A plazmamembrán típusú Ca2+ATPáz intramolekuláris kölcsönhatásainak vizsgálata Doktori (Ph.D.) értekezés
Padányi Rita
Témavezetok:
Dr. Enyedi Ágnes Dr. Sarkadi Balázs
Készült az Országos Gyógyintézeti Központ Hematológiai és Immunológiai Intézetének Molekuláris Sejtbiológia Osztályán. Budapest, 2003.
Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Molekuláris Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola Pathobiokémia program
Szigorlati bizottság:
Hivatalos bírálók:
Elnök: Dr. Staub Mária
Dr. Enyedi Péter
Tagok:Dr. Buday László
Dr. Tompa Péter
Dr. Vértessy G. Beáta
Tartalomjegyzék 1
ÖSSZEFOGLALÁS ..........................................................................................................................................2
2
ABSTRACT.........................................................................................................................................................3
3
RÖVIDÍTÉSEK ..................................................................................................................................................4
4
BEVEZETÉS .......................................................................................................................................................5 4.1 A CA2+ HOMEOSZTÁZIS ...............................................................................................................................5 4.1.1 Az intracelluláris Ca2+-koncentráció emelkedését kiváltó mechanizmusok .............................6 4.1.2 Ca 2+ függo folyamatok (Effektor funkciók)....................................................................................8 4.1.3 Az intracelluláris Ca2+-koncentrációt csökkento mechanizmusok.............................................9 4.2 A CA2+ TRANSZPORT ATPÁZOK...............................................................................................................10 4.3 SERCA HARMADLAGOS SZERKEZETE ....................................................................................................12 4.4 A PLAZMAMEMBRÁN TÍP USÚ CA2+ATPÁZOK........................................................................................14 4.4.1 A katalitikus ciklusban résztvevo domének ................................................................................. 15 4.4.2 A C-terminális regulátor régió...................................................................................................... 18 4.4.3 A különbözo izoformák aktivitásának kinetikai jellemzoi......................................................... 26
5
CÉLKITUZÉSEK ........................................................................................................................................... 29
6
METODIKÁK ................................................................................................................................................. 30 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 6.10 6.11
7
A KÍSÉRLETEKBEN FELHASZNÁLT DNS KONSTRUKCIÓK .....................................................................30 SEJTKULTÚRA ÉS TRANSZFEKCIÓ.............................................................................................................30 M EMBRÁNPREPARÁLÁS COS-7 SEJTEKBOL...........................................................................................30 KALPAINOS ÉS KIMOTRIP SZINES EMÉSZTÉS ...........................................................................................31 EMÉSZTÉS KASZPÁZ -3-MAL......................................................................................................................31 GÉLELEKTROFORÉZIS ÉS ELEKTROTRANSZFER......................................................................................32 CA2+ TRANSZPORT MÉRÉS.........................................................................................................................32 A Z ATPÁZ AKTIVITÁS MÉRÉSÉHEZ SZÜKSÉGES TISZTÍTOTT PMCA ELOÁLLÍTÁSA .........................32 A PMCA AKTIVÁLÓDÁSÁNAK KINETIKAI ANALÍZISE ..........................................................................33 A PMCA INAKTIVÁLÓDÁSÁNAK KINETIKAI ANALÍZISE .......................................................................33 PMCA4B SZERKEZETI MODELLJE............................................................................................................34
EREDMÉNYEK .............................................................................................................................................. 35 7.1
A HPMCA4B IZOFORMA INTRAMOLEKULÁRIS KÖLCSÖNHATÁSAINAK VIZSGÁLATA LIMITÁLT PROTEOLÍZISSEL.......................................................................................................................................................35 7.1.1 Hasítási helyek a hPMCA4b C-terminális régiójában.............................................................. 35 7.1.2 Különbözo konformációs állapotok hatása a PMCA4b degradációjára ............................... 41 7.2 A KALMODULIN-KÖTO SZEKVENCIÁBAN TALÁLHATÓ TRP1093 MUTÁCIÓJÁNAK HATÁSA A PMCA4B INTRAMOLEKULÁRIS KÖLCSÖNHATÁSAIRA.......................................................................................45 7.3 A Z AUTOINHIBÍTOR RÉGIÓTÓL N-TERMINÁLISAN TALÁLHATÓ ASZPARAGINSAV (A SP 1080) SZEREPE A HPMCA4B IZOFORMA BELSO GÁT LÁSÁBAN....................................................................................................48 8
MEGBESZÉLÉS, KÖVETKEZTETÉSEK ............................................................................................ 54
9
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ...................................................................................................................... 60
10
IRODALOMJEGYZÉK ........................................................................................................................... 61
11
SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE ............................................................................................. 70
1
1
Összefoglalás Élo sejtek számára létfontosságú az alacsony intracelluláris Ca2+ koncentráció
biztosítása. Ebben játszik kulcsszerepet a plazmamembrán típusú Ca2+ATPáz (PMCA), amely ATP hidrolízis energiájának terhére Ca2+ ionokat pumpál a citoszolból az extracelluláris térbe. A PMCA C-terminális regulátor régiója tartalmaz egy kalmodulinköto szekvenciát, amely nyugvó sejtben kölcsönhatásba lép az enzim katalitikus centrumával, és gátolja az enzim aktivitását. Aktivált sejtben a Ca2+-kalmodulin komplex kötodik a kalmodulin-köto szekvenciához, aminek hatására a katalitikus régió felszabadul a belso gátlás alól, a pumpa aktiválódik. Az aktiválódás során bekövetkezo szerkezeti változásokon kívül, az enzimciklus közben is folyamatosan változik a pumpa konformációja a nagy Ca2+-affinitású (E1) és a kis Ca2+-affinitású (E2) állapotok között. Limitált proteolízissel és pontmutációk segítségével tanulmányoztuk a PMCA4b Cterminális régiójának és katalitikus centrumának kölcsönhatásait. Három különbözo proteázt
választottunk,
amelyek
a
C-terminális
régióban
a
kalmodulin-köto
szekvenciától N-terminális (kaszpáz-3) illetve C-terminális (kimotripszin, kalpain) irányban hasítják a pumpát. Mindhárom proteáz esetében azt tapasztaltuk, hogy a fehérje konformációjától függoen változott a fragmentképzodés intenzitása. Inaktív fehérje esetében, amennyiben az enzim konformációja E2 állapot felé tolódik (Ca2+ hiányában), alig képzodött fragment, mivel a szoros intramolekuláris kölcsönhatások miatt a proteázok kevéssé férnek hozzá a hasítási helyekhez. Inaktív szerkezetu, de E1 konformációjú fehérje esetében (Ca2+ jelenlétében) valamivel nagyobb mértéku fragmentációt detektáltunk. Ez arra utal, hogy ebben az esetben a C-terminális régió lazábban kapcsolódik a katalitikus centrumhoz. A leggyengébb intramolekuláris kölcsönhatást bizonyító, legintenzívebb degradációt a Ca2+-kalmodulin komplexet köto, aktív szerkezetu fehérje esetében figyeltünk meg. Kísérleteink alapján a C-terminális régió szerkezeti változásai a kalmodulin-köto szekvenciától N-terminális és Cterminális irányba is kiterjednek a pumpa muködése során. Ezzel ellentétben, amennyiben az 1093. triptofánt (Trp1093 , a kalmodulin-köto szekvencia egyik fontos eleme) alaninra cseréltük, csak a kalmodulin-köto szekvencián belül található hasítási helyek lettek hozzáférhetobbek a proteázok számára. Kimutattuk továbbá, hogy az 1080. aszparaginsav (Asp1080 , emellett hasít a kaszpáz-3), bár a kalmodulin-köto szekvencián kívül helyezkedik el, jelentosen hozzájárul az inaktív szerkezet stabilizálásához.
2
2 Abstract The plasma membrane calcium pump (PMCA) is the sole Ca2+ extrusion system in many cells that is respons ible for maintaining the low cytosolic calcium concentration critical to cell function. The role of this protein is to eject Ca2+ from the cytosol to the extracellular space using the energy of ATP. The carboxyl terminus of PMCA contains a high affinity calmodulin-binding sequence that interacts with the catalytic core and inhibits the activity of the pump in resting cells. In activated cells binding of Ca2+-calmodulin to the calmodulin-binding sequence frees the catalytic core from the auto- inhibition and the pump becomes activated. In addition to the changes between the activated and inhibited states, the conformation of the pump also changes between the high (E1) and low (E2) Ca2+ affinity states during the reaction cycle. In this study we utilized limited proteolysis and site directed mutagenesis to monitor the regions involved in the auto- inhibitory interactions of the ubiquitous PMCA4b. We used three different proteases that all cleaved the protein at its carboxyl terminus upstream (caspase-3) or downs tream (chymotrypsin and calpain) of the calmodulin-binding sequence. We found that the fragmentation highly depended on the conformational state. When the pump was in the auto-inhibited state and the E1-E2 equilibrium was shifted more towards the E2 conformation (in the absence of Ca2+) the C-terminal region was resistant to proteolysis because of tight intra- molecular interactions. When the equilibrium was shifted more towards the E1 conformation (in the presence of Ca2+) the cleavage sites became more exposed and the pump was partially degraded suggesting that the interaction between the C-terminal region and the catalytic core was weaker. Binding of Ca2+-calmodulin to the binding site made the carboxyl terminus more flexible and the fragmentation more intensive. Our experiments show that the conformational changes in the C-terminal region induced by Ca2+ or by Ca2+-calmodulin extend to the regions both upstream and downstream of the calmodulin-binding sequence. In contrast, replacing Trp1093 (a key residue within the calmodulin-binding sequence) to an alanine exposed only proteolytic sites whithin the calmodulin-binding sequence. We also showed that an aspartate residue (Asp1080 , the target of caspase-3 cleavage), although, located outside of the calmodulin-binding sequence greatly contributes to the stabilization of the auto- inhibited conformation of the pump.
3
3 Rövidítések
ATP
adenozin- trifoszfát
bp
bázispár
BSA
borjú szérum albumin
cADPR
ciklikus adenozin-difoszfát-ribóz
cDNS
komplementer DNS
ECL
enhanced chemiluminescence
ER
endoplazmás retikulum
FCS
fetal calf serum (borjúszérum)
hPMCA
humán plazmamembrán Ca2+ATPáz
IP3
inozitol-1,4,5-triszfoszfát
K0,5
Vmax felének eléréséhez szükséges szubsztrátkoncentráció
kakt
aktiválódási sebességi állandó
Kd
disszociációs konstans
kinakt
inaktiválódási sebességi állandó
MAGUK
membrán-asszociált-guanilát-kináz
mRNS
hírvivo RNS
NMDA receptor
N-metil- D-aszpartát receptor
PCR
polimeráz láncreakció
PDZ
PSD95/Dlg/ZO-1
PIP2
foszfatidilinozitol-4,5-biszfoszfát
PMCA
plazmamembrán Ca2+ATPáz
pp60src
egy nem receptor tirozin-kináz
PSD
posztszinaptikus denzitás
PVDF
polivinilidén-difluorid
SAP
szinapszis-asszociált fehérje
SDS
nátrium lauril-szulfát
SERCA
szarko/endoplazmás retikulum Ca2+ATPáz
SR
szarkoplazmás retikulum
TCA
triklór-ecetsav
Vmax
a reakció maximális sebessége
4
4 Bevezetés A plazmamembrán Ca2+ATPáz a sejt aktív Ca2+-transzport-rendszerei közé tartozik, és az intracelluláris Ca2+-koncentráció egyik fontos szabályozó eleme. Ezek a transzport mechanizmusok különösen fontosak a sejt számára, hiszen a Ca2+ homeosztázis olyan alapveto sejtfolyamatokban játszik reguláló szerepet, mint pl. az anyagcsere, az izomkontrakció vagy a szekréció (8,19,25).
4.1 A Ca2+ homeosztázis A nyugalmi állapotban lévo sejt intracelluláris Ca2+-koncentrációja 100 nM alatti érték. A Ca2+ szint emelkedése a sejten belül a legkülönbözobb folyamatokat szabályozza. A Ca2+ jel sebessége, amplitúdója, térbeli és idobeli mintázata rendkívül változatos (7). Ezt a változatosságot tovább erosíti a jelátvitelben résztvevo molekulák nagy száma, valamint hogy sok molekulának több, eltéro tulajdonságú izoformája van. A jelátviteli rendszer fehérjéi összetett molekulakomplexeket hoznak létre, amelyek az egyes sejttípusokban, illetve a sejt különbözo részeiben eltéro kombinációkban lehetnek jelen, és így a legkülönbözobb térbeli és idobeli Ca2+ szignál kialakítására képesek. A Ca2+ jelátvitel megfelelo muködését szabályozó molekuláris mechanizmusokat három csoportra oszthatjuk (1.ábra): Ca2+ szint emelkedését kiváltó mechanizmusok Ca 2+ koncentráció nyugalomban 100 nM
Ca 2+ koncentráció aktivált sejtben 0,5-1 ? M Ca 2+ szintet csökkento mechanizmusok
1. ábra 2+
A Ca -jelátvitel három egysége (Berridge és mtsai alapján (8))
5
Ca2+ érzékeny folyamatok
?
Stimulusok
hatására
aktiválódnak
az
intracelluláris
Ca 2+-koncentráció
emelkedését kiváltó mechanizmusok, amelyek Ca2+-ot juttatnak a citoszolba. ?
A Ca2+ mint mediátor számos Ca2+ érzékeny folyamatot aktivál (effektor funkciók).
?
Az intracelluláris Ca 2+-koncentrációt csökkento mechanizmusok – ebbe a csoportba tartoznak a plazmamembrán típusú Ca2+ATPázok – eltávolítják a Ca2+-ot a citoplazmából, és visszaállítják a nyugalmi Ca2+-koncentrációt.
4.1.1 Az
intracelluláris
Ca2+-koncentráció
emelkedését
kiváltó
mechani zmusok Az intracelluláris Ca2+-koncentráció emelkedés egyrészt a plazmamembránon keresztül létrejövo Ca2+-beáramlás, másrészt az intracelluláris raktárakból a citoszolba történo Ca2+ felszabadulás következménye.
4.1.1.1
Ca2+ felszabadulás az intracelluláris raktárakból A sejt belso Ca2+ raktára az endoplazmás, illetve az izomban a szarkoplazmás
retikulumban van (6,9). A Ca2+ a raktárakban fehérjékhez kötve található, ami biztosítja, hogy a magas koncentráció (0,1-1mM) ellenére a Ca2+ nem csapódik ki. Ezek a Ca2+köto fehérjék nagy kapacitással kötik a Ca2+ iont, Ca2+ iránti affinitásuk azonban kicsi (K d ~ 1 mM), tehát megengedik a Ca2+ kiszabadulását a raktárból (106,70). A sejtet éro szignálok több lépésen keresztül képesek megváltoztatni az intracelluláris raktárak membránjának Ca2+ ionra vonatkozó permeabilitását azáltal, hogy aktiválják az itt található Ca2+ csatornákat. Az intracelluláris raktárakban kb. négy nagyságrenddel nagyobb a Ca2+-koncentráció, mint a citoszolban, így az aktiválást követoen a Ca2+ csatornákon keresztül a citoszolba passzív transzporttal áramlik a Ca2+ (83). Az intracelluláris raktárak membránjában számos Ca2+ csatorna található, amelyek közül az IP3 receptor és a rianodinreceptor család tagjai a legismertebbek. Ezeknek a csatornáknak a muködését sokféle faktor szabályozza. Az IP3 receptorhoz a PIP2 hasításakor képzodo IP3 molekula diffúzióval jut el, kötodése a receptor aktiválását eredményezi (4,91,44). Az IP3 koncentrációtól függoen aktiválhatja a receptort maga a Ca2+ ion is. Általánosságban igaz, hogy alacsony IP3 koncentráció mellett magas intracelluláris Ca2+ szint (? 300nM) gátolja a csatorna muködését. Magas IP3 koncentráció mellett, amenyiben a receptor köti az IP3 molekulát, a receptor elveszti 6
érzékenységét a magas Ca2+-koncentráció gátló hatásával szemben. Ebben az esetben a Ca2+ szint emelkedése stimulálja az IP3 receptort (11). A rianodinreceptor fo aktivátora maga a Ca2+ ion (Ca2+ indukált Ca2+ felszabadulás), amely a citoplazmatikus oldalról szabályozza a csatorna muködését. Ez a csatorna a szívizom és a harántcsíkolt izom szarkoplazmás retikulumában található, és a Ca2+ iránti érzékenységét a ciklikus ADP ribóz (cADPR) befolyásolja még nem teljesen tisztázott módon (16,66). A Ca2+ indukált Ca2+ felszabadulás folyamata lehetové teszi, hogy az IP3 illetve a rianodinreceptorok kommunikáljanak egymással, és koordinált Ca2+ szignált hozzanak létre. Plazmamembránon keresztül történo Ca 2+ beáramlás
4.1.1.2
A sejten belüli Ca2+-koncentráció emelkedés másik lehetséges útja a Ca2+ beáramlása a plazmamembránon keresztül. Az extra- és intracelluláris Ca2+koncentráció különbsége és a sejtmembrán két oldala között fennálló nyugalmi membránpotenciál elektrokémiai grádienst hoznak létre. Amennyiben a sejtmembrán Ca2+ ionra vonatkozó permeabilitása a sejtet éro stimulus hatására megno, az elektrokémiai grádiens hajtóereje Ca2+ beáramlását eredményezi az extracelluláris térbol a citoszolba. A Ca2+ beáramlása az extracelluláris térbol a citoszolba a plazmamembrán Ca2+csatornáin keresztül történik. A Ca2+-csatornákat aszerint, hogy milyen fiziológiás szignál hatására nyílnak meg, több csoportra osztjuk: ?
