiváltja a raktárszabályozott, vagy más néven kapacitatív Ca2+ belépést is. Emellett a belső raktárakból történő Ca2+ felszabadulás képes a ryanodin-receptorok aktiválására is, melyek ugyancsak Ca2+ kiáramlást okozhatnak az ER-ból; bár ezen receptorok szerepe a Ca2+ jelben patkány glomerulóza és H295R sejtben valószínűleg elhanyagolható. Az AII-vel ellentétben az extracelluláris [K+] emelkedése során fellépő citoplazma Ca2+ jel forrása teljes egészében az extracelluláris folyadék: a [K+]-emelkedés által kiváltott depolarizáció mind a T-, mind az L-típusú Ca2+ csatornákat aktiválja [18]. A H295R sejtben tehát akár 3 különböző eredetű citoplazma Ca2+ jel (IP3-mediált, kapacitatív és feszültségfüggő) mitokondriális hatásainak összehasonlító vizsgálata is lehetséges. (A glomerulóza sejtek Ca2+ anyagcseréjének részletes leírása a [18] összefoglaló munkában megtalálható.) A TIRF mikroszkópiát alkalmazó kísérleteinkben szavannacerkófból származó fibroblaszt sejtvonalat, a COS-7 sejtet használtuk (ATCC hivatkozási szám: CRL-1651). A sejtvonal előnye ezen kísérletekben többek között az volt, hogy − szemben a H295R sejtekkel − a COS-7 sejtek nagy hatékonysággal transzfektálhatóak [182, 193], így a mérésekhez szükséges rekombináns fehérjék expressziója könnyen megoldhatónak bizonyult. Emellett a COS-7 sejt általánosan használt modell a kapacitatív Ca2+ belépés vizsgálatában [193], így saját eredményeinket nagy irodalmi háttéradattal vethettük össze. A Mg2+ mitokondriális hatásainak vizsgálatakor a humán embrionális vesesejtek immortalizálásával létrehozott HEK-293T vonalat használtuk (ATCC hivatkozási szám: CRL-11268). Ezen sejtek gyorsan és nagy mennyiségben szaporíthatóak, lipidalapú reagensekkel gyakorlatilag 100%-osan transzfektálhatóak, s így ideálisak luminometriás mérésekhez, ahol a lumineszcens fehérje nagy mennyiségű expressziójára van szükség nagy sűrűségben tényészhető sejtekben. Ezen sejtvonalak ideálisnak mutatkoztak az olyan kérdések vizsgálatára, melyek a HCMD és a mitokondriális Ca2+ felvétel kapcsán az irodalomban aktuálisak voltak munkám kezdetén. Kis vagy nagy affinitású folyamat-e a Ca2+ felvétel? Milyen tényező
24
vagy tényezők magyarázhatják a sejttípusok közötti nagy különbségeket? Egyetlen mechanizmus felelős-e a kicsi és nagy Ca2+ jelek mitokondriális felvételéért? Kimutatható-e HCMD olyan esetekben, ahol a Ca2+ felvétel mikrodomén nélkül is létrejöhet? Ilyen kérdések merültek fel az irodalom és saját laborunk korábbi munkái nyomán, kísérleteinket ezen kérdések mentén kezdtük meg.
25
Célkitűzések Kísérletes munkám célja a következő kérdések megválaszolása volt: 1) Egyedüli módja-e a Ca2+ felvételnek a HCMD-en keresztüli ionfelvétel? 2) Ha nem, kimutatható-e HCMD-függő és -független mitokondriális Ca2+ felvétel ugyanabban a sejtben? 3) Ha létrejön HCMD-függő és -független Ca2+ felvétel is, akkor milyen tér- és időbeli, ill. egyéb tényezők hozzák létre a kettő közötti különbséget? 4) A fenti kérdések vizsgálatához célul tűztük ki fluoreszcens módszer kidolgozását a HCMD-függő és -független Ca2+ felvétel vizsgálatához intakt sejtben. 5) Van-e a mitokondriális Ca2+ felvétel affinitásában különbség sejttípusok között ugyanazon, jól szabályzott körülmények között? 6) A sejt foszforilációs állapota hatással van-e a mitokondriális Ca2+ felvételre? 7) Ha igen: i. Mely fehérjék vesznek ebben részt? ii. Milyen támadásponton hatnak ezen fehérjék? 8) A citoplazma [Mg2+]-ja hatással van-e a mitokondriális Ca2+ felvételre? 9) Ha igen, van-e intakt sejtben olyan [Mg2+]-változás, melynek szerepe lehet a Ca2+ felvétel szabályozásában?
26
Módszerek A kísérletekben használt módszerek részletes bemutatása meghaladja a dolgozat kereteit. Itt csak rövid áttekintést adok a felhasznált technikákról, azok részletesebb leírása a dolgozathoz csatolt cikkek különlenyomataiban megtalálható, továbbá az Eredmények rész megfelelő helyein a metodikára vonatkozó referenciákat is megadom.
Oldatok Az intakt sejteken végzett kísérletek során az extracelluláris folyadék (ha az Eredmények részben ezt máshogy nem írom) Krebs-Ringer oldat volt a következő módosításokkal: 3,6 mM K+, 1,2 mM Ca2+, 0,5 mM Mg2+, 5 mM Hepes és 2 mM HCO3(pH 7,4). A sejtek fluoreszcens festékekkel történő töltése („loading”) ugyanilyen oldatban, de 10 mM Hepes jelenlétében, 25 °C-on történt. Néhány kísérletben Ca2+ mentes extracelluláris oldatot használtunk, ezek Ca2+ hozzáadása nélkül, 0,5 mM EGTAval készültek. (Amennyiben Ca2+ és Mg2+ mentes oldatot használtunk 0,5 mM EDTA-val kötöttük meg a bivalens kationokat.) A citoszol-jellegű oldat összetetele (mM-ban megadva): KCl (117), NaCl (6), KH2PO4 (1), MgCl2 (1,13), K-Hepes (10), Na-piruvát (2), Na-szukcinát (2), K-ADP (2), K-EGTA (2); pH 7,1. A HEK-293T sejteken végzett kísérletekben a citoszol oldat Hepes helyett 10 mM MOPS+-t tartalmazott pufferként, a pH 7,2 volt. Amennyiben ezen oldatoktól eltértünk, azt az Eredmények részben megírom. A citoszol oldat [Ca2+] és [Mg2+]-ját a Chelator program [176] segítségével számolt puffer-, Ca2+- és Mg2+mennyiség felhasználásával állítottuk be. Az oldatok [Ca2+]-ját Ca2+-elektródával és/vagy Fura-2 szabad sav festékkel ellenőriztük. A sejtek permeabilizációját 10 percig, a fent megadott citoszol-jellegű oldatokban, 25 °C-on, 25 µg/ml digitonin felhasználásával végeztük. A külső mitokondriális membrán roncsolásához hipozmotikus (kb. 15 mOsm) oldatot használtunk, melynek összetétele (mM-ban): Na-piruvát (1), Na-szukcinát (1), KADP (1), KH2PO4 (1), EGTA (1), MOPS (2), MgCl2 (1,21); a pH 7,1 volt. A
27
rekombináns, hasított („trunkált”) Bid fehérje törzsoldata 37 µM koncentrációjú volt, összetétele pedig: 25 mM HEPES, 0,2 mM ditiotreitol, 1% oktil-glikozid, 100 mM NaCl és 30 v/v % glicerin (pH 7,5). (A kísérletekben ez az oldat higult ezerszeresre.) A széles körben használt, kereskedelmi forgalomban kapható oldatok (DMEM, HAM, OPTI-MEM stb.) összetételét itt nem adom meg, ezek könnyen hozzáférhetőek.
A H295R és HEK-293T sejtek tenyésztése és transzfekciója A H295R humán adrenokortikális sejtek eredeti izolálását W. E. Rainey végezte ([175]; ATCC hivatkozási szám: CRL-2128). A sejteket DMEM/Ham’s F12 (1:1 v/v) oldatban tenyésztettük, mely tartalmazott: 1% ITS+-t, 2% UltroSer G szintetikus szérumot, 100 U/ml penicillint és 100 µg/ml streptomycint. A 4-25 közötti passzázsokat használtuk. A sejteket konfokális mikroszkópos és epifluoreszcens mérésekhez hozzávetőlegesen 2 x 104 sejt/fedőlemez (5 cm2), Western-blot analízishez kb. 105/9,5 cm2 sűrűségben tenyésztettük. A sejtek tranziens DNS- és siRNS-transzfekcióját OPTIMEM oldatban Lipofectamine 2000 reagenssel (1 µl/ml) végeztük 4-6 órán át. Transzfekció után 2-3 nappal végeztük a kísérleteket. A HEK-293T sejteket (ATCC hivatkozási szám: CRL-11268) un „magas glükóz” DMEM oldatban tenyésztettük, az oldat tartalmazott: 1 mM piruvátot, 26,2 mM bikarbonátot, 25 mM glükózt, 90 ml/l FBS-t, 90 U/ml penicillint és 90 µg/ml streptomycint. A 4-25 közötti passzázsokat használtuk méréseink során. Luminometria során 8 x 104/lyuk, konfokális mérésekkor 6 x 104/fedőlemez sejtet használtunk. Transzfekciókor (4-6 h) Lipofectamine 2000 (5,7 µl/ml) reagenst és OPTI-MEM oldatot használtunk. Transzfekció után 2-3 nappal végeztük a méréseket. A kísérletekben felhasznált rekombináns fehérjék és a transzfekciókor fedőlemezenként alkalmazott DNS-mennyiség a következő volt: i) ER-hoz irányított GFP (ER-GFP, [177]) 1 µg; mitokondriumba irányított inverz Pericam (mt-inv-Pericam, [178]) 1 µg; mitokondriumba irányított GFP-hez kapcsolt aequorin ([179]) 1,4 µg; GFPhez kapcsolt citoplazmatikus luciferáz [179;180] 1,4 µg. A felhasznált kis interferáló RNS-ek (siRNS) és a kontrollként használt duplaszálú RNS-ek koncentrációja minden esetben 25 nM volt; a transzfekcióhoz Lipofectamine 2000 (1 µl/ml) reagenst és OPTI28
MEM oldatot használtunk 4-6 órán keresztül. A p38 MAPK ellenes siRNS keverék a humán p38 MAPKα cDNS 303-718 bázispárjai ellen készült. Néhány kísérletben az Invitrogen cég validált, ellenőrzött siRNS-ét használtuk a p38 MAPK gén csendesítésére. Mindkét siRNS hatékonyságát immuncitokémiai módszerrel ellenőriztük. A HeLa, COS-7 és primer patkány glomerulóza sejtek tenyésztése, izolálása és transzfekciója a már korábban leírtaknak megfelelően történt: [181-183].
Konfokális mikroszkópia A konfokális mikroszkópos méréseket a Zeiss cég LSM510 lézer konfokális pásztázó mikroszkóp rendszerével, 40×/1,3 és 60x/1,6 olaj immerziós objektívekkel (Plan-Neofluar, Zeiss) végeztük. Minden kísérleti adatot később „off-line”, az LSM510 Image Examiner szoftver segítségével elemeztünk. A sejteket kísérlet alatt egy gravitációs elven működő, szolenoid kapcsolóval szerelt szuperfúziós rendszerrel láttuk el friss oldattal, az oldatcseréket is ezzel a rendszerrel kiviteleztük (áramlási sebesség: 1 ml/perc). Ha máshogy nem írom az Eredmények részben, a kísérleteket 37 °C-on végeztük, a hőmérséklet stabilizálását az oldatok és a tárgyasztal melegítésével értük el. A TMRE kivételével minden fluoreszcens festéket acetoxi-metilészter (AM) formában juttattunk a sejtbe [184]. A festékek töltési ideje, amennyiben máshogy nem jelzem, 15 perc volt. Ha a fluoreszcencia értékeket koncentrációra számoltuk át, a Grynkiewicz és munkatársai által leírt formulát használtuk [185]. Ha másképp nem jelzem, a fluoreszcencia értékeket (F) a stimuláció előtt mért értékre (Fo) normalizáltuk. A méréseket 2-6 µm széles konfokális térrészben, 0,2-50 Hz időbeni feloldással végeztük. A citoplazma [Ca2+] ([Ca2+]c) mérésére Fluo-4 vagy FuraRed festékeket használtuk. Mivel a citoplazma és a nukleoplazma [Ca2+]-változásai az általunk használt sejtekben amplitúdójukban és kinetikájukban hasonlóak ([179;186;187] és nem közölt adat) a [Ca2+]c-t a sejtmagban mértük. Az alkalmazott festéktöltési koncentrációk, excitációs, valamint emissziós hullámhosszak a következők voltak: Fluo-4: 1-5 µM, 488 nm és 500-500 nm; FuraRed 5 µM, 488 nm és 650 nm felett. (Néhány kísérletben a citoplazmában nyomokban visszamaradt Rhod-2-vel követtük a [Ca2+]c-t. Mivel a
29
nukleoplazmában a fluoreszcens festékek dinamikus tartománya nagy [188], a sejtmagban lévő Rhod-2 alkalmas a [Ca2+]c követésére [187].) A mitokondriális [Ca2+] ([Ca2+]m) mérését Rhod-2 fluoreszcens festékkel vagy mitokondriumba irányított inverz Pericam (mt-inv-Pericam) rekombináns fehérjével végeztük. A Rhod-2 pozitív töltésénél fogva a negatívan töltött mitokondriumban dúsul és így alkalmas a [Ca2+]m szelektív mérésére. A mt-inv-Pericam egy zöld fluoreszcens fehérje-származék, C-terminális részére helyezett irányító szekvenciának (a humán citokróm c oxidáz targetáló szekvenciája) köszönhetően szelektíven a mitokondrium mátrix [Ca2+]-ját méri [178;189]. A Rhod-2 töltési koncentrációja, excitációs, valamint emissziós hullámhossza a következő volt: 3-6 µM, 543 nm és 565-615 nm. A mt-invPericam excitációs, valamint emissziós hullámhossza: 488 nm és 500-550 nm. A mitokondiális membránpotenciált a pozitívan töltött, lipofil, éppen ezért a mitokondriumban dúsuló fluoreszcens festékkel, tetrametil-rodamin-észterrel (TMRE) határoztuk meg. A festék a mitokondriális mátrix és a perimitokondriális tér között a Nernst-egyenletnek megfelelően oszlik meg. Egyes kísérletekben a mitokondriumok felett mért TMRE jelet normalizáltuk az ugyanezen sejtterületen a mitokondriumok depolarizációja után mért fluoreszcenciára. TMRE excitáció és emisszió: 543 nm, 565615 nm. A mérések során a sejteket 25 nM TMRE-vel töltöttük 30 percig szobahőmérésékleten (25 °C) standard extracelluláris oldatban, a festék a mérés teljes időtartama alatt jelen volt. A citoplazma [Mg2+]-t MagFluo-4 fluoreszcens festékkel mértük. A MagFluo-4 alacsony Ca2+ affinitása (22 µM) és nagy dinamikus tartománya alkalmassá teszi, hogy szubmikromoláris Ca2+ jelek mellett a [Mg2+]-t szelektíven mérjük. (A Mg2+ mérés szelektivitását kísérletesen is igazoltuk.) A fluoreszcencia értékek koncentrációra történő átváltását a konvencionális módszerrel végeztük: [185]. MagFluo-4 töltési koncentráció, excitációs és emissziós hullámhossz: 0,2 µM, 488 nm és 500-500 nm. Permeabilizált HEK-293T sejtek magplazma [Mg2+]-ját Magnesium Green fluoreszcens szabad savval mértük. (A Ca2+ okozta mérési hiba, az ún. átbeszélés elkerülésére ilyenkor 20 µM EGTA vagy BAPTA is jelen volt a citoszol jellegű oldatban.) Magnesium Green koncentráció, excitációs és emissziós hullámhossz: 1 µM, 488 nm és 500-500 nm.
30
Az UV-fotolízist is alkalmazó kísérletekben a HEK-293T sejteket 10 µM ortonitrofenil-EGTA-val [190] is töltöttük, a Ca2+ felszabadítását a sejt teljes területének 357 nm-es lézerrel történő 2-5 másodperces besugárzásával végeztük. A mitokondriális felvételi sebesség meghatározásához a [Ca2+]m görbék kezdeti lineáris szakaszát használtuk (1. ábra). A felvételi sebességnek az időegység alatt létrejött koncentráció- vagy normalizált fluoreszcencia-változást neveztük, a dimenziója így ∆nM/∆s (aequorin) vagy ∆F/Fo/∆s (Rhod-2), ill. ∆Fo/F/∆s (mit-inv-Pericam) volt.
50 µM
2.75
Fo/F (mt-inv-Pericam)
2.5
10 µM
2.25 2
5 µM 1.75 1.5 1.25
2 µM
1 0.75
1. ábra A mitokondriális Ca2+ felvétel kezdeti sebességének meghatározása Permeabilizált, mitokondriumba irányított inverz Pericam fehérjét kifejező HEK-293T sejtekben a perimitokondriális [Ca2+]-t 0 nMról megemelve mitokondriális Ca2+ felvétel jön létre. A görbéket a stimuláció előtti átlagos fluoreszcenciára normalizáltuk (Fo), kezdeti lineáris szakaszukra egyenest illesztettünk (pontozott vonalak). Az egyenesek meredekségét (∆Fo/F/∆s) tekintettük a Ca2+ felvétel kezdeti sebességét leíró paraméternek.
10 s
A mitokondriális [Ca2+] mérése fluoreszcens mikroszkópiával A mitokondriális Ca2+ felvételhez szükséges legkisebb [Ca2+]-t vizsgáló kísérletekben a [Ca2+]m-t mikrofluorimetriás eljárással követtük permeabilizált primer patkány glomerulóza, HeLa és H295R sejtekben. Ehhez inverz mikroszkóphoz (Zeiss, 40x/1,3 olaj imerziós objektív) szerelt monokromátoros, CCD-kamerával működő mikrospektrofluorimetriás rendszert (Photon Technology International) használtunk. Az adatokat „off-line” az ImageExaminer és Felix szoftverekkel elemeztük. A Rhod-2 excitációja 535 nm-en történt, emisszióját 605 nm-en mértük.
31
A mitokondriális [Ca2+] és citoplazmatikus [ATP] mérése luminometriával A [Ca2+]m méréséhez a HEK-293T sejteket (8 x 105/fedőlemez) polilizinnel fedett 12 mm átmérőjű tenyésztőedényben transzfektáltuk mitokondriumba irányított, GFP-hez kapcsolt aequorint [179] kódoló plazmiddal. A rekombináns fehérje irányító („targetáló”) szekvenciaként a humán citokróm oxidáz VIII első 31 aminósavát is tartalmazza [179]. A kísérleteket a transzfekció utáni 2-3. napon végeztük, standard extracelluláris médiumban 1 óra hosszan inkubáltuk a sejteket 1 µM vad típusú coelenterazinnal. A sejteket permeabilizáltuk (100 µg/ml digitonin 1 percig) majd Cairn luminométerrel detektáltuk a kibocsátott jeleket. A sejteket 37 °C-os citoszol oldattal szuperfundáltuk (1 ml/perc). A kísérlet végén a teljes aequorin mennyiségének meghatározásához a sejteket 0,1 mM digitonin és 10 mM CaCl2 tartalmú desztillált vízben lizáltuk. A lumineszcencia adatok koncentrációra történő átváltása a közölteknek megfelelően történt: [144;191]. A citoszol [ATP] méréséhez a sejteket GFP-hez kapcsolt luciferázt kódoló plazmiddal [179], az aequorinnál leírt módon transzfektáltuk. Az intakt sejtek lumineszcenciáját 1 mM luciferin jelenlétében, standart extracelluláris médiumban mértük (Cairn luminométer). A mérési adatokat az ingerlés előtti utolsó lumineszcencia értékre normalizáltuk (L/Lo).
Egyes sejtalkotók fluoreszcens jelölése A kísérletek egy részében szükség volt egyes sejtalkotók szelektív fluoreszcens jelölésére. Intakt sejtben a mitokondriumokat specifikus fluoreszcens festékkel, MitoTracker Deep Red-del (MTDR) jelöltük; némely esetben a ∆Ψ m-érzékeny TMRE szolgált a sejtalkotó jelölésére. A mitokondrium belső membránjának épségét calcein festékkel vizsgáltuk. A sejtek calcein-AM töltésekor a festék a mitokondriális mátrixba is bejut, de alapvetően a citoplazmát jelöli. Digitoninos permeabilizációkor azonban a sejtben maradt festék a mitokondrium mátrixot jelöli mindaddig, míg a mitokondriális belső membrán intakt marad [134]. Alkalmazott koncentrációk, excitációs és emissziós
32
hullámhosszak: MTDR: 200 nM, 633 nm és 650 nm felett (töltési idő 30 perc); TMRE: lásd fent; calcein: 5 µM, 488 nm és 500-500 nm. Az endoplazmás retikulum jelöléséhez az ER külső felszínéhez irányított zöld fluoreszcens proteint (ER-GFP) használtuk. A megfelelő lokalizáció eléréséhez az élesztő ubikvitin-konjugáz 6 enzim C-terminális ER-lokalizációs szekvenciája (MVYIGIAIFLFVGLFMK) volt a GFP C-terminális részéhez egy rövid összekötő (NSRV) segítségével fuzionálva. (A rekombináns fehérjét Dr. Várnai Péter hozta létre [177].) A megfelelő lokalizációt ellenőrzendő, az ER-GFP-t expresszáló sejteket endoplazmás retikulum jelölő vörös fetékkel (ER Tracker Red-del) is töltöttük és a kolokalizációt előkísérletben ellenőriztük. A ER-GFP excitáció 488 nm-en, az emisszió mérése 500-500 nm-en történt. Az ER-GFP-t kifejező sejtekben, ha egy tetszőleges sejtrészben megmérjük a GFP fluoreszcenciáját, az érték arányos lesz az ER axiális, vagyis a „mélységi”, a konfokális sík feletti vagy alatti irányban vett távolságával (2. ábra). Ebben a mérési térrészben (ún. region of interest vagy ROI) tehát a GFP fluoreszcencia az ER távolságát jellemző
paraméter,
melyet
egyes
kísérletekben
a
mitokondrium
és
ER
kolokalizációjának jellemzésére használtunk.
ROI 1
mito
ROI 2
mito
ROI 3
mito
2. ábra Az endoplazmás retikulum távolságának mérése ER-GFP segítségével Endoplazmás retikulumhoz irányított GFP (ER-GFP, zöld), mitokondriumban dúsuló Rhod-2 (piros), nagy mikroszkópos nagyítás és vékony konfokális réteg (nyíl) használatával lehetséges kis térrészben (ún. ROI-ban) a [Ca2+]m és az ER-távolság egyidejű mérése. Ezen térrészben mért GFP fluoreszcencia az endoplazmás retikulum közelségével lesz arányos: ha a mitokondriumot tartalmazó ROI-ban az ER is megtalálható (ROI 1) a GFP fluoreszcencia értéke nagy lesz. Ha az ER a ROI „alatt” vagy „fölött”, de nem a kérdéses fókuszsíkban helyezkedik el (ROI 3), a GFP fluoreszcencia az ER távolságának növekedésével csökken. Tehát a ROI-ban mért zöld fluoreszcencia az ER z síkban vett közelségének mérőfoka lesz.
33
Western-blot és immuncitokémia Western-blot analízishez 60-80 ezer H295R sejtet használtunk. A passzálás utáni 3. napon történtek a kísérleti beavatkozások, ezeket 37 ºC-on végeztük. Az ingerlés leállításához a sejteket jégre helyeztük, lízisüket az alábbi 4 ºC-os oldattal végeztük: 100 mM NaCl, 30 mM HEPES, 1% Triton X-100, 20 mM NaF, 2,5 mM Na-EGTA 10 mM benzamidin, 1mM Na-EDTA, 0,1 U/ml Aprotinin, 1:100 „Emlős Proteáz Inhibitor Keverék”, 1:100 Foszfatáz Inhibitor Keverék, 1 mM diizopropilfluoro-foszfát, 1mM Na+ vanadát és 1mM PMSF; pH 7,4. Az oldott lizátumot 96 ºC-on főztük 15 percig, majd 10%-os SDS gélen futtattuk. Az immunreaktivitást nyúl anti-p38 MAPK (1:1000) és antifoszfo-p38 MAPK (1:1000) antitestekkel, majd kecskéből származó nyúl IgG-ellenes, tormaperoxidázzal konjugált antitestekkel (1:5000) vizsgáltuk. Az immunreaktivitás mértékét denzitometriával számszerűsítettük. Immuncitokémiai vizsgálathoz üveglemezre tapasztott 20-30 ezer H295R sejtet ER-ba irányított GFP-t kódoló plazmiddal és p38 MAPK ellenes siRNS-sel vagy kontroll duplaszálú RNS-sel transzfektáltunk. A sejteket a transzfekció utáni 2-3. napon használtuk
fel.
A
fixálást
4%-os
paraformaldehiddel
végeztük
25
percig
szobahőmérsékleten standard foszfát-pufferelt oldatban (PBS). A sejteket mostuk (100 mM glicin PBS-ben), majd 0,1 % Triton X-100 tartalmú 1% FCS-t is tartalmazó PBS oldatban 20 percig permeabilizáltuk. Az elsődleges antitestet a megfelelő higításban (1:50) egy napig, 4 °C-on 1% FCS-tartalmú PBS oldatban alkalmaztuk. A másodlagos antitestet (Alexa-563 konjugált) 25 °C-on ugyanezen oldatban 1 óráig alkalmaztuk. A p38
MAPK
immunreaktivitást
(Alexa-563-fluoreszcencia)
543
nm-en
történő
gerjesztéssel és az emittált fény 560 nm feletti detekciójával vizsgáltuk.
Statisztika Az adatok elemzéséhez Microsoft Excel, Statistica, Origin és SigmaPlot programokat használtunk. Az eredmények statisztikai feldolgozásakor egy- és kétmintás
34
t-próbát, faktoriális ANOVA-t, Mann-Whitney U-próbát és Tukey-féle post-hoc vizsgálatokat alkalmaztunk, a kísérleti felállásnak és az adatok jellemzőinek megfelelően. Ha azt másképp nem jelzem, minden adatot átlag + standard hiba formában adok meg. Ha az elemszám a kísérlet leírásában vagy az ábraszövegben nem található, akkor azt az oszlopokban feltüntetett számok adják meg.
35
Eredmények I. Különböző sejttípusok mitokondriális Ca2+ érzékenységének vizsgálata A mitokondriális Ca2+ felvétel affinitására vonatkozó adatok nagyfokú bizonytalanságot mutatnak az irodalomban, aminek egyik lehetséges oka a kísérleti felállások paramétereinek különbözősége az egyes laboratóriumok között. Ezért kívántuk összehasonlítani a nettó Ca2+ felvételhez szükséges perimitokondriális [Ca2+] határértékét több sejttípusban, megegyező körülmények között. A kísérletben a sejteket permeabilizáltuk, a mitokondriális Ca2+ felvételt a citoszol jellegű oldat [Ca2+]-jának emelésével váltottuk ki. Amint az a 3. ábrán látható, mind a primer patkány glomerulóza, mind a H295R sejtek képesek a perimitokondriális [Ca2+] 250 nM-ra történő emelésekor mitokondriális Ca2+ felvétellel válaszolni. A primer sejtek válasza gyorsabb és amplitúdója nagyobb. HeLa sejtek esetében mérhető mitokondriális Ca2+ válasz csak 1 µM-nál mutatható ki.
Rhod-2 fluoreszcencia (F/FO)
glomerulóza
3. ábra Az extramitokondriális [Ca2+] hatása a [Ca2+]m-re különféle sejttípusokban, permeabilizált sejten Patkány glomerulóza, H295R és HeLa sejtekben Rhod-2-vel mértük a [Ca2+]m változásait különböző perimitokondriális [Ca2+] hatására. A Ca2+ lépések a következőek voltak: 100-250-100-250-500 nM (glomerulóza); 0-100-250-1000 nM (H295R); 0100-250-1000-2500 nM (HeLa). Az egyes színek más-más sejtet jelölnek. idő (s)
36
Ezalapján kijelenthető, hogy szigorúan azonos körülmények között is fennállhat különbség a mitokondriális Ca2+ felvétel érzé kenységében sejttípus és sejttípus között. A korábbi irodalmi adatokkal [107;168] egybehangzóan ezen eredmények is igazolják, hogy az endokrin és endokrin-eredetű sejtek mitokondriuma akár 150 nM-os [Ca2+]emelkedésre is képes Ca2+ felvétellel válaszolni. Ehhez pedig nincs szükség HCMD-re.
A plazmamembrán alatti mitokondriumok raktárszabályzott Ca2+ belépés során
Ca2+
felvételének
vizsgálata
Ezen kísérletben COS-7 sejtben vizsgáltuk a mitokondriális Ca2+ felvételt a Ca2+ csatornáktól való távolság függvényében. (A méréseket dr. Spät András és dr. Balla Tamás végezte, én a kísérleti adatok elemzésében vettem részt.) A kísérletet ún. „total internal reflection”, TIRF mikroszkópiával végeztük, amely alkalmas nagyon vékony (kb. 100 nm) térrészben, közvetlenül a plazmamembrán alatti sejtterület vizsgálatára [192]. A sejtekben a kapacitatív Ca2+ belépésért felelős csatorna-komplexum egyik tagját, a STIM1 fehérjét [193] piros fluoreszcens fehérjével (mRFP) jelöltük [192], a [Ca2+]m-t a mitokondriumba irányított inverz Pericam (mt-inv-Pericam, zöld) rekombináns fehérjével [178] követtük. A belső Ca2+ raktárakat Ca2+-mentes extracelluláris oldatban, a szarkoendoplazmás retikulum Ca2+ ATP-ázt gátló thapsigarginnal [194] ürítettük ki. Ekkor a plazmamembránban megjelentek a jellegzetes, a raktárszabályzott csatorna-komplexum összeállását jelző STIM-1 „pöttyök” [195] (az angol nyelvű szakirodalomban „punctum”) (4. ábra). A plazmamembrán alatti 100 nm-es térben mitokondriumok is láthatóak voltak. A szubplazmalemmális mitokondriumok döntő többsége azonban nem kolokalizált a STIM-1-gyel: a kolokalizáció mértékét (a z-síkban) jelző Pearson-koefficiens (mely a teljes kolokalizációt jelző 1 és a teljes kizárást jelző -1 érték között változhat) -0,912 + 0,026 volt (n=5). A belső raktárak ürítése után 2 mM Ca2+ adásával váltottuk ki a kapacitatív Ca2+ belépést, és összehasonlítottuk a STIM-1-távoli és a STIM-1-gyel kolokalizáló mitokondriumok Ca2+ felvételét. (STIM-1-távoli mitokondriumnak a punctumtól 10 pixelnél távolabbi organellumot neveztük.) Sem a mitokondriális Ca2+ felvétel késésében, sem meredekségében nem találtunk különbséget a STIM-1-közeli és távoli organellumok között (4. ábra). Ezek alapján raktárszabályzott Ca2+ belépés alatt a
37
mitokondriumok döntő többsége nem a Ca2+ csatornák (STIM-1/Orai-1 komplex) közelében helyezkedik el, s a csatorna-közeli mitokondriumok Ca2+ felvétele nem
Pericam normalizált intenzitás (Fo/F)
különbözik az attól távoli organellumokétól. (A kísérleteket 25 °C-on végeztük.)
közeli távoli
idő (s)
4. ábra Szubplazmalemmális mitokondriumok Ca2+ felvételének vizsgálata COS-7 sejtben COS-7 sejtekben a raktárszabályzott Ca2+ belépésért felelős csatorna-komplexumot piros fluoreszcens fehérjével (mRFP-STIM-1; piros) jelöltük, a [Ca2+]m-t mt-inv-Pericam-mel (zöld) mértük. A mérést a plazmamembrán 100 nm-es környezetében, TIRF mikroszkópiával végeztük. A belső Ca2+ raktárak ürítését követően 2 mM Ca2+ hozzáadásával kapacitatív Ca2+ belépést és mitokondriális Ca2+ jelet váltottunk ki. A STIM-1 közeli (sárga nyíl és piros görbe) és STIM-1-távoli (fehér nyíl és zöld görbe) mitokondriumok Pericam fluoreszcenciáját a Ca2+ visszaadás előtti maximális és Ca2+ jel utáni minimális értékekre normalizáltuk. A görbék 4-4 mitokondrium átlagát és standard hibáját mutatják. Reprezentatív 5 sejtre.
Az ER-mitokondrium távolság hatása a mitokondrium Ca2+ felvételére intakt H295R sejtekben A HCMD elmélet alapján a Ca2+ forráshoz közeli mitokondrium Ca2+ jelének gyorsabbnak (nagyobbnak) kell lennie, mint az attól távoliénak. Hogy ezt igazoljuk vagy cáfoljuk a [Ca2+]m és az ER-mitokondrium távolság egyidejű méréséhez új fluoreszcens megközelítést alkalmaztunk. Az ER jelöléséhez a H295R sejteket az ER külső felszínéhez irányított zöld fluoreszcens proteint (ER-GFP) kódoló plazmiddal transzfektáltuk. (A megfelelő lokalizációt ellenőrzendő, az ER-GFP-t expresszáló sejteket ER Tracker Red-del is töltöttük és a kolokalizációt előkísérletben ellenőriztük (5. ábra)).
38
egyesített
5. ábra Az ER-GFP lokalizációja H295R sejtben Az ER-hoz irányított zöld fluoreszcens fehérjét (GFP) kifejező sejteket ER-Tracker-Red (piros) festékkel is töltöttük. A GFP megfelelő lokalizációját az egyesített kép sárga árnyalata jelzi.
A [Ca2+]m-t ezen kísérletben Rhod-2-vel mértük, s mivel ez a festék alacsony [Ca2+]m mellett gyengén fluoreszkál, nem feltétlenül jelöl minden mitokondriumot egy sejten belül. Ezért a sejt teljes mitokondrium populációját MTDR-del megjelöltük; néhány kísérletben pedig MTDR helyett a Ca2+ mérés után TMRE-vel, mitokondriumban dúsuló fluoreszcens festékkel jelöltük a teljes mitokondrium populációt (6. ábra). Ilyen fluoreszcens jelölések mellett, a megfelelő konfokális nagyítást alkalmazva nagyon kis térrészben („region of interest” ún. ROI-okban), akár individuális mitokondriumok [Ca2+]m-ja is vizsgálható. Az ugyanezen ROI-ban mért GFP-fluoreszcencia fordítottan arányos az ER axiális (z) síkban vett távolságával. Minél nagyobb az adott ROI-ban a GFP fluoreszcencia, az ER annál közelebb van, vagyis a GFP fluoreszcencia tekinthető az ER-mal való kolokalizáció mértékének. A)
TMRE
B)
GFP
idő (s)
egyesített
6. ábra Az mitokondriumok ER-hoz viszonyított lokalizációja H295R sejt-ben A) TMRE-vel töltöttük az ER-hoz irányított GFP-t (GFP) kifejező sejteket. A sejt mitokondrium populációjának nagy része kolokalizál az ER-mal, néhány, a sejt perifériáján elhelyezkedő organellum azonban ER-távolinak mutatkozik. B) A mitokondriumok AII-vel kiváltott jele függ az ER-tól való távolságuktól. A piros görbe az ER-mal kolokalizáló, a zöld azzal részlegesen átfedő, a kék pedig ERtávoli mitokondrium 1 nM AII-re (fekete vonal) adott Rhod-2 válaszát mutatja.
39
A H295R sejteket kétféle módon ingereltük: AII-vel (1 nM) IP3-mediált, az extracelluláris [K+] 3,6 mM-ról 15 mM-ra történő emelésével pedig feszültségfüggő Ca2+ belépést váltottunk ki. Az alapvonalra normalizált [Ca2+]m-görbék felhasználásával a Ca2+ felvétel sebességét jellemző kezdeti meredekséget értékeltük. A kezdeti meredekséget és a GFP fluoreszcenciát is normalizáltuk az adott sejtben mért legmagasabb GFPfluoreszcenciát mutató ROI-ban mért értékekre. Így tehát egy sejten belül a legnagyobb GFP fluoreszcenciájú ROI-ban található mitokondrium(ok) tekinthető(ek) az ER-hoz legközelebbinek. Ugyan H295R sejtben a mitokondriumok többsége kolokalizál az ER-mal, néhány, a sejt perifériáján elhelyezkedő mitokondrium ER-távolinak bizonyul (6. ábra). AII-vel kiváltott Ca2+ jel esetében a mitokondrium kezdeti Ca2+ felvételi sebessége szoros, szignifikáns összefüggést mutat az ER-mal való kolokalizáció mértékével (7. ábra).
Ca2+ felvételi sebesség
1,0
r=0.856, p=5*10-18
0,5
ER-kolokalizáció
0,0
0,5
1,0
7. ábra A mitokondriális Ca2+ felvételi sebesség az ER-tól való távolság függvényében AII-inger alatt ER-GFP-t kifejező sejtekben Rhod-2-vel mértük a [Ca2+]m-t igen kis mérési területben (ROI-ban) 1 nM AII-vel történő ingerlés során. A mért Ca2+ felvételi sebességet normalizáltuk az abban a sejtben legnagyobb GFP fluoreszcenciát mutató (ER-hoz legközelebbi) ROI-ban mért adatra. Egyben minden ROI-ban mért GFP fluoreszcenciát is normalizáltunk az adott sejtben legnagyobb GFP fluoreszcenciájú ROI-ra. Itt 18 sejt 59 mitokondriumának értékeit ábrázoltuk, 5 különböző preparátumból. A regressziós egyenes erősen szignifikáns: p=5*10-18.
Az AII-vel kiváltott jellel szemben a 15 mM K+-nal létrehozott, depolarizáción és feszültségfüggő Ca2+ belépésen alapuló Ca2+ jel során a mitokondriális Ca2+ jel nem 40
mutatott korrelációt az ER-távolsággal: a kezdeti Ca2+ felvételi sebesség homogénnek mutatkozott a teljes mitokondrium populációban (8. ábra). Ez megfelel a vártnak, hiszen a Ca2+ itt nem az ER-ból, hanem a plazmamembránon keresztül kerül a citoplazmába. K+ra adott Ca2+ jel esetében a plazmamembrán alatt elhelyezkedő mitokondriumok esetében lehet elképzelni a HCMD kialakulását [143]. Ezen lehetőség vizsgálatára calceinnel töltött sejtekben összehasonlítottuk a sejt belsejében lévő perinukleáris és a plasmamembrán közeli mitokondriumok Ca2+ jeleit. Amint azt a 9. ábra mutatja, H295R sejtben
csupán
néhány mitokondrium található
a sejt perifériáján,
közel a
plazmamembránhoz. Mindazonáltal nem volt különbség sem a [Ca2+]m-csúcs, sem pedig a [Ca2+]m-emelkedés kezdeti meredekségében a plazmamembrán közeli és perinukleáris
Ca2+ felvételi sebesség
Rhod-2 F/FO
mitokondrium populáció között (10. ábra).
idő (s)
8. ábra A mitokondriális Ca2+ felvételi sebesség az ER-tól való távolság függvényében K+ ingerlés alatt Az ER-hoz irányított GFP-t (GFP) kifejező sejtekben a [Ca2+]m-t Rhod-2-vel mértük. Felső grafikon: ER-mal kolokalizáló (piros, lila) és nem kolokalizáló (zöld, kék) mitokondriumok [Ca2+]-változása K+-os ingerlés (fekete vonal) során. Alsó grafikon: a K+-nal kiváltott Ca2+ jel során mért iniciális felvételi sebességet a 7. ábrán taglaltaknak megfelelően elemeztük és ábrázoltuk (alsó grafikon; n=14 mitokondrium 4 sejtből, 3 különböző passzázsból).
kolokalizáció az ER-mal
Az AII-vel nyert eredmények tükrözik a mitokondriális Ca2+ jel erős függését az ER-tól (ti. az IP3-receptortól) vett távolságtól, kompatibilisek a HCMD elmélettel. A K+inger során azonban a mitokondrium Ca2+ felvétele sem az ER, sem a plazmamembrán távolságától nem függ, minden bizonnyal HCMD-független módon jön létre.
41
9. ábra A mitokondriumok elhelyezkedése H295R sejtben A mitokondriumokat TMRE-vel (vörös), a citoplazmát calceinnel (zöld) jelöltük intakt sejtben. A mitokondriumok túlnyomó többsége perinukleárisan helyezkedik el (bal oldali skála=10 µm). A jobb oldali képen nagyobb nagyítással (jobb oldali skála=1 µm) látható a mitokondriumok és a plazmamembrán térbeli viszonya.
10. ábra A mitokondriális Ca2+ felvételi sebesség a plazmamembrán távolságának függvényében K+-os ingerlés alatt A felső képen mutatott Rhod-2-vel (vörös) és calceinnel (zöld) töltött sejten mértük a jelölt ROI-okban a [Ca2+]m változásait. Ezek normalizált görbéit az alsó grafikon mutatja. Sem a mitokondriális Ca2+ jel amplitúdója, sem pedig kezdeti meredekség tekintetében nem különböznek a plazmamembrán közeli és távoli mitokondriumok. (A görbék melletti számok jelzik, hogy melyik görbe melyik ROI-ból származik.) idő (s)
Az angiotenzin II mitokondriális Ca2+ felvételt gátló hatása Amikor a mitokondriális Ca2+ jel kezdeti meredekségét az ER-távolság függvényében ábrázoljuk és összevetjük az AII-vel és K+-nal nyert adatokat (11. ábra), érdekes jelenséget vehetünk észre: az ER-távoli mitokondriumok nagyobb sebességgel veszik fel a Ca2+-ot akkor, ha a Ca2+ jelet K+-os depolarizációval hozzuk létre. A két agonista azonban közel azonos globális [Ca2+]c-emelkedést vált ki, a hatásukra létrejött, a teljes mitokondrium populáción mért (globális) [Ca2+]m-emelkedés és a mitokondriális
42
Ca2+ felvételt hatékonyságát jelző [Ca2+]m/[Ca2+]c hányados is ugyanakkora (12. ábra). Az ER-tól távoli mitokondriumok tehát AII-vel történő ingerlés során ugyanakkora
Ca2+ felvételi sebesség
[Ca2+]c-nak vannak kitéve, Ca2+ felvételük mégis kisebb, gátolt.
11. ábra A mitokondriális Ca2+ felvételi sebesség az ER távolságának függvényében K+ és AII ingerlés alatt A sejteket először 15 mM K+-mal (kék) majd 1nM AII-vel (piros) ingereltük, az adatokat a 4. ábrán taglaltaknak megfelelően mértük és ábrázoltuk (n=14 mitokondrium 4 sejtből).
mito/cito
[Ca2+] (F/FO)
kolokalizáció az ER-mal
cito
12. ábra A globális citoplazma és mitokondrium Ca2+ jel amplitúdója, és a Ca2+ felvétel hatékonysága K+ és AII stimulus estén A [Ca2+]c-t Fluo-4, a [Ca2+]m-t Rhod-2 segítségével nagy, a sejt globális válaszát reprezentáló ROI-ban mértük. A sejteket vagy 15 mM K+-mal vagy 1nM AII-vel ingereltük. A jelek amplitúdóját ábrázoltuk. A Ca2+ felvétel hatékonyságát a mitokondriális és citoplazmatikus jel amplitúdójának hányadosa (mito/cito) jellemzi. (n= 14 (K+) és 11 (AII).)
mito
Ezek alapján tehát felmerül, hogy az AII, amellett, hogy citoplazma Ca2+ jelet hoz létre és ezzel mitokondriális Ca2+ jelet vált ki, egyidejűleg gátolja is a mitokondriális Ca 2+ felvételt. Ennek vizsgálatára intakt H295R sejtekben egyidejűleg mértük a [Ca2+]c-t (Fluo-4) és a [Ca2+]m-t (Rhod-2) raktárszabályzott Ca2+ belépés során. Ezt a következőképpen váltottuk ki: Ca2+-mentes oldatban a belső Ca2+ raktárakat kiürítettük a SERCA-gátló thapsigargin 10 perces alkalmazásával. Ezt követően az extracelluláris [Ca2+] 1,2 mM-ra emelésével hoztuk létre a raktárszabályozott (kapacitatív) Ca2+ beáramlást. A sejtek egy része a Ca2+ jel előtt 2 percig AII-t is kapott, ilyen körülmények között a hormon nem váltott ki Ca2+ jelet. Az AII-t is kapott csoportban a kapacitatív Ca2+ jel során a mitokondriális Ca2+ jel amplitúdója kisebb (p=3*10-6), a citoplazma Ca2+ jel pedig nagyobb volt (p=2*10-5), mint a kontroll csoportban (13. ábra). A 43
mitokondrium Ca2+ felvételének hatékonyságát kifejező [Ca2+]m/[Ca2+]c (mito/cito) hányados tehát nagyon erősen csökkent AII hatására (p=5*10-8; nem ábrázolt adat). Ezen adatok a mitokondriális Ca2+ felvétel AII általi gátlását mutatják.
Rhod-2 (F/FO)
Fluo-4 (F/FO)
10 8 + AII
6 4 2
10
20ss 20
0
8 6 + AII +AII
4 2
20 s
0
13. ábra Citoplazma és mitokondriális Ca2+ jel rekalcináció során A belső raktárak ürítése után rekalcináció (1,2 mM Ca2+, nyíl) során mértük a citoplazma (Fluo4) és a mitokondrium (Rhod-2) Ca2+ jelét. Az egyik csoportot a rekalcináció előtt 2 perccel 1 nM AII-vel kezeltük (szaggatott vonal). (Reprezentatív ábra, n=31 kontroll és 28 AIIkezelt sejt.)
Az AII H295R sejtben számos kinázt képes aktiválni [196;197]. Annak eldöntésére,
hogy
a
Ca2+
felvétel
gátlásának
kialakításában
van-e
szerepe
foszforilációnak, a szélesspektrumú foszfatázgátló okadánsavat használtuk [198]. (Az okadánsav a PP1 és PP2A típusú fozfatázokat gátolja.) Az okadánsavnak két hatása volt a mitokondriális Ca2+ felvételre: egyrészt csökkentette a mito/cito hányadost, vagyis a Ca2+ felvétel hatékonyságát (14. ábra), másrészt megszűntette a mitokondriális Ca2+ felvétel és az ER-mitokondrium távolság közötti szoros összefüggést (nem ábrázolt adat).
fluoreszcencia (F/Fo)
8
p=0.0029
p=0.034
6
3 14. ábra Az okadánsav hatása a citoplazma és a 2
4 1
2 0
OA
cito
OA
OA
0
mitokondrium Ca2+ jelére AII-vel ingerelt sejtekben A foszfatázgátló okadánsav (OA; 100 nM) hatását az AIIkiváltotta citoplazma és a mitokondrium Ca2+ jelek amplitúdójára Fluo-4 (zöld) és Rhod-2 (piros) festékekkel mértük. (n=31 kontroll és 28 okadánsavval kezelt sejt). A fekete oszlopokkal a Ca2+ felvétel hatékonyságát dimenzió nélkül jelző mitokondriális/citoplazma amplitúdó-hányadost (m/c) ábrá-zoltuk.
mito m/c
Összefoglalva tehát elmondható, hogy az AII gátolja a mitokondrium Ca2+ felvételét, méghozzá Ca2+ független jelátviteli úton: a belső Ca2+ raktárak kiürítése után, Ca2+ felszabadítás nélkül is érvényesül ez a hatás (13. ábra). A gátlás valószínűleg foszforiláción és nem defoszforiláción keresztül valósul meg.
44
A p38 MAPK szerepének vizsgálata A fenti eredmények alapján az AII jelátviteli rendszerében olyan elemeket kellett keresnünk, melyek H295R sejtben Ca2+ független módon is tudnak aktiválódni a hormon hatására, s melyek hatásukat foszforiláción keresztül fejtik ki. Egy ilyen, a H295R sejtben is kifejeződő kináz a p38 MAPK [196;199]. A p38 MAPK egyik gátlószeréről ráadásul ismert volt, hogy képes HeLa sejtben fokozni a mitokondrium Ca2+ felvételét [88]. Valóban, 1 nM AII hatására a foszfo-p38 MAPK szintje Western-blot analízis alapján mintegy két és fél szeres (2,5 + 1.02; n=3) emelkedést mutat már egy perc alatt is (15. ábra). Ez az aktivált állapot pedig 2-5 perc között is fennmarad (15. ábra és [200]) (4,5 + 1.06, ill. 5.00 + 1,21 szeres emelkedés; n=6-3). Rendszerünkben az AII 10-120 s időtartam alatt vált ki citoplazma Ca2+ jelet, tehát a p38 MAPK aktivációja megvalósulhat a Ca2+ jel kialakulása előtt. Fontos kiemelni, hogy, ellentétben az AII-vel, a K+-nal kiváltott citoplazma Ca2+ jel gyakorlatilag latencia nélkül jön létre (6. ábra B panel vö. 8. ábra felső diagramm), itt a Ca2+ jelet nem előzheti meg egyéb jelátviteli lépés. Ugyanakkor a K+ kiváltotta Ca2+ jel is képes a p38 MAPK mintegy 1 perc alatt
m
in
m in A
II
2
1 A II
c koon nttro ro l ll AI I3 0 s
aktiválni (15. ábra).
P-p38
P-p38 p38
K+ 1m in
in
in K+ 2m
m I2 AI
kco onnt trro olll
p38
15. ábra Az AII és K+ hatása a p38 MAPK foszforilációjára H295R sejtben Az egyes ingerlések után Wester-blot analízissel határoztuk meg kináz aktivációját jelző foszfo-p38 MAPK (P-p38) szintjét. A fehérjemennyiség ellenőrzésére a teljes p38 MAPK (p38) immunreaktivitást használtuk. (Három kísérletet reprezentáló blotok.)
45
A p38 MAPK szerepének igazolásához először farmakológiai megközelítést alkalmaztunk. A kináz gátlásához a piridinil-imidazol származék SB202190 (10 µM) farmakont használtuk, amely elsősorban a p38 MAPK α és β izoformáit gátolja, kevésbé hat a γ és δ izoformákra [201]. A [Ca2+]c-t Fluo-4-gyel, a [Ca2+]m-t Rhod-2-vel mértük AII-vel kiváltott Ca2+ válaszok esetében. A gátlószer hatására a citoplazma Ca 2+ jel csúcsa szignifikáns csökkenést mutatott, a mitokondriális Ca2+ jel amplitúdója megtartott maradt (16. ábra D panel). Ennek megfelelően a [Ca2+]m/[Ca2+]c hányados, vagyis a Ca2+ felvétel hatékonysága SB202190 hatására fokozódott (16. ábra D panel). A p38 MAPK gátlása továbbá -akárcsak a foszfatáz gátlás- megszűntette a mitokondriális Ca2+ felvétel
SB202190
SB202474 (inaktív)
PD169316
6.0
4.0
1.0
2.0
0.5
4.0 2.0 p=0.0001
0.0
0.5
1.0
8
0.0
(A)
p=0.011
p=0.0002
1.0
2
0.5
G cito
G
G
mito
m/c
1.0
(D)
0.0
(B)
0.5
1.0
kolokalizáció
8
1.0
6 4 2
(C)
0.5
G
G
G
cito
mito
m/c
mito/cito
6 4
0.5
kolokalizáció
mito/cito
fluoreszcencia (F/Fo)
kolokalizáció
fluoreszcencia (F/Fo)
Ca2+ felvételi sebesség
ER-mitokondrium távolságtól való függését (16. ábra A panel).
(E)
16. ábra A p38 MAPK gátlásának hatása az AII által kiváltott Ca2+ válaszra A, B és C panel: Az ER-mal való kolokalizáció (ER-GFP) mértéke és a mitokondriális Ca2+ felvételi sebesség (Rhod-2) közötti összefüggés gátlószerek jelenlétében, AII-inger alatt. (n=41 mitokondrium 11 sejtből, SB202190; 23 mitokondrium 7 sejtből, PD169316; 16 mitokondrium 4 sejtből, SB202474.) D és E panel: Az SB202190 (D) és SB202474 (E) hatása a citoplazma (Fluo-4) és a mitokondrium (Rhod-2) Ca2+ csúcsára és a mitokondrium/citoplazma arányra AII-ingerlés során. G= SB202190 a D panelen, SB202474 az E panelen. (n=9 kontroll és 17 AII kezelt sejt a D panelen; 14 kontroll és 10 AII kezelt sejt az E panelen.)
46
Ezen adatokat megerősítette továbbá az, hogy egy másik p38 MAPK gátlószer, az ugyancsak piridinil-imidazol származék PD169316 (10 µM) is hasonlóan eltűntette ezt a korrelációt (16. ábra B panel), ill. az SB202190 inaktív analógja, az SB202474 (10 µM) nem volt hatással sem az ER-távolság–Ca2+ felvétel összefüggésre, sem pedig a Ca2+ felvétel hatékonyságára (16. ábra C és E panel). A farmakológiai gátlás esetleges nem kívánt mellékhatásaimak elkerülésére a fenti eredményeket siRNS technikával is meg kívántuk erősíteni. Ehhez a H295R sejteket p38 MAPK-ellenes siRNS-sel és ER-GFP-t kódoló plazmiddal kotranszfektáltuk és a GFP-t kifejező sejteket tekintettük p38 MAPK csendesítettnek. Valóban, az ER-GFP-t kifejező sejtek p38 MAPK immunreaktivitása látványosan kisebb volt, mint a zöld fluoreszcenciát nem mutató sejteké (17. ábra bal oldali oszlop), jelezve a gén sikeres csendesítését. siRNS
kontroll RNS
kontrol festés
ER-GFP
α p38 MAPK
egyesített
17. ábra A p38 MAPK gén csendesítése siRNS technikával H295R setjben A sejteket egyidejűleg transzfektáltuk ER-GFP-t kódoló plazmiddal és p38 MAPK ellenes siRNS-sel (bal oldali oszlop) vagy nem csendesítő kontroll RNS-sel (középső oszlop). Az ER-GFP (zöld, felső sor) kifejeződését tekintettük a sikeres siRNS-transzfekció jelének. Fixálás után a p38 MAPK immunreaktivitását p38 MAPK ellenes antitesttel (α p38 MAPK; piros, középső sor) vizsgáltuk. Immunfestési kontrollként (jobb oldali oszlop) nem immunizált nyúl szérum IgG frakcióját használtuk, ezen sejteket nem kezeltük RNS-sel. A GFP fluoreszcenciát zöld színben tűntettük fel. (Reprezentatív 12 fedőlemezre 3 független kísérletből.)
47
A p38 MAPK gén csendesítése nem befolyásolta az AII-re adott citoplazma Ca2+ jel (nukleáris Rhod-2 fluoreszcencia intenzitás) amplitúdóját, viszont szignifikánsan növelte a mitokondriális Ca2+ (mitokondriális Rhod-2) csúcsot és – értelemszerűen − a Ca2+ felvétel hatékonyságát jelző mitokondrium/citoplazma hányadost is (18. ábra alsó panel). Érdekes módon az siRNS kezelés a Ca2+ felvétel–ER-kolokalizáció összefüggést nem eltűntette, hanem a visszájára fordította a kontroll körülmények között
Ca2+ felvételi sebesség
tapasztaltakhoz képest (18. ábra felső panelek). siRNS
kontrol
kontrol kontroll
1.0
siRNS
2.4 1.6
0.5
0.8 p=2*10-6
0.0
0.5
1.0
p=0.0006
0.0
0.5
1.0
p =10 -6 p=4*10
-4
12
3
8
2
4
1
0
S cito
S m ito
S m /c
mito/cito
fluoreszcencia (F/FO)
ER-kolokalizáció
18. ábra A p38 MAPK gén csendesítésének hatása az AII hatására létrejövő Ca2+ jelben A két felső panel az ER-kolokalizáció (ERGFP) és Ca2+ felvételi sebesség (Rhod-2) összefüggést mutatja p38 MAPK ellenes siRNS és kontroll RNS kezelést követően, AII-vel ingerelt sejtekben. (n=18 mito/6sejt siRNS; 27mito/8sejt kontroll.) Az alsó panel a globális citoplazma (nukleáris Rhod-2), a globális mitokondriális jel (mitokondriális Rhod-2) Ca2+ amplitúdóját és a kettő arányát (m/c) mutatja. (n=20 siRNS kezelt és 25 kontroll sejt.)
0
A mitokondriális Ca2+ jel p38 MAPK-on keresztüli gátlása elméletileg két módon jöhet létre: egyrészt a Ca2+ felvétel gátlásán, másrészt a Ca2+ leadás fokozásán keresztül. Hogy a kettő közül melyik valósul meg, azt permeabilizált sejten, a mitokondriális Na+/Ca2+ kicserélőt gátló clonazepam (100 µM; [202]) jelenlétében, Rhod-2 ([Ca2+]m) segítségével vizsgáltuk. A perimitokondriális [Ca2+] 100 nM-ról 1 µM-ra történő emelése [Ca2+]m-emelkedést váltott ki, amely szignifikánsan gyorsabb volt p38 MAPK-ellenes siRNS-sel történő kezelés után (19. ábra, p=0,0027). Vagyis a Na+/Ca2+ kicserélő működése nem szükséges a mitokondriális Ca2+ jel kináz-mediált gátlásához.
48
Rhod-2 (F/Fo)
5
siRNS siRNA
4 3
kontrol kontroll 2 1
100 s 1 µM Ca2+
19. ábra A p38 MAPK ellenes siRNS hatása a mitokondriális Ca2+ felvételre clonazepam jelenlétében p38 MAPK ellenes siRNS-sel, ill. kontroll RNS-sel kezelt H295R sejteket permeabilizáltunk és a citoszol oldat [Ca2+]-ját 100 nM-ról az 1 µM-ra növelve mitokondriális Ca2+ felvételt váltottunk ki. A Ca2+ hatására létrejövő [Ca2+]m-változást (Rhod2) mértük 100 µM clonazepam jelenlétében.
Természetesen felmerül az a kérdés is, hogy a p38 MAPK gátló hatása csak AIIvel történő aktiváció után, vagy pedig nyugalomban, a kináz „bazális” aktivitásából fakadóan is érvényesül-e a mitokondriumon. Ennek kiderítésére a K+-nal kiváltott [Ca2+]c-emelkedést Fluo-4-gyel, a mitokondriális Ca2+-választ Rhod-2-vel mértük a p38 MAPK gátló SB202190 (10 µM) vagy inaktív analógjának, az SB202474 (10 µM) jelenlétében. A p38 MAPK gátlószer nem volt hatással a [Ca2+]m/[Ca2+]c hányadosra (SB202474: 0,59 + 0,044; SB202190: 0,75 + 0,087, n=8 és 4; p=0,16). Ez az eredmény megkérdőjelezi azon irodalmi adatot, mely szerint az SB202190 közvetlenül az uniporterre hat és hatása független a p38 MAPK aktivitásától [88]. Ezen adatok alapján tehát a p38 MAPK AII hatására már 1 percen belül is aktiválódik, ez az aktiváció pedig csökkenti a citoplazma Ca2+ jel átvitelét a mitokondriumba
mind
intakt,
mind
pedig
permeabilizált
H295R
sejtben.
A
mitokondriális gátláshoz nem elég a kináz bazális aktivitása, a kinázhatás továbbá elsősorban a Ca2+ felvétel csökkentését és nem a Ca2+ leadás fokozását jelenti. Az gátlás elengedhetetlen a Ca2+ felvétel–ER-távolság összefüggés kialakításához.
Az új (novel) típusú protein kináz C izoformák hatása a mitokondriális Ca2+ anyagcserére Az fent ismertett eredmények fényében a p38 MAPK aktivációja gátolja a mitokondrium Ca2+ felvételét. Elvben tehát nem csak az AII-nek, hanem minden olyan tényezőnek, amely képes a kinázt aktiválni, hasonló gátló hatással kell bírnia.
49
A TNFα jól ismert aktivátora a p38 MAPK-nak számos sejttípusban [203], sőt a kináz aktivációja TNFα-val akár közvetlenül, a MAPKK-kaszkád megkerülésével is lehetséges [204]. Az általunk alkalmazott koncentrációban (20 ng/ml) a TNFα valóban a p38 MAPK foszforilációjához vezetett 30 percen belül (20. ábra). A TNFα-előkezelés mind a citoplazma, mind a mitokondrium Ca2+ jelet csökkentette, de nem befolyásolta a Ca2+ felvétel hatékonyságát K+-os ingerlés során (mitokondrium/citoplazma arány: 0,59 +
xi n to α
ko nt ro l
l ol tr n ko
TN Fα
0,11 a kontroll és 0,62 + 0,11 a TNFα-kezelt csoportban; n=37 és 33).
P-p38 p38
20. ábra A TNFα és az S. aureus α-toxin hatása a p38 MAPK foszforilációjára A TNFα-val (20 ng/ml) vagy α-toxinnal (1 µg/ml) végzett 30 perces inkubáció után Western-blot analízissel követtük a p38 MAPK foszforilációját, foszfo-p38 MAPK specifikus antitest (P-p38) segítségével. A fehérjemennyiségek egyenlőségét a teljes p38 MAPK mennyiséggel ellenőriztük (p38). (Reprezentatív 4 független kísérletre.)
Hasonló eredményekre jutottunk S. aureus α-toxinjának alkalmazásával is. Az általunk alkalmazott koncentrációban (1-2 µg/ml) a toxin nem permeabilizálta a plazmamembránt ([205] és saját megfigyelés) de 30 perc alatt aktiválta a p38 MAPK-t (20. ábra). Az α-toxin előkezelés a K+-nal kiváltott válaszok során azonban nem befolyásolta sem a [Ca2+]c-t, sem a mitokondriális [Ca2+]-emelkedést (nem közölt adat), sem pedig a Ca2+ felvétel hatékonyságát jelző mitokondrium/citoplazma amplitúdó arányt (0,5 + 0,04 a kontroll és 0,46 + 0,04 az α-toxinnal kezelt csoportban; n=27 és 29). Ezek alapján tehát a p38 MAPK aktivációja önmagában nem elégséges a mitokondriális Ca2+ felvétel gátlásához, valamilyen egyéb, AII-hatásra aktiválódó jelátviteli elemre is szükség van a gátlás kifejtéséhez. H295R sejtben az AII nemcsak a p38 MAPK-t, hanem az ún. új típusú protein kináz C (nPKC) izoformákat is képes (Ca2+független módon) aktiválni [197;206]. (Az nPKC izoformák közül a H295R sejt a PKCε-t nagy mennyiségben expresszálja (21. ábra).) H295R PKCε aktin
Jurkat
*21. ábra A PKCε kifejeződése H295R sejtben Western-blottal, PKCε specifikus antitest segítségével vizsgáltuk a fehérje expresszióját H295R sejtben. Referencia sejtként a PKCε-t nagy mennyiségben expresszáló Jurkat sejtet használtuk. Töltési kontrollként az aktin-immunreaktivitás szolgált.
50
Az nPKC-k lehetséges szerepének feltárásához PKC gátlószerek hatását vizsgáltuk a Ca2+ felvétel–ER-távolság függvényre AII-vel ingerelt sejtekben, a már ismertetett metódust alkalmazva. Ha csupán a konvencionális PKC izoformákat (α, βI, βII, γ) gátoltuk Gö6976 (5 µM, [197]) segítségével, akkor a kontroll csoportban tapasztalt szoros összefüggés a Ca2+ felvétel és az ER-távolság között megmaradt (22. ábra bal grafikon). Ha mind a konvencionális, mind az nPKC izofomákat (ε, δ, θ, η) gátoltuk bisindolilmaleimid-1-gyel (BIS, 5 µM, [207]), akkor az összefüggés már megszűnt (22.