Elektromos szignál, depolarizáció hatására a feszültségfüggo Ca 2+-csatornák aktiválódnak, melyek az excitábilis sejtek membránjában találhatóak, és az általuk létrehozott
Ca2+-szignál
fontos
szerepet
játszik
a
neurotranszmitterek
felszabadulásában, a simaizom-kontrakcióban és számos hormon szekréciójában (72). ?
A Ca2+-csatornák másik nagy csoportja a ligandfüggo ioncsatornák (pl. glutamátNMDA receptor, P2 purinerg receptor) extracelluláris kémiai anyagok hatására aktiválódnak, és dönto szerepet játszanak például a neurotranszmitter hatásának közvetítésében (15,82). Ezek a csatornák feszültségre nem vagy csak nagyon kevéssé érzékenyek, és jellemzo rájuk a nagyfokú Ca2+-szelektivitás.
?
A kapacitatív Ca2+ beáramlás esetében a kiürült belso raktárak hatására aktiválódnak a raktárfüggo Ca 2+-csatornák, még ismeretlen mechanizmussal (68,81). A legújabb bizonyítékok szerint az endoplazmás retikulumban található Ca2+ mennyiségét az IP3 receptor vagy a rianodinreceptor érzékeli, amely 7
struktúrális kapcsolatban áll a raktárfüggo Ca2+-csatornával. Az ER Ca2+ szintjének csökkenése konformációs változást idéz elo a raktár ioncsatornájában, amely az intermolekuláris kapcsolat révén hat a plazmamembrán Ca2+-csatornára. A konformációs változás hatására a raktárfüggo Ca2+ csatorna megnyílik, és Ca2+ áramlik a sejtbe (5,12,63).
4.1.2 Ca2+ függo folyamatok (Effektor funkciók) A kialakult Ca2+-szignál a sejt Ca2+ érzékeny folyamatain keresztül számos celluláris választ hoz létre. Ezeket a folyamatokat Ca2+-köto fehérjék irányítják, amelyeket két csoportra oszthatunk: ?
Az ún. Ca2+ szenzorok olyan fehérjék, amelyek konformációja a Ca2+koncentrációtól függoen jelentosen változik. A család tagjai Ca2+-kötött formában különbözo effektor molekulákat aktiválnak. Klasszikus multifunkcionális szenzor a kalmodulin, mely az N- és a C-terminális globuláris doménjében 2-2 Ca2+ iont köt meg (69). A Ca2+-kalmodulin komplex számos enzimhez képes kötodni, és ezáltal sokféle sejtfolyamat szabályozásában vesz részt: pl. miozin-könnyulánc-kináz (simaizom kontrakció, sejtmigráció, adhézió, szekréció) (58), Ca2+-kalmodulin függo protein-kinázok I és II (gén expresszió, szinaptikus plaszticitás) (73,89), plazmamembrán Ca2+ATPáz (Ca2+ jelátvitel), ciklikus nukleotid foszfodiészteráz (cAMP- mediátorrendszer) (57), glikogén- foszforiláz-kináz (szénhidrátanyagcsere) (14), kalcineurin (transzkripció) (64), nitrogén- monoxid-szintetáz (NO-mediátorrendszer) (104). A másik klasszikus szenzor a troponin C, amely az aktin és a miozin kölcsönhatását szabályozza a harántcsíkolt izomban illetve a szívizomban (43). Ezenkívül sok egyéb Ca2+-szenzor található a sejtben még specifikusabb funkcióval. Pl. az annexin család (I-XII), amelynek tagjai Ca2+-függo módon kötodnek a membrán foszfolipid felszínéhez, és így megakadályozzák, hogy ezek a foszfolipáz A2 szubsztrátjai legyenek (46). Szerepet játszanak ezenkívül az endocitózisban és az exocitózisban is. A synaptotagmin olyan Ca2+-köto fehérje, amely membránvezikulákhoz kötodik, és a Ca2+ függo exocitózisért felelos (23,65).
?
A Ca2+-köto fehérjék másik csoportját olyan Ca2+-köto enzimek alkotják, amelyek a Ca2+-koncentráció emelkedésének hatására közvetlenül aktiválódnak. Ide tartozik a kalpain, amely egy intracelluláris proteáz, és számos folyamat szabályozásában vesz részt (pl. sejtciklus, differenciáció, apoptózis) (18,90). 8
A protein kináz C (PKC) egy olyan szerin/treonin kináz enzimcsalád, amelyet mind a Ca2+ jelátviteli rendszer, mind az inozitol- foszfolipid jelátviteli rendszer (diacilglicerol) aktiválhat (74,76). Az aktivált PKC számos sejtfunkciót – génexpresszió, sejtproliferáció, differenciáció – szabályoz. A szerin/treonin foszfoprotein- foszfatázok családjába tartoznak a PP2B enzimek. A PP2B, más néven kalcineurin egy olyan 2 alegységbol felépülo foszfatáz, amelyet különbözo alegységein keresztül mind a Ca2+ ion, mind a Ca2+-kalmodulin komplex képes aktiválni (64). Az aktivált enzim a transzkripció szabályozásán keresztül hat különbözo sejtfolyamatokra.
4.1.3 Az intracelluláris Ca2+-koncentrációt csökkento mechani zmusok A stimulusok hatására létrejövo Ca2+-koncentráció emelkedés a citoplazmában átmeneti, mivel a plazmamembránban, illetve az endoplazmás és szarkoplazmás retikulum (ER/SR) membránjában található transzportrendszerek eltávolítják a Ca2+-t a citoszolból. E transzportrendszerek közé tartoznak a plazmamembrán típusú, illetve a szarko/endoplazmás retikulum típusú Ca2+ATPázok, valamint a plazmamembránban található Na+/Ca2+ cseretranszporter. A Ca2+ATPázok ATP hidrolízisébol nyert energia felhasználásával pumpálnak Ca2+ ionokat a citoszolból az extracelluláris térbe (plazmamembrán típusú Ca2+ATPáz), illetve az endoplazmás és a szarkoplazmás retikulum lumenébe (szarko/endoplazmás retikulum típusú Ca2+ATPáz). A Na+/Ca2+ cseretranszporter ? összehasonlítva a Ca2+ATPázokkal ? nagyobb kapacitású, de kisebb Ca2+ affinitású rendszer (10). Míg a Ca2+ATPázok már néhány tized ? M Ca2+-koncentráció változásra is érzékenyen reagálnak, addig a Na+/Ca2+ cseretranszporter optimális aktivitását néhány ? M Ca2+-koncentrációnál éri el, és ezért kevésbé alkalmas a nyugalmi Ca2+ szint (? 0,1 ? M) finomabb beállítására. A Ca2+ ion eltávolítása az extracelluláris térbe ez esetben a Na+ ion elektrokémiai grádiensének terhére történik. A Na+/Ca2+ cseretranszporter (a plazmamembrán Ca2+ATPázokkal szemben) nincs jelen minden sejtben (hiányzik például a májsejtek membránjából), legnagyobb aktivitással idegsejtekben és szívizomsejtekben muködik. A citoszolból történo Ca2+ eltávolításában szerepet játszik a mitokondrium is, amely képes arra, hogy a Ca2+ jel kialakulása során gyorsan felvegye a Ca2+ ionokat, majd a jel lecsengése alatt azokat lassan visszajuttassa a citoszolba. A Ca2+ gyors eltávolításával a mitokondrium befolyásolja a Ca2+ jel amplitúdóját, térbeli és idobeli 9
alakját (31). A Ca2+ felvétel a protongrádiens energiájának terhére egy uniporteren keresztül történik, amelynek Ca2+ iránti affinitása alacsony (félmaximális aktivitás ~15 ? M). Az alacsony affinitás azt jelenti, hogy a mitokondrium akkor akkumulálja a Ca2+-ot hatékonyabban, ha lokálisan magas a Ca2+ ion koncentrációja (81). Erre akkor van lehetoség, amikor a mitokondrium és valamelyik ER/SR Ca2+-csatorna (pl. IP3 receptor vagy rianodinreceptor) térben közel vannak egymáshoz (26). A két organellum között így kölcsönös kapcsolat alakulhat ki: az ER/SR által kibocsátott Ca2+ ionokat a mitokondrium felveszi. A mitokondrium Ca2+-köto kapacitása nagy. A mitokondriális mátrix Ca2+ puffereket tartalmaz, amelyek a szabad mitokondriális Ca2+-koncentrációt szabályozzák. Amikor az intracelluláris Ca2+ visszaáll a nyugalmi értékre, a mitokondriális Na+ /Ca2+ cseretranszporter visszajuttatja a Ca2+ ionokat a citoszolba.
4.2 A Ca2+ transzport ATPázok A Ca2+ transzport ATPázok Ca2+ionokat távolítanak el a citoszolból, fenntartva ezzel az alacsony intracelluláris Ca2+-koncentrációt. A többi P-típusú ATPázhoz (pl. Na+/K +-ATPáz,
H+/K +-ATPáz)
hasonlóan
az
iontranszporttal
párhuzamosan
foszforilálódnak, és nagy energiájú foszforilált intermediert képeznek (59). Az enzimciklusuk során a Ca2+ ionok megkötése és a foszforiláció váltakozik a Ca2+transzporttal
és
a
hidrolízissel
(2.
ábra).
A
folyamatot
a
fehérje
konformációváltozása kíséri, aminek következtében a Ca2+-köto helyek Ca2+ iránti affinitása megváltozik (105). foszforiláció ATP
ADP
E1Ca2+
E1Ca2+-P
Ca2+ kötodése
Ca2+ transzlokáció Ca2 +
Ca2+
E2
E2-P Pi hidrolízis
2. ábra A Ca ATPázok enzimciklusa 2+
10
Az E1 konformációjú szerkezet nagy affinitással, míg az E2 forma kis affinitással köti a Ca2+-ot. Valószínu, hogy az E2 forma H+ iont köt, és az enzim a reakcióciklusa alatt H+ iont juttat a citoszolba a Ca2+ ionnal ellentétes irányba (hasonlóan a Na+/K + pumpához, amely szintén kétféle iont transzportál ellentétes irányba) (67,51). A plazmamembrán Ca2+ pumpa (PMCA) és a szarko/endoplazmás retikulum típusú Ca2+ATPáz (SERCA) integráns membránfehérjék, amelyek fo tömege (~70%) a citoszolba nyúlik, és csak kb. 10%-a van az extracelluláris térben. Elsodleges szerkezetük 32%-ban megegyezik. Nagyon konzervatív az enzim katalitikus centruma – az ATP-köto régió, illetve a foszforilálódó aszparaginsav környezete – valamint a Ca2+ ionok transzlokációjában résztvevo aminosavak egy része (96). Lényeges eltérés viszont, hogy a SERCA két Ca2+ iont transzportál egy ATP molekula energiájának terhére (52), míg a PMCA pumpa csak egyet (51). Hasonló a két fehérje másodlagos szerkezete: mind a SERCA, mind a PMCA pumpák 10 transzmembrán hélixet és 2 nagyobb citoplazmatikus hurkot tartalmaznak (a 2. és 3. illetve 4. és 5. transzmembrán hélix között) (3. ábra). A legfeltunobb eltérés köztük, hogy a PMCA rendelkezik egy hosszú intracelluláris C-terminális régióval (17). Ez tartalmazza az autoinhibítorként is muködo kalmodulin-köto szekvenciá t és egyéb regulációs helyeket. COOH
nagy hurok
kalmodulinköto szekvencia
kis hurok
NH2
intracelluláris tér transzmembrán régió 1 2 3 4
5
6 7 8 9 10
extracelluláris tér
3. ábra A PMCA szerkezetének sematikus modellje A két Ca 2+ATPáz szerkezeti modellje megegyezik, kivéve, hogy a SERCA esetében a kék színnel jelölt C-terminális regulátor régió hiányzik.
11
A SERCA nem tartalmaz endogén autoinhibítor régiót. Helyette egy specifikus fehérje, a foszfolambán szabályozhatja aktivitását (53,61). A foszfolambán a szívizomban expresszálódik, és azáltal hogy intermolekuláris kapcsolatba lép a SERCA- val, gátolja annak aktivitását.
4.3 SERCA harmadlagos szerkezete Közvetlen szerkezeti információt egészen az utóbbi évekig egyetlen aktív transzportfehérjérol sem írtak le. A legutóbbi évek eredménye, hogy meghatározták a szarko/endoplazmás retikulum típusú Ca2+ATPáz 1a izoformájának (SERCA1a) kristályszerkezetét az E1 illetve E2 konformációs állapotban (97,98,48). A kalciumkötött forma (E1Ca 2+), illetve a thapsigargin (TG) gátlószerrel stabilizált, kalciumot nem kötött forma (E2(TG)) szerkezetének ismeretébol következtetni lehet a Ca2+ transzport mechanizmusának egyes lépéseire. A SERCA transzmembrán régiója 10 különbözo hosszúságú és dolésu ? hélixbol épül fel (M1-M10). A két Ca2+-köto hely a transzmembrán régióban egymástól 5,7 Å távolságra helyezkedik el. Az ún. I. Ca2+-köto helyet az M5, M6 és M8 hélixeken található aminosavak megfelelo koordinációban elhelyezkedo oxigénatomjai hozzák létre (Asn768 , Glu771 (M5), Thr799 , Asp800 (M6), Glu908 (M8)). Az ún. II. Ca2+-köto helyet döntoen az M4 hélixen található aminosavak alakítják ki (Val304 , Ala305 , Ile307 , Glu309 (M4), Asn796 , Asp800 (M6)). A megfelelo geometriai felépítést a kötohelyek kialakításában résztvevo aminosavak, illetve más hélixeken elhelyezkedo aminosavak közötti hidrogénkötések stabilizálják. A SERCA nagy citoplazmatikus “feje” E1Ca2+ konformációban 3 jól elkülönítheto doménre tagolódik (4. ábra): a foszforilációs P-domén, a nukleotidköto N-domén és transzdukciós doménként vagy aktivátorként ismert A-domén. Az enzim citoplazmatikus doménjei közül a központi helyet a P-domén foglalja el, amely tartalmazza az enzimciklus során foszforilálódó aszparaginsavat (Asp351 ). A Pdomén szoros kapcsolatban áll több transzmembrán hélixszel. A ~60 Å hosszúságú M5 hélix a membrán luminális felszínétol egészen a P-domén közepéig tart. Ezenkívül a Pdomén hidrogénhidak segítségével kapcsolódik az M3, M4 és M6 hélixekhez. Ezek a kapcsolatok fontos szerepet játszhatnak az egymástól ~50 Å távolságra elhelyezkedo foszforilációs hely és a Ca2+-köto helyek közötti kommunikációban. Az N-domén köti az ATP adenozin csoportját. Ez a legnagyobb a három citoplazmatikus domén közül, amelyet egy vékony ún. „csukló“ régió kapcsol össze a P-doménnel. 12
Az A domén a legkisebb citoplazmatikus domén, amely hosszú peptidszakaszokon keresztül kapcsolódik az M2 és M3 hélixszekhez.
A
B 90o
N-domén 110o A-domén
30o P-domén
D351
3
5 4
1 Ca2+
D351
6 9
6
1 Ca2+
10
2 8
4
5
4
2 4 3
7
10 9
8
7
Ca2+
1
E1Ca 2+
E2
4. ábra A SERCA harmadlagos szerkezete A, E2 konformációban a három citoplazmatikus domén zárt struktúrát alkot. A P-doménen belül található az enzim foszforilációs helye (D351, piros
kör).