Ca2+ felvételi sebesség
ábra jobb grafikon).
Gö6976
BIS
1.0
2.0
0.5
1.0
p=0.001 0.0
0.5
1.0
0.0
0.5
1.0
22. ábra Az ER-kolokalizáció és mitokondriális Ca2+ felvételi sebesség összefüggése PKC gátlószerek jelenlétében AII-inger során A korábban ismertetett módon vizsgáltuk az ERlokalizáció (ER-GFP) és a Ca2+ felvétel (Rhod-2) összefüggését az általános PKC gátlószer bisindolilmaleimid-1 (BIS, 5 µM) vagy az nPKC-ket nem gátló Gö6976 (5 µM) jelenlétében. (n=10 mitokondrium/3 sejt mindkét csoportban.)
ER-kolokalizáció
A fentiekkel kompatibilis eredményre jutottunk, mikor ezen gátlószerek hatását kapacitatív Ca2+ belépés során vizsgáltuk. A belső Ca2+ raktárakat Ca2+ mentes oldatban kiürítettük (thapsigargin 200 nM, 8 perc), majd pedig 1 nM AII-t adtunk a sejtekhez két percig, továbbra is Ca2+ mentes oldatban thapsigargin jelenlétében. (Ilyen körülmények között ebben az esetben sem váltott ki Ca2+ jelet az AII.) Az AII mellé adott Gö6976 (5 µM) nem befolyásolta, de 5 µM BIS szignifikánsan növelte a kapacitatív influx során mért, a mitokondriális Ca2+ felvétel hatékonyságát jelző [Ca2+]m/[Ca2+]c (Rhod-2/Fluo-4) hányadost. (A [Ca2+]m/[Ca2+]c arány 0,55 + 0,05 AII, 0,5 + 0,04 AII + Gö6976 és 0,85 + 0,07 AII + BIS esetében, n=18-15-17; p=0,0048 az AII és AII + BIS között.) Ezek alapján tehát az AII-mediált gátlás nemcsak a p38 MAPK, hanem a nPKC izoformák aktivitását is igényli. Mindkét kinázt, ill. kinázcsoportot Ca2+-független módon (is) képes az AII aktiválni. Ezen aktiváció H295T sejtben elengedhetetlen a Ca2+ felvétel ER-kolokalizációtól való függésének kialakításához.
51
Az p38 MAPK és az nPKC izoformák egyidejű aktiválásának vizsgálata A fent bemutatott eredmények alapján sem a p38 MAPK sem pedig az nPKC izoformák külön-külön történő aktivációja nem elégséges a mitokondriális Ca2+ felvétel gátlásához. Ezt a p38 MAPK-ról már kimutattuk, most az nPKC-ket vizsgáltuk ebből a szempontból. Az nPKC izoformák aktiválásához farmakológiai módszert alkalmaztunk. Forbolmirisztil-acetát (PMA, 50 nM) segítségével aktiváltuk a konvencionális és az új típusú PKC izoformákat is, Gö6976 (5 µM) egyidejű adásával pedig gátoltuk a konvencionálisakat. Ezt az előkezelést 30 percig alkalmaztuk. A kontroll csoportot a PMA inaktív analógjával, 4-forbol-didekanoáttal (PDD, 50 nM) és Gö6976-tal (5 µM) inkubáltuk. Az extracelluláris [K+] 3,6 mM-ról 15 mM-ra történő emelésével kiváltott Ca2+ jel során az nPKC-k aktiválása nem befolyásolta a mitokondriális Ca2+ felvétel hatékonyságát kifejező [Ca2+]m/[Ca2+]c hányadost (23. ábra bal oldali oszlopok). (A [Ca2+]c-t Fluo-4-gyel, a [Ca2+]m-t Rhod-2-vel mértük.) Tehát az nPKC izoformák aktivációja önmagában még nem képes létrehozni az AII-éhez hasonló gátlást. Hogy a p38 MAPK-t és az nPKC izoformákat egyidejűleg aktiváljuk, a fenti előkezelést kiegészítettük 20 ng/ml TNFα-val: a két kinázt PMA + Gö6976 + TNFα előinkubációval (30 min) aktiváltuk, a másik csoport pedig PDD + Gö6976 kezelést kapott. Ilyen beavatkozás után a [Ca2+]m/[Ca2+]c hányados azonban szignifikánsan csökkent a kontroll csoporthoz képest K+-inger alatt (23. ábra jobb oldali oszlopok). A kinázok egyidejű aktiválása tehát már képes az AII-höz hasonló mitokondriális gátlás kifejtésére még akkor is, ha a Ca2+ forrása nem az ER, hanem az extracelluláris tér. (Itt ismét megemlítendő, hogy H295R sejtben a mitokondriumoknak csak elenyésző hányada helyezkedik el szubplazmalemmálisan (9. ábra), a K+-nal kiváltott mitokondriális Ca2+ jelben nem tudtunk HCMD-re utaló jelenséget kimutatni (10. ábra).)
52
p=0.005 1.2
0.6
0.8
0.4 0.2 0
nPKC
Ko
nPKC
Ko
11
15
11
+
-
+
-
-
+
-
+ + +
PDD PMA Gö6976
+
+ +
TNFα
-
-
0.4
mito/cyto
mito/cyto
0.8
p38
12
0
*23. ábra Az nPKC izoformák izolált és p38 MAPK-zal szimultán aktivációjának vizsgálata Az ábrán jelzett farmakon-kombinációk 30 perces alkalmazásával vagy csak az nPKC-ket (PMA+ Gö6976) vagy az nPKC-ket és a p38 MAPK-t is aktiváltuk (PMA+Gö6976+TNFα). A kontroll csoportban nem aktiváltuk egyik kinázt sem (PDD+Gö6976). A Ca2+ jelet 15 mM K+-nal váltottuk ki, Ca2+ felvétel hatékonyságát a mitokondrium/citoplazma (Rhod-2/Fluo-4) hányadossal jellemeztük. Koncentrációk: PDD és PMA 50 nM; Gö6976 5 µM; TNFα 20 ng/ml.
Ellenőrizni kívántuk, hogy a fent leírt farmakológiai kináz-aktiváció valójában a p38 MAPK-on keresztül valósul-e meg. Ehhez az intakt H295R sejteket 3 csoportban vizsgáltuk: i) PMA + TNFα +Gö6976 előkezeléssel aktiváltuk a p38 MAPK-t és a nPKCket, siRNS-sel pedig csendesítettük a p38 MAPK gént; ii) PMA + TNFα +Gö6976 előkezeléssel aktiváltuk a kinázokat és kontroll RNS-t alkalmaztunk; iii) p38 MAPK ellenes siRNS mellett inaktív drogokat adtunk (PDD + Gö6976). A Ca2+ jelet K+-nal váltottuk ki, a [Ca2+]c-t Fluo-4-gyel, a [Ca2+]m-t Rhod-2-vel mértük. A citoplazma Ca2+ jel amplitudója nem különbözött a 3 csoportban. A kinázok aktivációja a vártnak megfelelően csökkentette a mitokondriális Ca2+ jelet, amely hatás p38 MAPK ellenes siRNS-sel megszűntethető volt (24. ábra). A kinázok aktiválása nélkül az siRNS önmagában nem hatott a [Ca2+]m-re, tehát az általunk alkalmazott kinázaktivációs előkezelés valóban a p38 MAPK-on keresztül csökkenti a mitokondrium Ca2+ felvételét. Ugyanakkor ezek az adatok is megerősítik, hogy a bazális p38 MAPK aktivitás nem elégséges a gátlás létrehozásához.
53
Ezek alapján tehát a p38 MAPK és nPKC izoformák egyidejű aktivációja gátolja a mitokondrium Ca2+ felvételét, a gátlás független a Ca2+ forrásától. A kinázoknak egyidejűleg kell aktiválódni, külön-külön aktivációjuk hatástalan. Az általunk alkalmazott farmakológiai kinázaktiváció alkalmas az AII gátló hatásának Ca2+ jel nélküli kiváltására. p=0.026
2.5
2.5
2.0
2.0
1.5
1.5
17
15
10
17
15
10
1.0 PMA+Gö6976+TNFα
siRNS
[Ca2+]m
[Ca2+]c
p=0.016
1.0
+
+
-
+
+
-
-
+
+
-
+
+
24. ábra A PMA + Gö6976 + TNFα előkezelés hatásának vizsgálata intakt H295R sejteben Az nPKC izoformákat és a p38 MAPK-t a egyidejűleg aktiváltuk (PMA+Gö6976+TNFα) vagy pedig kontroll drogokat alkalmaztunk (PDD+Gö6976). Emellett siRNS-sel csökkentettük a p38 MAPK kifejeződését vagy nem csendesítő dupla szálú RNS-t alkalmaztunk. Fluo-4 és Rhod-2 segítségével mértük a [Ca2+]c-t és a [Ca2+]m-t K+-inger alatt. A Ca2+ válaszok első csúcsának amplitúdóját elemeztük. (Az alkalmazott koncentrációk a 23. ábra leírásában közölteknek felelnek meg.)
Az p38 MAPK és az nPKC izoformák hatása a mitokondriális membránpotenciálra Mind az AII, mind pedig p38 MAPK és az nPKC izoformák egyidejű farmakológiai aktiválása csökkenti a mitokondriális Ca2+ felvételt IP3-mediált Ca2+ felszabadulás, feszültségfüggő módon kiváltott és kapacitatív Ca2+ belépés esetében is. A gátlás tehát független a Ca2+ forrásától, s így a kinázok támadáspontját kézenfekvő a mitokondriumban keresni. A mitokondriális támadáspont lokalizációjához permeabilizált H295R sejtekben molekuláris biológiai és farmakológia módszerrel a lehetséges legnagyobb különbséget hoztuk létre a kinázok aktivitásának szempontjából. A kináz-aktivált csoportban a már
54
ismertetett PMA + TNFα + Gö6976 30 perces előkezeléssel egyidejűleg aktiváltuk a p38 MAPK-t (20. ábra) és az nPKC izoformákat [197]. Erről az előkezelésről már kimutattuk, hogy a p38 MAPK-on és nPKC izoformákon keresztül gátolja a mitokondriális Ca2+ felvételt (24. ábra). A kináz-gátolt csoport kontroll drogokat (PDD + Gö6976) kapott, ill. a p38 MAPK génjét siRNS-sel csendesítettük (17. ábra). (A kinázaktivált csoportot kontroll dupla szálú RNS-sel kezeltük.) Tekintve, hogy a hőmérséklet csökkenésével az ionmozgások lassulnak és a mikroszkópos adatgyűjtés frekvenciája behatárolt, az Eredmények I. részben bemutatott összes további kísérletet 25 °C-on végeztük. Lassabb Ca2+ felvétel esetében ugyanis képesek vagyunk a Ca2+ felvételi görbe kezdeti, lineáris szakaszának jobb időbeli feloldására. A kinázok Ca2+ felvételt gátló hatása elvben érvényesülhet a ∆Ψ m csökkentésén keresztül: csökkent hajtóerő a Ca2+ felvétel drasztikus lassulását okozhatja [13;91]. Ezen lehetőség vizsgálatára a ∆Ψm-t mindkét csoportban azonos nagyságúra kívántuk beállítani. Ehhez permeabilizált sejtben a mitokondriumot a mitokondriális szubsztrátok (szukcinát és piruvát) megvonásával először depolarizáltuk. Hogy ez a depolarizáció teljes legyen, a szubsztrátmentes oldathoz légzési lánc gátlószert (rotenon 10 µM) és F1FO-ATPázt gátlószert (oligomycin, 25 µg/ml) is adtunk. Ezen 2 perces periódus után K+ ionofór valinomycin (50 ng/ml) segítségével további 2 percig kiegyenlítettük a citoszol-jellegű oldat ([K+]=130 mM) és az intramitokondriális tér [K+]-ját. Továbbra is valinomycin jelenlétében az oldat [K+]-jának 0,1 mM-ra történő csökkentése kifelé irányuló K+-áramot indít meg, mely a mitokondriumot ismét polarizálja. Ahogy az a TMRE-vel mért reprezentatív görbén látható (25. ábra A panel), ez a művi ∆Ψm kb. 2 perc alatt egyensúlyi helyzetben stabilizálódik, mindkét (kináz-aktivált és -gátolt) csoportban azonos mértékű (25. ábra B panel) és 5 µM Ca2+ hozzáadására is stabil marad néhány tíz másodpercig. Ugyanezen körülmények között, vagyis azonos ∆Ψm és hajtóerő mellett mértük tehát a 5 µM Ca2+-mal kiváltott [Ca2+]m-változásokat mt-inv-Pericam segítségével. Amint az a reprezentatív görbéken (25. ábra C panel) és az adatokat összesítő oszlopdiagrammon (25. ábra D panel) látható, a kinázok aktivációja ilyen körülmények között is csökkentette a [Ca2+]m-görbe kezdeti meredekségét, vagyis a Ca2+felvétel sebességét.
55
A)
B)
5 µM Ca2+ 0.1 mM K+ valinomycin
depolarizáció
5
aktivált gátolt 2
100 s
1
TMRE (F/Fo)
TMRE (F/FO)
3
4 3 2 1
8
8
[Ca2+]m (Pericam FO/F)
2.5
2.0
aktivált gátolt
1.5
1.0
10 s
Ca2+ felvételi sebesség (Fo/(∆F*t-1))
aktivált
5 µM Ca2+ valinomycin + 0.1 mM K+
C)
0.3
8
8 gátolt
p=0.00003
0.2
0.1
0.0
24
20
aktivált
gátolt
D)
25. ábra K+-potenciállal hajtott mitokondriális Ca2+ felvétel permeabilizált H295R sejtekben A mitokondriumok depolarizációja után, valinomycin jelenlétében, K+ megvonással repolarizáltuk az organellumot (A). Az újonnal kialakult ∆Ψm független volt a kinázok aktivációjátol (B). Az új, steadystate ∆Ψm stabilizációja után 5 µM Ca2+ adásával Ca2+ felvételt váltottunk ki (C) és [Ca2+]m görbék kezdeti meredekségét elemeztük (D). A ∆Ψ m-t TMRE-vel, a [Ca2+]m-t mitokondriumba irányított inverz Pericam-mel mértük. (További részletek a szövegben.)
Ezen eredményt megerősítendő, megvizsgáltuk a kinázok hatását az 5 µM Ca2+ hatására létrejött ionfelvételre olyan körülmények között is, mikor a mitokondriális Ca2+ felvétel egyedüli hajtóereje a Ca2+ − mindkét csoportban azonos − koncentrációgrádiense. Ehhez a permeabilizált sejtek mitokondriumait teljesen depolarizáltuk a szubsztrátok elhagyásával és oligomycin (25 µg/ml), rotenon (10 µM), valinomycin (50 ng/ml) valamint protonofór (5µM FCCP) 2 perces adásával. (Ez a kezelés a mérhető ∆Ψm teljes megszűnését okozta, ezt előkísérletben ellenőriztük – nem közölt adat.) Ilyen körülmények között a Ca2+ felvétel hajtóereje kizárólag a Ca2+ koncentráció-grádiense. Mégis, a kinázok előzetese aktiválása a Ca2+ felvétel mt-inv-Pericam-mel mért kezdeti sebességét mintegy felére csökkentette (26. ábra).
56
2.0
Ca2+ felvételi sebesség (Fo/(∆F*t-1))
[Ca2+]m (Pericam Fo/F)
5 µM Ca2+ aktivált gátolt 1.5
20 s
1.0
p=4.47*10-8 0.050
0.025
0.000
37
37
aktivált
gátolt
2+
26. ábra Koncentráció grádiens által hajtott Ca felvétel permeabilizált sejtekben A mitokondriumok teljes depolarizációja után 5 µM Ca2+ hozzáadásával váltottunk ki mitokondriális ionfelvételt (bal oldali diagram). Az mitokondriumba irányított inverz Pericammal mért [Ca2+]m-görbék kezdeti meredekségeit hasonlítottuk össze kináz-aktiválás vagy -gátlás mellett. (További részletek a szövegben.)
Intakt, nem ingerelt H295R sejtekben a kinázok aktivációja (PMA + TNFα) a ∆Ψm növekedését váltotta ki (27. ábra) a kontroll csoporthoz (PDD + Gö6976) képest. Ugyanezen előkezelésről már igazoltuk, hogy gátolja a Ca2+ felvételt (23. és 24. ábra). Mivel a nagyobb ∆Ψm nem lehet a csökkent Ca2+ felvétel oka, ezért, a fenti kísérletekkel egyetemben, ez a kísérlet is megerősíti, hogy a p38 MAPK és nPKC izoformák gátló
TMRE (fluoreszcens egység)
p=2.5*10-5 80 60 40 20
40 gátolt
50 aktivált
normalizált TMRE (F/FFCCP)
hatása elsődlegesen nem a ∆Ψm-on keresztül valósul meg.
p=0.0086
3
2
1
36
36
gátolt
aktivált
27. ábra Az nPKC és p38 MAPK együttes aktiválásának hatása a ∆Ψm-re intakt sejtben A sejtekben PMA+TNFα+Gö6976 előkezeléssel aktiváltuk a kinázokat. A kontroll csoportot PDD+Gö6976-tal kezeltük. A 30 perces előkezelés alatt és a mérés során 25 nM TMRE volt jelen. A ∆Ψm-t vagy a mitokondriális régióban mért nyers TMRE fluoreszcenciával (bal diagram) vagy ugyanennek a fluoreszcenciának az 5 µM FCCP adása után mért intenzitásra történő normalizálásával jellemeztük (jobb diagram).
A mitokondriális külső membrán szerepének vizsgálata Kinázok gátló hatása elviekben nemcsak a ∆Ψ m-on keresztül is érvényesülhet. A mitokondriális külső membrán (OMM) az általános nézet szerint ugyan a feszültségfüggő anioncsatorna (VDAC, porin) jelenlétének köszönhetően mintegy 3 kDa méretig áteresztő, azaz nem képez diffúziós akadályt [5], de néhány irodalmi adat ez ellen szól
57
[208;209]. Ha a Ca2+ diffúziója gátolt a transzport helyéhez, a belső membránhoz, a Ca2+ felvétel kezdeti sebessége csökkenhet. Így felmerül a külső membrán szerepe a kinázok hatásának közvetítésében. A külső membrán szerepének vizsgálatakor a már ismertetett előkezeléssel aktiváltuk, ill. gátoltuk a kinázokat. Az előkezelés és permeabilizáció után a mitokondriális külső membrán roncsolását 15 mOsm ozmotikus koncentrációjú oldat 2 perces alkalmazásával végeztük el. Ez az oldat tartalmazta továbbá a ∆Ψm teljes megszűntetéséhez szükséges, korábban is alkalmazott farmakonokat (oligomycin 25 µg/ml, rotenon 10 µM, valinomycin 50 ng/ml, FCCP 5 µM). Előkísérletben igazoltuk, hogy a gátlószereket és az ionofórokat is tartalmazó 15 mOsm-os oldat 2 perces alkalmazása a külső mitokondriális membránt igen, de a belsőt nem lyukasztja ki, vagyis segítségével mitoplaszt hozható létre. Azt is kimutattuk, hogy ugyanezen kezelés után a mitokondriális Ca2+ felvétel továbbra is teljesen meggátolható 5 µM ruténium vörössel. A mitokondriális Ca2+ felvételt ezután már izozmotikus, standard citoszol oldatban, 5 µM Ca2+-mal váltottuk ki. A [Ca2+]m-emelkedés (mt-inv-Pericam) sebessége ilyen körülmények között nem különbözött a két csoportban (28. ábra). A kináz-aktiváció tehát az OMM hiányában elveszti gátló hatását, külső membrán nélküli mitokondrium (mitoplaszt) Ca2+ felvételére nincs hatással a p38 MAPK-nPKC rendszer.
2.0
Ca2+ felvételi sebesség (Fo/(∆F*t-1))
[Ca2+]m (Pericam Fo/F)
5 µM Ca2+ aktivált gátolt
1.5
1.0
10 s
0.075
0.050
0.025
0.000
20 37
10 37
aktivált
gátolt
28. ábra Koncentráció grádiens által hajtott Ca2+ felvétel mitoplasztokba A mitokondriumok depolarizációját (szubsztrátmegvonás, 5 µM FCCP, 10 µM rotenon, 8 µg/ml oligomycin, 50 ng/ml valinomycin) 15 mOsm-os oldatban végeztük el. Ezután izozmotikus oldatban 5 µM Ca2+ hozzáadásával ionfelvételt váltottunk ki a mitoplasztokba (bal diagram). Az inverz Pericam-mel mért [Ca2+]m-görbék kezdeti meredekségeit hasonlítottuk össze. (További részletek a szövegben.)
58
Az OMM permeabilizálását más módszerrel is elvégeztük. A proapoptotikus Bid fehérje hasított („trunkált”) formája, a t-Bid permeabilizálja az OMM-t, méghozzá mPTP-független módon [209-211]. A t-Bid ezen hatása nem jár mitokondriális duzzadással sem [212]. A mások által közöltekhez hasonlóan [209] 37 nM t-Bid 10 perc alatt a külső membrán permeabilizációját, és a citokróm c elvesztése miatt a légzési lánc leállását, a ∆Ψm megszűnését váltotta ki permeabilizált H295R sejtben. Ezt a mitokondriumok TMRE fluoreszcenciájának elvesztése jelezte (29. ábra bal oldali felvételek). A belső membrán épségét jelző calcein-fluoreszcencia ezalatt (29. ábra jobb oldali felvételek), és legalább további 10 percig változatlan maradt. Ezek alapján a t-Bid alkalmas az OMM szelektív permeabilizációjára. TMRE
mito-calcein
kontroll kontrol periódus periódus
15 min t-Bid
29. ábra t-Bid hatása a ∆Ψm-re és az OMM épségére permeabilizált H295R sejtben A sejteket permeabilizáció előtt 25 nM TMRE-vel és 5 µM calceinnel töltöttük 15 percen keresztül. A permeabilizálást 10 percig 25 µg/ml digitoninnal végeztük TMRE jelenlétében. Ezután a TMRE és a calcein kolokalizációt mutatott (kontroll periódus). 37 nM t-Bid 15 perc alatt a ∆Ψm, és következményesen a TMRE elvesztéséhez vezetett, de a calcein fluoreszcencia intenzitása és mintázata változatlan maradt. (Reprezentatív eredmény 4 fedőlemezre 2 preparátumból.)
Ezek ismeretében ezután ismét az 5 µM Ca2+ hatására létrejött ionfelvétel kezdeti sebességét vizsgáltuk permeabilizált, az ismertetett módon kináz-aktivált és kináz-gátolt sejtekben, de további két csoportot képeztünk azáltal, hogy vagy permeabilizáltuk a OMM-t (37 nM t-Bid, 10 perc), vagy pedig nem (30. ábra). A kinázok aktivációja, akárcsak eddig, a Ca2+ felvétel gátlását okozta, azonban ez a hatás teljes egészében eltűnt, ha az OMM-t permeabilizáltuk. A kinázok aktiválásának hiányában viszont a t-Bid kezelés nem fokozta a Ca2+ felvétel kezdeti meredekségét, a kinázgátlás és az OMMruptúra nem voltak additív hatásúak (30. ábra). (A t-Bid nemcsak az 5 µM Ca2+ hatására létrejött Ca2+ felvételt fokozta kináz-aktivált sejtekben, hanem a magas (5-250 µM, p=0,006) és a fiziológiáshoz közeli, alacsony [Ca2+]-tartományban is (2 µM, p=0,013) növelte a Ca2+ felvétel kezdeti meredekségét.)
59
Ca2+ felvételi sebesség (Fo/(∆F*t-1))
*
**
***
26
27
28
23
aktivált
aktivált t-Bid
gátolt
gátolt t-Bid
0.050
0.025
0.000
30. ábra t-Bid hatása a Ca2+ felvételre kináz-aktivált és -gátolt permeabilizált sejtben A sejtekben aktiváltuk (PMA+TNFα+Gö6976, kontroll RNS) vagy gátoltuk (PDD+Gö6976+siRNS a p38 MAPK ellen) a kinázokat. Digitoninos (25 µg/ml, 10 perc) permeabilizáció alatt vagy jelen volt 37 nM t-Bid vagy nem. Ezután a mitokondriumokat depolarizáltuk (szubsztrátmegvonás, 5 µM FCCP, 10 µM rotenon, 8 µg/ml oligomycin, 50 ng/ml valinomycin) és az 5 µM Ca2+-mal kiváltott Ca2+ felvétel kezdeti meredekségét mitokondriális inverz Pericammal mértük. (* p=0,0098; ** p=0,0014; *** p=0,016 az aktiválttal szemben; n=az oszlopokban feltüntetve.)
A
hipozmotikus
és
t-Bid-kezeléssel
nyert
adatokat
intakt,
légző
mitokondriumokon is meg kívántuk erősíteni. A kináz-aktivált és -gátolt csoportban dózis-hatás függvényt vettünk fel a perimitokondriális [Ca2+] és a mitokondriális Ca2+ felvétel kezdeti sebessége között (31. ábra). Ehhez a sejteket permeabilizáltuk és standard citoszol oldatban a [Ca2+] 0 µM-ról 2, 5, 10 vagy 45 µM-ra történő megemelésével mitokondriális Ca2+ felvételt váltottunk ki (egy fedőlemezen csak egy Ca2+ lépést alkalmaztunk). A [Ca2+]m-t mt-inv-Pericam-mel mértük, a felvétel kezdeti sebességét ábrázoltuk a [Ca2+] függvényében. Amint a két szigmoid görbén (31. ábra) látható és a 31. ábra táblázatából kiolvasható, a p38 MAPK és a nPKC izoformák egyidű aktiválása a dózis-válasz függvényt jobbra tolja: a maximális felvételi sebesség (Vmax) nem változik, de a félmaximális sebesség eléréséhez szükséges [Ca2+] (EC50) kétszeresére nő.
60
Mindezek alapján tehát a p38 MAPK és a nPKC izoformák közvetítette gátló hatáshoz szükség van intakt OMM-ra. A külső membrán (a kinázok által aktiválható
Ca2+ felvételi sebesség (Fo/(∆F*t-1))
módon) képes csökkenteni a mitokondriális Ca2+ felvétel sebességét. 0.4
aktivált
gátolt
p
0.35 + 0.02
0.36 + 0.01
0.72
EC50 (µM)
8.28 + 1.38
4.36 + 0.33
0.007
Hill koeff.
1.60 + 0.35
1.93 + 0.27
0.46
n
8 - 12
8 - 12
0.3
Vmax 0.2
aktivált
0.1
gátolt
(Fo/∆F/∆t)
0.0 0 2 5
10
[Ca2+] (µM)
45
31. ábra A kinázaktiváció hatása intakt, légző mitokondriumok Ca2+ felvételére A korábban ismertetetteknek megfelelően aktiváltuk, ill. gátoltuk a kinázokat. A permeabilizáció után a perimitokondriális [Ca2+] emelésével és a Ca2+ felvétel kezdeti meredekségének meghatározásával (mito-inv-Pericam) dózis-hatás függvényt vettünk fel (egy sejt csak egy Ca2+-lépésnek volt kitéve). Az adatokra Hill-függvényt illesztettünk az alábbi paraméterekkel: f = (Vmax * [Ca2+]h) / (EC50h + [Ca2+]h, ahol h a Hill-koefficiens. Az adatok statisztikai elemzését a táblázat foglalja össze.
(A 21. és 23. ábrán bemutatott kísérletek jelentős részét munkacsoportunk más tagjai, dr. Fülöp László, Koncz Péter és dr. Spät András végezte. Ezen adatok részletesebb kifejtése Koncz Péter doktori disszertációjának részét képezi. Itt a gondolatmenet szempontjából feltétlen szükség volt azonban az adatok érintőleges említésére.)
61
Eredmények II. A perimitokondriális [Mg2+] hatása a mitokondrium Ca2+ anyagcseréjére Mitokondriális szuszpenzión végzett kísérletek alapján a Mg2+ gátolja a mitokondriális Ca2+ felvételt, de a kísérltetek eddig a szuprafiziológiás koncentrációtartományban történtek [78;81;82]. Ezen kísérletsorozatunkban arra kerestük a választ, hogy az intakt sejt viszonyaihoz közelebb álló permeabilizált sejtben is kimutatható-e a Mg2+ gátló hatása a sejt citoplazmájára jellemző koncentráció-tartományban, ill., hogy kimutathatóak-e olyan [Mg2+]-változások intakt sejtben, melyek akut hatással lehetnének a mitokondrium Ca2+ anyagcseréjére. A kérdés vizsgálatára HEK-293T sejteket használtuk, melyeket a mitokondriumba irányított, GFP-hez kapcsolt, vad-típusú aequorint kódoló plazmiddal [179] tranziensen transzfektáltunk. A GFP-fluoreszcencián keresztül ellenőriztük a rekombináns fehérje mitokondriális
lokalizációját
(nem
közölt
adat),
az
aequorin
által
katalizált
biolumineszcens reakcióhoz pedig coelenterazint (1 µM) adtunk prosztetikus csoportként. A sejtek digitoninos permeabilizálása után a lumineszcenciát luminométerrel mértük és a mérési adatokat konvertáltuk [Ca2+]m-ra [144;191]. A Ca2+ felvétel és leadás sebességét elemeztük különböző Ca2+ és Mg2+ koncentrációk mellett. A perimitokondriális [Ca2+] 100 nM-ról 1 µM-ra történő emelése a [Ca2+]m emelkedését váltja ki HEK-293T sejtben is (32. ábra). Az új egyensúlyi [Ca2+]m elérése után a perimitokondriális [Mg2+] 2,5 mM-ról 1, majd 0,25 mM-ra történő csökkentése a [Ca2+]m további emelkedését váltja ki. Ez a hatás reverzibilis és ismételhető, gyakorlatilag mérhető latencia nélkül jön létre. Ez alapján a perimitokondriális Mg2+ akutan képes a [Ca2+]m csökkentésére permeabilizált sejtben is.
62
2+
[Mg ]C (mM)
600
[Ca2+]m (nM)
0.25
1 2.5
1
0.25
32. ábra A perimitokondriális [Mg2+] hatása a [Ca2+]m-ra permeabilizált HEK-293T sejben Permeabilizált HEK-293T sejtekben mitokondriumba irányított aequorin-GFP-vel, 1 µM coelenterazinos kezelés (1 h) után luminométerrel mértük a [Ca2+]m-t. A citoszol jellegű oldat [Ca2+] és [Mg2+]-jának változtatását szuperfúziós rendszerrel oldottuk meg. A kísérlet végén desztvíz + 100 µg/ml digitonin + 10 µM Ca2+-mal határoztuk meg a teljes aequorin mennyiséget. (Reprezentatív 3 fedőlemezre.)