Narancssárga
körök
a
Ca 2+ ionok kötésében résztvevo
aminosavakat jelölnek az M4, M5, M6 és M8 hélixeken. Az M2 és M3 hélixeken poláris vagy negatív töltésu aminosavak (sárga körök) egy lehetséges – a citoszolból a transzmembrán régióba vezeto – Ca2+ belépési utat határoznak meg. B, E1Ca2+ forma. Az E2 állapothoz képest a citoplazmatikus domének egymástól eltávolodnak (a doménmozgásokat nyilak jelölik), így a citoplazmatikus régió szerkezete tagolttá válik. (Green és mtsai alapján (48))
A három citoplazmatikus domén, amely a fehérje E1Ca2+ állapotában jól elkülönül egymástól, E2 konformációban lényegesen zártabb struktúrát alkot (4. ábra). A E2 forma zárt konformációját az A-N és az A-P domének határfelülete között kialakult hidrogénhidak stabilizálják. A szerkezeti vizsgálatok felfedték, hogy mindhárom domén jelentos mozgást végez az E2? E1 állapotváltozás során. Az N-domén közel 90o -ot hajlik el a membránhoz 13
viszonyítva, így a felso része több mint 50 Å-nyi mozgást végez. A domén mozgása két részbol tevodik össze, egyrészt a P-domén mozgásából, másrészt az N-domén Pdoménhez viszonyított mozgásából. A P-domén 30o -os elhajlását nagyrészt a transzmembrán hélixek (foleg M5) billenése okozza. Az A-domén kb. 110o -ot csavarodik horizontálisan. A nagy térbeli elmozdulások ellenére a domének szerkezete alig változik. A transzmembrán régióban – foleg az elso hat hélix (M1-M6) elrendezodésében – szintén jelentos változások következnek be a Ca2+ ionok megkötése közben. Az átrendezodés igen változatos a különbözo hélixek esetében, és nem csak a Ca2+-köto helyek környezetére korlátozódik. A membránhoz viszonyítva mind felfelé – a citoplazma felé –, mind lefelé, illetve laterálisan mozdulnak el hélixek, és a legtöbb esetben változik a dolésszögük is. Központi lépés az M5 hélix felso – citoplazma felé eso – billenése, amely nagyrészt felelos a P-domén elhajlásáért. Mivel a P-domén összeköttetésben áll az M3-M6 hélixekkel, az M5 hélix felso részének elhajlása a Pdoménen keresztül elbillenti az M3-M6 hélixeket is, amely további mozgásokat generál a transzmembrán illetve a citoplazmatikus régiókban. Összefoglalva: az E2? E1 állapotváltozás a Ca2+ ionok megkötésével kezdodik, ami megváltoztatja a transzmembrán régió elrendezodését. A P-domén közvetítésével a szerkezeti változások kiterjednek az egész fehérjére. Az A-domén rotációja, az A-N és az A-P határfelületek közötti kölcsönhatások megszunése lehetové teszi az N-domén és a P-domén elhajlását, kialakul az E1Ca2+ formára jellemzo nyitott szerkezet. A foszforilált SERCA intermedierek (E1Ca2+-P, E2-P) igen labilisak, szerkezetük nem ismert, így az enzimciklus további lépéseire csak következtetni lehet. Az E1Ca2+ konformációban a foszforilációs hely több mint 25 Å távolságra helyezkedik el az enzimhez kötött nuk leotidtól. Ez azt jelenti, hogy az ATP hidrolízis során az N-domén további elhajlása szükséges ahhoz, hogy a megkötött ATP ?–foszfátja elérje a Pdoménben található foszforilációs helyet. A foszforilációt követoen valószínuleg az egész fehérje szerkezetére kiterjedo konformációváltozás következik be. Ennek eredményeként kialakul az E2-P forma, lecsökken a fehérje Ca2+ iránti affinitása, és az
extracelluláris oldalon felszabadul a Ca2+.
4.4 A plazmamembrán típusú Ca2+ATPázok Az eukarióta sejtek egyik legfontosabb nagy affinitású Ca2+ eltávolító mechanizmusát a plazmamembrán típusú Ca2+ATPázok alkotják. Dönto szerepük van a 14
nyugalmi intracelluláris Ca2+-koncentráció fenntartásában, és a Ca2+ jelátvitel során bekövetkezo átmeneti Ca2+ szint emelkedések ellensúlyozásában (79,80). A plazmamembrán Ca2+ATPázt 4 gén kódolja (PMCA1-4). E négy génrol átíródott pre- mRNS-rol, két helyen bekövetkezo alternatív splicing során több mint 20 különbözo izoforma keletkezhet (94). Az alternatív splicing a molekula egy kis részét érinti – az enzim szabályozásában szerepet játszó két régiókban –, és nem befolyásolja alapvetoen a fehérje katalitikus ciklusban résztvevo doménjeinek szerkezetét. A PMCA1 és 4 izoformák szinte minden szövetféleségben elofordulnak, míg a másik két gén (PMCA2 és 3) termékei foként ideg-, váz- és szívizomsejtekben expresszálódnak (92). A PMCA4b a legelterjedtebb a különbözo izoformák között. Mivel vörösvérsejtben – ahonnan könnyen és nagy mennyiségben nyerheto ki a fehérje – szintén ez a forma domináns, sokáig a PMCA4b izoforma biokémiai jellemzése jelentette a plazmamembrán típusú Ca2+ATPáz vizsgálatát (37,95). Számítógépes modellezés és szekvencia analízis alapján a transzmembrán hélixek és az intracelluláris domének elrendezodése meglepoen hasonló a különbözo Ptípusú ATPázok között. Igaz, a szubdomének méretében szerkezetében, térbeli orientációjában vannak olyan különbségek, amelyek a kation specificitásért illetve az egyes transzporterek eltéro szabályozásáért felelosek. Annak ellenére, hogy a SERCA és a PMCA fehérjék elsodleges szerkezetének mindössze 32%-a azonos, különösen a magasabb hasonlóságot mutató két citoplazmatikus hurok, valamint az M1-M6 transzmembrán hélixek doménszerkezete feltehetoen megegyezik a két fehérjecsalád esetében. Ezzel szemben lényeges eltérés van a két kalcium pumpa között a Cterminális régióban. Ez a régió sokkal rövidebb a SERCA (20-50 aminosav), mint a PMCA esetében (70-200 aminosav).
4.4.1 A katalitikus ciklusban résztvevo domének A katalitikus ciklusban résztvevo domének alkotják a PMCA pumpának azt a részét (megközelítoleg az elso 1100 aminosav), amely szükséges az enzim Ca2+ transzportáló aktivitásához. A SERCA és a PMCA elsodleges szerkezetében mutatkozó hasonlóságok lehetové tették, hogy a SERCA kristályszerkezete alapján létrehozzuk a PMCA fehérje aktív centrumát alkotó részének homológia modelljét (5. ábra). Ez alapján a kis hurok, és a rövid N-terminális peptidszakasz alkotja az A-domént. A másik két citoplazmatikus domént pedig a nagy hurok hozza létre úgy, hogy a hurok két szélén
15
található, egymástól távol eso régió alakítja ki a P-domént, míg e két peptidszakaszt összeköto régió alkotja az N-domént. 4.4.1.1
Kis hurok A kis intracelluláris hurkon található a PMCA egyik regulátor régiója. Ezen a
helyen bekövetkezo alternatív splicing az egyes PMCA gének esetében eltéro mértékben növeli e peptidszakasz variabilitását. A PMCA2 gén esetében jöhet létre a legtöbb variáns (8 lehetséges forma), amelyekbol emlosökben 4, emberben 3 izoformát (“w”, x”, “y” variánsok) detektáltak mRNS szinten. Az izoformák közül a PMCA2w tartalmazza a leghosszabb inzertálódott peptidszakaszt. Savanyú foszfolipidek (pl. foszfatidilinozitol-bifoszfát (PIP2 )) a kis hurok lipid-köto helyein keresztül lépnek kölcsönhatásba a Ca2+ATPázzal, és szabályozzák a pumpa aktivitását (13). Itt található az a régió is, amely az enzim inaktív állapotában kölcsönhatásba lép a fe hérje Cterminális részén található kalmodulin-köto szekvenciával, és ezzel részt vesz a belso gátlás kialakításában (42). Az alternatív splicing hely e között a két szabályozó régió között helyezkedik el (5.ábra). A különbözo hosszúságú és aminosav sorrendu szakaszok inzertálódása a két régió közé, valószínuleg megváltoztatja a foszfolipid-köto helynek és az A-domén belso gátlás kialakításában résztvevo régiójának térbeli kapcsolatát. A kis hurokban bekövetkezo splicingnak eddig egyetlen funkcionális hatását írták le. Chicka és mtsai vizsgálták, hogy polarizált kutya vese epitélsejtekben (MDCK sejtek) a különbözo PMCA2 izoformák milyen membránkompartmentben helyezkednek el (24). Arra a meglepo eredményre jutottak, hogy a kis hurkot befolyásoló alternatív splicing határozza meg az izoformavariánsok lokalizációját. A PMCA2w az apikális, míg a 2x és a 2z variáns a bazolaterális membránban helyezkedik el. Ezeket az eredményeket igazolja, hogy a halló és a vesztibuláris rendszer szorsejtjeinek illetve a laktáló emlo epitélsejtjeinek apikális membránjában PMCA2w izoforma található. Az alternatív splicing két lehetséges módon szólhat bele a pumpafehérje lokalizációjába. Mivel ez a splicing hely közvetlenül az enzim lipid-köto régiója után helyezkedik el, a splicing
hatására
megváltozhat
a
lipid-szenzitív
peptidszakasz
környezetének
szerkezete, és ezáltal a Ca2+ATPáz képessé válhat arra, hogy olyan lipidekhez kapcsolódjon, amelyek foleg az apikális membránban fordulnak elo. Másrészrol az is lehetséges, hogy a splicing során inzertálódott peptidszakasz más fehérjékkel lép kölcsönhatásba, és ez irányítja a PMCA-t a megfelelo membránkompartmentbe.
16
Egyelore azonban még nem azonosították az(oka)t a molekulapartner(eke)t, amely(ek) az apikális lokalizációért felelos(ek). COOH
A
B
kalmodulin-köto szekvencia
alternatív splicing hely
N-domén
alternatív splicing hely
A-domén
N L
NH2
P-domén P
1 2 3 4
5
6 7 8 9 10
extracelluláris tér 5. ábra A PMCA szerkezete A, A PMCA szerkezetének sematikus modellje. A kis hurkon és a Cterminális régió kalmodulin-köto szekvenciáján belül található a két alternatív splicing hely (fekete kör). A kis hurok tartalmazza a lipid-köto helyet (L), a nagy hurok az enzim foszforilációs helyét (P) és az ATP-köto régiót
(N).
Mindkét
hurokban
megvastagított
vonal
jelöli
azt
a
peptidszakaszt, amellyel a kalmodulin-köto szekvencia kölcsönhatásba lép az enzim inaktív állapotában. B, A PMCA homológia modellje (a SERCA kristályszerkezete
(1EUL.pdb)
alapján)
a
fehérje
6.
transzmembrán
hélixének C-terminálisáig állítható elo. Az A-domént a kis hurok (kék) és az N-terminális régió (lila), míg az N-domént (zöld) és a P-domént (piros) pedig a nagy hurok alakítja ki.
4.4.1.2
Nagy hurok A kb. 400 aminosavból álló nagy hurok tartalmazza a legfontosabb katalitikus
doméneket. Ezek közé tartozik az ATP-köto hely, amely meghatározott távolságra helyezkedik el attól az igen konzervatív D*KTGT szekvenciától, amely az enzimciklus során foszforilálódó aszparaginsavat tartalmazza (D*). A PMCA homológia modellben – a SERCA pumpának megfeleloen – az ATP-köto régió az N-domén, míg a foszforilációs hely a P-domén része (5. ábra). Hasonlóan a kis hurokhoz, a nagy hurok is tartalmaz egy olyan régiót, amely a Cterminális régió kalmodulin-köto szekvenciájával lép kölcsönhatásba, és így részt vesz a 17
belso gátlás kialakításában (41). Ez a régió a foszfoenzim képzésében szerepet játszó aszparaginsavtól C-terminálisan található, és a PMCA homológia modelljében a nukleotid-köto N-domén egy részét alkotja. 2.4.1.3 Transzmembrán régió A SERCA szerkezeti vizsgálatai során két Ca2+-köto helyet határoztak meg, amelyeket az M4, M5, M6 és M8 hélixeken elhelyezkedo aminosavak alakítanak ki. Ha a SERCA I. Ca2+-köto helyét összehasonlítjuk a PMCA megfelelo doménjével, azt láthatjuk, hogy ez utóbbiban három olyan aminosavat, amelyek oldalláncát alkotó oxigénatomok a SERCA-ban részt vesznek a Ca2+ ion kötésében, olyan aminosavak helyettesítenek, amelyek oldalláncai nem tartalmaznak oxigénatomot (50). A SERCA II. Ca2+-köto helye és a PMCA ennek megfelelo doménje között viszont nincs számottevo különbség. Amikor a PMCA fehérjében a SERCA II. Ca2+-köto helyét kialakító aminosavak megfeleloit (PMCA4b izoforma: Asn879 , Asp883 ) más aminosavra cserélték, a mutáns enzim teljesen inaktív volt még akkor is, amikor a szubsztitúció minimális változtatást okozott (aszparaginsav ? aszparagin csere) (2,49). Hasonló aminosavcsere az I. helynek megfelelo régióban kismértékben befolyásolta, de nem gátolta teljesen a Ca2+ transzportot. Ezek alapján a PMCA feltételezhetoen egyetlen, a SERCA fehérjénél azonosított, M4 és M6 hélixek által kialakított, ún. II. aktív helyének megfelelo Ca2+köto hellyel rendelkezik.
4.4.2 A C-terminális regulátor régió A PMCA-t kiemeli a P-típusú ATPázok családjából az a tulajdonsága, hogy rendkívül sokoldalúan szabályozható a muködése. A PMCA utolsó transzmembrán hélixe után elhelyezkedo C-terminális rész a pumpa fo szabályozó régiója. Ezen a régión keresztül befolyásolja az enzim aktivitását a Ca2+-kalmodulin komplex, különbözo enzimek által katalizált foszforiláció, proteolízis, illetve fehérje- fehérje kölcsönhatások. 4.4.2.1
Kalmodulin-köto szekvencia A PMCA legfontosabb aktivátora a Ca2+-kalmodulin komplex, amely az enzim
kalmodulin-köto szekvenciájához kötodik (54). Ez a szekvencia a pumpa C-terminális régiójában található, és kb. 40 aminosav választja el az utolsó transzmembrán hélixtol 18
(40,99). Ca2+-kalmodulin komplex hiányában ez a fehérjeszakasz autoinhibítorként muködik. Jelölt peptidekkel végzett keresztkötési kísérletek alapján feltételezzük, hogy a kalmodulin-köto szekvencia intramolekuláris kölcsönhatásba lép a pumpa két különbözo régiójával a kis és a nagy hurkon belül (5. ábra). Ezek a régiók a PMCA homológia modell szerint a citoplazmatikus A-doménen és a nukleotid-köto N-doménen találhatóak (6. ábra). A SERCA struktúrális vizsgálatai felfedték, hogy mindkét domén jelentos mozgást végez az enzimciklus során.
N-domén A-domén
P-domén
E1Ca2+
E2 6. ábra
A kalmodulin-köto szekvenciával kölcsönhatásba lépo régiók mozgása az E2? E1 állapotváltozás során Az E2 illetve E1Ca2+ konformációjú SERCA fehérje szerkezete (1IWO.pdb, 1EUL.pdb): Az A- (kék) és az N-doménban (zöld) található – fekete színnel jelölt – régiók megfelelnek azoknak a PMCA peptidszakaszoknak, amelyek az
enzim
inaktív
állapotában
a
kalmodulin-köto
szekvenciával
intramolekuláris kapcsolatba lépnek. Az intramolekuláris kölcsönhatás valószínuleg akadályozza az enzimciklus során a konformációváltozásokat (E2? E1).
Inaktív állapotban – Ca2+-kalmodulin komplex hiányában – azonban a C-terminális régió és a katalitikus centrum kölcsönhatása gátolja a szerkezeti változásokat, ezzel feltehetoen lassítja az enzimciklus muködését, és a pumpát inaktív állapotban tartja. 19
Amennyiben a citoszol Ca2+-koncentrációja megemelkedik, a Ca2+-kalmodulin komplex nagy affinitással kötodik a PMCA kalmodulin-köto szekvenciájához, így a pumpa felszabadul a gátlás alól. Ez a szabályozási mechanizmus nagyon hasonló más Ca2+kalmodulin- függo enzim esetében is (miozin könnyulánc-kináz, Ca2+-kalmodulin- függo protein-kináz I). A Ca2+-kalmodulin- függo protein-kináz I esetében az inaktív enzim kristályszerkezete alapján igazolták, hogy a C-terminális regulátor régió, amely tartalmazza a kalmodulin-köto domént, több helyen kapcsolódik a katalitikus centrumhoz meggátolva ezzel a szubsztrát és az ATP kötodését (47). A különbözo izoformák az alternatív splicing- nak köszönhetoen C-terminális régiójukban rendkívül változatosak. Ezen a helyen mind a négy PMCA gén által kódolt pre-mRNS-en bekövetkezik alternatív splicing. Bár a különbözo gének esetében különbözo számú variáns jön létre (PMCAa- f), minden esetben keletkezik “a” és “b” izoforma. A splicing hely a kalmodulin-köto szekvencia közepén, egy nagyon konzervatív szekvenciától C-terminálisan található (5. ábra) (34). Az utána következo szakasz attól függoen változik, hogy tartalmaz-e egy nagy (154-175 bp) exont (“a” variáns), vagy nem (“b” variáns) (60,32). Amennyiben az exon nem vágódik ki, megváltozik a kalmodulin-köto szekvencia C-terminális fele, valamint kereteltolódás miatt az egész hátralévo C-terminális régió. Az alternatív splicing hatását a PMCA4a és 4b izoformák esetében tanulmányozták a legalaposabban. A PMCA4b kalmodulin-köto szekvenciája 28 aminosavból áll. A PMCA4a esetében ez a régió hosszabb, kb. 49 aminosavból épül fel, és két, a kalmodulin kötésében szerepet játszó szakaszra oszlik, amelyeket egy rövid, nem köto szakasz kapcsol össze (100). A kalmodulin-köto szekvenciában jelenlévo eltérések okozzák, hogy a PMCA4b izoformának magasabb a kalmodulin iránti affinitása, mint a PMCA4a izoformának. A kalmodulin iránti affinitásbeli különbségek megváltoztatják az enzim Ca2+ iránti affinitását, a pumpa egyik fontos fiziológiás paraméterét. Peptideken végzett kísérletek bizonyítják, hogy a kalmodulin-köto szekvencia N-terminális felében található konzervatív triptofán (Trp1093 ) fontos szerepet játszik mind a kalmodulin kötésében, mind a Ca2+ATPáz belso gátlásának kialakításában (40). Penheiter és mtsai olyan PMCA4b mutáns kinetikai jellemzoit vizsgálták, ahol ezt a triptofánt alaninra cserélték (Trp1093 ? Ala mutáns) (78). Korábbi, szintetikus peptidekkel végzett kísérleteknek megfeleloen a Trp1093 ? Ala mutáns C-terminális régiója kevésbé gátolja az enzim aktivitását, mint a vad típusúé. Míg a PMCA4b alapaktivitása alacsony (kb. 10-20%-a a kalmodulin mellett mérheto maximális aktivitásnak), addig a mutánsé lényegesen magasabb (kb 50%-a a maximális 20
aktivitásnak). Feltehetoen a nyitottabb szerkezet következménye, hogy a Ca2+kalmodulin komplex számára könnyebben hozzáférheto a kalmodulin-köto szekvencia, és a mutáns enzim kalmodulinnal 2-3- szor gyorsabban aktiválódik, mint a vad típusú fehérje. A legnagyobb eltérés a két fehérje között az inaktiválódás sebességében van: a vad típushoz képest a Trp1093 ? Ala mutáns 350-szer gyorsabban inaktiválódik. A Trp1093 aminosav
tehát
lényeges
szerepet
játszik
az
enzim-kalmodulin
komplex
stabilizálásában, hiszen mutációja a kalmodulin disszociációját nagy mértékben befolyásolja. A Trp1093 mutációja kisebb mértékben növeli az enzim aktiválódásának sebességét, mivel az aktiválódás kezdeti lépéseit valószínuleg olyan szerkezeti jellemzok határozzák meg, amelyek biztosítják a Ca2+-kalmodulin komplex számára a megfelelo régiók felismerését, és a kalmodulin-köto szekvenciához történo hozzáférést.
4.4.2.2
Másodlagos autoinhibítor régió A PMCA4b izoforma belso gátlásáért a többi izoformától eltéroen nem csak a
kalmodulin-köto szekvencia felelos (99). A fehérje rendelkezik ugyanis egy ún. másodlagos autoinhibítor régióval (Ser1113 és Asp1157 aminosavak közötti szakasz), mely az elsodleges autoinhibítor régiótól C-terminális irányban helyezkedik el (39). Ez a két szakasz együtt felelos – kb. 3/4-1/4 arányban a kalmodulin-köto szekvencia illetve a másodlagos autoinhibítor régió – a 4b formára jellemzo igen alacsony alapaktivitásért.
4.4.2.3
Foszforilációs helyek A PMCA izoformák C-terminális régiója nagyon gazdag szerinben és
treoninban. Az alternatív splicing-nak köszönhetoen azonban a potenciálisan foszforilálható aminosavak eloszlása és pozíciója nagymértékben különbözik az egyes izoformák esetében. A protein-kináz C (PKC) több izoformát is képes foszforilálni. A PMCA4b variáns esetében a foszforilálható aminosav(ak) a kalmodulin-köto szekvenciától C-terminálisan található(ak) (39). Az itt bekövetkezo foszforiláció az enzim részleges aktivációját okozza azáltal, hogy gyengíti a fehérje intramolekuláris kölcsönhatásait. A PKC foszforilálja ezen kívül a 2a, a 3a és a 4a izoformákat is. A 2a és a 3a izoforma esetében a PKC foszforiláció nem változtatja meg az enzim alapaktivitását, sot, azáltal hogy gátolja a Ca2+-kalmodulin komplex kötodését a kalmodulin-köto szekvenciához, csökkenti a pumpa Ca2+-kalmodulin komplexszel történo aktiválhatóságát (33). 21
Másrészrol
a
már
kötodött
Ca2+-kalmodulin
komplex
gátolja
a
Ca2+ATPáz
foszforilációját. Ez a helyzet a 4a formánál is azzal a különbséggel, hogy a PKC foszforiláció nem befolyásolja a Ca2+-kalmodulin kötodését (101). Ebben az esetben a foszforilálható szerin a kalmodulin-köto szekvenciának azon a részén helyezkedik el, amelyik nem játszik szerepet a kalmodulin kötésében. A cAMP-függo protein-kináz (PKA) valószínuleg csak néhány PMCA izoformát foszforilál. Eddig csak a PMCA1b variáns esetében bizonyították, hogy a PKA foszforilálja a pumpa C-terminális régióját (55). Ezenkívül a PMCA2b forma Cterminális régiójában találtak egy – nem teljesen konszenzus – PKA szubsztrát szekvenciát. In vitro a PKA foszforiláció emeli a PMCA1b aktivitását. In vivo csak szívizom sejtekben bizonyították, hogy a PKA stimuláció aktiválja a PMCA-t (30,75). A legtöbb szövetben, ahol PMCA1b expresszálódik, a PKA stimuláció nincs hatással a PMCA muködésére. Ennek oka valószínuleg az, hogy más szabályozó mechanizmusok befolyásolják a Ca2+ATPáz PKA enzimmel történo foszforilációját. Dean és mtsai kimutatták, hogy tirozin foszforiláció is befolyásolhatja a PMCA muködését (27). Emberi vörösvérsejtekben a pp60src kináz foszforilálja a PMCA4b izoformát a C-terminális régióban, és ez a foszforiláció gátolja az enzim aktivitását.
4.4.2.4
Hasítási helyek
A C-terminális szabályozó régió egy-egy részének eltávolítása különbözo hatással lehet a Ca2+ATPáz muködésére, attól függoen, hogy a proteáz mekkora és milyen funkciót ellátó szakaszt hasít le. Vörösvérsejt plazmamembrán Ca2+ATPáz – amely nagyrészt PMCA4b és kisrészt 1b izoforma – esetében bizonyították, hogy a kalpain, amely egy Ca2+-függo, intracelluláris proteáz, képes az enzimet aktiválni azáltal, hogy lehasítja a C-terminális szabályozó szakasz egy részét. Wang és mtsai megállapították, hogy a vörösvérsejt Ca2+ATPáz kalpainos fragmentációját befolyásolja a kalmodulin jelenléte (102,103). Tisztított vörösvérsejt Ca2+ATPáz esetében kalmodulin hiányában egy 124-125 kDa molekulatömegu fragmentcsoport képzodését írták le, amelybol a 125 kDa-os fragment képes volt Ca2+-kalmodulin komplexet kötni, míg a 124 kDa-os fragment nem. Ezzel szemben kalmodulin jelenlétében egy nagyobb molekulatömegu, 127 kDa-os fragment keletkezett. Ez a fragment hasonlóan a 125 kDa-os fragmenthez megtartotta a Ca2+kalmodulin komplex-köto képességét.
22
Ezzel szemben James és mtsai tisztított vörösvérsejt kalcium pumpán végzett kalpainos emésztési kísérleteikben csak egy, megközelítoleg 124 kDa molekulatömegu fragment képzodését észlelték, függetlenül attól, hogy jelen volt-e a kalmodulin vagy nem. (56). Megállapították, hogy a kísérleti körülmények változatásával (pl. kalpain-koncentráció, homérséklet) változik a fragment Ca2+-kalmodulin komplex-köto képessége. Ebbol arra következtettek, hogy a kalpain a körülményektol függoen több, egymáshoz közel található helyen hasítja a pumpát, és így a 124 kDa-os fragment valójában több nagyon hasonló méretu fragment összessége. A tisztított vörösvérsejt Ca2+ATPáz kalmodulin hiányában történo fragmentációját vizsgálva két hasítási helyet határoztak meg a pumpa kalmodulin-köto szekvenciáján belül (a szekvencia közepén illetve az N-terminális felé eso végén). Kalmodulin jelenlétében történo fragmentációt a kalmodulin-köto szekvenciát reprezentáló szintetikus peptiden vizsgálták (7. ábra). Azt tapasztalták, hogy amennyiben a kalmodulin-köto peptidhez Ca2+-kalmodulin komplex kapcsolódik, a domén
közepén
található
ha sítási
hely
nem
elérheto
a
proteáz
számára. Ebben az esetben a kalpain egy újabb hasítási helyen a kalmodulin-köto szekvencia C-terminálisán hasít elsodlegesen. másodlagos hasítási hely kalmodulin hiányában vagy jelenlétében
elsodleges hasítási helyek kalmodulin hiányában
kalmodulin jelenlétében
LRRGQILW FRGLNRIQTQIKVVNAFHSS
7. ábra James és mtsai által meghatározott kalpainos hasítási helyek a kalmodulin-köto szintetikus peptiden
Munkacsoportunk nemrég kimutatta, hogy a PMCA4b izoforma C-terminális régióját a kaszpáz-3 cisztein proteáz is hasítja az apoptózis korai szakaszában (77). A kaszpáz-3 általában a DEXD konszenzus szekvencia után hasít. Ilyen konzenszus szekvencia található a PMCA4b pumpa kalmodulin-köto szekvenciájától N-terminálisan (1077DEID1080 ). Olyan mutánsok segítségével, amelyekben a konszenzus szekvenciát alkotó aszparaginsava(ka)t alaninra cseréltük, sikerült bizonyítani, hogy a hasítás az 1080. aszparaginsav után következik be. A PMCA4b kaszpáz-3-mal történo emésztése
23
során így egy kb. 120 kDa-os fragment képzodik, amelynek hiányzik a teljes regulátor régiója, így kalmodulin hiányában is maximálisan aktív. A PMCA szerkezetének vizsgálata során gyakran használnak extracelluláris proteázokat, pl. tripszint vagy kimotripszint. A vörösvérsejt kalcium pumpa tripszines emésztése során eloször egy 90 kDa molekulatömegu fragment képzodik (85,108). Ez a fragment kalmodulin- szenzitív, alacsony aktivitású enzim, ami azt mutatja, hogy a pumpa a C-terminális regulátor régióját megtartotta. Hosszabb ideig tartó emésztés hatására ugyanakkor lehasad a C-terminális regulátor régió, és egy teljesen aktív 81 kDa-os fragment keletkezik. A kimotripszin aromás aminosavak mellett hasít, tehát nagyon sok potenciális hasítási hely található a pumpán belül, amelyek közül feltehetoen a fehérje szerkezeti állapota határozza meg, hogy melyik helyen következik be a hasítás. A kimotripszin a vörösvérsejt kalcium pumpa C-terminális régióját kezdi emészteni (35). Az egyik tipikus kimotripszines fragment a kalmodulinra nem érzékeny, kb. 125 kDa-os fragment. A 81 kDa-os tripszines hasítási termékhez hasonlóan ennek a fragmentnek is nagy a Ca2+ iránti affinitása és a transzport aktivitása. Az emésztési kísérletek többnyire alacsony homérsékleten, magas proteáz/fehérje arány mellett, sokszor vörövérsejtbol izolált fehérjén történtek. Ezek a körülmények nem feltétlenül kedveztek a fehérje natív állapotának.
4.4.2.5
PDZ-köto szekvencia
A C-terminális régióban bekövetkezo alternatív splicing hatására kialakuló két fo PMCA variáns az „a” és a „b” forma. A fehérje C-terminálisán található utolsó négy aminosav a „b” variánsok esetében igen konzervatív, és ezen belül a PMCA4b izoforma C-terminális szekvenciája (ETSV) megfelel a I. típusú PDZ doménhez kötodo fehérjék konszenzus szekvenciájának (E- T/S-X-V). A PMCA1b, 2b és 3b variáns is hasonló Cterminális szekvenciával rendelkezik azzal a különbséggel, hogy az utolsó aminosav ebben az esetben valin helyett leucin (ETSL). A PDZ domén több különbözo fehérjében megtalálható általános intermolekuláris kapcsolatot kialakító motívum. Fehérje- fehérje kölcsönhatások révén multiprotein komplexek létrehozásában játszanak szerepet, gyakran úgy, hogy membránfehérjéket kapcsolnak szubcelluláris struktúrákhoz, illetve a citoszkeletális hálózathoz. A PMCA4b és a 2b izoforma esetében kimutatták, hogy a PDZ-köto szekvencián keresztül a membrán-asszociált-guanilát-kináz (MAGUK) család több tagjához is 24
képesek kapcsolódni (29). A MAGUK család tagjai (SAP90, PSD93, SAP97, SAP102) sejt-sejt kapcsolatok kialakításában és fenntartásában, illetve jelátviteli folyamatokban játszanak szerepet. Míg a SAP90, a PSD93 és a SAP97 mind a PMCA2b, mind a 4b izoformához nagy affinitással kötodik, addig a SAP102 szelektíven csak a 4b variánshoz. A SAP97 és egyéb MAGUK fehérjék a kortikális aktin citoszkeletonnal kapcsolódnak. Konfokális mikroszkópos kísérletek bizonyítják, hogy kutya vese epitél sejtekben (MDCK sejtek) mind a PMCA4b, mind a SAP97 a bazolaterális membránban lokalizálódik. Vese és bél epitélsejtekben a PMCA bazolaterális elhelyezkedése a transzcelluláris vektoriális Ca2+ transzport kialakításában játszik fontos szerepet (62). Az elso PDZ domént tartalmazó fehérje, amelyrol bizonyították, hogy a PMCA2b izoforma C-terminálisához kötodik, de a PMCA4b variánshoz nem, a Na+/H+csere regulátor faktor-2 (NHERF-2) (28). Annak ellenére, hogy MDCK sejtben mind a PMCA2b, mind a NHERF-2 az apikális membránban található és a NHERF-2 számos fehérje pl. CFTR megfelelo sejtkompartmentbe történo irányításában részt vesz, a kísérletek azt bizonyítják, hogy a PMCA2b esetében az NHERF-2 nem szükséges az apikális lokalizációhoz. Így azt a feltételezést, hogy a C-terminális PDZ-köto szekvencia segítségével jut el a Ca2+ pumpa egy polarizált sejt megfelelo kompartmentjébe, eddig még nem sikerült alátámasztani. Amennyiben a PMCA olyan enzimmel lokalizálódik egy helyen, amely muködése függ a Ca2+-koncentrációtól, akkor a Ca2+ pumpa a lokális Ca2+ szint szabályozásával olyan mikrokörnyezetet teremthet a partner fehérje számára, amellyel befolyásolja az aktivitását. Eddig két olyan Ca2+-kalmodulin komplex által regulált enzimet azonosítottak – a nitrogén-oxid szintetáz-I-t (NOS-I) (88) és a Ca2+-kalmodulin- függo szerin protein-kinázt (CASK) (87) – , amelyek a PDZ doménjükön keresztül a PMCA4b izoforma C-terminális PDZ-köto szekvenciájához kötodnek. Ha a NOS-I fehérjéhez fizikailag közel helyezkedik el a PMCA4b enzim, akkor az általa fenntartott lokálisan alacsony Ca2+-koncentráció csökkenti a NOS-I aktivitását. A CASK neuronális szinapszisokban található, és számos fehérjével képes kölcsönhatásba lépni. Muködése még nem teljesen tisztázott, de valószínu, hogy a Ca2+-kalmodulin komplex kötodése olyan konformációs változásokat eredményez a fehérje szerkezetében, amelynek hatására képes lesz a Tbr-1 transzkipciós faktor megkötésére. A kialakult CASK-Tbr-1 komplex a magba transzlokálódik, és a transzkripció szabályozásában vesz részt. A PMCA4b által fenntartott lokálisan alacsony Ca2+ szint – hasonlóan a NOS-I szabályozásához – gátolja a CASK muködését, mivel lokálisan csökkenti a Ca2+kalmodulin komplex koncentrációját. Ily módon, a CASK enzim mikrokörnyezetének 25
befolyásolásán keresztül a plazmamembrán Ca2+ATPáz a sejt transzkripciós aktivitását képes befolyásolni. Valószínu, hogy a fehérje-fehérje kölcsönhatások dinamikusan változnak a sejtmuködés során. Míg a trombinnal aktivált vérlemezkékben a Ca2+ATPáz (PMCA1b és 4b) a PDZköto szekvencián keresztül a citoszkeletális hálózathoz kapcsolódik, addig a nem aktivált trombocitákban a citoszkeletonhoz kötodött Ca2+ pumpa aránya nem jelentos (107).