2.5
400
200 100 s
0
1000 100
100
2+
[Ca ]C (nM)
Hogy ez a hatás a Ca2+ felvétel gátlásán avagy a leadás fokozásán keresztül valósul meg, azt a következő kísérletsorozatban vizsgáltuk. A [Ca2+]m-t ismét aequorinnal mértük permeabilizált sejtekben. A perimitokondriális [Ca2+]-t különböző, de állandó [Mg2+] mellett a nyugalmi 100 nM-ról 500, 1000 majd 2000 nM-ra emeltük, minden koncentráció-lépés között a [Ca2+]-t 100 nM-ra csökkentettük vissza (33. ábra). 500
1000
2000
2+
[Ca ]C (nM)
2+
[Ca ]m (nM)
2000 1500 1000 500 0
100 s
33. ábra A Ca2+ felvétel kezdeti sebességének meghatározása Permeabilizált HEK-293T sejtekben mitokondriumba irányított aequorin-GFP-vel mértük a [Ca2+]m-t. A perimitokondriális [Ca2+] ([Ca2+]c) emelésével Ca2+ felvételt váltottunk ki. Minden Ca2+ lépés között a [Ca2+]c-t 100 nM-ra csökkentettük vissza. A felvételi és leadási sebességet a [Ca2+]m változás iniciális meredekségével jellemeztük (szaggatott kék egyenesek). A kísérleteket 0,25, 0,5, 1 és 2,5 mM [Mg2+] mellett végeztük. (Repr. 6 fedőlemezre, [Mg2+]=1mM.)
Így mérve a [Ca2+]m-t, az egyes Ca2+-lépések hatására létrejött Ca2+ felvétel és leadás kezdeti sebességei mérhetőek (33. ábra, szaggatott kék lineárisok). Az egyes felvételi sebességeket ábrázolva a perimitokondriális [Ca2+] függvényében kitűnik, hogy a Mg2+ a teljes [Ca2+]-tartományban koncentráció függően csökkenti a Ca2+ felvétel sebességét (34. ábra). A gátlás a 0,25-0,5 mM-os [Mg2+]- és a szubmikromoláris [Ca2+]tartományban a legerősebb (35. ábra bal panel és 34. ábra). Mindemellett a Mg2+ nem volt hatással a 2000 nM-ról 100 nM-ra történő [Ca2+]-csökkenéssel kiváltott Ca2+ leadás
63
sebességére (35. ábra jobb panel); ezek alapján pedig a kimutatható Mg2+-hatás a Ca2+
34. ábra A [Mg2+] hatása a Ca2+ felvételi sebességre permeabilizált HEK-293T sejtben A 30. ábrán bemutatott kísérletek eredményének összefoglalása. A perimitokondriális [Ca2+] ([Ca2+]c) függvényében ábrázoltuk az ionfelvétel kezdeti sebességét, különböző [Mg2+] mellett. n=8-12. Az ordináta logaritmikus léptékű! *p=0,0004 1 µM Ca2+, 0,25 mM Mg2+ és 1 µM Ca2+, 0,5 mM Mg2+ között.
100
*
10
[Mg2+] 0,25 mM 0,5 mM 1,0 mM 2,5 mM
1
0.1
leadási sebesség (∆nM/s)
2000
30 20
*
10 0
0.25 0.5 1.0 2+
[Mg ]C (mM)
2.5
2+
2+
Ca
1000 1500 [Ca2+]C (nM)
Ca
500
felvételi sebesség (∆nM/s)
Ca
2+
felvételi sebesség (∆nM/s)
felvétel gátlásán keresztül valósul meg.
100 75 50 25 0
0.25 0.5
1.0
2.5
2+
[Mg ]C (mM)
35. ábra A [Mg2+] hatása a Ca2+ felvételi és leadási sebességre A 33. ábrán bemutatott kísérletek eredményének statisztikai ábrázolása. Bal panel: Az 1 µM Ca2+ hatására létrejött Ca2+ felvétel kezdeti sebességét a perimitokondriális [Mg2+] függvényében ábrázoltuk. (n=8-12; p=0,0004 a 0,25 és 0,5 mM [Mg2+] mellett mért felvételi sebesség között). Jobb panel: A [Ca2+] 2 µM-ról 100 nM-ra való csökkentésével kiváltott leadás kezdeti sebessége a [Mg2+] függvényében (n=8-12.) *p=0,0004 0,25 mM Mg2+ és 0,5 mM Mg2+ között.
A citoplazma Mg2+ jelének leírása HEK-293T sejtben A fenti eredmények fényében a legfontosabb kérdés ezek után az volt, hogy az intakt sejt citoplazmajának [Mg2+]-ja összevethető-e azzal a [Mg2+]-tartománnyal, melyről kimutattuk, hogy gátolja a mitokondriális Ca2+ felvételt. Ennek vizsgálatára intakt HEK-293T sejtekben konfokális mikroszkópiával szimultán mértük a purinerg agonsita ATP (10 µM) kiváltotta változásokat: a [Ca2+]c-t FuraReddel, a [Mg2+]c-t az
64
alacsony Ca2+ affinitású (Kd=22 µM) de nagy dinamikus tartományú Mg2+-érzékeny fluoreszcens festékkel, Mag-Fluo-4-gyel mértük. HEK-293T sejtben 10 µM ATP hatására a [Ca2+]c 104 + 13 nM-ról 904 + 53 nMra emelkedik (n=7; p=0,00004) és ezt az emelkedést a [Mg2+]c egyidejű, szignifikáns növekedése (0,28 + 0,01 mM-ról 0,71 + 0,06 mM-ra; n=7; p=0,0028) kíséri (36. ábra).
ATP
500
2+
[Ca ]C (nM)
750
250
36. ábra IP3-mediált Ca2+ és Mg2+ jel intakt HEK293T sejtben A sejteket a Ca2+ érzékeny FuraRed és a Mg2+ érzékeny Mag-Fluo-4 festékekkel töltöttük és a 10 µM ATP hatására standard extracelluláris oldatban létrejött válaszokat lézer konfokális mikroszkóppal követtük a sejtmag felett. A kísérlet végén a festékek maximális és minimális fluoreszcenciáját 5 µM FCCP és 10 µM A23187 jelenlétében standard majd Ca2+ és Mg2+ mentes oldatban határoztuk meg. (Reprezentatív 7 sejt válaszára, 3 preparátumból.)
0
0.5
2+
[Mg ]C (mM)
0.7
0.3
0.1
20 s
A két koncentráció-emelkedés egyidejű, mindkettő kb. 500 ms alatt éri el félmaximális értékét, de a Mg2+ jel esése szignifikánsan gyorsabb (t1/2= 5,93 + 0,53 s a Ca2+ és 3.04 + 0,25 s a Mg2+ esetében; n=7-7; p=0,00075) (37. ábra). Az irodalmi adatokkal egyezően [179;187] a citoplazma és a nukleoplazma Ca2+ jelének amplitúdója és kinetikája megegyezik ATP-vel történő ingerlés során, és ugyanez igaz a Mg2+-ra is (37. ábra). Ezek alapján a későbbiekben mind a [Ca2+]c-t mind a [Mg2+]c-t a mag felett mértük.
65
ATP
2+
[Ca ]C (FR FO/F)
ATP 1.6
1.6
1.4
1.4
1.2
1.2
1.0
1.0
2+
[Mg ]C (MF F/FO)
10 s 1.6
1.6
1.4
1.4
1.2
1.2
1.0
1.0
sejtmag
37. ábra A Ca2+ és Mg2+ jel összehasonlítása különböző sejtkompartmentekben A FuraRed és a Mag-Fluo-4 festékek fluoreszcenciáját 50 ms-os időbeli feloldással mértük a citoplazma szubplazmalemmális területén és a sejtmagban ATP-vel történő ingerlés során. Az alapvonalra normalizált görbékből számoltuk a jelek kinetikai paramétereit és amplitúdóját. (Reprezentatív 7 sejtre, 2 preparátumból.)
citoplazma
Mg2+ érzékeny festékek esetében a legfontosabb módszertani kérdés a szelektivitás, ugyanis − bizonyos koncentráció felett − a Ca2+ is képes ezen festékeket gerjeszteni. Hogy a mi esetünkben nem ún. Ca2+ „átbeszélésről” van szó, azt a 38. ábra szemlélteti. ATP-vel kiváltott Ca2+ jelet Mg2+ jel kísér, de ugyanekkora, kapacitatív beáramlással kiváltott Ca2+ jellel párhuzamosan csak elenyésző [Mg2+]c-emelkedés mérhető (38. ábra bal panel). Továbbá, ismételt ATP ingerlés során a Mg2+ válasz jelentős deszenzitizációt mutat, míg a Ca2+ jel amplitúdója megtartott marad (38. ábra jobb panel). A két jel eltérő deszenzitizációja is alátámasztja, hogy, az adott körülmények között, a Mag-Fluo-4 jel döntően a [Mg2+] emelkedéséből származik.
66
1.2 mM Ca2+
2+
[Mg ]O = 0 mM
0 Ca2+ tg
1.8 [Ca ]C (FR FO/F)
ATP
1.4
2+
1.2
1.4 1.2 1.0
1.8
1.8
1.6 1.4 1.2
ATP
1.6
1.0
[Mg2+]C (MF F/FO)
2+
[Mg ]C (MF F/FO)
2+
[Ca ]C (FR FO/F)
1.6
1.6 1.4 1.2 1.0
1.0
100 s
100 s
38. ábra A Ca2+ és Mg2+ jel összehasonlítása különböző eredetű Ca2+ jelek esetében. Az extracelluláris Mg2+ hatásának vizsgálata ATP, ill. kapacitatív influx hatására létrejött Ca2+ és Mg2+ jeleket mértünk FuraRed és Mag-Fluo-4 segítségével intakt HEK-293T sejtekben. Bal grafikon: A sejteket Ca2+-mentes oldatban 10 µM ATPvel ingereltük, majd a belső raktárakat 10 percig 500 nM thapsigarginnal ürítettük továbbra is Ca2+ mentes oldatban. Az extracelluláris Ca2+ visszaadásával váltottuk ki a raktárszabályzott Ca2+ belépést. (Repr. 8 sejtre, 2 független preparátumból.) Jobb grafikon: Ismételt ATP-ingerlés után az extracelluláris oldatot Mg2+-mentesre cseréltük 180 másodpercig. Ezután Mg2+ mentes oldatban ismét ingereltük a sejteket. (Reprezentatív 10 sejtre 2 független preparátumból.)
A citoplazma Ca2+ jelét követő [Mg2+]-emelkedés nem a HEK-239T sejtre specifikus jelenség. H295R humán adrenokortikális sejtben a feszültségfüggő Ca2+ belépést is Mg2+ jel követi, ugyanakkor kapacitatív Ca2+ belépés során ebben a sejtben teljesen elmarad a [Mg2+]c emelkedése (39. ábra). ∆[Ca2+]
∆[Mg2+] p=0.00003
0.35
0.25 0.5
0.15 0.25
RM 0
K+
RM
K+
0
Mag-Fluo-4 ∆F/ Fo
FuraRed Fo/∆F
0.75
39. ábra A Ca2+ és Mg2+ jel összehasonlítása különböző forrású Ca2+ jelek esetén intakt H295R sejtben A FuraRed (piros oszlopok) és a Mag-Fluo-4 (kék oszlopok) festékek fluoreszcenciáját követtük a sejtmagban lézer konfokális mikroszkóppal. A Ca2+ jelet 15 mM K+-mal vagy Ca2+-depléció (10 perc 500 nM thapsigargin Ca2+-mentes oldatban) utáni rekalcinációval (RM) váltottuk ki, a Ca2+ és Mg2+ jelek maximális amplitúdóját elemeztük. A raktárszabályzott Ca2+ belépés alatt mért Mag-Fluo-4 fluoreszcencia emelkedése nem különbözött az alapvonaltól (p>0,05). (n=11 K+ és 7 raktár mediált Ca2+ belépés.)
67
Mindezeket egybevéve az IP3 által kiváltott Ca2+ jelet egyidejű Mg2+ jel követi HEK-293T sejtben, és ez a Mg2+ jel abban a koncentráció-tartományban mozog, amely hatékonyan gátolja a mitokondriális Ca2+ felvételt.
A Mg2+ forrásainak azonosítása HEK-293T sejtben Az irodalmi adatok szerint ugyan a [Mg2+]c szigorúan kontrollált élettani paraméter, szabályozásáról keveset tudunk [213-215]. Ezért is kívántuk az általunk leírt Mg2+ jel forrásait lokalizálni. Köszönhetően a membránpotenciálnak a Mg2+ elektrokémiai grádiense nagy hajtóerőt jelent a Mg2+ sejtbe történő belépéséhez. HEK-293T sejtben azonban az extracelluláris Mg2+ nem játszik szerepet az általunk látott gyors Mg2+ jel kialakításában. ATP-vel történő ismételt ingerlés a Mg2+ jel csökkenését vonja maga után (38. ábra jobb panel). Ha ezek után a sejteket 3 percig Mg2+-mentes oldatban tartjuk, az ismételt ingerlés során a Mg2+ jel amplitúdója megegyezik a korábbival és megintcsak deszenzitizációt mutat (38. ábra jobb panel). Ebben az időtartományban tehát az ATP kiváltotta Mg2+ jel nem függ az extracelluláris Mg2+-tól. (Az ATP kiváltotta Ca2+ jel amplitúdója sem változott Ca2+ mentes extracelluláris oldatban (38. ábra), vagyis a purinerg agonista döntően a P2y receptorokon keresztül hat ebben a sejtben.) Az intracelluláris ATP bomlása Mg2+ felszabadulással jár [216], hiszen az ADP rosszabb kelátora a Mg2+-nak, mint az ATP. Ezt figyelembe véve megvizsgáltuk az extracelluláris ATP, mint purinerg agonista hatását a citoplazma [ATP]-ra luciferinluciferáz módszerrel [180], intakt sejtekben. A mitokondriális szétkapcsolószer FCCP (5 µM) és a glikolízist gátló 2-dezoxiglükóz (DOG, 5 mM) együttesen 70%, ugyanezek gátlószerek jodoacetáttal (IAA, 1 mM) kiegészítve 80%-os lumineszcencia esést okoztak (40. ábra). IP3-mobilizáló agonistával (10 µM ATP) való ingerlés mintegy 20%-os eséshez vezetett 250 s alatt (40. ábra). Tekintve, hogy a citoplazma Mg2+ jel kb. 500 ms alatt eléri maximális amplitúdója felét (37. ábra), az ATP-bomlás t1/2 értéke pedig 58 + 3 s (n=7), a gyors Mg2+ jel döntően nem ATP-bomlásból származik.
68
[ATP]C (L/LO)
1.0 ATP
0.5
0.0
FCCP+DOG
FCCP+DOG+IAA
40. ábra Az IP3-mediált Ca2+ jel hatása az citoplazma [ATP]-jára intakt HEK-293T sejtben A sejteket GFP-aequorinhoz kötött luciferáz enzimet kódoló plazmiddal transzfektáltuk. A lumineszcenciát 1 mM luciferin jelenlétében, luminométerrel mértük, a stimulus pillanatában mért értéket tekintettük egységnyinek. Az ATP, FCCP+dezoxyglükóz és az FCCP+dezoxyglükóz+jodoacetát hozzáadását a nyíl jelöli. (részleteket lásd a szövegben; n=7 ATP, 2-2 FCCP+DOG és FCCP+DOG+IAA esetén)
100 s
Ca2+ jel során a citoplazma [Ca2+]-ja és [H+]-ja is emelkedik, ezek pedig Mg2+-ot mobilizálhatnak a kation-kötőhelyekről. Ezen jelenség hozzájárulását a Mg2+ jel kialakításához UV-fotolízissel, intakt HEK-293T sejtekben vizsgáltuk. A sejteket nemcsak fluoreszcens festékekkel (FuraRed és Mag-Fluo-4), hanem orto-nitrofenilEGTA-val is töltöttük, a Ca2+ felszabadítást UV-lézer segítségével végeztük. Az így létrehozott Ca2+ jel is [Mg2+]c-emelkedéssel jár (41. ábra). Ha azonban az UV-fotolízissel és ATP-vel létrehozott jeleket a közös [Ca2+]c-tartományban vetjük össze (41. ábra betét), akkor látható, hogy az IP3-mobilizáló agonista ugyanolyan [Ca2+]c mellett hatékonyabb ingere a [Mg2+]c emelkedésének. Ebben a közös [Ca2+]c-tartományban a Ca2+ jelre normalizált Mg2+ jel szignifikánsan magasabb ATP-vel történő ingerlés (1,18 + 0,032; n=14), mint UV-fotolízis során (0,83 + 0,009; n=24; p=0,0001). Ezek alapján tehát a Ca2+-emelkedés tényleg leszorít Mg2+-t a citoplazmatikus kötőhelyekről, de nem ez a leszorítás a Mg2+ jel egyetlen forrása.
69
2+ [Mg [Mg2+]]cC (MF (MFF/F FoO/F) )
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
2.0
1.30
1.45
1.60
1.5
1.0 1.00
1.25
1.50
1.75
2+
(FR FO/F) 2+] ]C(FR [Ca[Ca Fo/F) c 41. ábra Az IP3 által kiváltott és UV-fotolízissel létrehozott Ca2+ és Mg2+ jelek összehasonlítása intakt HEK-293T sejtben Az intakt HEK-293T sejtekben egyidejűleg mértük a [Ca2+]c-t és a [Mg2+]c-t FuraRed és Mag-Fluo-4 festékekkel, konfokális mikroszkópiával. A sejteket 10 µM ATP-vel (piros háromszög) ingereltük vagy orto-nitrofenil-EGTA-ból UV-fotolízissel szabadítottuk fel a Ca2+-t (kék kör), majd a citoplazma Ca2+ jel normalizált amplitúdójának függvényében ábrázoltuk a Mg2+ jel normalizált amplitúdóját. Betét: a közös [Ca2+] tartományba (lásd szöveg) eső pontokat és a rájuk illeszthető regressziós egyenest (szaggatott egyenes) ábrázoltuk. (További részletek a szövegben.)
Mivel az IP3 hatékonyabb ingernek bizonyult a Mg2+ jel tekintetében, mint a fotolízissel létrehozott ugyanakkora Ca2+ jel, ill. az IP3-receptor Mg2+ konduktanciája hasonlóan nagy, mint Ca2+ vezetőképessége [217], felmerül egy IP3-érzékeny belső Mg2+ raktár lehetősége is. Ennek vizsgálatára permeabilizált HEK-293T sejteket használtunk. A permeabilizáció után a sejteket 1 mM Mg2+, 1 µM Ca2+ és 2 mM ATP tartalmú citoszol oldatban tartottuk 10 percig, hogy a belső raktárakat telítsük bivalens kationokkal. Ezután a sejtek magjában mértük az IP3 hozzáadására létrejött ionkoncentráció-változásokat. Az oldat [Ca2+]-ját 100 nM-ra, [Mg2+]-ját 0,3 mM-ra állítottuk be EGTA vagy BAPTA segítségével (20-20 µM), a [Ca2+]-t Rhod-2, a [Mg2+]-t Magnesium Green szabad sav festékekkel mértük. Az esetlegesen felszabaduló Mg2+-t kelálni képes adenin nukleotidokat ezúttal kihagytuk az citoszol oldatból. Mint az a 42. ábrán látható, 1 µM IP3 többféle válasz-mintázatot is létrehozott. Az esetek kb. egyhatodában Mg2+
70
felszabadulás volt mérhető Ca2+ emelkedés nélkül (39. ábra b panel), másik egyhatodában pedig [Ca2+]-emelkedés Mg2+ jel nélkül (39. ábra a panel). Az esetek kétharmadában mindkét ion koncentrációja emelkedett, de eltérő kinetikával (39. ábra c és d panel). Ez arra utal, hogy az IP3 képes belső raktárból is Mg2+-t mobilizálni.
2+
b 1.6
1.4
1.2 1.4
1.2
1.2
1.1 1.2
1.1
1.0
1.0 1.0
1.0
0.8
0.9 0.8
0.9
1.6
c
1.6
d
1.4
1.2 1.4
1.2
1.2
1.1 1.2
1.1
1.0
1.0 1.0
1.0
0.8
0.9 0.8
[Mg2+] (MgG F/FO)
[Ca ] (Rhod-2 F/FO)
a 1.6
0.9 10 s
42. ábra Az IP3 által kiváltott nukleáris [Ca2+]- és [Mg2+]-változások permeabilizált HEK-293T sejtben A HEK-293T sejteket 10 percig digitoninnal (20 µg/ml) permeabilizáltuk majd további 10 percig 1 µM Ca2+ és 1 mM Mg2+ koncentrációjú, 2 mM ATP-t is tartalmazó citoszol oldatban tartottuk őket. A mérés kezdetekor a citoszol oldathoz 1-5 µM Magnesium Green és 5 µM Rhod-2 szabad savat adtunk a [Mg2+] és [Ca2+] méréséhez. A fluoreszcenciát a sejtmag felett konfokális mikroszkóppal mértük. IP3 (1 µM, nyíl) hozzáadása különféle válaszokat váltott ki. A görbék reprezentatívak 5 (a), 4 (b) és 19 (c+d) sejtre. (További részletek a szövegben.)
Összeségében tehát elmondható, hogy a Ca2+ jellel párhuzamosan kialakuló citoplazma Mg2+ jel legfontosabb forrása a citoszolban lévő kötőhelyekről történő Mg2+ leszorítás és az IP3 hatására egy belső raktárból történő felszabadulás.
71
Megbeszélés A mitokondriális Ca2+ felvétel és a mitokondrium Ca2+ anyagcseréje a sejt életének és fiziológiás funciójának betöltése szempontjából alapvető folyamat. A [Ca2+]m szabályozza többek között a mitokondriális mátrix három dehidrogenázát, a citrát-kör bizonyos enzimeit és az ATP-szintázt is [38-41]; a fiziológiást meghaladó Ca2+ felvétel pedig apoptózishoz vezethet [1]. Ezen általános biokémiai, élettani és patológiás folyamatok mellet a mitokondriális Ca2+ felvétel olyan sejt- és szövettípusra specifikus folyamatokat is módosít, mint a génexpresszió [19], a szteroid-szintézis [18;173] vagy az exocitózis [17;218]. Érthető tehát, hogy bármely tényező, mely a mitokondriális Ca2+ felvételt szabályozza vagy indirekt módon befolyásolja, messzemenően befolyásolja a sejt energetikáját és fiziológiás működését. Annak ellenére, hogy a mitokondriális Ca2+ felvétel leírása közel fél évszázada történt [51] és mitokondrium szuszpenzión a Ca2+ felvétel alaposan és sok szempontból jellemzett
folyamatnak
tekinthető
[13],
számos
lényegi
kérdés
továbbra
is
megválaszolatlan, az ionfelvétel intakt sejten belüli közvetlen szabályzása pedig gyakorlatilag nem ismert [24;65]. A Ca2+ felvétel in vitro alacsony affinitása [13] és az intakt sejten belül tapasztalt nagy mitokondriális ionfelvétel [138] között feszülő ellentmondást a HCMD-elmélet [139-141] csak részben oldja fel. A ma elfogadott irodalom ugyanis a HCMD-t a mitokondriális Ca2+ felvétel sine qua non-jának tartja, holott ezt számos megfigyelés erőteljesen megkérdőjelezi [107;168;219]. Nincs megnyugtató magyarázat továbbá a Ca2+ felvétel hasonló körülmények között mért EC50 értékének nagyfokú szórására [13;65-67] sem; a voltage-clamp módszerrel nyert adatok pedig a „klasszikustól” merőben eltérő kinetikát és affinitást mutattak [73;74]. Alapvető nehézség továbbá az, hogy az MCU, helyesebben az MCU-nak tulajdonított transzportért felelős fehérje továbbra sem leírt, s így a molekuláris partnerei sem ismertek [44].
72
Módszertani megfontolások Kísérleteink túlnyomó többségét a humán adrenokortikális, aldoszteront és egyéb szteroid-termékeket is elválasztó H295R sejtvonalon [175] végeztük. Mivel a H295R endokrin-eredetű sejvonal, és − ismeretlen okból − az endokrin és endokrin-eredetű sejtek mitokondriuma különösen érzékeny a [Ca2+] emelkedésére [107;168], ideális modellsejtnek tűnt a HCMD-független, alacsony szubmikromoláris Ca2+ jelek mitokondriális
hatásainak
vizsgálatára.
Ugyanakkor
primer
megfelelőjében,
a
mellékvesekéreg glomerulóza sejtben korábbi adatok utaltak arra, hogy lehetséges HCMD-függő Ca2+ felvétel is [148]. Kísérlettervezés szempontjából szerencsés körülmény továbbá, hogy a H295R sejtben IP3-mediált módon, valamint feszültségfüggő és raktár-szabályozott ionbelépésen keresztül is lehet citoplazma Ca2+ jelet kiváltani, ezek amplitúdójukban pedig összemérhetőek. Így a különböző eredetű, de azonos mértékű [Ca2+]c-emelkedések mitokondriális hatása könnyen összehasonlítható. Fontos szempont, hogy szteroidtermelő sejt lévén, a mitokondrium Ca2+ felvétele nemcsak a sejt metabolikus aktivitását szabályozza, hanem egy sejtspecifikus, fiziológiás funkciót, a hormontermelést is befolyásolja [18;173]. A sejtvonal használata, ellentétben a primer glomerulóza sejttel, transzfekciós kísérletekre is lehetőséget adott; immortalizált modell birtokában pedig nincs szükség kísérleti állatokra. A mitokondriális [Ca2+]-t és változásait több eltérő fluoreszcens és lumineszcens módszerrel vizsgáltuk. Intakt sejtben a pozitív töltésű, mitokondriumban dúsuló Rhod-2 Ca2+ érzékeny fluoreszcens festékkel mértük a [Ca2+]m-t. Ez a fluoreszcens festék alkalmas a [Ca2+]m relatíve szelektív mérésére, hiszen nagyrészt a mitokondriumban dúsul, pH érzékenysége minimális és 500-1000 nM körüli Kd értékének köszönhetően a 0,1-10 µM-os [Ca2+] tartományban fluoreszcenciája arányos a [Ca2+]-val [24;168]. Előnyei közé tartozik, hogy 543 nm-en gerjeszthető, ez a magasabb hullámhosszú lézer besugárzás pedig kevésbé károsítja a sejtet, mint a rövidebb hullámhosszú fotonok [220]. Intakt sejtben HCMD-függő mitokondriális Ca2+ felvétel során várható gyors és nagy amplitúdójú [Ca2+]m emelkedés [65], ez pedig detektálási problémát okozhat pl. az aequorinon alapuló mérési rendszerekben [221;222]. Ez a hátrány Rhod-2 esetében nem 73
jelentkezik. A Rhod-2-nek további előnyös tulajdonsága, hogy kis koncentrációban a citoplazmában és magplazmában is megtalálható, és, köszönhetően a fluoreszcens festékek nukleuszban mutatott nagy dinamikus tartományának [188], alkalmazható a [Ca2+]c mérésére is [187;223]. Így egyetlen festékkel lehetséges a [Ca2+]c és [Ca2+]m egyidejű követése, legalábbis olyan sejttípusokban, ahol a mitokondrium a sejttérfogat jelentős hányadát teszi ki. A glomerulóza és a H295R sejtek ilyenek, mitokondriumban rendkívül gazdagok [224]. Természetesen a sejtek digitoninos permeabilizációjakor a mitokondrium mátrixában található Rhod-2 marad a sejten belüli egyetlen fluoreszcens jelforrás, így ilyen körülmények között tetszőleges sejttípusban alkalmazható a [Ca2+]m mérésére [24]. A permeabilizált H295R sejten végzett [Ca2+]m mérések jelentős részét a mitokondriumba irányított GFP alapú Ca2+ érzékeny fehérjével, mitokondriális inverz Pericam-mel (mt-inv-Pericam) végeztük. Köszönhetően a humán citokróm c oxidáz VIII lokalizációs szignáljának [24], a fehérje gyakorlatilag csak a mitokondriális mátrixban található meg [178], jele így specifikus a mitokondriumra. A mt-inv-Pericam nagy Ca2+ affinitása (Kd ∼ 200 nM [178;189]) ugyanakkor lehetővé teszi, hogy a szubmikromoláris [Ca2+] tartományban igen nagy pontossággal mérjük a [Ca2+]m-t. Mivel a legtöbb ilyen kísérletben a [Ca2+]m emelkedésének sebességét vizsgáltuk, az adatok pontos kinetikai elemzéséhez szükség is volt a nagy Ca2+ érzékenységű mérésre. (Lévén a mt-inv-Pericam fluoreszcenciája Ca2+ hatására csökken, a fehérjével nyert felvételi sebesség dimenziója Fo/∆F/∆t volt. A FuraRed hasonlóan viselkedik, így a citoplazma jelének jellemzésére az Fo/F normalizált értéket használtuk.) Tekintve, hogy a nagy Ca2+ affinitás miatt a mt-invPericam hamar telítődik [178], a fehérjével mért mitokondriális Ca2+ válasz amplitúdója nem mérhető megbízhatóan, ezt a paramétert nem is értékeltük. Permeabilizált HEK-293T sejtben a [Ca2+]m-t a mitokondriumba irányított aequorinnal mértük. Permeabilizált sejtben a perimitokondriális [Ca2+] szuperfúziós rendszerrel történő emelésekor a HCMD nem alakulhat ki. Saját méréseink alapján permeabilizált HEK-293T sejtek mitokondriumában a [Ca2+] ilyen körülmények között nem is emelkedett a több µM-os tartományba. Ennek köszönhetően az aequorin fogyásából adódó mérési hibára nem kellett számítani [191]. Ugyanakkor előnyös, hogy
74
az aequorinnal nyert adatok (a Kd ismeretében) a fluoreszcens festékeknél jóval egyszerűbben konvertálhatóak koncentrációra [144]. A [Ca2+]c mérésére már jól bevált fluoreszcens technikákat alkalmaztuk. A Fluo-4 nagy dinamikus tartománya és kedvező Kd-je ideálissá teszi a szubmikromoláris [Ca2+] jelek detektálására [225;226]. Fluo-4 esetében, szemben a széles körben alkalmazott Fura-2-vel, nincs szükség UV-tartományban történő gerjesztésre, amely potenciálisan károsíthat számos sejtfunkciót és megváltoztathatja a sejt Ca2+ anyagcseréjét [220;223;227]. A Mg2+ anyagcserével kapcsolatos kísérleteinkben a FuraRed használatának előnyei a következőek voltak: emittált jele spektrálisan jól elkülöníthető mind a [Ca2+]c, mind a [Ca2+]m, mind pedig a [Mg2+]c mérésére használt összes többi fluorofórtól [228]; Kd-je ideális a szubmikromoláris-alacsony mikromoláris [Ca2+] tartományban történő mérésre [188]; egyazon hullámhosszon gerjeszthető, mint a MagFluo-4 és így technikailag lehetővé teszi a [Ca2+]c és [Mg2+]c gyors és egyidejű mérését. A [Ca2+]c-t a legtöbb esetben a mag felett mértük. Ez a módszer az irodalomban is szokásos (pl. [179]), és saját korábbi vizsgálataink is alátámasztották, hogy a [Ca2+]c változásai a mag felett megbízhatóan követhetők [187]. E méréstechnikával kihasználhatjuk a fluoreszcens festékek maximális dinamikus tartományát [188] és elkerüljük a festékek kompartmentalizációjából származó esetleges mérési hibákat [15].
A mitokondrium térbeli helyzetének hatása a Ca2+ felvételre Munkacsoportunk korábbi adatai alapján a H295R sejt primer megfelelőjében, a glomerulóza sejtben van HCMD-függő Ca2+ felvétel, ugyanakkor képes rendkívül kicsi, akár 100 nM-os [Ca2+]-emelkedésre is mitokondriális aktivációval válaszolni [107]. Ezek a megfigyelések felvetették, hogy esetleg egyazon sejtben mind HCMD-függő, mind attól független Ca2+ felvétel is lehetséges lehet. Ennek közvetlen igazolására azonban újfajta metodikai megközelítést kellett kidolgoznunk. A HCMD elmélet alapján a Ca2+ forráshoz közeli mitokondrium Ca2+ jelének gyorsabbnak (nagyobbnak) kell lennie, mint az attól távoliénak [141]. Ezen feltevés vizsgálatához a [Ca2+]m és az ER-mitokondrium távolság egyidejű követését kellett megoldanunk. Ehhez az ER-t a külső felszínéhez irányított zöld fluoreszcens fehérjével (ER-GFP, [177]) jelöltük meg. A rekombináns fehérje megfelelő
75
sejten belüli lokalizációt mutatott: kolokalizált az ER-t festő ER Tracker Red festékkel. (Az ER Tracker Red festéket nem használhattuk rutinszerűen az ER jelölésére, ugyanis glibenclamid alapú festék, elvben tehát nyithatja a sejt ATP-szenzitív K+ csatornáit [229].) Konfokális mikroszkópiával, megfelelően kicsi mérési területen (ROI-ban) mérve sikerült a mitokondriális Ca2+ felvétel kezdeti sebessége, valamint az ER-közelsége között rendkívül szoros összefüggést kimutatnunk AII-vel kiváltott Ca2+ jelek esetében. Ez közvetlenül igazolja, hogy a Ca2+ forrás távolsága jelentős tényező a mitokondriális Ca2+ felvétel szempontjából, tehát tekinthető adott sejttípusban a HCMD elmélet közvetlen kimutatásának is. Ennek megfelelően részleges magyarázatot ad arra, hogy az in vitro alacsony affinitású Ca2+ felvétel [42] hogyan lehet mégis jelentős in vivo körülmények között. Az AII esetében tapasztalt szoros negatív összefüggés a Ca2+ felvétel és az ERtávolság (vagyis pozitív korreláció a Ca2+ felvétel és az ER-közelség) között teljesen hiányzott akkor, mikor a sejteket K+-mal ingereltük. Ez megfelelt a vártnak, hiszen ilyen ingerlés során a jel kezdetén a Ca2+ forrása az extracelluláris tér [230]. (Kismértékű IP3keletkezésre csak jóval később kell számítani [18;231].) Az ER-távolság - Ca2+ felvétel összefüggés hiánya K+ esetében ugyanakkor alátámasztja azt is, hogy az AII esetében tapasztalt szoros kapcsolat nem a mérési felállásból fakadó műtermék. Az összefüggés hiánya K+ esetében azonban még nem zárja ki azt, hogy ilyenkor a mitokondriális Ca2+ felvétel HCMD-függő módon jöjjön létre: a plazmamembrán alatti mitokondriumok ugyanis elvben ki lehetnek téve HCMD-nek [208]. Hogy mégsem ez a helyzet, azt a következő megfigyelések támasztják alá: H295R sejtben a mitokondriumoknak csak elenyésző hányada található közvetlenül a plazmalemma alatt; a mitokondriális Ca2+ felvétel sebessége nem függ a mitokondrium plazmamembrántól vett távolságától. A feszültségfüggő csatornák szájadékánál az ionbelépés során a lokális [Ca2+] megközelítheti a 10-4 M nagyságrendet [208;232], ugyanakkor ez a koncentráció időben nagyon gyorsan lecsökken, a csatornáktól pár 100 nm-re pedig már nem haladja meg a globális citoszol koncentráció értékét [141;233;234]. Mivel a plazmamembránhoz közelebbi mitokondriumok H295R sejtben ugyanolyan gyors és ugyanakkora Ca2+ jelet mutattak, mint a perinukleáris, sejthártyától távoli organellumok, a plazmamembránközeli mitokondriumok valószínűsíthetően nem voltak elég „szubplazmalemmálisak”
76
ahhoz, hogy HCMD-effektus létrejöjjön. Ezek alapján pedig nagyon valószínű, hogy Ca2+ felvételük teljesen HCMD-független. A mitokondriális Ca2+ felvétel „HCMDfüggetlensége” Ca2+ influx során nem specifikus a H295R sejtre, inzulintermelő β-sejtek esetében feszültségfüggő Ca2+ belépés során is leírtak hasonló jelenséget [219]. Néhány további megfigyelésünk is összhangban van a H295R sejtben látott HCMD-független mitokondriális Ca2+ felvétellel. COS-7 sejtekben a plazmamembrán alatti
<100 nm széles rétegben vizsgáltuk a raktárszabályzott Ca2+ belépés során a
mitokondriális Ca2+ felvételt ún. „total internal reflection”, TIRF mikroszkópiával. A belső Ca2+ raktárak kiürítésekor az ER membránjában lévő STIM-1 (stromal interacting protein 1, [235;236]) molekula a perifériás ER hólyagokba helyeződik át és beindítja a Ca2+ beáramlást az Orai-1 csatornán keresztül [237;238]. COS-7 sejtben a belső Ca2+ raktárak ürítése után a plazmamembrán alatti mitokondriumok döntő többsége nem kolokalizált a Ca2+ belépés tényleges helyét jelző STIM-1-gyel. Ugyanakkor az a néhány mitokondrium, amely a STIM-1-gyel kolokalizációt, vagy legalábbis átfedést mutatott, nem vette fel gyorsabban a Ca2+-t kapacitatív beáramlás alatt. Kiemelendő továbbá, hogy irodalmi adatok alapján a kapacitatív Ca2+ beáramlásért felelős molekuláris komplexben (STIM-1/Orai-1) a mitokondrium nagy valószínűséggel nem is fér el [192;193]. Megfigyeléseink arra utalnak, hogy még a STIM-1-Orai-1 komplex közelében lévő mitokondriumok sincsenek HCMD-effektusnak kitéve. Következésképpen ezen adatok egy másik sejttípuson (COS-7), más technikával (TIRF) és más Ca2+ jel mellett (raktárszabályozott belépés) erősítik meg a H295R sejten nyert K+-os adatokat. Megfigyelésünk összhangban van a korábbi irodalmi adatokkal, mely a mitokondriumok STIM-1/Orai-1 komplexből történő „kiszorulását” valószínűsítették [192;193].
A p38 MAPK szerepe a mitokondriális Ca2+ felvétel gátlásában H295R sejtben tehát HCMD-függő és attól független módon is létrejöhet Ca2+ felvétel, s mint ilyen, megfigyelésünk részben megerősíti a HCMD-elméletet, részben pedig (számos egyéb megfigyeléssel egyetemben [107;148;168;239;240]) cáfolja a HCMD-függő mitokondriális Ca2+ felvétel kizárólagosságát. Az AII-vel és K+-mal nyert adatok összehasonlítása egy további váratlan jelenségre is felhívja a figyelmet. A két 77
agonista az alkalmazott koncentrációban (AII 1 nM; K+ 15 mM) közel ugyanakkora globális (vagyis a sejt egészére jellemző, nagy ROI-okban mért) citoplazma Ca2+ jelet hoz létre. Az ER-távoli mitokondriumok tehát ugyanakkora [Ca2+]-nak vannak kitéve a jel során mindkét agonista esetében, ennek ellenére AII-vel történt ingerlés során ezek a mitokondriumok nem, vagy csak elenyésző mértékben vesznek fel Ca2+-t. Ez arra engedett következtetni, hogy az AII nemcsak mitokondriális Ca2+ jelet vált ki, hanem egyidejűleg gátolja is az ionfelvételt az organellumba. Ez a gátlás értelemszerűen az ERtávoli mitokondriumok esetében a legszembetűnőbb, hiszen ezek nincsenek kitéve HCMD-nek sem. Mivel a mitokondriális Ca2+ felvétel kezdeti meredekségét az AII kiváltotta Ca2+ válasz legelején (1-5 s) határoztuk meg, ez azt is jelenti, hogy mire a Ca2+ jel „beindul”, a mitokondriális gátlás már aktív. Vagyis minden bizonnyal az AII már a Ca2+ jel előtt, Ca2+-független módon beindított egy gátló jelpályát. Ezen feltevés igazolására olyan kísérleti felállást terveztünk, melyben az AII Ca2+ független jelátviteli lépéseit tudtuk szelektíven vizsgálni. A belső, IP3-érzékeny Ca2+ raktárakat a szarko-endoplazmás retikulum Ca2+ ATPázt (SERCA) gátló thapsigargin [241;242] segítségével, Ca2+ mentes oldatban ürítettük. Ilyen körülmények között adva az AII már nem vált ki [Ca2+]c emelkedést, ugyanakkor az extracelluláris Ca2+ visszaadásával kiváltott Ca2+ belépés [243] során csökkenti a mitokondriális Ca2+ felvétel hatékonyságát. (Érdekes módon az AII fokozza a kapacitatív Ca2+ belépést is: a [Ca2+]cemelkedése nagyobb AII-adás után. Ez feltehetőleg a plazmamembrán foszfoinozitid összetételének megváltoztatásán keresztül valósul meg [182].) A mitokondriális gátlás kifejtésében elsősorban kinázok lehetséges szerepét vetettük fel, ugyanis az AII a Ca2+ jellel párhuzamosan, azzal részlegesen átfedve vagy épp függetlenül több kináz-jelpályát is beindít számos sejttípusban [244-246], többek között glomerulóza [18;247] és H295R sejtben is [199;206;248;249]. Valóban, az aspecifikus foszfatáz-gátló okadánsav, amely a szerin-treonin protein foszfatázok 1, 2A, és 2B csoportját gátolja [250], erőteljesen csökkentette a mitokondriális Ca2+ felvételt intakt, AII-vel ingerelt sejtben. Ez összhangban áll a kinázok feltételezett szerepével az AII kifejtette gátlás létrehozásában, ugyanakkor azt is jelzi, hogy ez a gátlás foszforiláción, és nem AII-indukált defoszforiláción keresztül valósul meg. Más munkacsoport is közölt adatokat a Ca2+ anyagcsere változására foszfatáz-gátló
78
jelenlétében H295R sejtben [251]. Az általuk alkalmazott gátlószer, a calyculin A gátolta a mitokondriális Ca2+ felvételt K+-, de nem befolyásolta azt AII-inger során. Laborunk saját tapasztalatai szerint a calyculin A a sejtmorfológia olyan durva akut változásait okozza (sejtzsugorodás, a szétterülés megszűnése, membránfodrok képződése stb.), melyek nagyon megnehezítik a Ca2+ anyagcserében beállt változások megnyugtató értelmezését, s melyek magyarázhatják Rossier munkacsoportjának miénkkel csak részben átfedő eredményeit. Az AII kiváltotta gátlás létrehozásában tehát Ca2+-független módon is aktiválható kinázokat kerestünk. A Ca2+ belépés ugyan önmagában is aktiválja a p38 MAPK-t [252;253], de az AII képes ezt Ca2+ függetlenül, a 12-hidroxi-eikozatetraénsavon (12HETE) [196] vagy a β-arrestinen keresztül [254;255] is megtenni. Ráadásul felvetődött a p38 MAPK gátlószereinek mitokondriális Ca2+ felvételt fokozó hatása is HeLa sejtben [88]. Kísérleteinkben a p38 MAPK szerepét a mitokondriális Ca2+ felvétel gátlásában egyértelműen bizonyították a következő megfigyelések: az AII már egy perc alatt képes a p38 MAPK foszforilációjának fokozására és így aktiválására; a p38 MAPK két gátlószere is fokozza a mitokondriális Ca2+ felvétel hatékonyságát, míg az inaktív analóg hatástalan; a p38 MAPK génjének csendesítése mind intakt sejten AII-ingerlés esetén, mind permeabilizált sejtben fokozza a mitokondriális Ca2+ felvételt. Ezen adatok egyértelműen mutatják, hogy az AII hatására kialakuló mitokondriális gátlásnak a p38 MAPK aktivációja a sine qua non-ja. (Itt kell megemlíteni, hogy Montero szerint a p38 MAPK gátlószere, az SB202190 nem kinázok gátlásán keresztül, hanem közvetlenül az MCU-ra hatva fokozza a Ca2+ felvételt [88]. A kísérleti körülmények szigorú kontrollálásával azonban sikerült megmutatnunk, hogy az SB202190 Ca2+ felvételt fokozó hatása ATP hiányában nem érvényesül: az SB202190 hatása ténylegesen a foszforiláció gátlásán keresztül valósul meg [256].)
Az új típusú PKC izoformák szerepe Pusztán elméleti megfontolásokat követve a fenti megfigyelések alapján a p38 MAPK aktivációjának gátolnia kell a mitokondriális Ca2+ felvételt. Irodalmi adatok [203205] és saját megfigyeléseink alapján a TNFα és a S. aureus α-toxinja aktiválja a p38
79
MAPK-t. Az aktiváció ellenére sem a TNFα, sem az α-toxin előkezelés nem csökkenti a mitokondriális Ca2+ felvétel hatékonyságát. Ezek alapján pedig a p38 MAPK aktivációja szükséges, de nem elégséges a Ca2+ felvétel AII-mediált gátlásához, egyéb faktorra vagy faktorokra is szükség van. Az ún. új típusú (nPKC) és atipusos PKC izoformák gátlásban betöltött lehetséges szerepe több okból is felmerült. Egyrészt HeLa sejtben a PKC α, β, δ és ζ izoformái (izoforma-függő módon) befolyásolják a mitokondriális Ca2+ felvételt [87], másrészt a PKCε és PKCθ kifejeződnek primer glomerulóza sejtekben [257]. A PKCε és PKCθ izoformák mellett a H295R pedig még a PKCζ-t is expresszálja [206;257]. Említésre érdemes az is, hogy a PKCε szívizomsejtek mitokondriumaiban kimutatható [102;258], képes transzlokálódni
az organellumba [99;259], fokozott
expressziója pedig
kardioprotektív [102]. Ezek felvetették szerepét a mitokondriális Ca2+ anyagcsere szabályzásában. Még fontosabb a mi szempontunkból azonban, hogy a H295R sejt nagy mennyiségben fejezi ki a PKCε -t [197], az AII pedig képes Ca2+ független módon is aktiválni ezt a kinázt [206]. Az
nPKC
izoformák
szerepének
vizsgálatára
farmakológiai
módszert
alkalmaztunk, és kihasználtuk, hogy a Gö6976 gátlószer csak a konvencionális PKC izoformákra (α, βI, βII, γ) hat [197], míg a bisindolilmaleimid-1 (BIS) mind a konvencionális, mind az nPKC izofomákat (ε, δ, θ, η) képes gátolni [207]. Kihasználva a gátlószerek eltérő spektrumát, az AII gátló hatását megint Ca2+ mentes körülmények között vizsgáltuk: a belső Ca2+ raktárakat Ca2+ mentes oldatban kiürítettük majd AII-t adtunk. Az AII mellé adott Gö6976 nem befolyásolta, de a BIS szignifikánsan növelte a mitokondriális Ca2+ felvétel hatékonyságát kapacitatív influx során. Az AII kifejtette gátlás kialakulásához tehát szükség van az nPKC izoformák aktivitására is. A p38 MAPK-zal analóg módon az nPKC-k önmagában történő aktiválása sem elég a mitokondriális Ca2+ felvétel gátlásához. Akárcsak a TNFα és a S. aureus α-toxin előkezelés, a forbolészterrel (PMA) együtt adott Gö6976 sem befolyásolja a mitokondriális Ca2+ felvételt. Ha azonban ezek mellé adott TNFα-val a p38 MAPK-t is aktiváljuk, akkor a mitokondriális Ca2+ felvétel hatékonysága már szignifikánsan csökken. Ezzel a módszerrel tehát sikerült a p38 MAPK–nPKC rendszer mitokondriális hatását mindkét oldalról megmutatni: nemcsak az aktivált kinázok gátlása fokozza,
80
hanem a kinázok „külső” aktiválása is csökkenti a mitokondriális Ca2+ felvételt. Ugyanakkor azt is fontos itt megemlíteni, hogy az általunk alkalmazott kinázaktiváló előkezelés (PMA+Gö6976+TNFα) lehetővé teszi a p38 MAPK és nPKC-k egyidejű aktivációját, s ezzel utánozza az AII ugyanezen hatását. Az előkezelésről bizonyítottuk, hogy valóban a p38 MAPK-on keresztül hat, de nem vált ki Ca2+ jelet. Az előkezelés tehát Ca2+ jelnek még nem kitett, Ca2+ által még nem módosított mitokondrium vizsgálatát teszi lehetővé. Az, hogy a gátló mechanizmusban pontosan melyik nPKC izoforma vesz részt, nem képezi az értekezésem tárgyát. Röviden annyit érdemes említeni, hogy laborunk Western-blot módszerrel a PKCε jelentős kifejeződését mutatta ki H295R sejtben [256]. (Ugyanezen módszerrel PKCη-t azonban nem sikerült detektálni [256].) A PKCε a protein kináz D (PKD) fő aktivátora több sejttípusban [260-262] és H295R sejtben is expresszálódik [256]. A PKD kimutatható a mitokondriumban [263] és csendesítése fokozza a mitokondriális Ca2+ felvételt [256]. Ezek alapján a PKCε mitokondriális gátlásban betöltött szerepe igen valószínű. (Bizonyos sejtekben a PKD aktivációja más nPKC izoformákon keresztül is, ill. PKC-független módon is létrejöhet [264].)
A gátlás hatása a mitokondriális Ca2+ válasz mintázatának létrehozásában Az AII tehát, a p38 MAPK és az nPKC izoformák együttes aktivációján keresztül, gátolja a mitokondrium Ca2+ felvételét. De hogyan vesz részt ez a gátlás a Ca2+ felvétel ER-távolságtól való szoros összefüggésének és a mitokondriumok sejten belüli inhomogén Ca2+ válaszának kialakításában? Az AII szokatlanul nagy latenciaidővel (10180 s) hozza létre a Ca2+ jelet H295R sejtben. Ezen idő alatt azonban lehetőség van a p38 MAPK és az nPKC izoformák Ca2+-tól független aktivációjára [196;206;254;255]. Erre utal, hogy SB202190 jelenlétében az AII-vel kiváltott [Ca2+]m-emelkedésnek már a kezdeti meredeksége és a pár másodperc alatt elért első csúcsa is [200] fokozódik, vagyis az iniciális Ca2+ jel már egy Ca2+ felvételében gátolt mitokondriumot „talál”. Az ER-ból felszabaduló Ca2+ az ER-közeli mitokondriumoknak értelemszerűen nagyobb ingere, mint az ER-távoli, kis [Ca2+]-nak kitett organellumoknak. Így jöhet létre a Ca2+ felvétel és ER-távolság közötti összefüggés: a HCMD-ben a magas [Ca2+] „áttöri” a gátlást, míg
81
az ER-távoli mitokondriumok Ca2+ felvétele csekély marad. Mindazonáltal a Ca2+ felvétel gátlása a sejt teljes mitokondrium populációján érvényesül. Ha a Ca2+ felvételt ugyanis a mitokondriumok döntő többségét jelentő perinukleáris, ER-mal kolokalizáló organellumokban vizsgáljuk, akkor a p38 MAPK vagy az nPKC-k gátlása itt is jelentősen fokozza a Ca2+ felvételt. Vagyis az ER-közeli, HCMD-nek (nagy valószínűséggel) kitett mitokondriumok ionfelvételét − ha kisebb mértékben is − de szintén gátolja az AII. Az AII által kiváltott mitokondriális gátlás a Ca2+ felvétel „előrecsatolt” szabályzásának tekinthető: az agonista még a detektálható Ca2+ jel kialakulása előtt beindít egy gátló mechanizmust, mely már „készen várja” a Ca2+ felszabadulást, s mint ilyen, a Ca2+ túltöltés meggátlásával védhet az mPTP-függő apoptózistól [130]. K+ esetében a Ca2+ jel elején nem várható az AII-éhez hasonló gátlás, hiszen a Ca 2+ jel itt azonnal megindul [265]. Később a Ca2+ közvetlenül aktiválja a p38 MAPK-t [252;253] és minden bizonnyal PLC-n keresztül [266] a nPKC-t is [197;206], vagyis a mitokondriális Ca2+ felvétel gátlása itt is beindulhat a Ca2+ jel későbbi fázisában. (Ez azonban nem előre, hanem visszacsatolásos gátlás.) Szemben az AII-vel, ahol az ER-közeli mitokondriumok a citoplazma átlagát meghaladó [Ca2+]-nak vannak kitéve, K+ esetén nincs HCMDeffektus, egy előrecsatolt „védő” mechanizmus megléte itt talán kevésbé szükségszerű. Ez a felvázolt modell már csak egyetlen megfigyelésünkre nem ad magyarázatot, mégpedig arra, hogy a gátlás kivédésekor, AII-ingerlés alatt miért lesz az ER-távoli mitokondriumok
Ca2+
felvétele
magasabb
az
ER-közeliekhez
képest.
Ennek
magyarázatához tudnunk kell, hogy a ∆Ψm nem feltétlenül egységes a sejten belül. A sejt perifériáján lévő mitokondriumok ∆Ψm értéke több sejttípusban magasabb, mint a perinukleáris
organellumoké
[267;268].
Mivel
H295R
sejtben
a
perifériás
mitokondriumok egyben ER-távoliak is, megvizsgáltuk, hogy a ∆Ψm értéke függ-e az ER-tól vett távolságtól. Eredményeink szerint az ER-távoli mitokondriumok ∆Ψm-ja magasabb, mint ER-közeli társaiké [269]; feltehetőleg az ER-ból folyamatosan kiáramló Ca2+ [270;271] depolarizálja a hozzá közeli mitokondriumokat. Abban az esetben tehát, mikor a p38 MAPK-nPKC rendszert gátoljuk (pl. p38 MAPK ellenes siRNS-sel), a most gátlás alól felszabadult ER-távoli mitokondrium nagyobb hajtóerővel veszi fel a Ca2+-t, mint az ER-közeli, relatíve depolarizált mitokondrium.
82
Modellünk tehát ugyan megerősíti a mitokondriális Ca2+ felvétel jelenleg széles körben elfogadott elméletét, azonban azt bizonyos vonatkozásban módosítja/kiegészíti. H295R sejtben valóban kimutatható HCMD-effektus. A 15 mM K+ kiváltotta Ca2+ jel során
a
többségükben
perinukleáris
mitokondriumok
kb.
500-600
nM-os
2+
perimitokondriális [Ca ]-nak vannak kitéve [269], amely ugyanakkora mitokondriális Ca2+ jelet generál, mint az 1 nM AII. Az elfogadott nézet szerint 500-600 nM [Ca2+]cemelkedésnek nem várható jelentős hatása a [Ca2+]m-ra [140;191]. Mivel K+ estében nincs HCMD-effektus, ez azt jelenti, hogy az endokrin sejtek mitokondriuma akár pár 100 nM-os Ca2+ jelből is hatékonyan veszi fel a Ca2+-t (lásd még: [107;168]).
A mitokondriális membránpotenciál szerepe a gátlás kialakításában A p38 MAPK és nPKC-k támadáspontjának meghatározása is célja volt kísérleteinknek. Az eddig tárgyalt kísérleti eredmények már utalnak arra, hogy a kinázok közvetítette gátlás közvetlenül a mitokondriumon valósul: sem a p38 MAPK ellenes siRNS kezelés, sem a kinázok egyidejű aktivációja nem befolyásolta a citoplazma Ca2+ jelet AII-, ill. K+-ingerlés alatt; a PMA+Gö6976+TNFα előkezelés nem befolyásolta a [Ca2+]c-t; a kinázok gátolták a Ca2+ jelet IP3-mediált, feszültségfüggő ionbelépésen keresztül kialakult és kapacitatív Ca2+ jelek során [256] is; valamint permeabilizált sejtben is gátló hatássú a p38 MAPK–nPKC rendszer. Ezek alapján pedig megalapozott volt a támadáspontot közvetlenül a mitokondriumban keresni, hiszen a mitokondriális Ca2+ felvétel gátlása független volt a Ca2+ forrásától. Első elméleti lehetőségként a ∆Ψ m szerepét vizsgáltuk a mitokondriális gátlás kialakításában. A ∆Ψm kis csökkenése a Ca2+ felvétel drasztikus gátlását vonhatja maga után [13;91], minden tényező tehát, amely a membránpotenciált befolyásolja, kihat a Ca2+ felvételre is [92]. Az irodalom ráadásul összefüggésbe hozza a PKCε-t az ATP-szenzitív K+ csatorna aktivációjával [100] és a következményes mitokondriális depolarizáción alapuló kardioprotekcióval [101]. Ezen kísérletekben kihasználtuk, hogy a már korábban alkalmazott és tesztelt előkezeléssel (PMA+Gö6976+TNFα) AII és Ca2+ jel nélkül tudjuk aktiválni a p38 MAPK-t és az nPKC izoformákat. A kináz-aktiváció kontrolljaként olyan sejteket alkalmaztunk, melyekben a p38 MAPK kifejeződését siRNS-sel csökkentettük.
83
(Mivel az nPKC és p38 MAPK csak egyidejű aktivációja képes a mitokondriális Ca2+ felvétel gátlására, a p38 MAPK csendesítése önmagában elég a gátló hatás megszűntetéséhez.) Kihasználtuk továbbá a permeabilizált sejtek azon előnyét is, hogy a perimitokondriális [Ca2+] tetszőlegesen beállítható, s nem kell számolni az intakt sejten belül Ca2+ jel alatt jelentkező koncentráció-inhomogenitással sem. A ∆Ψm szerepét a kinázok gátló hatásának kifejtésében két különböző kisérleti felállásban is vizsgáltuk. A K+ ionofór valinomycin segítségével és a perimitokondriális [K+] megválasztásával a szubsztráttal nem ellátott mitokondrium repolarizálható az ilyen körülmények között meginduló K+-áram segítségével [272]. Valóban, K+ ionofór jelenlétében az extramitokondriális [K+] 0,1 mM-ra történő csökkentése a mitokondrium (re)polarizációját indította meg. Kiemelendő, hogy az újonnan kialakult ∆Ψm kb. 2 perc alatt stabilizálódótt és 5 µM Ca2+ hozzáadásakor jó néhány másodpercig még stabil maradt. A ∆Ψm nem különbözött a kináz-aktivált és -gátolt csoportban, tehát a Ca2+ hozzáadásával kiváltott ionfelvétel mindkét csoportban azonos hajtóerő mellett valósult meg. Ennek ellenére a kinázok aktiválása csökkentette a kezdeti Ca2+ felvételi sebességet. A másik, ∆Ψm-t vizsgáló kísérletben a mitokondriumot teljesen depolarizáltuk, a Ca2+ felvétel hajtóereje ilyen körülmények között pusztán a Ca2+ koncentráció-grádiense. Ilyen körülmények között is képesek a kinázok a Ca2+ felvételt gátolni. (Mivel ebben a kísérletben protonofór (FCCP) is jelen volt, a pH extra- és intramitokondriálisan azonos volt és a csoportok között sem különbözhetett. A Ca2+ felvételben mért különbség tehát semmiképp sem származhatott az mt-inv-Pericam pH-érzékenységéből [24;178]) Ezen eredmények alapján egyértelmű, hogy a p38 MAPK és nPKC által kiváltott hatás nem a ∆Ψm módosításán keresztül valósul meg.
A mitokondriális külső membrán mint a kinázok támadáspontja Az általánosan elfogadott nézet szerint a mitokondriális külső membrán (OMM) mintegy 3 kDa méretig szabadon átjárható [5]. Ennek részben ellentmondó megfigyelések is napvilágot láttak az elmúlt évtizedben. A feszültségfüggő anioncsatorna (VDAC) fokozott expressziója pl. nemcsak a mitokondriális Ca2+ jelet növelte IP3 által kiváltott Ca2+ jel esetében, hanem a citoplazma Ca2+ jel áttevődését is gyorsította a
84
mátrixba, sőt, az apoptózist is elősegítette [208]. Az OMM permeabilizálása hasonlóképpen fokozta a Ca2+ felvételt a mitokondriumba a több µM-os [Ca2+] tartományban. Arra is utalnak adatok, hogy az OMM Ca2+ áteresztő-képessége nem állandó mértékű [273-275]. Ennélfogva elképzelhető volt, hogy a kinázok az OMM Ca2+ áteresztő-képességét csökkentik, s ez csökkenti a kezdeti Ca2+ felvételi sebességet. Ezt az elképzelést támasztotta alá, hogy az OMM eltávolítása egy rövid hipozmotikus shockkal [73] egyben a kináz-aktiváció gátló hatását is megszűntette. Az OMM finomabb manipulálását tette azonban lehetővé a proapoptotikus „BH3-only” Bid fehérje [276] rekombináns, trunkált változatának (t-Bid) alkalmazása. A t-Bid ugyanis az OMM permeabilizációját, a citokróm c elvesztését és a ∆Ψ m megszűnését [209;277] mitokondriális duzzadás és mPTP-nyitás nélkül váltja ki [212]. Valóban, 15 percig alkalmazott t-Bid ugyan megszűntette a mérhető ∆Ψ m-t, de a belső membránt (IMM) kimutatható mértékben nem károsította. A mitoplaszton kapott eredményekkel egyezően, a t-Bid is eltűntette a kináz-aktiváció hatását: permeabilizált OMM mellett a p38 MAPK és nPKC nem csökkentette az ionfelvétel sebességét. Ezen adatok egyértelműen mutatják, hogy a külső membrán épsége előfeltétele a mitokondriális Ca2+ felvétel kinázokon keresztüli gátlásának. A kinázok gátlásából és az OMM permeabilizációjából fakadó Ca2+ felvétel-gyorsulás azonos mértékű volt, a két beavatkozás nem volt additív. Ez egyrészt megerősíti, hogy a kinázok hatásának az ép OMM előfeltétele, másrészt egyértelműen kizárja, hogy a kinázok támadáspontja a belső membránban maga a transzportért felelős fehérje lenne. Az eredményeink legegyszerűbben így foglalhatóak modellbe: a kinázok az OMM Ca2+ permeabilitását csökkentik, a
belső membránnál pedig a Ca2+
hozzáfárhetősége csökken, s ez csökkenti végül a Ca2+ felvétel sebességét. Nyugalmi körülmények között, vagyis amikor a p38 MAPK és nPKC izoformák nem aktívak, az OMM nem gátolja a Ca2+ diffúzióját. Következésképpen az OMM Ca2+ permeabilitása kináz-szabályozás alatt áll. Ezzel összeegyeztethető, hogy intakt, légző mitokondriumban a kinázok aktivációja a [Ca2+]-Ca2+ felvételi sebesség függvényt jobbra tolja. A modellbe beleillik az a megfigyelés is, hogy a kinázok aktivációja intakt sejtben a ∆Ψm növekedését okozza. Az ER-ból nyugalmi körülmények között is folyamatosan „csurgó” Ca2+ [270;271] depolarizálja a mitokondriumot [269]. Ha a kinázaktiváció miatt csökken
85
a Ca2+ felvétel, egy depolarizáló áram csökkenésével a ∆Ψ m nőni fog. Modellünk is utal tehát arra, hogy az OMM Ca2+ permeabilitása nem feltétlenül állandó paraméter [273;274;296]. Az általunk vázolt szabályozási rendszer modelljét mutatja az alábbi séma:
m itokondrium
A kinázok aktivációja AII-vel történő ingerlés során a Ca2+ jel kialakulásával párhuzamosan történik, ebben az esetben a mitokondriális gátlás egy előrecsatolt negatív szabályozásnak tekinthető. Az extracelluláris [K+] emelkedésekor a Ca2+ jel indítja be a kinázok aktivációjához vezető jelátviteli folyamatokat, ilyenkor a mitokondriális Ca2+ felvétel gátlása negatív visszacsatoláson keresztül szabályzódik. (Irodalmi kiegészítések: [196,206].) A piros szín aktivációt, a kék gátlást jelent, a nyilak vastagsága a folyamat sebességét érzékelteti.