Feltételezhetoen
a
PDZ
kölcsönhatás
rövid
távú
szabályozásában
a
foszforilációnak van szerepe, mivel foszforilálható aminosavak minden izoforma PDZköto szekvenciájában megtalálhatóak. Ugyanakkor a kölcsönhatás hosszú távú szabályozását a megfelelo C-terminális szekvenciával rendelkezo variáns expressziója teszi lehetové.
4.4.3 A különbözo izoformák aktivitásának kinetikai jellemzoi Scharff és mtsai mutatták ki eloször, hogy a vörösvérsejt Ca2+ATPáz kalmodulinnal történo aktiválódása lassú, és az aktiválódás sebessége függ a Ca2+koncentrációtól (86). A plazmamembrán Ca2+ATPáznak az a tulajdonsága, hogy a Ca2+ tüske kialakulására képes idoben késve reagálni, egyedülálló a Ca2+-ot eltávolító mechanizmusok között. A SERCA és Na+/Ca2+ cseretranszporter esetében a Ca2+ ionok kötodése közvetlenül aktiválja a fehérjét. A PMCA aktiválódásához azonban szükség van arra, hogy eloször egy másik Ca2+-köto fehérje, a kalmodulin kötodjön a pumpa Cterminális szabályozó régiójához. A PMCA pumpa Ca2+-mal és kalmodulinnal történo aktiválódása így legalább négy lépésbol áll: 1., a kalmodulin megköti a Ca2+ ionokat, 2., a kialakult Ca2+-kalmodulin komplex kötodik a PMCA-hoz, 3., a Ca2+-kalmodulin komplex kötodése gyengíti a kölcsönhatást az enzim katalitikus centruma és a kalmodulin-köto szekvenciát is magába foglaló C-terminális régió között, 4., Ca2+ ion kötodik a PMCA transzmembrán régiójában található transzport Ca2+-köto helyhez. Mivel sejten belül a citoplazma kalmodulin koncentrációja megközelítoleg állandó, a Ca2+ szint változása határozza meg a Ca2+-kalmodulin komplex kötodését illetve disszociációját, és ezáltal a Ca2+ATPáz aktivitását. A Ca2+-koncentráció hirtelen megemelkedését követoen az egyes izoformák eltéro sebességgel aktiválódnak, és ez alapján három csoportba sorolhatjuk oket (21). Az izoformák közül leglassabban a PMCA4b izoforma aktiválódik. Gyorsan eléri a maximális aktivitását a 3f és a 2a izoforma, illetve közepes sebességel aktiválódik a 2b és a 4a forma. Az aktiválódás sebességére nem lehet egyszeruen az egyensúlyi affinitás mérésekbol következtetni. A 26
4a izoforma Ca2+-kalmodulin komplex iránti affinitása például kisebb mint a 4b izoformáé, mégis gyorsabban aktiválódik. Ebben az esetben azonban a gyors aktiválódást gyors inaktiválódás is követi szemben a PMCA4b lassú inaktiválódási sebességével. Amennyiben eltávolítjuk a PMCA4b izoforma kalmodulin-köto szekvenciáját is magába foglaló C-terminális régióját, a pumpa aktivitását csak a Ca2+ koncentrációja befolyásolja, annak növekedésével gyorsan aktiválódik. Ez azt bizonyítja, hogy a Ca2+kalmodulin komplexszel történo lassú allosztérikus aktiválódás felelos a PMCA4b izoforma lassú aktiválódásáért. Olyan deléciós mutáns segítségével, amely a kalmodulin-köto szekvenciát még tartalmazza, de az attól C-terminálisan elhelyezkedo másodlagos autoinhibítor régiót már nem, megállapították, hogy a másodlagos autoinhibítor régió is lényeges szerepet játszik a lassú aktiválódásban (20). A lassú aktiválódásnak tehát szerkezeti okai lehetnek. Valószínu, hogy a PMCA4b izoforma esetében a C-terminális régió és a katalitikus centrum kölcsönhatása erosebb mint a többi izoforma esetében, és a Ca2+-kalmodulin komplex nehezen fér hozzá a kalmodulin-köto szekvenciához. Ez magyarázza a 4b izoformára jellemzo igen alacsony alapaktivitást és a pumpa lassú aktiválódását. A másodlagos autoinhibítor régiót nem tartalmazó deléciós mutáns aktivitása, kinetikai jellemzoi pedig azt támasztják alá, hogy az
intramolekuláris
kölcsönhatásban
a
C-terminális
régió
kalmodulin-köto
szekvenciáján kívül lényeges szerepet játszik az attól C-terminálisan elhelyezkedo másodlagos autoinhibítor régió is. A funkcionálisan eltéro izoformák szöveti eloszlása különbözo, és szoros korrelációt lehet felfedezni az adott sejttípusban jelenlévo PMCA izoforma aktiválódásának sebessége és az adott sejttípus Ca2+ jelátvitelének sebessége között. Szív és harántcsíkolt izom Ca2+ jelei nagyon gyorsan le csengenek (10-100 ms). Ezek a szövetek expresszálják a gyors izoformákat. A harántcsíkolt izomban foleg a 3f izoforma található (45), a szívizomban (patkány) a 2a izoforma domináns. A belso fül szorsejtjeiben, ahol ugyancsak a 2a forma expresszálódik, szintén gyorsan cseng le a Ca2+ jel. Másrészt vörösvérsejtben és Jurkat sejtben, ahol nagyságrendekkel lassabban csökken a Ca2+-koncentráció, szinte kizárólag 4b izoforma expresszálódik. Caride és mtsai vizsgálták a különbözo izoformák inaktiválódását azt követoen, hogy a kalmodulint a miozin könnyulánc-kináz kalmodulin-köto szekvenciáját reprezentáló peptid segítségével eltávolították a reakcióelegybol (22). A miozin könnyulánc-kináz kalmodulin-köto peptidjének igen nagy a kalmodulin iránti affinitása, de nem kötodik a PMCA katalitikus centrumához (36). Az inaktiválódás tekintetében – az aktiválódás 27
vizsgálatakor nyert adatokhoz hasonlóan – szintén nagy különbségek vannak az egyes izoformák között. A PMCA4b inaktiválódása lassú, lényegesen lassabb, mint például a 4a izoformáé. A PMCA2b izoforma azonban még ennél is lassabban inaktiválódik. A lassú inaktiválódás oka, hogy a kalmodulin hosszú ideig kötve marad a pumpa Cterminális régiójához, így feltehetoen a Ca2+ szignált követoen sokáig aktív marad. A lassú aktiválódás és a lassú inaktiválódás hatására az enzim késve válaszol a Ca2+koncentráció változásaira. Az elobbi kinetikai jellemzo képessé teszi a PMCA izoformákat, hogy befolyásolják a Ca2+ jel amplitúdóját, alakját és idotartamát. A lassú inaktiválódás akkor jut lényeges szerephez, amikor nem egy Ca2+ jel éri a sejtet, hanem legalább két Ca2+ tüske, amelyeket néhány másodpercnyi alacsony Ca2+-koncentráció választ el. Ez történik a Ca2+ oszcilláció esetében is. Ha megfeleloen lassan inaktiválódik az enzim, akkor a második Ca2+ tüske kialakulásakor még a kalmodulin kötve lehet a pumpák egy részéhez, és így az enzim sokkal gyorsabban képes aktiválódni az újra megemelkedo Ca2+-koncentráció hatására, mintha már a teljesen gátolt állapot kialakult volna („memória effektus”). Az izoformák lokalizációja és az inaktiválódásuk sebessége között szintén lehet összefüggést találni. A PMCA4b – bár ubikviter forma – elsosorban a hematopoietikus ossejtbol származó sejtekben, vörösvérsejtekben és egyéb vérsejtekben található nagyobb mennyiségben. A 2b variáns viszont kizárólag a gyorsabban reagáló sejtekben, pl. különbözo idegsejtekben expresszálódik. Az utóbbi esetben a sejtek muködése során fontos szabályozó tényezo az ún. „long-term potentation” és „inhibition”, amelyek kialakulására hatással lehet egy hosszabb „memóriával” rendelkezo Ca2+ATPáz izoforma. A „memória effektus” valószínuleg kevésbé jelentos azokban a sejtekben, ahol a 4b forma expresszálódik, mivel ezeknek a sejteknek a muködése kevésbé függ Ca2+ tüskék sorozatától. A PMCA izoformák más- más kinetikai jellemzokkel rendelkezo Ca2+ATPázok, amelyek sejt- és szövetspecifikusan expresszálódnak, és a fehérje- fehérje valamint a lipidkölcsönhatásban szerepet játszó régiók (PDZ-köto szekvencia, kis hurok) segítségével a megfelelo szubcelluláris kompartmentekbe irányíthatóak. Egy adott helyen funkcionáló izoforma pedig rendkívül sokoldalúan szabályozható. A PMCA tehát egy olyan citoszolikus Ca2+ szintet csökkento plazmamembrán fehérje, amely segítségével a Ca2+ jelnek mind az idobeli lefolyása, mind térbeli mintázata igen finoman szabályozható.
28
5 Célkituzések A PMCA sokrétu szabályozhatóságának szerkezeti alapját a katalitikus centrum és a C-terminális régió intramolekuláris kölcsönhatása képezi. Az intramolekuláris kapcsolat konformációja valószínuleg dinamikusan változik az enzim muködése során. Kísérleteink célja a humán PMCA4b izoforma (hPMCA4b) intramolekuláris kölcsönhatásainak,
illetve
a
konformációváltozások
során
ebben
a
régióban
bekövetkezo szerkezeti változásoknak a vizsgálata volt. A hPMCA4b DNS-ével transzfektált COS-7 majom vese sejtekbol preparált mikroszómális membrán segítségével a Ca2+ pumpát in situ a membránban vizsgáltuk. 1. A C-terminális autoinhibítor régióban hasító proteázok (kaszpáz-3, kalpain, kimotripszin) segítségével tanulmányozni kívántuk a C-terminális régió szerkezeti jellegzetességeit. Ennek során a következo célok, illetve kérdések merültek fel: ? A kalpainos hasítási helyek meghatározása in situ a membránban, csonkolt mutánsok segítségével. ? Kimotripszin esetében olyan kísérleti körülmények beállítása, amelyek mellett az általunk vizsgált autoinhibítor régióban tanulmányozható a fragmentáció. ? A PMCA muködése során a fehérje szerkezete folyamatosan változik. Ezért vizsgálni kívántuk a kalcium pumpa fragmentációját különbözo konformációs állapotokban. 2. A PMCA4b izoforma kalmodulin-köto szekvenciájában található triptofánról (Trp1093 ) kimutatták, hogy fontos szerepet játszik az enzim belso gátlásában. A Cterminális régióban hasító proteázok segítségével vizsgálni kívántuk, hogy a Trp1093 mutációjának milyen hatása van a PMCA4b intramolekuláris kölcsönhatásaira. 3. Vizsgálni
kívántuk,
hogy
a
kalmodulin-köto szekvenciától N-terminálisan
elhelyezkedo, ún. „csukló” régióban található aszparginsav (Asp1080 ) mutációja milyen hatással van az enzim aktivitására.
29
6 Metodikák 6.1 A kísérletekben felhasznált DNS konstrukciók A humán PMCA4b és a Trp1093? Ala mutáns John T. Penniston professzor (Mayo Clinic, Rochester, MN, USA) ajándéka volt (78). A humán PMCA4b Asp1080 és Asp1077 mutánsainak létrehozása: A mutáns fehérjék DNS-ét kettos PCR technikával állítottuk elo. Az elso PCR termék: egy PMCA4b szekvenciát amplifikáltunk olyan primereket használva, amelyek tartalmazzák a kívánt mutációt és egy olyan restrikciós hasítási helyet (BamHI), amely a szekvenciában is jelen van. Ezekután ezt a PCR terméket használtuk fel primerként a második PCR-ban egy olyan primerrel, amely egy másik páratlan restrikciós hasítási helyet (NsiI) tartalmazott. A PCR termékeket Blunt PCR cloning kit segítségével klónoztuk. A NsiIBamHI darabot kivágtuk, majd a vad típusú hPMCA4b DNS-t tartalmazó pSP72 vektorba helyeztük. Végül a teljes hosszúságú mutáns PMCA4b-t tartalmazó SalI-KpnI darabot kivágtuk a pSP72 vektorból, és a pMM2 expressziós vektorba helyeztük (1).
6.2 Sejtkultúra és transzfekció A COS-7 sejteket 10% fetális szarvasmarha szérummal, 100 U/ml penicillinnel, 0,1 mg/ml streptomicinnel és 2 mM L- glutaminnal kiegészített DMEM médiumban tenyésztettük. A sejteket 37 o C-on CO2 termosztában (5% CO2 ) inkubáltuk. A transzfekciót Lipofectamine (Gibco-BRL) segítségével, a gyártó utasításainak megfeleloen végeztük. A 70-80%-ban konfluens sejteket a DNS- lipofectamine komplex-szel OPTI-MEM szérum- mentes médiumban 5 órán keresztül 37 o C-on inkubáltuk CO2 termosztátban, majd kiegészítettük 20% FBS-t tartalmazó médiummal. A transzfekciót követo 24. órában a sejtek friss DMEM médiumot kaptak, majd újabb 24 óra elteltével a sejtekbol membránpreparátumot készítettünk.
6.3 Membránpreparálás COS-7 sejtekbol COS–7
sejtekbol
Enyedi
és
mtsai
szerint
(38)
készítettünk
membránpreparátumot a következo módosításokkal: A sejteket jéghideg foszfát-puffer tartalmú
sóoldattal
mostuk,
majd ebbe
a
médiumba
(kiegészítve:
0,1 mM
fenilmetilszulfonil fluoriddal, 6 ? g/ml aprotininnel, 2,2 ? g/ml leupeptinnel és 1 mM EGTA- val (pH7,4)) gyujtöttük össze. Centrifugálás (2000g, 10 perc) után a sejteket jéghideg hipotóniás oldatban (10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM MgCl2 , 0,5 mM EGTA, 30
4 ? g/ml aprotinin, 2 ? g/ml leupeptin, 4 mM dithiotreitol) szuszpendáltuk. A lizálás, a homogenizálás (homogenizáló oldat: 0,5 M szukróz, 0,3 M KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 4 mM dithiotreitol, 4 ? g/ml aprotinin, 2 ? g/ml leupeptin) és a centrifugálás (100000g, 40 perc) után a membránt 0,25 M szukróz, 0,15 M KCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 2 mM dithiotreitol, 20 ? M CaCl2 összetételu oldatban szuszpendáltuk, majd folyékony nitrogénben tároltuk.
6.4 Kalpainos és kimotripszines emésztés A reakcióközeg tartalmazott 50 ? g/ml membránfehérjét, 100 mM KCl-t, 25 mM TES-trietanolamint (pH 7,2), szükség szerint 0,2 mM CaCl2 -t (100 ? M szabad Ca2+), 0,1 mM EGTA-t, 5 mM dithiothreitolt, 1 mM MgCl2 -t, 0,05% Tritont, és szükség szerint 485 nM kalmodulint. A membránt a reakcióközegben 37 o C-on 3 percig inkubáltuk, majd az emésztést 5 ? g/ml ? -kalpain (Calbiochem) vagy 0,05 ? g/ml ? kimotripszin (Sigma Chemical Co.) hozzáadásával kezdtük. A proteolízist 0 o C-os triklórecetsav (TCA) hozzáadásával állítottuk le (végso koncentráció: 6%), majd 100 ? g szarvasmarha szérum albuminnal (BSA) kiegészítettük, és a membránt 20 percre jégre helyeztük. A kicsapódott fehérjét 15 percig 3000 rpm fordulatszámon ülepítettük, a felülúszó eltávolítása után egyszer mostuk desztillált vízzel, majd a fehérjét mintafelvevo pufferben -70 o C-on tároltuk. A mintafelvevo puffer tartalmazott 62,5 mM Tris-HCl-t (pH 6,8), 2% SDS-t, 10% glicerolt, 5 mM EDTA-t, 125 mg/ml ureát és frissen hozzáadott 100 mM dithiotreitolt.
6.5 Emésztés kaszpáz-3-mal A reakcióközeg tartalmazott 50 ? g/ml membránfehérjét, 100 mM KCl-t, 25 mM TES-trietanolamint (pH 7,2), 8,5% szukrózt, 0,09 mM EGTA-t, 5 mM dithiothreitolt, 20 ? g/ml aprotinint, 20 ? g/ml leupeptint, 0,1% CHAPS-t, szükség szerint 0,1 mM CaCl2 -t (10 ? M szabad Ca2+), illetve szükség szerint 485 nM kalmodulint. A membránt a reakcióközegben 37 o C-on 3 percig inkubáltuk, majd az emésztést 0,25 ? g rekombináns kaszpáz-3 (Upstate Biotechnology Inc.) hozzáadásával kezdtük. A proteolízist 0 o C-os
triklórecetsav
(TCA)
hozzáadásával
állítottuk
le
(végso
koncentráció: 6%), majd 100 ? g BSA- val kiegészítettük, és a membránt 20 percre jégre helyeztük. A kicsapódott fehérjét 15 percig 3000 rpm sebességgel ülepítettük, a felülúszó eltávolítása után egyszer mostuk desztillált vízzel, majd a fehérjét mintafelvevo pufferben -70 o C-on tároltuk. A mintafelvevo puffer tartalmazott 62,5 mM 31
Tris-HCl-t (pH 6,8), 2% SDS-t, 10% glicerolt, 5 mM EDTA-t, 125 mg/ml ureát és frissen hozzáadott 100 mM dithiotreitolt.
6.6 Gélelektroforézis és elektrotranszfer A mintákat 7,5%-os SDS-poliakrilamid gélen futtattuk Laemmli módszere szerint, majd PVDF membránra blottoltuk 25 mM Tris, 0,7 M glicint tartalmazó blot pufferben 250 mA áramerosség mellett 2 óra alatt BioRad miniblot készüléken. A mintákat tartalmazó membránt immunfestéssel és ECL (Enhanced Chemiluminescence) technika segítségével tettük láthatóvá. Felhasznált elsodleges ellenanyagok (ea): 5F10 monoklonális ea
pan-anti-PMCA, epitóp a 719-738 aminosavak között
JA9 monoklonális ea
anti-PMCA4, epitóp az 51-75 aminosavak között
JA3 monoklonális ea
anti-PMCA4b, epitóp az 1156-1180 aminosavak között
A fehérjék mennyiségi megoszlását a BioRad Chemiluminescence Imaging System segítségével határoztuk meg. Eredményeinket a Molecular Analyst és a GraphPad Prism programokkal értékeltük ki.
6.7 Ca2+ transzport mérés Ca2+ transzport mérés során a membránvezikulák
45
Ca2+ izotóppal jelzett Ca2+-
felvételét mértük (39). A reakcióközeg tartalmazott 100 mM KCl-t, 25 mM TEStrietanolamint (pH 7,2), 7 mM MgCl2 -t, 0,1 mM CaCl2 -t (45 Ca2+ izotóppal jelzett), 40 mM KH2 PO4 /K2 HPO4-t (pH7,2), 200 nM thapsigargint, 4 ? g/ml oligomicint, és a kívánt szabad Ca2+-koncentrációhoz szükséges EGTA-t. Szükség esetén kalmodulint is tettünk a közegbe az ábrákon feltüntetett mennyiségben. A reakcióközeghez 20 ? g/ml membránfehérjét adtunk, 37 o C-on 3 percig inkubáltuk, majd a reakciót 5 mM ATP hozzáadásával indítottuk. A reakció végét Millipore membránfilteren (pórusméret: 0,45 ? m) történo gyors szurés jelentette. A vezikulák
45
Ca2+-tartalmát folyadékszcintillációs
számlálóban (Beckman LS 6000) mértük meg.
6.8 Az ATPáz aktivitás méréséhez szükséges tisztított PMCA eloállítása 100-200 ? g fehérjét tartalmazó COS-7 sejt membránt 80 ? l 4 o C-os szolubilizáló pufferben szuszpendáltuk (20). A puffer tartalmazott 240 mM KCl-t, 60 mM TEStrietanolamint (pH 7,2), 10 mM MgCl2 -t, 10 mM NaN 3 -t, 2 mM dithiothreitolt, 1 mM ouabaint, 400 nM thapsigargint, 8 ? g/ml oligomicint, 4 ? g/ml aprotinint, 1 ? g/ml 32
leupeptint, 400 ? M EGTA-t és 0,5% Triton X-100-t. A szuszpenziót 4 o C-on 4 percig állni hagytuk, majd 320 ? l higító puffert adtunk hozzá (összetétele megegyezett a szolubilizáló pufferével, kivéve, hogy a Triton X-100 helyett 0,5 mg/ml foszfatidilkolint tartalmazott). Rögtön ezután 200 mg Bio-Beads SM-2 gyöngyöt adunk hozzá, amely megköti a Triton X-100-t. A mintákat 1 órán keresztül 4 o C-on ráztuk, majd a Bio-Beads gyöngyöket centrifugálással eltávolítottuk.
6.9 A PMCA aktiválódásának kinetikai analízise A tisztított PMCA fehérje aktiválódásának sebességét 37 o C-on kapcsolt enzimreakción keresztül Beckman DU70 spektrofotométer segítségével határoztuk meg (20). A reakcióközeg 120 mM KCl-t, 30 mM TES-trietanolamint (pH 7,2), 5 mM MgCl2 -t, 2,5 mM ATP-t, 5 mM NaN 3 -t, 1 mM dithiothreitolt, 0,5 mM ouabaint, 200 nM thapsigargint, 4 ? g/ml oligomicint, 2? g/ml aprotinint, 0,5 ? g/ml leupeptint, 200 ? M EGTA-t, annyi CaCl2 -t, amennyi a 0,5 ? M szabad Ca2+-koncentrációhoz szükséges, szükség szerint 235 nM kalmodulint, 0,2 mM 2-amino-6- merkapto-7-metil-purin ribonukleozidot
(MESG)
és
1
U/ml
purin- nukleozid-foszforilázt tartalmazott.
Spektrofotométerrel a MESG foszforolízisének hatására 360 nM-en bekövetkezo abszorpció változást detektáltuk. Az adatokra a GraphPad Prism program segítségével a következo egyenest illesztettük: Y(t)=Y0 -v c/k+(v 0 +vc)t+(vc/k)exp(-kt), ahol Y0 a “nulla” idopontban mért optikai denzitás, v 0 az optikai denzitás növekedésének sebessége egyensúlyi állapotban, amennyiben nincs kalmodulin a közegben, és v 0 +v c az optikai denzitás
növekedésének
sebessége
egyensúlyi
állapotban
235 nM kalmodulin
jelenlétében.
6.10 A PMCA inaktiválódásának kinetikai analízise A kalmodulin disszociációját követo inaktiválódás kinetikai analízise során ugyanolyan összetételu reakcióközeget használtunk, mint a kalmodulinnal történo aktiválódás vizsgálata során. Eloször megvártuk, hogy az enzim aktivitása 0,5 ? M szabad Ca2+ és 235 nM kalmodulin mellett stacionárius állapotot érjen el, majd 10 ? M kalmodulin-köto peptidet (RRKWQKTGHAVRAIGRLSS) adtunk hozzá. Ez a kalmodulin-köto peptid a csirke simaizom miozin könnyulánc-kináz kalmodulin-köto szekvenciájának felel meg, mely nagy affinitással köti a kalmodulint, de nincs hatással a PMCA4b kalmodulin nélküli aktivitására. Az adatokra a GraphPad Prism program segítségével a következo egyenest illesztettük: Y(t)=Y0 -v 0t+(vc/k-1 )(1-exp(-k-1t)). 33
6.11 PMCA4b szerkezeti modellje A PMCA4b szekvenciáját a SERCA1a fehérje szekvenciájával hasonlítottuk össze számítógépes analízissel. Felhasználtuk azokat az ismereteket, amelyek a polipeptidlánc különbözo részéirol rendelkezésünkre állnak. Ezután a MODELLER 6v2 programmal a SERCA1a szerkezeti adatait (Protein Data Bank: 1EUL.pdb – SERCA E1, 1IWO.pdb – SERCA E2) felhasználva elkészítettük a PMCA4b fehérje E1 és E2 konformációjú homológia modelljét.
34
7 Eredmények
7.1 A hPMCA4b izoforma intramolekuláris kölcsönhatásainak vizsgálata limitált proteolízissel A plazmamembrán Ca2+ATPáz jellegzetessége, hogy nyugvó sejtben a Cterminális szabályozó régiója gátolja az enzim aktivitását azáltal, hogy kölcsönhatásba lép az enzim katalitikus centrumával. Megemelkedett Ca2+-koncentráció mellett, a képzodo Ca2+-kalmodulin komplex kötodik a fehérjéhez, az intramolekuláris kölcsönhatás gyengül, és az enzim feltehetoen nyitottabb szerkezetet vesz fel. Ennek hatására a pumpa aktivitása és Ca2+ iránti affinitása megno. A reakcióciklus során a pumpa folyamatos konformációváltozáson megy át, a katalitikus centrumot is magába foglaló citoplazmatikus domének jelentos mozgásokat végeznek. Aktív és inaktív állapotban azonban nagy különbségek lehetnek az enzimciklus sebességében, mivel inaktív állapotban a C-terminális régió és a katalitikus centrum kölcsönhatása lassítja a konformációváltozásokat. In vitro körülmények között, ATP hiányában az enzimciklus áll, az E2 és E1 konformációjú fehérje között egyensúly alakul ki. Ca2+ kötodése a fehérjéhez az egyensúlyt az E1 állapot felé tolja, míg a Ca2+ hiánya az E2 konformációs állapotnak kedvez. A C-terminális régió fragmentációjának vizsgálata során – az alapján, hogy egy proteáz számára mennyire hozzáférheto egy adott hasítási hely – az enzim intramolekuláris kölcsönhatásairól illetve annak erosségérol kaphatunk információt. Az, hogy
bizonyos
–a
proteáz
aktivitását
nem
befolyásoló –
körülmények
megváltoztatásával egy proteáz kevésbé képes hasítani egy adott helyen, arra utal, ho gy a hasítási hely környezete szorosabb kölcsönhatásba került a fehérje más részével, és emiatt nem elérheto az enzim számára. Míg a Ca2+ATPáz aktivitásának vizsgálatából átfogó képet kaphatunk a C-terminális régió és a katalitikus centrum kölcsönhatásáról, addig különbözo hasítási helyeken ható proteázok felhasználásával lokálisan (az adott hasítási hely környezetében) vizsgálhatjuk a C-terminális régió szerkezetét.
7.1.1 Hasítási helyek a hPMCA4b C-terminális régiójában Vizsgálatainkhoz
három
olyan
eltéro
szubsztrátspecificitású
proteázt
választottunk, amelyek a PMCA4b izoforma C-terminális régiójában hasítanak elsodlegesen. Régóta ismert, hogy a kalpain, amely egy Ca2+-függo intracelluláris 35
proteáz, hasítja a plazmamembrán Ca2+ATPázt (102,103,56). Bár bizonyított, hogy a Cterminális régióban hasít, a hasítási helyek pontosabb behatárolása során eddig egymásnak ellentmondó eredmények születtek. Pontosan ismerjük viszont egy apoptotikus proteáz, a kaszpáz-3 hasítási helyét a PMCA4b kalmodulin-köto szekvenciájától N-terminálisan (77). A két intracelluláris proteáz mellett harmadikként a kimotripszint használtuk a PMCA4b C-terminális régiójának vizsgálatára.
7.1.1.1
A PMCA4b fragmentációja kalpainnal A molekuláris biológiai és a biokémiai módszerek fejlodése lehetové tette, hogy
az egyes PMCA izoformák kalpainos fragmentációját in situ a membránban – az enzim természetes állapotához közel álló rendszerben – tanulmányozzuk. A hPMCA4b izoforma kalpainos hasítását 37 o C-on, a fehérje cDNS-ével transzfektált COS-7 sejtekbol preparált membránokon végeztük a fehérje inaktív (kalmodulin nélkül) és aktív (kalmodulin mellett) állapotában. Az emésztést követoen a fehérjéket SDSgélelektroforézis segítségével választottuk szét, majd 5F10 ellenanyaggal festettük meg. Az 5F10 egy olyan lineáris epitópot ismer fel a 719-738 aminosavak között, amely minden PMCA izoformában közös. A pumpa inaktív állapotában, amikor nem tettünk kalmodulint a közegbe, két fragment képzodését figyeltük meg (8. ábra).
ct92
PMCA4b +kalpain
PMCA4b +kimotripszin
ct71 ct120
PMCA4b +kaszpáz-3
hPMCA4b
8. ábra A hPMCA4b izoforma emésztése kalpainnal, kimotripszinnel és kaszpáz-3-mal PMCA4b-vel transzfektált COS-7 sejtekbol izolált mikroszómális membránt emésztettünk Ca2+ jelenlétében kalpainnal, kimotripszinnel és kaszpáz-3mal a Metodikák fejezetben leírtak szerint. A mintákat és a C-terminálisan csonkolt mutánsokat 5F10 ellenanyaggal festettük meg.
A Western blot analízist végrehajtottuk a PMCA4 specifikus JA9, illetve a PMCA4b specifikus JA3 monoklonális ellenanyagokkal is. A JA9 ellena nyag az enzim Nterminális végén az 51-75 aminosavak között ismeri fel a fehérjét, míg a JA3 ellenanyag 36
a C-terminális régióhoz kötodik az 1156-1180 aminosavak között. Az emésztés során keletkezo fragmenteket mind az 5F10, mind a JA9 ellenanyag felismerte, a JA3 ellenanyaggal viszont nem lehetett a fragmenteket detektálni. Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy a kalpain a PMCA4b izoforma C-terminális régióját hasítja a JA3 epitóptól N-terminálisan. A hasítás helyeit C-terminálisan csonkolt mutánsok segítségével határoltuk be. A ct71, ct92 és ct120 mutánsok esetében 71, 92 illetve 120 aminosav hiányzik a hPMCA4b izoforma C-terminálisáról. A 126 kDa molekulatömegu ct71 tartalmazza a kalmodulinköto szekvenciát és a másodlagos autoinhibítor régió egy részét is. A ct92 mutáns Cterminálisa
a
kalmodulin-köto
szekvencia
C-terminálisával
egyezik
meg,
molekulatömege 124 kDa. A 120 kDa molekulatömegu ct120 mutáns esetében pedig a teljes kalmodulin-köto szekvencia, illetve az attól C-terminális irányba eso régió hiányzik. Úgy találtuk, hogy a kalpain hatására képzodött két fragment hasonló távolságra vándorolt, mint a ct71 és ct92 mutánsok (9. ábra). Az ép PMCA4b fehérje (134 kDa) és a csonkolt mutánsok molekulatömegének ismeretében az elektroforetikus mobilitás alapján a fragmentek molekulatömege 125 illetve 124 kDa. 0,8
hPMCA4b
0,7
hPMCA4b kalpainos fragmentjei
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
16
15,6
15,2
14,8
14
ct92 ct120
14,4
13,6
13,2
12,8
12
12,4
11,6
11,2
10,8
10
ct71
10,4
9,6
9,2
8,8
8
8,4
7,6
7,2
6,8
6
6,4
5,6
5,2
4,8
4
4,4
3,6
3,2
2,8
2
2,4
0
9. ábra A kalpainos fragmentek és a C-terminálisan csonkolt mutánsok elektroforetikus vándorlásának összehasonlítása A PMCA4b és a kalpainos fragmentek – ugyanabban a gélben történo – migrációját a Bio-Rad Molecular Imager System segítségével analizáltuk. A kemilumineszcencia függvényében.