Összevetés az irodalommal Más
munkacsoportok
Ca2+
felvétel-fokozódást
kaptak
az
OMM
permeabilizációjakor olyan esetben is, mikor nem alkalmaztak a miénkhez hasonló előzetes kináz-aktivációt [209]. Ennek magyarázatához tudni kell, hogy a sejtek permeabilizációja (több, itt nem részletezett okból) a p38 MAPK és az nPKC izoformák aktivációjához vezet H295R sejtben [256], s valószínűleg más sejttípusokban is. Elképzelhető tehát, hogy az általánosan használt permeabilizációs módszerek más sejttípusban is beindítanak egy, a H295R sejtéhez hasonló gátlási mechanizmust, s ezek után a OMM-permeabilizáció már Ca2+ felvételt fokozó hatású. Más munkacsoport a
86
VDAC fokozott expressziójával növelte a mitokondriális Ca2+ felvételt [208]. Ez ugyan egy „túlexpressziós” kísérleti felállás (a „funkciónyerés” nem jelenti automatikusan, hogy fiziológiás körülmények között is számolni kell az adott jelenséggel), de jelzi, hogy a Ca2+ nem szabadon diffundál a külső membránon keresztül. Ezek alapján pedig a VDAC egy lehetséges kináz-támadáspont a külső membránban. A fentemlített munkákban az OMM szerepét a Ca2+ felvételben csak a magas, 10 µM feletti koncentrációtartományban
sikerült
kimutatni.
H295R
sejtben
az
OMM
permeabilizációja
(természetesen csak kináz-aktiváció után) azonban már a 2 µM-os tartományban is fokozza a Ca2+ felvételt. Sőt, a p38 MAPK csendesítése az 500 nM Ca2+ kiváltotta mitokondriális Ca2+ felvételt is növelni tudja [256]. Ezek alapján nagyon valószínű, hogy az OMM Ca2+ felvételt csökkentő hatása nemcsak a magas, hanem a szubmikromoláris, fiziológiás koncentráció-tartományban is érvényesül. H295R sejtek intakt, légző mitokondriumán a Ca2+ felvétel EC50 értéke kinázaktiváció hiányában 4 µM volt . Ez az érték az irodalomból ismert Kd-tartomány (10-5 M nagyságrend [42]; 15-20 mM voltage-clamp felállásban [73;74]) alsó határára esik. Ha számításba vesszük, hogy a permeabilizáció eltávolítja a sejt citoplazmájában megtalálható Ca2+ felvételt fokozó faktorokat [84;85], a citoszol-jellegű oldat pedig 2 mM ADP-t is tartalmazott, ez az érték fiziológiás körülmények között még alacsonyabb is lehet (az ADP gátolja az MCU-t [82]). A H295R sejt mitokondriuma tehát szokatlanul Ca2+ érzékenynek tekinthető. Az itt bemutatott összes kísérleti eredmény szempontjából alapvető kérdés, hogy az általunk leírt kinázok aktivációja pontosan mely transzporteren keresztül létrejövő Ca2+ felvételt gátolja. A mitokondrium a Ca2+-t az MCU-n keresztül [13;42], a gyors felvételi móddal (RaM [106]), a mitokondriális RyR-ral (mRyR [108;109]) és bizonyos körülmények között talán az mPTP-n keresztül is [134;135] felveheti. Ezek közül a RaM mintegy 40-80 ms alatt inaktiválódik [31], tehát nem lehet felelős az általunk regisztrált, több másodpercen keresztül tartó Ca2+ felvételért. A mRyR-t csak endotél- és szívizomsejtben írták le [108;109], egyéb sejtek mitokondriumában eddig nem sikerült kimutatni. H295R sejtek mitokondriális Ca2+ felvétele még hipozmotikus shock után is Ruthenium Vörös érzékeny maradt, ez pedig kizárja azt a lehetőséget, hogy az mPTP tranziensen nyitott konformációján [134] keresztül történt volna a Ca2+ felvétel [133].
87
Amint azt az Irodalmi bevezető részben részletesen kifejtettem, a Ca2+ felvétel speciális körülmények között a Ca2+ kicserélőkön keresztül is megvalósulhat. A p38 MAPK és nPKC Ca2+ felvételt gátló hatása ellenben clonazepam jelenlétében is megmarad, tehát a gátló hatásuk független a Na+/Ca2+ kicserélőtől [43]. A Ca2+/H+ kicserélő Letm1 Ca2+ felvételben betöltött szerepe [80] pedig még távolról sem tekinthető megalapozottnak. (A Letm1 Ca2+ felvételben játszott szerepének kritikus elemzése megtalálható a [24;44] összefoglalókban.) Ráadásul jelentős kapacitású Ca2+/H+ cserét eddig csak néhány − nem ingerlékeny − szövetben írtak le [80;118], a mellékvesekéreg zona glomerulóza nem tartozik közéjük. Figyelmet érdemel az a tény is, hogy a Ca2+ leadó mechanizmusok már 500 nM extramitokondriális [Ca2+] mellett is telítődnek [43], az általunk mért dózis-hatás görbe pedig még a 2-50 µM-os koncentráció-tartományban is jelentős transzportfokozódást mutat. A dózis-hatás függvény továbbá nagyon pontosan leírható egy Hill-függvénnyel: ez egyetlen transzportútvonalat feltételez; jelzi, hogy az általunk mért kezdeti felvételi sebesség kellően iniciális volt; nem mellékesen ez az MCU-ra jellemző kinetika [31]. Összességében tehát elmondható, hogy az általunk mért mitokondriális Ca2+ felvételért felelős transzporter
kinetikai és farmakológiai
tulajdonságai az MCU-nak felelnek meg. Túlexpressziós rendszerben, HeLa sejtben a különböző konvencionális, új típusú és atípusos PKC izoformák képesek a mitokondriális Ca2+ anyagcsere befolyásolására [87]. Ez azonban nem bizonyítja az endogén kinázok szabályzó szerepét. A munkában nem vizsgálták, hogy a mitokondriális Ca2+ anyagcsere mely szereplője a PKC-k támadáspontja, és azt sem sikerült megnyugtatóan bizonyítani, hogy a támadáspont egyáltalán mitokondriális-e. A mitokondriális Ca2+ anyagcsere kinázon alapuló szabályzásának jól alátámasztott módja azonban a Na+/Ca2+ cserélő PINK-1 kinázon [278;279] keresztüli szabályzása [280]. Mindazonáltal az általunk leírt, a p38 MAPK és az nPKC izoformák által közvetített szabályzás az első, s eleddig egyetlen leírt módja a Ca2+
felvétel
poszttranszlációs
módosításon,
befolyásolásának.
88
endogén
kinázokon
keresztüli
A citoszol [Mg2+] hatása a mitokondrium Ca2+ anyagcseréjére A p38 MAPK és nPKC-n keresztüli Ca2+ felvétel-szabályzás, ha általános, több sejttípusban megtalálható mechanizmusnak bizonyul, részben magyarázhatja az ionfelvétel affinitásának jelentős variabilitását [65]. Egy másik lehetséges magyarázata a Kd nagyfokú szórásának, hogy a kísérletekben olyan nem, vagy csak felületesen kontrollált paraméter van, amely hat az organellum Ca2+ anyagcseréjére. Egy ilyen lehetséges paraméter a perimitokondriális [Mg2+]. A Mg2+ általános Ca2+ transzportgátlónak tekinthető [73;76;77;79;80], ráadásul a klasszikus mitokondriális vizsgálatok már igazolták a Ca2+ felvétel extramitokondriális Mg2+-on keresztüli gátlását [78;81;82]. Ezekben a vizsgálatokban a [Mg2+] azonban az 1-10 mM koncentráció-tartományban mozgott, amely, összevetve az intakt sejt [Mg2+]c-val, magas fiziológiás, vagy inkább szuprafiziológiás tartománynak tekinthető [213]. HEK-293T sejtben végzett vizsgálatainkban mi a Mg2+ hatását az alacsony, fiziológiás
koncentráció-tartományban
(0,25-2
mM;
[213])
vizsgáltuk.
Az
extramitokondriális [Mg2+] kis, néhány száz nM-os emelkedése jelentősen gátolta a mitokondriális Ca2+ felvételt. Mivel a Ca2+ felvétel sebességét a [Ca2+]m görbék kezdeti, lineáris szakaszán határoztuk meg és az alkalmazott koncentráció-tartományban a Mg2+ nem gátolta az organellum Ca2+ leadását, a Mg2+ hatása kétséget kizáróan a Ca2+ felvétel gátlásán keresztül valósul meg. Természetesen felmerül a kérdés, hogy a Mg2+ extravagy
intramitokondriális
támadásponttal
hat-e
a
Ca2+
felvételre.
Ennek
megválaszolásához tudni kell, hogy a Mg2+ képes ugyan az Mrs2p mitokondriális csatornán keresztül bejutni a mátrixba [281], de az extramitokondriális és intramitokondriális [Mg2+] még a magas, 10 mM-os tartományban is csak rendkívül lassan egyenlítődik ki [282;283]. A Mg2+ gátló hatása HEK-293T setjben azonban gyakorlatilag latencia nélkül érvényesül és rendkívül gyorsan meg is szűnik. Külső membrántól megfosztott mitokondrium (mitoplaszt) befelé rektifikáló Ca2+ áramát a Mg2+ igen hatékonyan gátolja már 500 µM-os koncentrációban is, a külső oldaról [73]. Ezek alapján a Mg2+ támadáspontja nagy valószínűséggel a belső mitokondriális membrán külső felszínén található.
89
A [Mg2+] mérésének módszertani szempontjai Intakt HEK-293T sejtekben a [Mg2+]c-t a Mg2+-érzékeny fluoreszcens festékkel, Mag-Fluo-4-gyel követtük. A Mag-Fluo-4 Ca2+ affinitása kellően alacsony ahhoz (Kd = 22 µM), hogy a szubmikromoláris [Ca2+]-tartományban biztonságosan és szelektíven, azaz Ca2+ általi gerjesztés nélkül mérje a [Mg2+]c-t. A festék Mg2+ iránti affinitása (Kd = 4 mM) és nagy dinamikus tartománya is megfelel ennek a célnak. Valóban, a mi kísérleteinkben a Mag-Fluo-4 fluoreszcenciája a [Mg2+] megbízható követését tette lehetővé, hiszen: az IP3-mediált és a raktárszabályzott Ca2+ jel amplitúdója nem különbözik HEK-293T sejtben, de csak az előbbi jár érdemleges Mag-Fluo-4 fluoreszcencia-növekedéssel; ismételt ATP-vel történő ingerlés során a Ca2+ jel nem mutat jelentős deszenzitizációt, míg a Mg2+ jel amplitúdója jelentősen csökken; a Ca2+ és Mg2+ jel lecsengésének sebessége szignifikánsan eltér; az IP3-mediált és UV-fotolízissel kiváltott azonos [Ca2+]-emelkedés eltérő Mg2+ jellel párosul; H295R sejtben a feszültségfüggő Ca2+ belépést igen, de a raktárszabályzott Ca2+ jelet nem kíséri kimutatható Mg2+ jel. Ezek alapján egyértelmű, hogy a kísérleteinkben előforduló [Ca2+]tartományban a Mag-Fluo-4 megbízhatóan, szelektíven a [Mg2+]-változásokat mérte. A Ca2+ jelet követő gyors és jelentős Mg2+ jel nehezen egyeztethető össze a néhány irodalmi adattal, melyek a citoplazma Mg2+ koncentrációját szigorúan szabályzott, de csak nagyon lassú változásokat mutató paraméternek írják le [83;214;284;285]. Ennek a látszólagos ellentmondásnak a magyarázata méréstechnikai lehet. HEK-293T sejtben mi sem tudtunk gyors és jelentős [Mg2+]-változásokat kimutatni, ha a Mag-Fluo-4 töltési koncentrációja meghaladta az igen alacsony, 200 nMos szintet. (Hasonló eredményt kaptunk MagFura-2 alkalmazásakor is; nem közölt adat.) Tekintve, hogy az irodalomban a Mg2+-érzékeny festékek töltési koncentrációja az 1-10 µM-os tartományban mozgott [215;285], nem kizárható, hogy a festék ilyen koncentrációban már érdemlegesen kelálták a Mg2+-t. Ezen túlmenően ezen festékek jelentős
szekvesztrációt
mutatnak
különböző
intracelluláris
kompartmentekben
([286;287] és saját megfigyelés), és ezáltal befolyásolhatják a sejt Mg2+ anyagcseréjét. Az alkalmazott festékkoncentrációk különbözősége emiatt is jelentős eltéréseket
90
okozhatott a regisztrált biológiai válaszban. Az általunk alkalmazott alacsony Mag-Fluo4 koncentráció segítségével mi nemcsak HEK-293T, hanem H295R és HeLa (nem közölt adatok) sejtben is gyors [Mg2+]-változásokat tudtunk kimutatni, amelyek ugyanszintén alátámasztják az alacsony festékkoncentráció alkalmazásának előnyeit.
A citoplazma Mg2+ jel és forrásai A Mg2+ mitokondriális Ca2+ felvételt gátló hatásának a vizsgálatakor a legfontosabb kérdés az volt, hogy intakt sejtben Ca2+ jel során vannak-e olyan [Mg2+]változások, melyek permeabilizált sejtben jelentős hatással vannak a mitokondriális Ca2+ felvételre. HEK-293T sejtek ATP-vel történő ingerlése a vártnak megfelelően citoplazma Ca2+ jelet hozott létre, melynek amplitúdója megközelítette az 1 µM-t. Ezt a Ca2+ jelet gyors, Ca2+ jellel párhuzamosan kifejlődő Mg2+ jel kísérte, melynek során a nyugalmi [Mg2+]c a 0,3 mM-os értékről a 0,7-0,8 mM-os tartományba emelkedett. HEK-293T sejtben a [Mg2+]c az irodalomban más sejtek vonatkozásában közölt nyugalmi [Mg2+]ctartomány alsó részébe esik [83;214], kicsit magasabb értéket találtunk H295R (0,5 mM) és HeLa (0,4 mM) sejtekben (nem közölt adat). Mindenesetre ATP-vel történő ingerlés során a [Mg2+] olyan tartományban változik HEK-293T sejtben, amely igen hatékonyan gátolja a Ca2+ felvételt a mitokondriumba. Sőt, a [Ca2+] is abban a tartományban változik, amely a mitokondriális Ca2+ felvétel szempontjából Mg2+-ra leginkább érzékenynek bizonyult permeabilizált sejtben. Ezen eredmények a mitokondriális Ca2+ felvétel egy új, intakt sejtben is megvalósuló, Mg2+-on keresztüli szabályzását valószínűsítik. Kísérleteinkben a Mg2+ jel forrásának meghatározása is célunk volt. Az irodalom abban mindenképp egyetért, hogy a citoszol ATP bomlása automatikusan a [Mg2+]c emelkedését vonja maga után [216;288;289]. A citoplazma ATP koncentrációjának követésére a luciferáz lumineszcencia módszerét alkalmaztuk [290]. A glikolitikus és mitokondriális ATP-termelés gátlásakor a luciferáz lumineszcenciája mintegy 80%-kal esett, jelezve, hogy a jel döntően a citoplazmatikus ATP-ből származik. HEK-293T sejtben azonban az IP3-mobilizáló agonista által kiváltott Mg2+ jel és citoszol ATPbomlás kinetikája olyannnyira különböző (utóbbi mintegy ötvenszer lassabb), hogy a
91
gyors, iniciális Mg2+ jel kialakításában az ATP-bomlás szerepe biztonsággal elhanyagolható. Ca2+ jel korai fázisában nemcsak a [Ca2+]c, hanem a citoszol [H+]-ja is emelkedik [97], ez pedig Mg2+-ot mobilizálhat a citoplazma kation-kötőhelyeiről [214]. Valóban, UV-fotolízissel kiváltott [Ca2+]c-emelkedés önmagában a [Mg2+]c egyidejű emelkedését vonta maga után, jelezve, hogy a Mg2+-leszorítás biztosan a [Mg2+]-emelkedés egyik oka. Az UV-fotolízissel kiváltott Ca2+ jel azonban kevésbé volt hatékony ingere a [Mg2+]emelkedésnek, mint az ugyanekkora, IP3-mobilizáló agonistával létrehozott Ca2+ jel. Ez felvetette, hogy a Mg2+ forrása nem kizárólag a citoplazma kation-kötőhelyeiről történő Mg2+-leszorítás. A sejt teljes Mg2+-tartalma nem homogénen oszlik meg a sejten belül [83;214], bizonyos adatok felvetik egy vagy több intracelluláris Mg2+-raktár lehetőségét is [285], azonban a raktár pontos lokalizációja és a Mg2+ felszabadulás módja ismeretlen. Elektrofiziológiai mérések alapján az IP3-receptor Mg2+ vezetőképessége nagy, gyakorlatilag a Ca2+ konduktanciával megegyező [217;291]. Mivel az IP3-mediált Ca2+ jel hatékonyabban emeli a [Mg2+]c-t, mint az ugyanakkora [Ca2+]-emelkedés IP3-képzés nélkül (UV-fotolízis), felmerült, hogy az IP3 esetleg közvetlenül Mg2+-t szabadítana fel egy belső raktárból. Permeabilizált HEK-293T sejtben az IP3 nemcsak Ca2+-t, hanem, eltérő kinetikával, Mg2+-t is felszabadított. Sőt, néhány esetben a Mg2+ felszabadulás [Ca2+]-emelkedés nélkül valósult meg. Ezen adatok egyértelműen bizonyítják, hogy az IP3 képes Mg2+-t felszabadítani, s megerősítik egy belső, agonista-érzékeny Mg2+ raktár meglétét. Itt kell megemlíteni azt is, hogy nemcsak az IP3-receptor, hanem a RyR is jelentős Mg2+ vezetőképességgel rendelkezik [292], tehát nem elképzelhetetlen, hogy Ca2+ indukált Mg2+ felszabadulás is részt vegyen a Mg2+ jel kialakításában. A thapsigarginérzékeny Ca2+ raktárak kiürítése után az UV-fotolízissel létrehozott Ca2+ és Mg2+ jel is változatlan maradt, a Ca2+ indukált Mg2+ felszabadulás megléte és szerepe a Mg2+ jel kialakításában tehát HEK-293T sejtben nagy biztonsággal kizárható. Ugyancsak kizárható az extracelluláris Mg2+ szerepe a kezdeti Mg2+ jel kialakításában: az ATP extracelluláris bivalens kationok hiányában ugyanakkora amplitúdójú Ca2+ és Mg2+
92
választ hozott létre, mint standard extracelluláris médiumban. (Ez azt is mutatja, hogy az ATP P2y receptorokon keresztül fejtette ki hatásait.) Ezen eredmények a mitokondriális Ca2+ felvétel egy új, intakt sejtben is megvalósuló, Mg2+-on keresztüli szabályzását mutatják. Ez a szabályzás olyan [Ca2+]tartományban érvényesül, mely számos sejttípus citoplazmájában megvalósul Ca2+ jel során [187;293;294]. A Mg2+ gátló hatása is abban a tartományban a legerősebb, mely [Mg2+] az intakt sejt citoplazmájára inger alatt jellemző. Akárcsak a p38 MAPK-on és nPKC-n keresztüli szabályozás, a Ca2+ jellel párhuzamosan kialakuló Mg2+ jel is a mitokondriális Ca2+ felvétel „előrecsatolt” gátlásának tekinthető. A Mg2+ tompítja a mitokondrium Ca2+ felvételét és védhet az apoptózissal szemben [70;295]. Ezen felül eredményeink felhívják a figyelmet arra is, hogy minden, a mitokondriális Ca2+ anyagcserét vizsgáló kísérletben különös körültekintést ígényel a [Mg2+] beállítása.
93
Következtetések A disszertációban tárgyalt kísérletek igazolják, hogy a Ca2+ mobilizáló hormon AII, amellett, hogy citoplazma Ca2+ jelen keresztül mitokondriális Ca2+ felvételt vált ki, egy járulékos mechanizmussal tompítja is az organellum Ca2+ felvételét H295R sejtben. Az AII ezt a gátlást két kináz, a p38 MAPK és egy nPKC aktiválásán keresztül fejti ki. A két kináz egyidejű aktivációja szükséges a gátlás létrehozásához, külön-külön aktivációjuk nem képes hasonló hatás létrehozására. Kimutattuk továbbá, hogy a kinázok hatása nem közvetlenül a Ca2+ felvételért felelős transzportfehérjén, hanem a mitokondriális külső membránon keresztül érvényesül. H295R sejtben a mitokondriális külső membrán Ca2+ felvételt csökkentő hatása kinázfüggő módon jön létre, és már az alacsony mikromoláris tartományban is érvényesül. Ezek alapján pedig a mitokondriális külső membrán a Ca2+ felvétel egyik (szabályozott) gátló tényezője. A mitokondriális Ca2+ felvétel és ER-mitokondrium távolság egyidejű mérésével igazoltuk, hogy Ca2+ mobilizáló hormonnal történő ingerlés során a mitokondrium Ca2+ felvétele HCMD-függő módon jön létre H295R sejtben. Ennek kialakításáért a mitokondrium és ER egymáshoz viszonyított térbeli helyzete és a p38 MAPK/nPKC izoformák gátló hatása együttesen felelős. Igazoltuk továbbá, hogy H295R sejtben HCMD-független mitokondriális Ca2+ felvétel is létrejöhet depolarizációt követő Ca2+ belépés alatt. COS-7 sejtben ugyancsak HCMD-független mitokondriális Ca2+ felvételt mutattunk ki raktárszabályzott Ca2+ belépés során. H295R és HEK-293T sejtekben igazoltuk, hogy a citoplazma Ca2+ jelet egyidejű Mg2+ jel kíséri. A Mg2+ jel olyan koncentráció-tartományban mozog, amely hatékonyan gátolja
a
mitokondriális
Ca2+
felvételt
permeabilizált
HEK-293T
sejtek
mitokondriumába. A Mg2+ jel fő forrásai: Mg2+-leszorítás citoplazmatikus kötőhelyeiről és IP3-érzékeny belső raktár. A citoplazmatikus ATP hidrolízise nem vesz részt a kezdeti Mg2+ jel kialakításában. Ezek alapján a [Mg2+]c a mitokondriális Ca2+ felvétel egy új, intakt sejtben is érvényesülő szabályozó tényezője.
94
Összefoglalás A mitokondrium a sejt Ca2+ anyagcseréjének aktív szereplője, a mitokondriális Ca2+ felvétel módosítja a citoplazma Ca2+ jel amplitúdóját, kinetikáját, szabályozza a citrát-kör és a terminális oxidáció több lépését, a szabadgyök- és szteroidtermelést. A mitokondriális Ca2+ felvétel szabályozása kevéssé felderített, de az uralkodó nézet szerint a folyamat alacsony affinitása miatt Ca2+ felvétel csak ún. magas Ca2+ koncentrációjú mikrodoménekből (HCMD) történhet. Néhány ennek ellentmondó megfigyelés is ismert azonban. Vizsgáltuk, hogy létrejöhet-e egyáltalán HCMD-független Ca2+ felvétel intakt sejtben, s ha igen, ugyanezen sejtben HCMD-függő ionfelvétel is kimutatható-e. Sikerült igazolnunk, hogy a humán adrenokortikális aldoszterontermelő H295R sejtben a Ca2+ mobilizáló agonista angiotenzin II HCMD-függő, míg a depolarizációt és Ca2+ belépést okozó K+ HCMD-független módon hoz létre mitokondriális Ca2+ jelet. Kimutattuk továbbá, hogy az angiotenzin II a Ca2+ jellel párhuzamosan aktiválja a p38 MAPK-t és egy új típusú PKC izoformát, melyek a mitokondrium külső membránján hatva (feltehetőleg annak Ca2+ permeabilitását gátolva) csökkentik a Ca2+ felvételt. A két kináz egyidejű aktiválása szükséges a gátlás kifejtéséhez. Igazoltuk, hogy a kináz-mediált gátlás felelős az IP3 kiváltotta Ca2+ felszabadulás során a mitokondriális Ca2+ felvétel HCMD-függőségének kialakításáért, s a gátlás hiánya teszi lehetővé K+-inger alatt a HCMD-független Ca2+ felvételt. Ezzel összhangban COS-7 sejtben is sikerült HCDMfüggetlen Ca2+ felvételt kimutatnunk raktárszabályzott Ca2+ belépés alatt. A Mg2+, szuprafiziológiás koncentrációban, a mitokondriális Ca2+ felvétel ismert gátlója. HEK-293T sejtben kimutattuk, hogy az intakt sejtre jellemző koncentrációban is képes a Ca2+ felvétel erőteljes tompítására. Intakt sejtben leírtuk a Ca2+ jellel egyidejű Mg2+ jelet, mely a citoszol Mg2+-kötőhelyeiről történő leszorításból és IP3-érzékeny belső raktárból származik. A Mg2+ jel abban a koncentráció-tartományban mozog, mely a mitokondrium Ca2+ felvételét hatékonyan gátolja. Eredményeink a mitokondriális Ca2+ felvétel két új, előrecsatolt gátlását mutatják, melyek az organellum ionfelvételét csökkentve védhetnek a Ca2+ túltöltés és a következményes apoptózis ellen. 95
Summary Mitochondrial Ca2+ uptake modifies cytosolic Ca2+ signal and regulates oxidative phosphorylation, generation of ROS, steroid-synthesis and apoptosis. Mitochondrial Ca2+ uptake is generally accepted to be a low affinity process occurring only when [Ca2+] attains several micromoles in the so-called high Ca2+ perimitochondrial microdomains (HCMD). However, some data do not support this idea. We examined the possibility of a HCMD-independent mitochondrial Ca2+ uptake in cells in which there is HCMD-dependent Ca2+ uptake. We have shown in human adrenocortical H295R cells that whereas the Ca2+ mobilizing agonist angiotensin II induces mitochondrial Ca2+ signal in a HCMD-dependent manner, mitochondrial Ca2+ uptake during K+-evoked Ca2+ influx occurs without the formation of HCMDs. We have also found that angiotensin II, parallel with the mobilisation of Ca2+, activates p38 MAPK and a novel-type protein kinase C isoform. Simultaneous activation of these kinases attenuates mitochondrial Ca2+ uptake probably by reducing the Ca2+ permeability of the outer mitochondrial membrane. The kinase-mediated inhibition is partially responsible for the strong correlation between Ca2+ uptake and ER-mitochondrion distance during Ca2+ mobilization whereas lack of kinase activation enables a HCMDindependent mitochondrial Ca2+ uptake during Ca2+ influx. Similarly, we have shown the existence of HCMD-independent Ca2+ uptake also in COS-7 cells. Mg2+ in supraphysiological concentration is a well-known inhibitor of Ca2+ uptake into suspended mitochondria. We have found in permeabilized HEK-293T cells that Mg2+ reduces Ca2+ uptake of mitochondria also in the concentration-range typical for intact cells. In HEK-293T and H295R cells we described a fast cytosolic Mg2+ signal that accompanies the Ca2+ signal and that is in concentration-range effectively attenuating Ca2+ uptake into mitochondria. The two major sources of cytosolic Mg2+ signal are displacement of Mg2+ (by Ca2+) from cytosolic binding sites and IP3-induced Mg2+ release from internal stores. These novel mechanisms can be regarded as negative feed-forward regulation of mitochondrial Ca2+ uptake and may protect the cell against apoptosis during Ca2+ overload.
96
Köszönetnyilvánítás Mindenekelőtt szeretném megköszönni Spät András professzor úrnak, hogy munkám szakmai és emberi tanításával, példamutatásával és kifogyhatatlan energiájával mind TDK-, mind PhD-hallgató koromban támogatta, egyengette és lehetővé tette. Megtiszteltetésnek és szerencsémnek érzem, hogy laboratóriumába fogadott és együtt dolgozhattam vele, tanulhattam tőle. Szeretném megköszönni Szatmáriné Rajki Anikó, Halász Eszter és Németh Helga munkatársaimnak a folyamtosan magas színvonalú és megbízható munkát, amely nélkül ezen munka nem jöhetett volna létre. Ugyancsak köszönöm a labor többi tagjának (és volt tagjának), Koncz Péternek, Fülöp Lászlónak, Pitter Jánosnak és Petheő Gábornak az értékes kritikát és a közös szakmai munka élményét. Köszönetem fejezem ki az Élettani Intézet korábbi és jelenlegi igazgatójának, Spät András és Hunyady László professzor uraknak, hogy munkámat TDK- és PhDhallgató koromban lehetővé tették, s azért, hogy inspiráló légkört teremtettek. Külön köszönöm Ligeti Erzsébet professzor asszonynak, hogy programvezetőként PhD munkám és tanulmányaim lehetővé tette és szervezte. Köszönöm továbbá az Élettani Intézet minden munkatársának azt a légkört, amely igényes szakmai munkát követelt és amelyben jó volt dolgozni. Különösen hálás vagyok azon munkatársaimnak, akikhez kéréssel vagy kérdéssel mindig fordulhattam: Várnai Péter, Tretter László, Jakus Zoltán, Mócsai Attila, Balla András, Enyedi Péter, Enyedi Balázs, Czirják Gábor, Geiszt Miklós. Köszönöm azon külföldi kollegáknak, akikkel együtt dolgozhattam, s így közvetlenül vagy közvetve hozzájárultak ezen munkához: Michael Duchen és Javier García-Sancho professzoroknak és Sonia Gallego-Sandínnak. Végül, de nem utolsósorban szeretném megköszönni családomnak a lelki, szakmai, anyagi és emberi támogatást. Nélkülük semmi sem valósult volna meg ebből a munkából.
97
Irodalomjegyzék 1. Duchen MR. Mitochondria in health and disease: perspectives on a new mitochondrial biology. Mol Aspects Med 2004; 25: 365-451. 2. Belloni AS, Rebuffat P, Malendowicz LK, Mazzocchi G, Rocco S, Nussdorfer GG. Age-related changes in the morphology and function of the Zona glomerulosa of the rat adrenal cortex. Tissue Cell 1992; 24: 835-842. 3. Spinazzi R, Petrelli L, Guidolin D, Carraro G, Casale V, Tortorella C, Neri G, Albertin G, Andreis PG, Nussdorfer GG. In vitro culture on Matrigel favors the long-term maintenance of rat zona glomerulosa-cell differentiated phenotype. Int J Mol Med 2006; 17: 1101-1110. 4. Peachman KK, Lyles DS, Bass DA. Mitochondria in eosinophils: functional role in apoptosis but not respiration. Proc Natl Acad Sci U S A 2001; 98: 1717-1722. 5. Colombini M. VDAC: the channel at the interface between mitochondria and the cytosol. Mol Cell Biochem 2004; 256-257: 107-115. 6. De P, V, Reina S, Guarino F, Messina A. Structure of the voltage dependent anion channel: state of the art. J Bioenerg Biomembr 2008; 40: 139-147. 7. Shoshan-Barmatz V, Gincel D. The voltage-dependent anion channel: characterization, modulation, and role in mitochondrial function in cell life and death. Cell Biochem Biophys 2003; 39: 279-292. 8. Mannella CA, Marko M, Buttle K. Reconsidering mitochondrial structure: new views of an old organelle. Trends Biochem Sci 1997; 22: 37-38. 9. John GB, Shang Y, Li L, Renken C, Mannella CA, Selker JM, Rangell L, Bennett MJ, Zha J. The mitochondrial inner membrane protein mitofilin controls cristae morphology. Mol Biol Cell 2005; 16: 1543-1554. 10. Cipolat S, Rudka T, Hartmann D, Costa V, Serneels L, Craessaerts K, Metzger K, Frezza C, Annaert W, D'Adamio L, Derks C, Dejaegere T, Pellegrini L, D'Hooge R, Scorrano L, De Strooper B. Mitochondrial rhomboid PARL regulates cytochrome c release during apoptosis via OPA1-dependent cristae remodeling. Cell 2006; 126: 163-175. 11. Mannella CA. The relevance of mitochondrial membrane topology to mitochondrial function. Biochim Biophys Acta 2006; 1762: 140-147.