A
intenzitását
folytonos
vonal
ábrázoltuk az
ép
a
PMCA4b
megtett és
a
távolság fragmentek
migrációját, a szaggatott vonalak a csonkolt mutánsok migrációját jelölik.
A fenti eredmények alapján az egyik kalpainos hasítási hely a kalmodulin-köto szekvencia C-terminálisának közelében található, míg a másik hasítási hely ettol Cterminálisan kb. 20 aminosav távolságra van (10. ábra). 37
ct120
kalmodulin-köto szekvencia
ct92
ct71
M10-..LDEIDHAEME LRRGQ I LWFRGLNRIQTQIKVVKAFHSS LHESIQKPYNQKSIHSFMTHPEFAIEE..-COOH
2. Kaszpáz-3 (120 kDa)
1.
3. Kalpain Kimotripszin Kalpain (124 kDa) (124,5 kDa) (125 kDa)
Trp1093
10. ábra A hPMCA4b izoforma C-terminális régiójának elsodleges szerkezete Az általunk meghatározott kalpain, kaszpáz-3, illetve kimotripszin hasítási helyeket fekete nyilak jelzik. A szürke nyilak James és mtsai által meghatározott kalpainos hasítási helyeket jelzik (1. nyíl: kalmodulin hiányában, 2. nyíl: kalmodulin hiányában és jelenlétében, 3. nyíl: kalmodulin jelenlétében észlelt hasítási hely). A ct120, ct92 és ct71 mutánsok C-terminálisát szintén nyilak jelzik.
Amennyiben az emésztést aktív állapotú enzimen kalmodulin jelenlétében végeztük, csak a 125 kDa-os fragment képzodését figyeltük meg. A 124 kDa-os fragment hiányát nagy valószínuséggel a Ca2+-kalmodulin komplex kötodése okozza, mivel ilyenkor a kalmodulin-köto régióban a hasítási hely(ek) nem elérheto(ek) a proteáz számára. A bevezetoben ismertettük, hogy James és mtsai az izolált vörösvérsejt Ca2+ATPáz (foleg PMCA4b) kalmodulin hiányában történo kalpainos emésztése során képzodött fragmentek C-terminális szekvenálása alapján két hasítási helyet határoztak meg a kalmodulin-köto szekvencián belül (7. ábra, 10. ábra) (56). Ezekben a kísérletekben a kalpainos kezelést jégen, a mi vizsgálatainknál jóval hosszabb ideig végezték. Amennyiben membránhoz kötött vörösvérsejt Ca2+ATPázt emésztettünk a mi kísérleteinknek megfele lo körülmények mellett, a COS-7 sejtekben expresszált PMCA4b kalpainos fragmentációjának megfelelo mintázatot kaptunk. Tovább vizsgáltuk annak okát, miért nem látjuk a James és mtsai által leírt fragmenteket. Mi is tanulmányoztuk a kalcium pumpa fragmentációját jégen, 30 percig tartó kalpainos kezelést követoen. Ilyen körülmények mellett több ct90- nél kisebb, de ct120- nál nagyobb fragmentet detektáltunk. Úgy tunik tehát, hogy a kalmodulin-köto szekvencián belül található hasítási helyek alacsonyabb homérsékleten jobban elérhetoek a proteáz számára, mint 37 o C-on. Kalmodulin jelenlétében végzett emésztést követoen még 0 o Con sem figyeltük meg a ct92-nél kisebb fragmentek képzodését, mivel a kalmodulin kötodése ezeknek a fragmenteknek a kialakulását gátolta. Azokban a kísérletekben, ahol James és mtsai a hasítási helyeket kalmodulin jelenlétében vizsgálták, az emésztést a 38
kalmodulin-köto szekvenciát reprezentáló szintetikus peptiden végezték. Mivel a szintetikus peptidrol az általunk meghatározott természetes hasítási helyek hiányoznak, egyértelmu, hogy csak ezen a szekvencián belül figyelhettek meg hasítást.
7.1.1.2
A hPMCA4b fragmentációja kaszpáz-3-mal Munkacsoportunk bizonyította elsoként, hogy kaszpáz-3 az apoptózis korai
szakaszában hasítja a PMCA4b izoformát (77). Kimutattuk, hogy a kaszpáz-3 közvetlenül a 10. transzmembrán hélix és a kalmodulin-köto szekvencia között elhelyezkedo 1077 DEID1080 szekvencia után hasít. (10. ábra). A hasítás eltávolítja a teljes kalmodulin-köto szekvenciát, és így a képzodo 120 kDa-os fragment kalmodulin nélkül is maximálisan aktív. Hogy kontrollált körülmények között tanulmányozhassuk a különbözo konformációjú PMCA4b izoforma fragmentációját, a PMCA4b- vel transzfektált COS-7 sejtekbol izolált mikroszómális membránt in vitro rekombináns kaszpáz-3-mal emésztettük. Az in vivo kísérleteknek megfeleloen a kalmodulin jelenlététol függetlenül egyetlen 120 kDaos fragment képzodött (a 8. ábra a kalmodulin nélkül észlelt fragmentációt, a 11. ábra a fragment és a C-terminálisan csonkolt mutánsok elektroforetikus vándorlását mutatja). Ez is igazolja, hogy a kaszpáz-3 hasítási hely nem vesz részt a kalmodulin kötésében.
hPMCA4b 0,8 0,7
0,6
hPMCA4b kaszpáz-3 fragmentje
0,5
0,4 0,3 0,2
16
15,6
15,2
14,8
14
14,4
ct92 ct120
13,6
13,2
12,8
12
12,4
11,6
11,2
10,8
10
ct71
10,4
9,6
9,2
8,8
8
8,4
7,6
7,2
6,8
6
6,4
5,6
5,2
4,8
4
4,4
3,6
3,2
2,8
2
0
2,4
0,1
11. ábra A kaszpáz-3 proteáz hatására képzodött fragment és a C-terminálisan csonkolt mutánsok elektroforetikus vándorlásának összehasonlítása A PMCA4b és a kaszpáz-3 hatására képzodött fragment – ugyanabban a gélben
történo –
migrációját
a
Bio-Rad
Molecular
Imager
System
segítségével analizáltuk. A kemilumineszcencia intenzitását ábrázoltuk a megtett távolság függvényében. A folytonos vonal az ép PMCA4b és a fragment
migrációját,
a
szaggatott
migrációját jelölik. 39
vonalak
a
csonkolt
mutánsok
7.1.1.3
A hPMCA4b fragmentációja kimotripszinnel A PMCA4b izoforma kimotripszines hasítását, hasonlóan az elozo két proteázzal
végrehajtott kísérletekhez, transzfektált COS-7 sejtekbol preparált membránokon 37 o Con végeztük. Azt tapasztaltuk, hogy a kimotripszin a C-terminális régióban kezdi fragmentálni a Ca2+ATPázt, majd a létrejött fragmenteket tovább hasítja. Olyan kísérleti körülményeket
állítottunk
minimalizáltuk
a
be,
amelyek
másodlagos
mellett
hasításokat.
A
a
vizsgált
fehérjéket
idointervallumban
SDS- gélelektroforézis
segítségével választottuk szét, majd az anti-PMCA 5F10, illetve a PMCA4 specifikus JA9 és JA3 monoklonális ellenanyagokkal festettük. Az emésztés során keletkezo fragmenteket az 5F10 és a JA9 ellenanyag felismerte, míg a JA3 ellenanyag nem. Ez azt bizonyítja, hogy a kimotripszin – hasonlóan a kalpainhoz és a kaszpáz-3-hoz - a PMCA4b izoforma C-terminális régióját hasítja a JA3 epitóptól N-terminálisan. A kimotripszin aktivitása nem függ a Ca2+ koncentrációtól, így a PMCA4b izoforma hasítását Ca2+ hiányában, és Ca2+ illetve Ca2+ és kalmodulin jelenlétében is vizsgálhattuk. A fragmentáció mintázatában egyik esetben sem láttunk eltérést, mindig egy domináns N-terminális fragment képzodött (8. ábra), ami valamivel kisebb volt a ct71 deléciós mutánsnál, és valamivel nagyobb a ct92-nél (12. ábra).
0,8
0,7
hPMCA4b kimotripszines fragmentje
0,6
0,5
0,4
hPMCA4b
0,3
0,2
0,1
16
15,6
15,2
14,8
14
ct92 ct120
14,4
13,6
13,2
12,8
12
12,4
11,6
11,2
10,8
10
ct71
10,4
9,6
9,2
8,8
8
8,4
7,6
7,2
6,8
6
6,4
5,6
5,2
4,8
4
4,4
3,6
3,2
2,8
2
2,4
0
12. ábra A kimotrips zines fragment és a C-terminálisan csonkolt mutánsok elektroforetikus vándorlásának összehasonlítása A PMCA4b és a kimotripszines fragment – ugyanabban a gélben történo – migrációját a Bio-Rad Molecular Imager System segítségével analizáltuk. A kemilumineszcencia
intenzitását
ábrázoltuk
a
megtett
távolság
függvényében. A folytonos vonal az ép PMCA4b és a fragment migrációját, a szaggatott vonalak a csonkolt mutánsok migrációját jelölik.
40
Ez alapján a hasítási hely a kalmodulin-köto szekvenciától C-terminálisan a ct71 és a ct92 mutáns C-terminálisai között található (1113. szerin és 1134. prolin között). A fragment elektroforetikus mobilitása alapján számolt molekulatömege ~124,5 kDa. Ismert, hogy a kimotripszin aromás aminosavak mellett hasít. Megvizsgálva a behatárolt
terület
aminosav
szekvenciáját
és
figyelembe
véve
a
fragment
molekulatömegét, valószínu, hogy a kimotripszin az 1122. tirozin után hasítja a Cterminális régiót (10. ábra).
7.1.2 Különbözo konformációs állapotok hatása a PMCA4b degradációjára Találtunk tehát három olyan eltéro szubsztrátspecificitású proteázt, amelyek közül ketto (kalpain, kimotripszin) a kalmodulin-köto szekvenciától C-terminális irányban (a másodlagos autoinhibítor régióban), egy pedig (kaszpáz-3) ettol Nterminálisan – a 10. transzmembrán hélix és a kalmodulin-köto szekvencia között – hasít. Az egyes hasítási helyek környezetének szerkezeti változásait úgy vizsgáltuk, hogy különbözo feltételek mellett (Ca2+, kalmodulin) idoben követtük a megfelelo fragmentek képzodését. Három különbözo szerkezeti állapotban vizsgáltuk a PMCA4b izoformát. Amennyiben Ca2+-ot és kalmodulint is tettünk a közegbe, a fehérje aktív, így feltehetoen a C-terminális régió és a katalitikus centrum közötti kölcsönhatás gyenge. Kalmodulin hiányában a fehérje inaktív és az intramolekuláris kölcsönhatás a Cterminális régió és a katalitikus centrum között eros. Ez utóbbi esetben még két további formában tanulmányozhattuk a kalcium pumpa hasítását, mivel a Ca2+ hozzáadásával illetve elvonásával a katalitikus centrum szerkezete E1 vagy E2 konformáció felé tolódik. A PMCA4b izoformával transzfektált COS-7 sejtekbol preparált membránokat különbözo
ideig
emésztettük
az
egyes
proteázokkal.
A
fehérjéket
SDS-
gélelektroforézissel szeparáltuk, majd immunfestéssel tettük láthatóvá. A fragmentek mennyiségének idobeli alakulását a BioRad Chemiluminescence Imaging System segítségével értékeltük ki, minden esetben úgy, hogy a „0” idopontban mért ép PMCA4b fehérje mennyiségét vettük 100%- nak. A kaszpáz-3 és a kimotripszin nem Ca2+-függo enzimek, így ezekkel a proteázokkal Ca2+ hiányában (EGTA mellett) is emésztettük a fehérjét. A PMCA4b kaszpáz-3-mal történo fragmentációját mutatja a 13. ábra. Ca2+ hiányában a 120 kDa-os fragment alig képzodik, ami azt mutatja hogy a hasítási hely nem elérheto a proteáz számára. Amennyiben a közeg Ca2+-ot is tartalmaz, megno az azonos ido alatt képzodött fragment mennyisége. Ennek ellenére a fehérjének csak 3041
40%-a fragmentálódott, ami azt mutatja, hogy a pumpa 60-70%-a védett marad a kaszpáz-3-mal
szemben.
Ca2+-kalmodulin
Amennyiben
komplex
kötodik
a
Ca2+ATPázhoz, a hasítási hely teljesen hozzáférhetové válik a proteáz számára, így maximális fragmentképzodés alakul ki.
A
B
EGTA
120 kDa-os fragment
PMCA4b 120 kDa Ido (perc):
0
15
30 60 120 180
100
Ca2+ + kalmodulin
80
%
Ca2+ 60
PMCA4b 120 kDa Ido (perc):
0
15
Ca2+
40 20
30 60 120 180
EGTA 0 0
Ca2+ + kalmodulin
30
60
90 120 150 180
perc PMCA4b 120 kDa Ido (perc):
0
15
30 60 120 180
13. ábra PMCA4b degradációja kaszpáz-3-mal PMCA4b-vel
transzfektált
COS-7
sejtekbol
preparált
mikroszómális
membránt különbözo ideig emésztettünk kaszpáz-3-mal Ca 2+ hiányában (EGTA), Ca2+ jelenlétében (Ca 2+) és Ca2+-kalmodulin komplex jelenlétében (Ca 2+ + kalmodulin). A, A mintákat 5F10 ellenanyaggal festettük meg. B, A 120 kDa-os fragment mennyiségét Bio-Rad Molecular Imager System segítségével értékeltük ki. A 120 kDa-os fragment képzodését Ca2+kalmodulin komplex (kör), Ca2+ (háromszög) és EGTA (négyzet) jelenlétében az ido függvényében ábrázoltuk. A feltüntetett adatok három független kísérlet alapján számolt átlagok ± S.E.
Kimotripszin
esetében
a
124,5 kDa-os
fragment
képzodése
hasonló
jellegzetességet mutat (14. ábra). Ca2+ hiányában alig keletkezik a fragment. Bár Ca2+ jelenléte már önmagában is szignifikánsan emeli a detektált fragment mennyiségét, a legtöbb fragment képzodését a Ca2+- kalmodulin komplex hozzáadásával lehetett elérni. Ebben az esetben az általunk használt körülmények mellett az ép fehérjének kb. 60%-a alakul át 124,5 kDa-os fragmentté. Mivel a fehérje több kimotripszines hasítási helyet is tartalmaz, így ez a fragment feltehetoen tovább degradálódik. 42
A kimotripszines hasítási hely tehát – a kaszpáz-3 hasítási helyhez hasonlóan – akkor a leghozzáférhetobb a proteáz számára, ha a pumpafehérje a Ca2+-kalmodulin komplex kötodésének hatására aktív szerkezetet vesz fel.
A
B
EGTA
PMCA4b 124,5kDa Ido (perc): 0 0.5 1
1.5
2
3
4
124,5 kDa-os fragment
5
Ca2+ + kalmodulin 60
%
Ca2+ PMCA4b
40
124,5kDa Ido (perc): 0 0.5 1
1.5
2
3
4
5
Ca2+ 20
EGTA 0
Ca2+ + kalmodulin
0
1
2
3
4
5
perc
PMCA4b 124,5kDa Ido (perc): 0 0.5 1
1.5
2
3
4
5
14. ábra PMCA4b degradációja kimotripszinnel PMCA4b-vel
transzfektált
COS-7
sejtekbol
preparált
mikroszómális
membránt különbözo ideig emésztettünk kimotripszinnel Ca 2+ hiányában (EGTA), Ca2+ jelenlétében (Ca 2+) és Ca2+-kalmodulin komplex jelenlétében (Ca 2+ + kalmodulin). A, A mintákat 5F10 ellenanyaggal festettük meg. B, A 124,5 kDa-os fragment mennyiségét Bio-Rad Molecular Imager System segítségével értékeltük ki. A 124,5 kDa-os fragment képzodését Ca2+kalmodulin komplex (kör), Ca2+ (háromszög) és EGTA (négyzet) jelenlétében az ido függvényében ábrázoltuk. A feltüntetett adatok három független kísérlet alapján számolt átlagok ± S.E.