98
12. Gerencser AA, Adam-Vizi V. Mitochondrial Ca2+ dynamics reveals limited intramitochondrial Ca2+ diffusion. Biophys J 2005; 88: 698-714. 13. Gunter TE, Sheu SS. Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms. Biochim Biophys Acta 2009; 1787: 1291-1308. 14. Campanella M, Casswell E, Chong S, Farah Z, Wieckowski MR, Abramov AY, Tinker A, Duchen MR. Regulation of mitochondrial structure and function by the F1Fo-ATPase inhibitor protein, IF1. Cell Metab 2008; 8: 13-25. 15. Berridge MJ, Lipp P, Bootman MD. Signal transduction. The calcium entry pas de deux [comment]. Science 2000; 287: 1604-1605. 16. Catterall WA. Excitation-contraction coupling in vertebrate skeletal muscle: A tale of two calcium channels. Cell 1991; 64: 871-874. 17. Kaftan EJ, Xu T, Abercrombie RF, Hille B. Mitochondria shape hormonally induced cytoplasmic calcium oscillations and modulate exocytosis. J Biol Chem 2000; 275: 25465-25470. 18. Spät A, Hunyady L. Control of aldosterone secretion: a model for convergence in cellular signaling pathways. Physiol Rev 2004; 84: 489-539. 19. Kim MS, Usachev YM. Mitochondrial Ca2+ cycling facilitates activation of the transcription factor NFAT in sensory neurons. J Neurosci 2009; 29: 12101-12114. 20. Giorgi C, Romagnoli A, Pinton P, Rizzuto R. Ca(2+) signaling, mitochondria and cell death. Curr Mol Med 2008; 8: 119-130. 21. Szabadkai G, Duchen MR. Mitochondria mediated cell death in diabetes. Apoptosis 2009; 14: 1405-1425. 22. Pozzan T, Rizzuto R, Volpe P, Meldolesi J. Molecular and cellular physiology of intracellular calcium stores. Physiol Rev 1994; 74: 595-636. 23. Rios E. RyR1 Expression and the Cell Boundary Theorem. J Biol Chem 2010; 285: le13. 24. Contreras L, Drago I, Zampese E, Pozzan T. Mitochondria: The calcium connection. Biochim Biophys Acta 2010; 1797: 607-618. 25. Pinton P, Pozzan T, Rizzuto R. The Golgi apparatus is an inositol 1,4,5trisphosphate-sensitive Ca2+ store, with functional properties distinct from those of the endoplasmic reticulum. EMBO J 1998; 17: 5298-5308. 26. Drago I, Giacomello M, Pizzo P, Pozzan T. Calcium dynamics in the peroxisomal lumen of living cells. J Biol Chem 2008; 283: 14384-14390.
99
27. Rodriguez A, Webster P, Ortego J, Andrews NW. Lysosomes behave as Ca2+regulated exocytic vesicles in fibroblasts and epithelial cells. J Cell Biol 1997; 137: 93-104. 28. Gerasimenko JV, Tepikin AV, Petersen OH, Gerasimenko OV. Calcium uptake via endocytosis with rapid release from acidifying endosomes. Curr Biol 1998; 8: 1335-1338. 29. Mitchell KJ, Pinton P, Varadi A, Tacchetti C, Ainscow EK, Pozzan T, Rizzuto R, Rutter GA. Dense core secretory vesicles revealed as a dynamic Ca2+ store in neuroendocrine cells with a vesicle-associated membrane protein aequorin chimaera. J Cell Biol 2001; 155: 41-51. 30. Nicholls DG, Vesce S, Kirk L, Chalmers S. Interactions between mitochondrial bioenergetics and cytoplasmic calcium in cultured cerebellar granule cells. Cell Calcium 2003; 34: 407-424. 31. Gunter TE, Yule DI, Gunter KK, Eliseev RA, Salter JD. Calcium and mitochondria. FEBS Lett 2004; 567: 96-102. 32. Boldogh IR, Pon LA. Mitochondria on the move. Trends Cell Biol 2007; 17: 502510. 33. Yi M, Weaver D, Hajnóczky G. Control of mitochondrial motility and distribution by the calcium signal: a homeostatic circuit. J Cell Biol 2004; 167: 661-672. 34. Pralong W-F, Hunyady L, Várnai P, Wollheim CB, Spät A. Pyridine nucleotide redox state parallels production of aldosterone in potassium-stimulated adrenal glomerulosa cells. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89: 132-136. 35. Duchen MR, Biscoe TJ. Relative mitochondrial membrane potential and [Ca2+]i in type I cells isolated from the rabbit carotid body. J Physiol 1992; 450: 33-61. 36. Jouaville LS, Pinton P, Bastianutto C, Rutter GA, Rizzuto R. Regulation of mitochondrial ATP synthesis by calcium: Evidence for a long-term metabolic priming. Proc Natl Acad Sci USA 1999; 96: 13807-13812. 37. Walsh C, Barrow S, Voronina S, Chvanov M, Petersen OH, Tepikin A. Modulation of calcium signalling by mitochondria. Biochim Biophys Acta 2009; 1787: 1374-1382. 38. McCormack JG, Halestrap AP, Denton RM. Role of calcium ions in regulation of mammalian intramitochondrial metabolism. Physiol Rev 1990; 70: 391-425. 39. Denton RM. Regulation of mitochondrial dehydrogenases by calcium ions. Biochim Biophys Acta 2009; 1787: 1309-1316.
100
40. Pfeiffer DR, Tchen TT. The activation of adrenal cortex mitochondrial malic enzyme by Ca2+ and Mg2+. Biochemistry 1975; 14: 89-96. 41. Territo PR, Mootha VK, French SA, Balaban RS. Ca(2+) activation of heart mitochondrial oxidative phosphorylation: role of the F(0)/F(1)-ATPase. Am J Physiol Cell Physiol 2000; 278: C423-C435. 42. Gunter TE, Pfeiffer DR. Mechanisms by which mitochondria transport calcium. Am J Physiol 1990; 258: C755-C786. 43. Gunter TE, Buntinas L, Sparagna G, Eliseev R, Gunter K. Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions. Cell Calcium 2000; 28: 285-296. 44. Santo-Domingo J, Demaurex N. Calcium uptake mechanisms of mitochondria. Biochim Biophys Acta 2010. 45. Ligeti E, Ikrenyi K, Fonyo A. The inhibitor-sensitivity and pathways of Pi uptake during calcium and strontium accumulation in liver mitochondria FEBS Lett 1979; 107: 205-208. 46. Fonyo A. Inhibitors of mitochondrial phosphate transport. Pharmacol Ther 1979; 7: 627-645. 47. Fiermonte G, Palmieri L, Dolce V, Lasorsa FM, Palmieri F, Runswick MJ, Walker JE. The sequence, bacterial expression, and functional reconstitution of the rat mitochondrial dicarboxylate transporter cloned via distant homologs in yeast and Caenorhabditis elegans. J Biol Chem 1998; 273: 24754-24759. 48. Mayr JA, Merkel O, Kohlwein SD, Gebhardt BR, Bohles H, Fotschl U, Koch J, Jaksch M, Lochmuller H, Horvath R, Freisinger P, Sperl W. Mitochondrial phosphate-carrier deficiency: a novel disorder of oxidative phosphorylation. Am J Hum Genet 2007; 80: 478-484. 49. Kramer R, Palmieri F. Molecular aspects of isolated and reconstituted carrier proteins from animal mitochondria. Biochim Biophys Acta 1989; 974: 1-23. 50. Gursahani HI, Schaefer S. Acidification reduces mitochondrial calcium uptake in rat cardiac mitochondria. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2004; 287: H2659H2665. 51. DELUCA HF, ENGSTROM GW. Calcium uptake by rat kidney mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A 1961; 47: 1744-1750. 52. Carafoli E, Balcavage WX, Lehninger AL, Mattoon JR. Ca2+ metabolism in yeast cells and mitochondria. Biochim Biophys Acta 1970; 205: 18-26.
101
53. Reynafarje B, Lehninger AL. Electric charge stoichiometry of calcium translocation in mitochondria. Biochem Biophys Res Commun 1977; 77: 12731279. 54. Azzone GF, Massari S, Pozzan T. Mechanism of active shrinkage in mitochondria. I. Coupling between weak electrolyte fluxes. Biochim Biophys Acta 1976; 423: 15-26. 55. Akerman KE. Charge transfer during valinomycin-induced Ca2+ uptake in rat liver mitochondria. FEBS Lett 1978; 93: 293-296. 56. Bygrave FL, Reed KC, Spencer T. Cooperative interactions in energy-dependent accumulation of Ca2+ by isolated rat liver mitochondria. Nat New Biol 1971; 230: 89. 57. Scarpa A, Graziotti P. Mechanisms for intracellular calcium regulation in heart. I. Stopped-flowmeasurements of Ca++ uptake by cardiac mitochondria. J Gen Physiol 1973; 62: 756-772. 58. Vinogradov A, Scarpa A. The initial velocities of calcium uptake by rat liver mitochondria. J Biol Chem 1973; 248: 5527-5531. 59. Igbavboa U, Pfeiffer DR. EGTA inhibits reverse uniport-dependent Ca2+ release from uncoupled mitochondria. Possible regulation of the Ca2+ uniporter by a Ca2+ binding site on the cytoplasmic side of the inner membrane. J Biol Chem 1988; 263: 1405-1412. 60. Kroner H. Ca2+ ions, an allosteric activator of calcium uptake in rat liver mitochondria. Arch Biochem Biophys 1986; 251: 525-535. 61. Konji V, Montag A, Sandri G, Nordenbrand K, Ernster L. Transport of Ca2+ and Mn2+ by mitochondria from rat liver, heart and brain. Biochimie 1985; 67: 12411250. 62. Montero M, Alonso MT, Albillos A, Garcia-Sancho J, Alvarez J. Mitochondrial ca(2+)-induced ca(2+) release mediated by the ca(2+) uniporter. Mol Biol Cell 2001; 12: 63-71. 63. Garlid KD. Mitochondrial cation transport: a progress report. J Bioenerg Biomembr 1994; 26: 537-542. 64. Zazueta C, Correa F, Garcia N, Garcia GJ. Different subunit location of the inhibition and transport sites in the mitochondrial calcium uniporter. J Bioenerg Biomembr 2004; 36: 439-445. 65. Spät A, Szanda G, Csordás G, Hajnóczky G. High- and low-calcium-dependent mechanisms of mitochondrial calcium signalling. Cell Calcium 2008; 44: 51-63.
102
66. Akerman KE. Effect of Mg2+ and spermine on the kinetics of Ca2+ transport in rat-liver mitochondria. J Bioenerg Biomembr 1977; 9: 65-72. 67. Hutson SM, Pfeiffer DR, Lardy HA. Effect of cations and anions on the steady state kinetics of energy-dependent Ca2+ transport in rat liver mitochondria. J Biol Chem 1976; 251: 5251-5258. 68. Huttemann M, Lee I, Pecinova A, Pecina P, Przyklenk K, Doan JW. Regulation of oxidative phosphorylation, the mitochondrial membrane potential, and their role in human disease. J Bioenerg Biomembr 2008; 40: 445-456. 69. Aggarwal BB, Quintanilha AT, Cammack R, Packer L. Damage to mitochondrial electron transport and energy coupling by visible light. Biochim Biophys Acta 1978; 502: 367-382. 70. Racay P. Effect of magnesium on calcium-induced depolarisation of mitochondrial transmembrane potential. Cell Biol Int 2007; 32: 136-145. 71. Xiong J, Camello PJ, Verkhratsky A, Toescu EC. Mitochondrial polarisation status and [Ca2+]i signalling in rat cerebellar granule neurones aged in vitro. Neurobiol Aging 2004; 25: 349-359. 72. Somlyo AP, Urbanics R, Vadasz G, Kovach AG, Somlyo AV. Mitochondrial calcium and cellular electrolytes in brain cortex frozen in situ: electron probe analysis. Biochem Biophys Res Commun 1985; 132: 1071-1078. 73. Kirichok Y, Krapivinsky G, Clapham DE. The mitochondrial calcium uniporter is a highly selective ion channel. Nature 2004; 427: 360-364. 74. Michels G, Khan IF, Endres-Becker J, Rottlaender D, Herzig S, Ruhparwar A, Wahlers T, Hoppe UC. Regulation of the human cardiac mitochondrial Ca2+ uptake by 2 different voltage-gated Ca2+ channels. Circulation 2009; 119: 24352443. 75. Vainio H, Mela L, Chance B. Energy dependent bivalent cation translocation in rat liver mitochondria. Eur J Biochem 1970; 12: 387-391. 76. Lansman JB, Hess P, Tsien RW. Blockade of current through single calcium channels by Cd2+, Mg2+, and Ca2+. Voltage and concentration dependence of calcium entry into the pore. J Gen Physiol 1986; 88: 321-347. 77. White RE, Hartzell HC. Effects of intracellular free magnesium on calcium current in isolated cardiac myocytes. Science 1988; 239: 778-780. 78. Jacobus WE, Tiozzo R, Lugli G, Lehninger AL, Carafoli E. Aspects of energylinked calcium accumulation by rat heart mitochondria. J Biol Chem 1975; 250: 7863-7870.
103
79. Nadler MJ, Hermosura MC, Inabe K, Perraud AL, Zhu Q, Stokes AJ, Kurosaki T, Kinet JP, Penner R, Scharenberg AM, Fleig A. LTRPC7 is a Mg.ATP-regulated divalent cation channel required for cell viability. Nature 2001; 411: 590-595. 80. Jiang D, Zhao L, Clapham DE. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science 2009; 326: 144-147. 81. Prentki M, Janjic D, Wollheim CB. The regulation of extramitochondrial steady state free Ca2+ concentration by rat insulinoma mitochondria. J Biol Chem 1983; 258: 7597-7602. 82. Litsky ML, Pfeiffer DR. Regulation of the mitochondrial Ca2+ uniporter by external adenine nucleotides: the uniporter behaves like a gated channel which is regulated by nucleotides and divalent cations. Biochemistry 1997; 36: 7071-7080. 83. Romani AM, Maguire ME. Hormonal regulation of Mg2+ transport and homeostasis in eukaryotic cells. Biometals 2002; 15: 271-283. 84. Nicchitta CV, Williamson JR. Spermine. A regulator of mitochondrial calcium cycling. J Biol Chem 1984; 259: 12978-12983. 85. Roche E, Buteau J, Aniento I, Reig JA, Soria B, Prentki M. Palmitate and oleate induce the immediate-early response genes c- fos and nur-77 in the pancreatic bcell line INS-1. Diabetes 1999; 48: 2007-2014. 86. Salvi M, Toninello A. Effects of polyamines on mitochondrial Ca(2+) transport. Biochim Biophys Acta 2004; 1661: 113-124. 87. Pinton P, Leo S, Wieckowski MR, Di Benedetto G, Rizzuto R. Long-term modulation of mitochondrial Ca2+ signals by protein kinase C isozymes. J Cell Biol 2004; 165: 223-232. 88. Montero M, Lobaton CD, Moreno A, Alvarez J. A novel regulatory mechanism of the mitochondrial Ca2+ uniporter revealed by the p38 mitogen-activated protein kinase inhibitor SB202190. FASEB J 2002; 16: 1955-1957. 89. Montero M, Lobaton CD, Hernandez-Sanmiguel E, Santodomingo J, Vay L, Moreno A, Alvarez J. Direct activation of the mitochondrial calcium uniporter by natural plant flavonoids. Biochem J 2004; 384: 19-24. 90. Moreau B, Nelson C, Parekh AB. Biphasic regulation of mitochondrial Ca2+ uptake by cytosolic Ca2+ concentration. Curr Biol 2006; 16: 1672-1677. 91. Kapus A, Szászi K, Káldi K, Ligeti E, Fonyó A. Is the mitochondrial Ca2+ uniporter a voltage-modulated transport pathway? FEBS Lett 1991; 282: 61-64.
104
92. Sato T, Saito T, Saegusa N, Nakaya H. Mitochondrial Ca2+-activated K+ channels in cardiac myocytes: a mechanism of the cardioprotective effect and modulation by protein kinase A. Circulation 2005; 111: 198-203. 93. Xu W, Liu Y, Wang S, McDonald T, Van Eyk JE, Sidor A, O'Rourke B. Cytoprotective role of Ca2+- activated K+ channels in the cardiac inner mitochondrial membrane. Science 2002; 298: 1029-1033. 94. Palmieri L, Pardo B, Lasorsa FM, Del Arco A, Kobayashi K, Iijima M, Runswick MJ, Walker JE, Saheki T, Satrustegui J, Palmieri F. Citrin and aralar1 are Ca(2+)stimulated aspartate/glutamate transporters in mitochondria. Embo J 2001; 20: 5060-5069. 95. Satrustegui J, Pardo B, Del Arco A. Mitochondrial transporters as novel targets for intracellular calcium signaling. Physiol Rev 2007; 87: 29-67. 96. Pralong W-F, Spät A, Wollheim CB. Dynamic pacing of cell metabolism by intracellular Ca2+. J Biol Chem 1994; 269: 27310-27314. 97. Pedersen SF, Jorgensen NK, Hoffmann EK. Dynamics of Ca2+i and pHi in Ehrlich ascites tumor cells after Ca2+-mobilizing agonists or exposure to hypertonic solution. Pflügers Arch 1998; 436: 199-210. 98. Wiederkehr A, Park KS, Dupont O, Demaurex N, Pozzan T, Cline GW, Wollheim CB. Matrix alkalinization: a novel mitochondrial signal for sustained pancreatic beta-cell activation. EMBO J 2009; 28: 417-428. 99. Ogbi M, Johnson JA. Protein kinase Cepsilon interacts with cytochrome c oxidase subunit IV and enhances cytochrome c oxidase activity in neonatal cardiac myocyte preconditioning. Biochem J 2006; 393: 191-199. 100. Jaburek M, Costa AD, Burton JR, Costa CL, Garlid KD. Mitochondrial PKC epsilon and mitochondrial ATP-sensitive K+ channel copurify and coreconstitute to form a functioning signaling module in proteoliposomes. Circ Res 2006; 99: 878-883. 101. Kim MY, Kim MJ, Yoon IS, Ahn JH, Lee SH, Baik EJ, Moon CH, Jung YS. Diazoxide acts more as a PKC-varepsilon activator, and indirectly activates the mitochondrial K(ATP) channel conferring cardioprotection against hypoxic injury. Br J Pharmacol 2006. 102. Baines CP, Zhang J, Wang GW, Zheng YT, Xiu JX, Cardwell EM, Bolli R, Ping P. Mitochondrial PKCepsilon and MAPK form signaling modules in the murine heart. Circ Res 2002; 90: 390-397. 103. Brustovetsky T, Shalbuyeva N, Brustovetsky N. Lack of manifestations of diazoxide/5-hydroxydecanoate-sensitive KATP channel in rat brain nonsynaptosomal mitochondria. J Physiol 2005; 568: 47-59. 105
104. Holmuhamedov EL, Jahangir A, Oberlin A, Komarov A, Colombini M, Terzic A. Potassium channel openers are uncoupling protonophores: implication in cardioprotection. FEBS Lett 2004; 568: 167-170. 105. Brennan JP, Southworth R, Medina RA, Davidson SM, Duchen MR, Shattock MJ. Mitochondrial uncoupling, with low concentration FCCP, induces ROSdependent cardioprotection independent of KATP channel activation. Cardiovasc Res 2006; 72: 313-321. 106. Sparagna GC, Gunter KK, Sheu SS, Gunter TE. Mitochondrial calcium uptake from physiological-type pulses of calcium. A description of the rapid uptake mode. J Biol Chem 1995; 270: 27510-27515. 107. Pitter JG, Maechler P, Wollheim CB, Spät A. Mitochondria respond to Ca2+ already in the submicromolar range: correlation with redox state. Cell Calcium 2002; 31: 97-104. 108. Beutner G, Sharma VK, Giovannucci DR, Yule DI, Sheu SS. Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria. J Biol Chem 2001; 276: 2148221488. 109. Beutner G, Sharma VK, Lin L, Ryu SY, Dirksen RT, Sheu SS. Type 1 ryanodine receptor in cardiac mitochondria: transducer of excitation-metabolism coupling. Biochim Biophys Acta 2005; 1717: 1-10. 110. Uehara K, Onoue H, Jeyakumar LH, Fleischer S, Uehara A. Localization of ryanodine receptor 3 in the sinus endothelial cells of the rat spleen. Cell Tissue Res 2004; 317: 137-145. 111. Pacher P, Hajnóczky G. Propagation of the apoptotic signal by mitochondrial waves. EMBO J 2001; 20: 4107-4121. 112. Crompton M, Moser R, Ludi H, Carafoli E. The interrelations between the transport of sodium and calcium in mitochondria of various mammalian tissues. Eur J Biochem 1978; 82: 25-31. 113. Palty R, Silverman WF, Hershfinkel M, Caporale T, Sensi SL, Parnis J, Nolte C, Fishman D, Shoshan-Barmatz V, Herrmann S, Khananshvili D, Sekler I. NCLX is an essential component of mitochondrial Na+/Ca2+ exchange. Proc Natl Acad Sci U S A 2010; 107: 436-441. 114. Baysal K, Jung DW, Gunter KK, Gunter TE, Brierley GP. Na+-dependent Ca2+ efflux mechanism of heart mitochondria is not a passive Ca2+/2Na+ exchanger. Am J Physiol 1994; 266: C800-C808. 115. Carafoli E. The calcium cycle of mitochondria. FEBS Lett 1979; 104: 1-5.
106
116. Kapus A, Lukacs GL, Cragoe EJ, Jr., Ligeti E, Fonyo A. Characterization of the mitochondrial Na+-H+ exchange. The effect of amiloride analogues. Biochim Biophys Acta 1988; 944: 383-390. 117. Piao L, Li Y, Kim SJ, Sohn KC, Yang KJ, Park KA, Byun HS, Won M, Hong J, Hur GM, Seok JH, Shong M, Sack R, Brazil DP, Hemmings BA, Park J. Regulation of OPA1-mediated mitochondrial fusion by leucine zipper/EF-handcontaining transmembrane protein-1 plays a role in apoptosis. Cell Signal 2009; 21: 767-777. 118. Wingrove DE, Gunter TE. Kinetics of mitochondrial calcium transport. I. Characteristics of thesodium-independent calcium efflux mechanism of liver mitochondria. J Biol Chem 1986; 261: 15159-15165. 119. Jung DW, Baysal K, Brierley GP. The sodium-calcium antiport of heart mitochondria is not electroneutral. J Biol Chem 1995; 270: 672-678. 120. Smets I, Caplanusi A, Despa S, Molnar Z, Radu M, VandeVen M, Ameloot M, Steels P. Ca2+ uptake in mitochondria occurs via the reverse action of the Na+/Ca2+ exchanger in metabolically inhibited MDCK cells. Am J Physiol Renal Physiol 2004; 286: F784-F794. 121. Wingrove DE, Gunter TE. Kinetics of mitochondrial calcium transport. II. A kinetic description ofthe sodium-dependent calcium efflux mechanism of liver mitochondria andinhibition by ruthenium red and by tetraphenylphosphonium. J Biol Chem 1986; 261: 15166-15171. 122. Babcock DF, Herrington J, Goodwin PC, Park YB, Hille B. Mitochondrial participation in the intracellular Ca2+ network. J Cell Biol 1997; 136: 833-844. 123. Haworth RA, Hunter DR. The Ca2+-induced membrane transition in mitochondria. II. Nature of the Ca2+ trigger site. Arch Biochem Biophys 1979; 195: 460-467. 124. Baines CP, Kaiser RA, Purcell NH, Blair NS, Osinska H, Hambleton MA, Brunskill EW, Sayen MR, Gottlieb RA, Dorn GW, Robbins J, Molkentin JD. Loss of cyclophilin D reveals a critical role for mitochondrial permeability transition in cell death. Nature 2005; 434: 658-662. 125. Abramov AY, Duchen MR. Mechanisms underlying the loss of mitochondrial membrane potential in glutamate excitotoxicity. Biochim Biophys Acta 2008; 1777: 953-964. 126. Kokoszka JE, Waymire KG, Levy SE, Sligh JE, Cai J, Jones DP, MacGregor GR, Wallace DC. The ADP/ATP translocator is not essential for the mitochondrial permeability transition pore. Nature 2004; 427: 461-465.
107
127. Baines CP, Kaiser RA, Sheiko T, Craigen WJ, Molkentin JD. Voltage-dependent anion channels are dispensable for mitochondrial-dependent cell death. Nat Cell Biol 2007; 9: 550-555. 128. Halestrap AP, McStay GP, Clarke SJ. The permeability transition pore complex: another view. Biochimie 2002; 84: 153-166. 129. Halestrap AP, Clarke SJ, Khaliulin I. The role of mitochondria in protection of the heart by preconditioning. Biochim Biophys Acta 2007; 1767: 1007-1031. 130. Baumgartner HK, Gerasimenko JV, Thorne C, Ferdek P, Pozzan T, Tepikin AV, Petersen OH, Sutton R, Watson AJ, Gerasimenko OV. Calcium elevation in mitochondria is the main Ca2+ requirement for mPTP opening. J Biol Chem 2009. 131. Odagiri K, Katoh H, Kawashima H, Tanaka T, Ohtani H, Saotome M, Urushida T, Satoh H, Hayashi H. Local control of mitochondrial membrane potential, permeability transition pore and reactive oxygen species by calcium and calmodulin in rat ventricular myocytes. J Mol Cell Cardiol 2009. 132. Duchen MR. Roles of mitochondria in health and disease. Diabetes 2004; 53 Suppl 1: S96-102. 133. Hajnóczky G, Csordás G, Das S, Garcia-Perez C, Saotome M, Sinha RS, Yi M. Mitochondrial calcium signalling and cell death: Approaches for assessing the role of mitochondrial Ca(2+) uptake in apoptosis. Cell Calcium 2006; 40: 553560. 134. Petronilli V, Miotto G, Canton M, Brini M, Colonna R, Bernardi P, Di Lisa F. Transient and long-lasting openings of the mitochondrial permeability transition pore can be monitored directly in intact cells by changes in mitochondrial calcein fluorescence. Biophys J 1999; 76: 725-734. 135. Szalai G, Krishnamurthy R, Hajnóczky G. Apoptosis driven by IP3-linked mitochondrial calcium signals. EMBO J 1999; 18: 6349-6361. 136. McCormack JG. Characterization of the effects of Ca2+ on the intramitochondrial Ca2+-sensitive enzymes from rat and within intact rat liver mitochondria. Biochem J 1985; 231: 581-595. 137. Duchen MR. Ca2+-dependent changes in the mitochondrial energetics in single dissociated mouse sensory neurons. Biochem J 1992; 283: 41-50. 138. Rizzuto R, Simpson AWM, Brini M, Pozzan T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature 1992; 358: 325-327.
108
139. Hajnóczky G, Robb-Gaspers LD, Seitz MB, Thomas AP. Decoding of cytosolic calcium oscillations in the mitochondria. Cell 1995; 82: 415-424. 140. Rizzuto R, Brini M, Murgia M, Pozzan T. Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria. Science 1993; 262: 744-747. 141. Rizzuto R, Pozzan T. Microdomains of intracellular Ca2+: molecular determinants and functional consequences. Physiol Rev 2006; 86: 369-408. 142. Isshiki M, Mutoh A, Fujita T. Subcortical Ca2+ waves sneaking under the plasma membrane in endothelial cells. Circ Res 2004; 95: e11-e21. 143. Pivovarova NB, Hongpaisan J, Andrews SB, Friel DD. Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: Spatial and temporal characteristics. J Neurosci 1999; 19: 6372-6384. 144. Alonso MT, Villalobos C, Chamero P, Alvarez J, Garcia-Sancho J. Calcium microdomains in mitochondria and nucleus. Cell Calcium 2006; 40: 513-525. 145. Csordás G, Thomas AP, Hajnóczky G. Quasi-synaptic calcium signal transmission between endoplasmic reticulum and mitochondria. EMBO J 1999; 18: 96-108. 146. Szalai G, Csordás G, Hantash BM, Thomas AP, Hajnóczky G. Calcium signal transmission between ryanodine receptors and mitochondria. J Biol Chem 2000; 275: 15305-15313. 147. Sharma VK, Ramesh V, Franzini-Armstrong C, Sheu SS. Transport of Ca2+ from sarcoplasmic reticulum to mitochondria in rat ventricular myocytes. J Bioenerg Biomembr 2000; 32: 97-104. 148. Rohács T, Tory K, Dobos A, Spät A. Intracellular calcium release is more efficient than calcium influx in stimulating mitochondrial NAD(P)H formation in adrenal glomerulosa cells. Biochemical Journal 1997; 328: 525-528. 149. Marsault R, Murgia M, Pozzan T, Rizzuto R. Domains of high Ca2+ beneath the plasma membrane of living A7r5 cells. EMBO J 1997; 16: 1575-1581. 150. Nakahashi Y, Nelson E, Fagan K, Gonzales E, Guillou JL, Cooper DM. Construction of a full-length Ca2+-sensitive adenylyl cyclase/aequorin chimera. J Biol Chem 1997; 272: 18093-18097. 151. Isshiki M, Ying YS, Fujita T, Anderson RG. A molecular sensor detects signal transduction from caveolae in living cells. J Biol Chem 2002; 277: 43389-43398.
109
152. Pinton P, Tsuboi T, Ainscow EK, Pozzan T, Rizzuto R, Rutter GA. Dynamics of glucose-induced membrane recruitment of protein kinase C bII in living pancreatic islet b-cells. J Biol Chem 2002; 277: 37702-37710. 153. Shore GC, Tata JR. Two fractions of rough endoplasmic reticulum from rat liver. I. Recovery of rapidly sedimenting endoplasmic reticulum in association with mitochondria. J Cell Biol 1977; 72: 714-725. 154. Rizzuto R, Pinton P, Carrington W, Fay FS, Fogarty KE, Lifshitz LM, Tuft RA, Pozzan T. Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses. Science 1998; 280: 1763-1766. 155. Mannella CA, Buttle K, Rath BK, Marko M. Electron microscopic tomography of rat-liver mitochondria and their interaction with the endoplasmic reticulum. BioFactors 1998; 8: 225-228. 156. Franke WW, Kartenbeck J. Outer mitochondrial membrane continuous with endoplasmic reticulum. Protoplasma 1971; 73: 35-41. 157. Csordás G, Renken C, Várnai P, Walter L, Weaver D, Buttle KF, Balla T, Mannella CA, Hajnóczky G. Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria. J Cell Biol 2006. 158. Szabadkai G, Bianchi K, Várnai P, De Stefani D, Wieckowski MR, Cavagna D, Nagy AI, Balla T, Rizzuto R. Chaperone-mediated coupling of endoplasmic reticulum and mitochondrial Ca2+ channels. J Cell Biol 2006; 175: 901-911. 159. de Brito OM, Scorrano L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature 2008; 456: 605-610. 160. Kornmann B, Currie E, Collins SR, Schuldiner M, Nunnari J, Weissman JS, Walter P. An ER-mitochondria tethering complex revealed by a synthetic biology screen. Science 2009; 325: 477-481. 161. Perreault S, Bousquet O, Lauzon M, Paiement J, Leclerc N. Increased association between rough endoplasmic reticulum membranes and mitochondria in transgenic mice that express P301L tau. J Neuropathol Exp Neurol 2009; 68: 503-514. 162. Morris RL, Hollenbeck PJ. Axonal transport of mitochondria along microtubules and F-actin in living vertebrate neurons. J Cell Biol 1995; 131: 1315-1326. 163. Pitts KR, Yoon Y, Krueger EW, McNiven MA. The dynamin-like protein DLP1 is essential for normal distribution and morphology of the endoplasmic reticulum and mitochondria in mammalian cells. Mol Biol Cell 1999; 10: 4403-4417. 164. Wang HJ, Guay G, Pogan L, Sauve R, Nabi IR. Calcium regulates the association between mitochondria and a smooth subdomain of the endoplasmic reticulum. J Cell Biol 2000; 150: 1489-1498. 110
165. Simmen T, Aslan JE, Blagoveshchenskaya AD, Thomas L, Wan L, Xiang Y, Feliciangeli SF, Hung CH, Crump CM, Thomas G. PACS-2 controls endoplasmic reticulum-mitochondria communication and Bid-mediated apoptosis. EMBO J 2005; 24: 717-729. 166. Goetz JG, Genty H, St Pierre P, Dang T, Joshi B, Sauve R, Vogl W, Nabi IR. Reversible interactions between smooth domains of the endoplasmic reticulum and mitochondria are regulated by physiological cytosolic Ca2+ levels. J Cell Sci 2007; 120: 3553-3564. 167. Mendes CC, Gomes DA, Thompson M, Souto NC, Goes TS, Goes AM, Rodrigues MA, Gomez MV, Nathanson MH, Leite MF. The type III inositol 1,4,5-trisphosphate receptor preferentially transmits apoptotic Ca2+ signals into mitochondria. J Biol Chem 2005; 280: 40892-40900. 168. Szabadkai G, Pitter JG, Spät A. Cytoplasmic Ca2+ at low submicromolar concentration stimulates mitochondrial metabolism in rat luteal cells. Pflügers Arch 2001; 441: 678-685. 169. Kamishima T, Quayle JM. Mitochondrial Ca2+ uptake is important over low [Ca2+]i range in arterial smooth muscle. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2002; 283: H2431-H2439. 170. Allshire A, Bernardi P, Saris NE. Manganese stimulates calcium flux through the mitochondrial uniporter. Biochim Biophys Acta 1985; 807: 202-209. 171. Maechler P, Kennedy ED, Pozzan T, Wollheim CB. Mitochondrial activation directly triggers the exocytosis of insulin in permeabilized pancreatic b-cells. EMBO J 1997; 16: 3833-3841. 172. Giacomello M, Drago I, Bortolozzi M, Scorzeto M, Gianelle A, Pizzo P, Pozzan T. Ca2+ hot spots on the mitochondrial surface are generated by Ca2+ mobilization from stores, but not by activation of store-operated Ca2+ channels. Mol Cell 2010; 38: 280-290. 173. Rohács T, Nagy Gy, Spät A. Cytoplasmic Ca2+ signalling and reduction of mitochondrial pyridine nucleotides in adrenal glomerulosa cells in response to K+, angiotensin II and vasopressin. Biochem J 1997; 322: 785-792. 174. Rainey WE, Bird IM, Sawetawan C, Hanley NA, McCarthy JL, McGee EAW-R, Mason JI. Regulation of human adrenal carcinoma cell (NCI-H295) production of C19steroids. J Clin Endocrinol Metab 1993; 77: 731-737. 175. Rainey WE, Bird IM, Mason JI. The NCI-H295 cell line: a pluripotent model for human adrenocortical studies. Mol Cell Endocrinol 1994; 100: 45-50.
111
176. Schoenmakers TJ, Visser GJ, Flik G, Theuvenet AP. CHELATOR: an improved method for computing metal ion concentrations in physiological solutions. Biotechniques 1992; 12: 870-876. 177. Várnai P, Balla A, Hunyady L, Balla T. Targeted expression of the inositol 1,4,5triphosphate receptor (IP3R) ligand-binding domain releases Ca2+ via endogenous IP3R channels. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102: 7859-7864. 178. Nagai T, Sawano A, Park ES, Miyawaki A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. Proc Natl Acad Sci 2001; 98: 3197-3202. 179. Manjarres IM, Chamero P, Domingo B, Molina F, Llopis J, Alonso MT, GarciaSancho J. Red and green aequorins for simultaneous monitoring of Ca(2+) signals from two different organelles. Pflügers Arch 2008; 455: 961-970. 180. Kennedy HJ, Pouli AE, Ainscow EK, Jouaville LS, Rizzuto R, Rutter GA. Glucose generates sub-plasma membrane ATP microdomains in single islet betacells. Potential role for strategically located mitochondria. J Biol Chem 1999; 274: 13281-13291. 181. Collins TJ, Lipp P, Berridge MJ, Bootman MD. Mitochondrial Ca2+ uptake depends on the spatial and temporal profile of cytosolic Ca2+ signals. J Biol Chem 2001; 276: 26411-26420. 182. Korzeniowski MK, Popovic MA, Szentpetery Z, Varnai P, Stojilkovic SS, Balla T. Dependence of stim1/orai1 mediated calcium entry on plasma membrane phosphoinositides. J Biol Chem 2009. 183. Spät A, Balla I, Balla T, Cragoe EJ, Jr., Hajnóczky G, Hunyady L. Angiotensin II and potassium activate different calcium entry mechanisms in rat adrenal glomerulosa cells. J Endocrinol 1989; 122: 361-370. 184. Tsien RY. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature 1981; 290: 527-528. 185. Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem 1985; 260: 3440-3450. 186. Chamero P, Manjarres IM, Garcia-Verdugo JM, Villalobos C, Alonso MT, Garcia-Sancho J. Nuclear calcium signaling by inositol trisphosphate in GH3 pituitary cells. Cell Calcium 2008; 43: 205-214. 187. Pitter JG, Szanda G, Duchen MR, Spät A. Prostaglandin F(2alpha) potentiates the calcium dependent activation of mitochondrial metabolism in luteal cells. Cell Calcium 2005; 37: 35-44.
112
188. Thomas D, Tovey SC, Collins TJ, Bootman MD, Berridge MJ, Lipp P. A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals. Cell Calcium 2000; 28: 213-223. 189. Lin X, Várnai P, Csordás G, Balla A, Nagai T, Miyawaki A, Balla T, Hajnóczky G. Control of calcium signal propagation to the mitochondria by inositol 1,4,5trisphosphate-binding proteins. J Biol Chem 2005; 280: 12820-12832. 190. Ellis-Davies GC, Barsotti RJ. Tuning caged calcium: photolabile analogues of EGTA with improved optical and chelation properties. Cell Calcium 2006; 39: 75-83. 191. Montero M, Alonso MT, Carnicero E, Cuchillo-Ibanez I, Albillos A, Garcia AG, Garcia-Sancho J, Alvarez J. Chromaffin-cell stimulation triggers fast millimolar mitochondrial Ca2+ transients that modulate secretion. Nat Cell Biol 2000; 2: 5761. 192. Várnai P, Tóth B, Tóth DJ, Hunyady L, Balla T. Visualization and manipulation of plasma membrane-endoplasmic reticulum contact sites indicates the presence of additional molecular components within the STIM1-Orai1 Complex. J Biol Chem 2007; 282: 29678-29690. 193. Varnai P, Hunyady L, Balla T. STIM and Orai: the long-awaited constituents of store-operated calcium entry. Trends Pharmacol Sci 2009. 194. Takemura H, Thastrup O, Putney JW, Jr. Calcium efflux across the plasma membrane of rat parotid acinar cells is unaffected by receptor activation or by the microsomal calcium ATPase inhibitor, thapsigargin. Cell Calcium 1990; 11: 1117. 195. Chvanov M, Walsh CM, Haynes LP, Voronina SG, Lur G, Gerasimenko OV, Barraclough R, Rudland PS, Petersen OH, Burgoyne RD, Tepikin AV. ATP depletion induces translocation of STIM1 to puncta and formation of STIM1ORAI1 clusters: translocation and re-translocation of STIM1 does not require ATP. Pflügers Arch 2008. 196. Natarajan R, Yang DC, Lanting L, Nadler JL. Key role of P38 mitogen-activated protein kinase and the lipoxygenase pathway in angiotensin II actions in H295R adrenocortical cells. Endocrine 2002; 18: 295-301. 197. Lehoux JG, Lefebvre A. Novel protein kinase C-epsilon inhibits human CYP11B2 gene expression through ERK1/2 signalling pathway and JunB. J Mol Endocrinol 2006; 36: 51-64. 198. Schuh RA, Kristian T, Fiskum G. Calcium-dependent dephosphorylation of brain mitochondrial calcium/cAMP response element binding protein (CREB). J Neurochem 2005; 92: 388-394.
113
199. Gu J, Wen Y, Mison A, Nadler JL. 12-lipoxygenase pathway increases aldosterone production, 3',5'-cyclic adenosine monophosphate response elementbinding protein phosphorylation, and p38 mitogen-activated protein kinase activation in H295R human adrenocortical cells. Endocrinology 2003; 144: 534543. 200. Szanda G, Koncz P, Rajki A, Spät A. Participation of p38 MAPK and a noveltype protein kinase C in the control of mitochondrial Ca2+ uptake. Cell Calcium 2008; 43: 250-259. 201. Davies SP, Reddy H, Caivano M, Cohen P. Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors. Biochem J 2000; 351: 95-105. 202. Matlib MA, Schwartz A. Selective effects of diltiazem, a benzothiazepine calcium channel blocker, and diazepam, and other benzodiazepines on the Na+/Ca2+ exchange carrier system of heart and brain mitochondria. Life Sci 1983; 32: 28372842. 203. Baud V, Karin M. Signal transduction by tumor necrosis factor and its relatives. Trends Cell Biol 2001; 11: 372-377. 204. Ge B, Gram H, Di Padova F, Huang B, New L, Ulevitch RJ, Luo Y, Han J. MAPKK-independent activation of p38alpha mediated by TAB1-dependent autophosphorylation of p38alpha. Science 2002; 295: 1291-1294. 205. Husmann M, Dersch K, Bobkiewicz W, Beckmann E, Veerachato G, Bhakdi S. Differential role of p38 mitogen activated protein kinase for cellular recovery from attack by pore-forming S. aureus alpha-toxin or streptolysin O. Biochem Biophys Res Commun 2006; 344: 1128-1134. 206. Romero DG, Welsh BL, Gomez-Sanchez EP, Yanes LL, Rilli S, Gomez-Sanchez CE. Angiotensin II-Mediated Protein Kinase D Activation Stimulates Aldosterone and Cortisol Secretion in H295R Human Adrenocortical Cells. Endocrinology 2006; 147: 6046-6055. 207. Wilkinson SE, Parker PJ, Nixon JS. Isoenzyme specificity of bisindolylmaleimides, selective inhibitors of protein kinase C. Biochem J 1993; 294 ( Pt 2): 335-337. 208. Rapizzi E, Pinton P, Szabadkai G, Wieckowski MR, Vandecasteele G, Baird G, Tuft RA, Fogarty KE, Rizzuto R. Recombinant expression of the voltagedependent anion channel enhances the transfer of Ca2+ microdomains to mitochondria. J Cell Biol 2002; 159: 613-624. 209. Csordás G, Madesh M, Antonsson B, Hajnóczky G. tcBid promotes Ca2+ signal propagation to the mitochondria: control of Ca2+ permeation through the outer mitochondrial membrane . EMBO J 2002; 21: 2198-2206.
114
210. Luo X, Budihardjo I, Zou H, Slaughter C, Wang X. Bid, a Bcl2 interacting protein, mediates cytochrome c release from mitochondria in response to activation of cell surface death receptors. Cell 1998; 94: 481-490. 211. Scorrano L, Ashiya M, Buttle K, Weiler S, Oakes SA, Mannella CA, Korsmeyer SJ. A distinct pathway remodels mitochondrial cristae and mobilizes cytochrome c during apoptosis. Dev Cell 2002; 2: 55-67. 212. Quinsay MN, Lee Y, Rikka S, Sayen MR, Molkentin JD, Gottlieb RA, Gustafsson AB. Bnip3 mediates permeabilization of mitochondria and release of cytochrome c via a novel mechanism. J Mol Cell Cardiol 2010; 48: 1146-1156. 213. Romani A. Regulation of magnesium homeostasis and transport in mammalian cells. Arch Biochem Biophys 2007; 458: 90-102. 214. Romani AM. Magnesium homeostasis in mammalian cells. Front Biosci 2007; 12: 308-331. 215. Kubota T, Shindo Y, Tokuno K, Komatsu H, Ogawa H, Kudo S, Kitamura Y, Suzuki K, Oka K. Mitochondria are intracellular magnesium stores: investigation by simultaneous fluorescent imagings in PC12 cells. Biochim Biophys Acta 2005; 1744: 19-28. 216. Leyssens A, Nowicky AV, Patterson L, Crompton M, Duchen MR. The relationship between mitochondrial state, ATP hydrolysis, [Mg2+]i and [Ca2+]i studied in isolated rat cardiomyocytes. J Physiol 1996; 496 ( Pt 1): 111-128. 217. Foskett JK, White C, Cheung KH, Mak DO. Inositol trisphosphate receptor Ca2+ release channels. Physiol Rev 2007; 87: 593-658. 218. Marmol P, Pardo B, Wiederkehr A, Del Arco A, Wollheim CB, Satrustegui J. Requirement for aralar and its Ca2+-binding sites in Ca2+-signal transduction in mitochondria from INS-1 clonal beta -cells. J Biol Chem 2008. 219. Rutter GA, Tsuboi T, Ravier MA. Ca2+ microdomains and the control of insulin secretion. Cell Calcium 2006; 40: 539-551. 220. Zhou YD, Fang XF, Cui ZJ. UVA-induced calcium oscillations in rat mast cells. Cell Calcium 2009; 45: 18-28. 221. Pozzan T, Rudolf R. Measurements of mitochondrial calcium in vivo. Biochim Biophys Acta 2009; 1787: 1317-1323. 222. Vay L, Hernandez-Sanmiguel E, Lobaton CD, Moreno A, Montero M, Alvarez J. Mitochondrial free [Ca2+] levels and the permeability transition. Cell Calcium 2009; 45: 243-250.
115
223. Koncz P, Szanda G, Rajki A, Spät A. Reactive oxygen species, Ca(2+) signaling and mitochondrial NAD(P)H level in adrenal glomerulosa cells. Cell Calcium 2006; 40:347-57. 224. Nussdorfer GG. Cytophysiology of the adrenal zona glomerulosa. Int Rev Cytol 1980; 64: 307-368. 225. Gee KR, Brown KA, Chen WN, Bishop-Stewart J, Gray D, Johnson I. Chemical and physiological characterization of fluo-4 Ca(2+)-indicator dyes. Cell Calcium 2000; 27: 97-106. 226. Zima AV, Bare DJ, Mignery GA, Blatter LA. IP3-dependent nuclear Ca2+ signalling in the mammalian heart. J Physiol 2007; 584: 601-611. 227. Alonso MT, Chamero P, Villalobos C, Garcia-Sancho J. Fura-2 antagonises calcium-induced calcium release. Cell Calcium 2003; 33: 27-35. 228. Morgan AJ, Thomas AP. Single-cell and subcellular measurement of intracellular Ca2+ concentration. Methods Mol Biol 2006; 312: 87-117. 229. Debska G, May R, Kicinska A, Szewczyk A, Elger CE, Kunz WS. Potassium channel openers depolarize hippocampal mitochondria. Brain Res 2001; 892: 4250. 230. Spät A. Glomerulosa cell - a unique sensor of extracellular K+ concentration. Mol Cell Endocrinol 2004; 217: 23-26. 231. Meldrum E, Parker PJ, Carozzi A. The PtdIns-PLC superfamily and signal transduction. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res 1991; 1092: 49-71. 232. Parekh AB. Ca2+ microdomains near plasma membrane Ca2+ channels: impact on cell function. J Physiol 2008; 586: 3043-3054. 233. Demuro A, Parker I. Imaging single-channel calcium microdomains. Cell Calcium 2006; 40: 413-422. 234. McCarron JG, Chalmers S, Bradley KN, MacMillan D, Muir TC. Ca2+ microdomains in smooth muscle. Cell Calcium 2006; 40: 461-493. 235. Roos J, DiGregorio PJ, Yeromin AV, Ohlsen K, Lioudyno M, Zhang S, Safrina O, Kozak JA, Wagner SL, Cahalan MD, Velicelebi G, Stauderman KA. STIM1, an essential and conserved component of store-operated Ca2+ channel function. J Cell Biol 2005; 169: 435-445. 236. Zhang SL, Yu Y, Roos J, Kozak JA, Deerinck TJ, Ellisman MH, Stauderman KA, Cahalan MD. STIM1 is a Ca2+ sensor that activates CRAC channels and migrates from the Ca2+ store to the plasma membrane. Nature 2005; 437: 902-905.
116
237. Prakriya M, Feske S, Gwack Y, Srikanth S, Rao A, Hogan PG. Orai1 is an essential pore subunit of the CRAC channel. Nature 2006; 443: 230-233. 238. Xu P, Lu J, Li Z, Yu X, Chen L, Xu T. Aggregation of STIM1 underneath the plasma membrane induces clustering of Orai1. Biochem Biophys Res Commun 2006; 350: 969-976. 239. Spät A, Pitter JG, Rohács T, Szabadkai G. Stimulus-secretion coupling and mitochondrial metabolism in steroid secreting cells. News Physiol Sci 2001; 16: 197-200. 240. Korzeniowski MK, Szanda G, Balla T, Spät A. Store-operated Ca(2+) influx and subplasmalemmal mitochondria. Cell Calcium 2009. 241. Takemura H, Hughes AR, Thastrup O, Putney JW, Jr. Activation of calcium entry by the tumor promoter thapsigargin in parotid acinar cells. J Biol Chem 1989; 264: 12266-12271. 242. Lytton J, Westlin M, Hanley MR. Thapsigargin inhibits the sarcoplasmic or endoplasmic reticulum Ca-ATPase family of calcium pumps. J Biol Chem 1991; 266: 17067-17071. 243. Putney JW, Jr. A model for receptor-regulated calcium entry. Cell Calcium 1986; 7: 1-12. 244. Berk BC. Angiotensin II signal transduction in vascular smooth muscle: pathways activated by specific tyrosine kinases. J Am Soc Nephrol 1999; 10 Suppl 11: S62S68. 245. Guo DF, Sun YL, Hamet P, Inagami T. The angiotensin II type 1 receptor and receptor-associated proteins. Cell Res 2001; 11: 165-180. 246. Li F, Malik KU. Angiotensin II-induced Akt activation is mediated by metabolites of arachidonic acid generated by CaMKII-stimulated Ca2(+)-dependent phospholipase A2. Am J Physiol Heart Circ Physiol 2005; 288: H2306-H2316. 247. Gambaryan S, Butt E, Tas P, Smolenski A, Allolio B, Walter U. Regulation of aldosterone production from zona glomerulosa cells by ANG II and cAMP: evidence for PKA-independent activation of CaMK by cAMP. Am J Physiol Endocrinol Metab 2006; 290: E423-E433. 248. Lehoux JG, Lefebvre A. Angiotensin II activates p44/42 MAP kinase partly through PKCvarepsilon in H295R cells. Mol Cell Endocrinol 2007; 265-266: 121-125. 249. Zheng XJ, Bollag WB. AngII induces transient phospholipase D activity in the H295R glomerulosa cell model. Mol Cell Endocrinol 2003; 206: 113-122.
117
250. Garcia A, Cayla X, Guergnon J, Dessauge F, Hospital V, Rebollo MP, Fleischer A, Rebollo A. Serine/threonine protein phosphatases PP1 and PP2A are key players in apoptosis. Biochimie 2003; 85: 721-726. 251. Lalevee N, Resin V, Arnaudeau S, Demaurex N, Rossier MF. Intracellular transport of calcium from plasma membrane to mitochondria in adrenal H295R cells: implication for steroidogenesis. Endocrinology 2003; 144: 4575-4585. 252. Takeda K, Matsuzawa A, Nishitoh H, Tobiume K, Kishida S, Ninomiya-Tsuji J, Matsumoto K, Ichijo H. Involvement of ASK1 in Ca2+-induced p38 MAP kinase activation. EMBO Rep 2004; 5: 161-166. 253. Oh-hashi K, Kaneyama M, Hirata Y, Kiuchi K. ER calcium discharge stimulates GDNF gene expression through MAPK-dependent and -independent pathways in rat C6 glioblastoma cells. Neurosci Lett 2006; 405: 100-105. 254. Bruchas MR, Macey TA, Lowe JD, Chavkin C. Kappa opioid receptor activation of p38 MAPK is. J Biol Chem 2006; 281: 18081-18089. 255. Sun Y, Cheng Z, Ma L, Pei G. Beta-arrestin2 is critically involved in CXCR4mediated chemotaxis, and this is mediated by its enhancement of p38 MAPK activation. J Biol Chem 2002; 277: 49212-49219. 256. Koncz P, Szanda G, Fülöp L, Rajki A, Spät A. Mitochondrial Ca2+ uptake is inhibited by a concerted action of p38 MAPK and protein kinase D. Cell Calcium 2009; 46: 122-129. 257. Lehoux JG, Dupuis G, Lefebvre A. Control of CYP11B2 gene expression through differential regulation of its promoter by atypical and conventional protein kinase C isoforms. J Biol Chem 2001; 276: 8021-8028. 258. Kong JY, Klassen SS, Rabkin SW. Ceramide activates a mitochondrial p38 mitogen-activated protein kinase: a potential mechanism for loss of mitochondrial transmembrane potential and apoptosis. Mol Cell Biochem 2005; 278: 39-51. 259. Costa AD, Garlid KD, West IC, Lincoln TM, Downey JM, Cohen MV, Critz SD. Protein kinase G transmits the cardioprotective signal from cytosol to mitochondria. Circ Res 2005; 97: 329-336. 260. van Lint J, Rykx A, Maeda Y, Vantus T, Sturany S, Malhotra V, Vandenheede JR, Seufferlein T. Protein kinase D: an intracellular traffic regulator on the move. Trends Cell Biol 2002; 12: 193-200. 261. Zugaza JL, Sinnett-Smith J, van Lint J, Rozengurt E. Protein kinase D (PKD) activation in intact cells through a protein kinase C-dependent signal transduction pathway. EMBO J 1996; 15: 6220-6230.
118
262. Haworth RS, Roberts NA, Cuello F, Avkiran M. Regulation of protein kinase D activity in adult myocardium: novel counter-regulatory roles for protein kinase Cepsilon and protein kinase A. J Mol Cell Cardiol 2007; 43: 686-695. 263. Storz P, Doppler H, Toker A. Protein kinase D mediates mitochondrion-tonucleus signaling and detoxification from mitochondrial reactive oxygen species. Mol Cell Biol 2005; 25: 8520-8530. 264. Berna MJ, Hoffmann KM, Tapia JA, Thill M, Pace A, Mantey SA, Jensen RT. CCK causes PKD1 activation in pancreatic acini by signaling through PKC-delta and PKC-independent pathways. Biochim Biophys Acta 2007; 1773: 483-501. 265. Várnai P, Osipenko ON, Vizi ES, Spät A. Activation of calcium current in voltage-clamped rat glomerulosa cells by potassium ions. J Physiol 1995; 483: 67-78. 266. Ellis MV, James SR, Perisic O, Downes CP, Williams RL, Katan M. Catalytic domain of phosphoinositide-specific phospholipase C (PLC). J Biol Chem 1998; 273: 11650-11659. 267. Collins TJ, Berridge MJ, Lipp P, Bootman MD. Mitochondria are morphologically and functionally heterogeneous within cells. Embo J 2002; 21: 1616-1627. 268. Reers M, Smiley ST, Mottola-Hartshorn C, Chen A, Lin M, Chen LB. Mitochondrial membrane potential monitored by JC-1 dye. Methods Enzymol 1995; 260: 406-417. 269. Spät A, Fülöp L, Koncz P, Szanda G. When is high-Ca2+ microdomain required for mitochondrial Ca2+ uptake ? Acta Physiol (Oxf) 2008; 195: 139-147. 270. Beecroft MD, Taylor CW. Luminal Ca2+ regulates passive Ca2+ efflux from the intracellular stores of hepatocytes. Biochem J 1998; 334: 431-435. 271. Cardenas C, Miller RA, Smith I, Bui T, Molgo J, Muller M, Vais H, Cheung KH, Yang J, Parker I, Thompson CB, Birnbaum MJ, Hallows KR, Foskett JK. Essential regulation of cell bioenergetics by constitutive InsP3 receptor Ca2+ transfer to mitochondria. Cell 2010; 142: 270-283. 272. Bragadin M, Pozzan T, Azzone GF. Kinetics of Ca2+ carrier in rat liver mitochondria. Biochemistry 1979; 18: 5972-5978. 273. Pavlov E, Grigoriev SM, Dejean LM, Zweihorn CL, Mannella CA, Kinnally KW. The mitochondrial channel VDAC has a cation-selective open state. Biochim Biophys Acta 2005; 1710: 96-102. 274. Báthori G, Csordas G, Garcia-Perez C, Davies E, Hajnóczky G. Ca2+-dependent control of the permeability properties of the mitochondrial outer membrane and 119
voltage-dependent anion-selective channel (VDAC). J Biol Chem 2006; 281: 17347-17358. 275. Tan W, Colombini M. VDAC closure increases calcium ion flux. Biochim Biophys Acta 2007; 1768: 2510-2515. 276. Darios F, Lambeng N, Troadec JD, Michel PP, Ruberg M. Ceramide increases mitochondrial free calcium levels via caspase 8 and Bid: role in initiation of cell death. J Neurochem 2003; 84: 643-654. 277. Madesh M, Antonsson B, Srinivasula SM, Alnemri ES, Hajnóczky G. Rapid kinetics of tBid-induced cytochrome c and Smac/DIABLO release and mitochondrial depolarization. J Biol Chem 2002; 277: 5651-5659. 278. Clark IE, Dodson MW, Jiang C, Cao JH, Huh JR, Seol JH, Yoo SJ, Hay BA, Guo M. Drosophila pink1 is required for mitochondrial function and interacts genetically with parkin. Nature 2006; 441: 1162-1166. 279. Plun-Favreau H, Klupsch K, Moisoi N, Gandhi S, Kjaer S, Frith D, Harvey K, Deas E, Harvey RJ, McDonald N, Wood NW, Martins LM, Downward J. The mitochondrial protease HtrA2 is regulated by Parkinson's disease-associated kinase PINK1. Nat Cell Biol 2007; 9: 1243-1252. 280. Gandhi S, Wood-Kaczmar A, Yao Z, Plun-Favreau H, Deas E, Klupsch K, Downward J, Latchman DS, Tabrizi SJ, Wood NW, Duchen MR, Abramov AY. PINK1-associated Parkinson's disease is caused by neuronal vulnerability to calcium-induced cell death. Mol Cell 2009; 33: 627-638. 281. Schindl R, Weghuber J, Romanin C, Schweyen RJ. Mrs2p forms a high conductance Mg2+ selective channel in mitochondria. Biophys J 2007; 93: 38723883. 282. Rutter GA, Osbaldeston NJ, McCormack JG, Denton RM. Measurement of matrix free Mg2+ concentration in rat heart mitochondria by using entrapped fluorescent probes. Biochem J 1990; 271: 627-634. 283. Jung DW, Apel L, Brierley GP. Matrix free Mg2+ changes with metabolic state in isolated heart mitochondria. Biochemistry 1990; 29: 4121-4128. 284. Tashiro M, Inoue H, Konishi M. Metabolic inhibition strongly inhibits Na+dependent Mg2+ efflux in rat ventricular myocytes. Biophys J 2009; 96: 49414950. 285. Mooren FC, Turi S, Gunzel D, Schlue WR, Domschke W, Singh J, Lerch MM. Calcium-magnesium interactions in pancreatic acinar cells. FASEB J 2001; 15: 659-672.
120
286. Jung DW, Panzeter E, Baysal K, Brierley GP. On the relationship between matrix free Mg2+ concentration and total Mg2+ in heart mitochondria. Biochim Biophys Acta 1997; 1320: 310-320. 287. Jung DW, Chapman CJ, Baysal K, Pfeiffer DR, Brierley GP. On the use of fluorescent probes to estimate free Mg2+ in the matrix of heart mitochondria. Arch Biochem Biophys 1996; 332: 19-29. 288. Chinopoulos C, Vajda S, Csanady L, Mandi M, Mathe K, Adam-Vizi V. A novel kinetic assay of mitochondrial ATP-ADP exchange rate mediated by the ANT. Biophys J 2009; 96: 2490-2504. 289. Henrich M, Buckler KJ. Effects of anoxia and aglycaemia on cytosolic calcium regulation in rat sensory neurons. Am J Physiol 2008; 294: C280-C294. 290. Maechler P, Wang HY, Wollheim CB. Continuous monitoring of ATP levels in living insulin secreting cells expressing cytosolic firefly luciferase. FEBS Lett 1998; 422: 328-332. 291. Bezprozvanny I, Ehrlich BE. Inositol (1,4,5)-trisphosphate (InsP3)-gated Ca channels from cerebellum: conduction properties for divalent cations and regulation by intraluminal calcium. J Gen Physiol 1994; 104: 821-856. 292. Tinker A, Williams AJ. Divalent cation conduction in the ryanodine receptor channel of sheep cardiac muscle sarcoplasmic reticulum. J Gen Physiol 1992; 100: 479-493. 293. Alvarez J, Montero M, Garcia-Sancho J. Subcellular Ca2+ dynamics. News Physiol Sci 1999; 14: 161-168. 294. Petersen OH. Local and global Ca2+ signals: physiology and pathophysiology. Biol Res 2004; 37: 661-664. 295. Wolf FI, Trapani V. Cell (patho)physiology of magnesium. Clin Sci (Lond) 2008; 114: 27-35. 296. Szanda G, Halász E, Spät A. Protein kinases reduce mitochondrial Ca2+ uptake through an action on the outer mitochondrial membrane. Cell Calcium 2010; 48: 168-175.
121
Saját közlemények jegyzéke A tézisek alapjául szolgáló közelmények: Szanda G, Koncz P, Várnai P, Spät A. Mitochondrial Ca2+ uptake with and without the formation of high-Ca2+ microdomains Cell Calcium,40:527-37,2006 (I.f.: 4,118) Szanda G, Koncz P, Rajki A, Spät A. Participation of p38 MAPK and a novel-type protein kinase C in the control of mitochondrial Ca2+ uptake Cell Calcium, 43:250-9, 2008 (I.f.: 4,481) Szanda G, Rajki A, Gallego-Sandín S, Garcia-Sancho J, Spät A. Effect of cytosolic Mg2+ on mitochondrial Ca2+ signaling Pflugers Arch. (Eur.J.Physiol.) 457: 941-54, 2009 (I.f.:3,526) Spät A, Fülöp L, Koncz P, Szanda G. When is high-Ca2+ microdomain required for mitochondrial Ca+ uptake? Acta Physiol (Oxf)195:139-47,2009 (I.f.:2,45) Szanda G, Halász E, Spät A. Protein kinases reduce mitochondrial Ca2+ uptake through an action on the outer mitochondrial membrane Cell Calcium, 48:168-75, 2010 (I.f.~ 4,3) Korzeniowski MK, Szanda G, Balla T, Spät A. Store-operated Ca2+ influx and subplasmalemmal mitochondria Cell Calcium 46:49-55, 2009 (I.f.: 4,288) Egyéb közlemények: Pitter JG, Szanda G, Duchen MR, Spät A. Prostaglandin F2alpha potentiates the calcium dependent activation of mitochondrial metabolism in luteal cells Cell Calcium, 37:35-44, 2005 (I.f.: 4,939) 122
Koncz P, Szanda G, Rajki A, Spät A. Reactive oxygen species, Ca2+ signaling and mitochondrial NAD(P)H level in adrenal glomerulosa cells Cell Calcium, 40:347-57, 2006 (I.f.: 4,118) Spät A, Szanda G, Csordás G, Hajnóczky G. High- and low-calcium-dependent mechanisms of mitochondrial calcium signaling Cell Calcium, 44:51-63, 2008 (I.f.: 4,481) Koncz P, Szanda G, Fülöp L, Rajki A, Spät A. Mitochondrial Ca2+ uptake is inhibited by a concerted action of p38 MAPK and PKD Cell Calcium 46:122-129, 2009 (I.f.: 4,288)
123