A kalpain Ca2+-függo enzim, ezért a PMCA4b emésztése során csak a Ca2+kalmodulin komplex hatását vizsgáltuk (15. ábra). Ca2+-kalmodulin komplex hiányában két fragment képzodött (124 és 125 kDa), mindemellett a fehérje fragmentációja nem volt teljes. Ca2+-kalmodulin komplex jelenlétében a 124 kDa-os fragment nem képzodött, a 125 kDa-os fragment képzodése viszont sokkal kifejezettebb lett, és az emésztés végén alig maradt detektálható ép PMCA4b fehérje. Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy a Ca2+-kalmodulin komplex kötodésének hatására – annak ellenére, hogy a komplex kötodése megakadályozza az egyik fragment képzodését – a 125 kDa43
os fragmentet eredményezo hasítási hely elérhetobbé válik a kalpain számára és a pumpa intenzívebben degradálódik.
A
B 125 kDa-os fragment
Ca2+ PMCA4b Ido (perc):
125kDa 0
0.5
1
1.5
2
3
4
Ca2++ kalmodulin
60
5
%
40
Ca2+ + kalmodulin
Ca2+
20
PMCA4b Ido (perc):
125kDa 0
0.5
1
1.5
2
3
4
0
5
0
1
2
3
4
5
perc
15. ábra PMCA4b degradációja kalpainnal PMCA4b-vel
transzfektált
COS-7
sejtekbol
preparált
mikroszómális
membránt különbözo ideig emésztettünk kalpainnal Ca2+ jelenlétében (Ca 2+) és Ca 2+-kalmodulin komplex jelenlétében (Ca 2+ + kalmodulin). A, A mintákat 5F10 ellenanyaggal festettük meg. B, A 125 kDa-os fragment mennyiségét Bio-Rad Molecular Imager System segítségével értékeltük ki. A 125 kDa-os fragment képzodését Ca2+-kalmodulin komplex (kör) és Ca 2+ (háromszög) jelenlétében az ido függvényében ábrázoltuk. A feltüntetett adatok három független kísérlet alapján számolt átlagok ± S.E.
Összefoglalva tehát, a PMCA4b C-terminális régióban bekövetkezo fragmentációja nagy mértékben függ a fehérje konformációs állapotától. Ca 2+kalmodulin komplex hiányában a C-terminális régió és a katalitikus centrum kölcsönhatása feltehetoen szoros. Ebben az esetben a katalitikus centrum konformációja (E2? E1) befolyásolja a C-terminális régió fragmentációját. Ca 2+ hiányában (EGTA jelenlétében), amikor az E2 -E1 konformációs egyensúly az E2 állapot felé van eltolva, a Ca 2+ATPáz védett a proteázokkal szemben. Ca 2+ jelenlétében, E1 konformáció mellett a hasítási helyek hozzáférhetobbé válnak, a pumpa részlegesen fragmentálódik. Ca 2+-kalmodulin jelenlétében pedig, amikor az intramolekuláris kölcsönhatások gyengék, a hasítási helyek sokkal elérhetobbek mindhárom proteáz számára, így a PMCA4b intenzíven degradálódik.
44
7.2 A kalmodulin-köto szekvenciában található Trp1093 mutációjának hatása a PMCA4b intramolekuláris kölcsönhatásaira A PMCA4b izoforma kalmodulin-köto szekvenciájában található triptofánról (Trp1093 ) kimutatták, hogy mind az enzim belso gátlásában, mind a kalmodulin kötésében kitüntetett szerepet játszik (40). Penheiter és mtsai vizsgálták annak a mutánsnak a kinetikai jellemzoit, amelyben ezt a triptofánt alaninra cserélték (Trp1093 ? Ala mutáns) (78). Kimutatták, hogy a mutáció hatására megemelkedik a Ca2+ATPáz kalmodulin nélkül mért alapaktivitása, ami arra utal, hogy a Trp1093 ? Ala mutáns nyitottabb szerkezettel rendelkezik, mint a vad típusú PMCA4b fehérje. Célunk az volt, hogy a mutáció következtében megváltozott intramolekuláris kölcsönhatást a Cterminális régióban – a Trp1093 környezetében – hasító proteázok segítségével is megvizsgáljuk. Limitált proteolízissel a kalmodulin-köto szekvenciától mind C-terminálisan (kalpain, kimotripszin), mind N-terminálisan (kaszpáz-3) vizsgáltuk, hogy a Trp1093 mutációja befolyásolja-e a megfelelo hasítási helyek környezetének szerkezetét. Trp1093? Ala
PMCA4b Ca2+
Ca2+ + kalmodulin
Ca2+
125 kDa 124 kDa
Ca2+ + kalmodulin
125 kDa 124 kDa
16. ábra A hPMCA4b és a Trp1093? Ala mutáns fragmentációja kalpainnal PMCA4b-vel és a Trp1093 ? Ala mutánssal transzfektált COS-7 sejtekbol izolált mikroszómális membránt kalpainnal emésztettük Ca2+ és Ca2+kalmodulin jelenlétében. A mintákat 5F10 ellenanyaggal festettük meg.
A kalpainos degradációt Ca2+-kalmodulin jelenlétében illetve hiányában tanulmányoztuk. Ca2+-kalmodulin komplex hiányában a Trp1093 ? Ala mutáns valamivel nagyobb mértékben degradálódott, mint a vad típusú PMCA4b, és igen látványos eltérés volt megfigyelheto a fragmentáció mintázatában. Az 16. ábra a vad típus és a mutáns fehérje 3 perces kalpainos emésztésének eredményét mutatja. A PMCA4b esetében a 45
125 kDa-os fragment képzodik nagyobb mennyiségben. Ezzel szemben a Trp1093 ? Ala mutáns esetében a 124 kDa-os fragment dominál, ami azt mutatja, hogy ez a hasítási hely jobban hozzáférheto a mutáns fehérjében. Ha a 125 és a 124 kDa-os fragmentek alakulását az ido függvényében ábrázoljuk (17. ábra), látható, hogy a vad típusú PMCA4b kalmodulin hozzáadása nélkül kapott kalpainos emésztése során csak kis mennyiségben keletkezik a 124 kDa-os fragment (~10%-a a kiindulási Ca2+ATPáz mennyiségének). A 125 kDa-os fragment képzodése ennél valamivel nagyobb mértéku (~20%). A Trp1093 mutációja kb. háromszorosára növeli az adott ido alatt keletkezett 124 kDa-os fragment mennyiségét, de nem befolyásolja – vagy kissé csökkenti – a 125 kDa-os fragment képzodését. Trp1093? Ala
PMCA4b
40
40
124 kDa
%
%
125 kDa 20
20
125 kDa
124 kDa 0
0 0
1
2
3
4
5
0
perc
1
2
3
4
5
perc
17. ábra A 125 és a 124 kDa-os kalpainos fragmentek képzodése az ido függvényében a vad típusú PMCA4b és a Trp1093? Ala mutáns esetében PMCA4b-vel és a Trp1093 ? Ala mutánssal transzfektált COS-7 sejtekbol izolált
mikroszómális
membránt
emésztettünk
kalpainnal
Ca2+
jelenlétében. A, A vad típusú PMCA4b illetve B, a Trp1093? Ala mutáns emésztése során képzodött 125 kDa-os (háromszög) és a 124 kDa-os fragment
(négyzet)
mennyiségét
Bio-Rad
Molecular
Imager
System
segítségével értékeltük ki. A feltüntetett adatok három független kísérlet alapján számolt átlagok ± S.E.
A Trp1093 ? Ala mutáns kimotripszines fragmentációját Ca2+ hiányában, Ca2+ illetve Ca2+-kalmodulin komplex jelenlétében is tanulmányoztuk. Kalmodulin hiányában – a kalpainhoz hasonlóan – lényeges különbséget tapasztaltunk a vad típusú és a mutáns fehérje fragmentációjának mintázatában (18. ábra). A Trp1093 ? Ala mutáns kimotripszinnel történo emésztése során új fragment megjelenését detektáltuk, azaz a
46
mutáció olyan hasítási helyet hozott a fehérje felszínére, amely egyébként elérhetetlen a proteáz számára. Az új fragment elektroforetikus migráció alapján számolt molekulatömege ~123 kDa, valamivel kisebb mint a ct92 mutánsé. Valószínu, hogy a kimotripszin a kalmodulin-köto szekvencia N-terminális felében található fenilalanin (Phe1094 ) után hasítja a mutáns fehérjét. Amint a 18. ábrán látható a Ca2+-kalmodulin komplex kötodése megvédi ezt a hasítási helyet kimotripszinnel szemben igazolva, hogy az új hasítási hely a kalmodulin-köto szekvencián belül helyezkedik el. A vad típusra jellemzo 124,5 kDa-os fragment keletkezését a Trp1093 mutációja nem befolyásolta jelentosen. Trp1093? Ala
PMCA4b EGTA
Ca2+
Ca2+ + kalmodulin
EGTA
Ca2+
Ca2+ + kalmodulin
124.5 kDa 123 kDa
18. ábra A hPMCA4b és a Trp1093? Ala mutáns fragmentációja kimotripszinnel PMCA4b-vel és a Trp1093 ? Ala mutánssal transzfektált COS-7 sejtekbol izolált mikroszómális membránt kimotripszinnel emésztettük Ca2+ és Ca2+kalmodulin jelenlétében, valamint Ca2+ hiányában (EGTA). A mintákat 5F10 ellenanyaggal festettük.
A kalpainos és a kimotripszines kísérletekbol nyert eredmények azt bizonyítják, hogy a Trp1093 mutációja nem befolyásolja a kalmodulin-köto szekvenciától C-terminális irányba eso hasítási helyek hozzáférhetoségét, de jobban elérhetové teszi a kalmodulinköto szekvencián belül található hasítási helyeket. A Trp1093 ? Ala mutáns kaszpáz-3-mal történo fragmentációjának vizsgálata során nem találtunk szignifikáns eltérést a vad típusú és a mutáns fehérje degradációja között, ami azt bizonyítja, hogy a Trp1093 mutációja nem befolyásolja a kaszpáz-3 hasítási hely hozzáférhetoségét. Összefoglalva, a triptofán? alanin csere tehát csak a mutáns aminosav közvetlen környezetében növeli meg a hasítási helyek hozzáférhetoségét; a mutációtól akár C-terminális, akár N-terminális irányba eso, távolabbi hasítási helyek nem váltak elérhetobbé a proteázok számára (19. ábra).
47
Trp 1093? Ala
kalmodulin-köto szekvencia
TM10-..LDEIDHAEME LRRGQ I LA 1093FRGLNRIQTQIKVVKAFHSS LHESIQKPYNQKSIHSFMTHPEF..-COOH
Kaszpáz-3 (120 kDa)
Kimotripszin (123 kDa)
Kalpain (124 kDa)
Kimotripszin (124,5 kDa)
Kalpain (125 kDa)
19. ábra Hasítási helyek a Trp1093? Ala mutáns C-terminális régiójában A mutáns fehérje kalmodulin-köto régiójában található triptofánt alanin (A1093) helyettesíti. Fekete nyilak jelzik azokat a hasítási helyeket, amelyek jobban hozzáférhetoek a Trp1093 ? Ala mutánsban, mint a vad típusú PMCA4b fehérjében. A szürke nyilak azokat a hasítási helyeket jelölik, amelyek a Trp1093 mutáció hatására nem elérhetobbek a proteázok számára.
7.3 Az autoinhibítor régiótól N-terminálisan található aszparaginsav (Asp1080) szerepe a hPMCA4b izoforma belso gátlásában Inaktív állapotban a PMCA4b izoforma aktivitásának gátlásáért a kalmodulinköto szekvencia és a másodlagos autoinhibítor régió felelosek. Amennyiben a kalmodulin-köto szekvencia N-terminális irányba eso végétol (Leu1086 ) eltávolítjuk a Cterminális régiót, az enzim maximálisan aktív, és aktivitása kalmodulin hozzáadásával sem fokozható (38). Az a polipeptidlánc, amely a 10. transzmembrán hélixet a Leu1086tól kezdodo kalmodulin-köto szekvenciával köti össze, nem tartozik sem a katalitikus centrumhoz, sem az autoinhibítor régióhoz. Ebben az összeköto vagy „csukló” régióban – a kalmodulin-köto szekvencia N-terminálisához nagyon közel – található a kaszpáz-3 hasítási hely (Asp1080 ) (77). A 6.1. fejezetben leírtuk, hogy a kaszpáz-3 proteázzal vizsgált „csukló” régió fragmentációja jelentosen függ az enzim konformációjától, azaz az intramolekuláris kölcsönhatás erosségétol. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a „csukló” szerepet játszhat az enzim inaktív (zárt) szerkezetének kialakításában. Ezért vizsgáltuk, milyen hatással van a kaszpáz-3 hasítási hely mutációja a pumpa aktivitására. Vizsgálatainkhoz olyan mutánsokat készítettünk, ahol az 1080. aszparaginsavat alaninra (Asp1080 ? Ala), lizinre (Asp1080? Lys) illetve aszparaginra (Asp1080 ? Asn) cseréltük. Ezután mértük a 48
mutáns cDNS-ekkel transzfektált COS-7 sejtekbol készített membránvezikulák Ca2+felvételét telítési Ca2+-koncentrációnál kalmodulin jelenlétében illetve hiányában. A 20. ábra mutatja, hogy minden Asp1080 mutáns kalmodulin hiányában mért alapaktivitása magasabb mint a vad típusú pumpáé. Az Asp1080 ? Ala és az Asp1080 ? Lys mutánsok kalmodulin nélkül is majdnem teljesen aktívak, aktivitásukat a kalmodulin csak kis mértékben fokozza. Jelentosebb aktiválódást csak az Asp1080 ? Asn mutáns esetében tapasztaltunk. Megvizsgáltuk a PMCA4b kaszpáz-3 konszenzus szekvenciáját alkotó másik aszparaginsav (Asp1077 ) szerepét is a belso gátlásban. Az 1080. aszparaginsavval ellentétben azonban az 1077. aszparaginsav mutációja (Asp1077 ? Ala) nem okozott jelentos változást az enzim alapaktivitásában, ami arra utal hogy az Asp1080 mutáció
maximális aktivitás %-a
hatása specifikus. 100 80 60 40 20 0
vt
D1077A DN
DA
DK
20. ábra Az Asp1080 mutációja megemeli a PMCA alapaktivitását A vad típusú PMCA4b (vt) és az Asp1080 és Asp1077 mutánsok (Asp1080? Ala (DA),
Asp1080 ? Lys
(DK),
Asp1080 ? Asn
(DN),
Asp1077 ? Ala
(D1077A)
kalmodulin hiányában mért alapaktivititását a kalmodulin jelenlétében mért maximális aktivitás %-ában ábrázoltuk. A feltüntetett adatok három független kísérlet alapján számolt átlagok ± S.E.
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy a 10. transzmembrán hélixet és a kalmodulinköto szekvenciát összeköto régió fontos szerepet tölt be az enzim belso gátlásában, és hogy az Asp1080
meghatározó aminosav a pumpa inaktív konformációjának
kialakításában. Mivel az Asp1080 mutációja megvédi a fehérjét a kaszpáz-3 enzimmel szemben, proteolízis segítségével csak a kalpainos illetve a kimotripszines hasítási hely szerkezetében bekövetkezo változásokat tanulmányozhattuk. A vad típusú enzim és az Asp1080 ? Ala mutáns kalpainos illetve kimotripszines fragmentációjában azonban nem
49
tapasztaltunk szignifikáns eltérést, ami azt bizonyítja, hogy a mutáció hatása lokális, és nem terjed ki a C-terminális irányba eso távolabbi régiókra. Ezt követoen mértük a mutánsok aktivitását a Ca2+-koncentráció függvényében (21. ábra). Látható, hogy kalmodulin jelenlétében a különbözo fehérjékhez tartozó görbék közel azonosak. Ez azt bizonyítja, hogy az Asp1080 mutációja nincs hatással a kalmodulinnal aktivált enzim karakterisztikájára. Kalmodulin hiányában azonban minden mutáns nagyobb maximális sebességgel, és nagyobb Ca2+ iránti affinitással rendelkezett, mint a vad típusú enzim. B,
+ kalmodulin vt, DA, DK, DN 100 75 50
vt -kalmodulin
25 0 -7
-6
maximális aktivitás %-a
maximális aktivitás %-a
A,
- kalmodulin vt + kalmodulin 100 DA, DK
75 50
DN
25
vt
0
-5
-7
-6
log Ca2+
-5
log Ca 2+
21. ábra A vad típusú PMCA4b (vt) és az Asp1080 mutánsok Ca 2+ transzport aktivitása a Ca 2+-koncentráció függvényében A transzport aktivitást A, kalmodulin jelenlétében és B, hiányában különbözo Ca2+-koncentrációknál mértük. A mért értékeket az adott fehérje maximális segítségével
aktivitásának szigmoid
%-ában
görbét
ábrázoltuk,
illesztettünk
és
rá.
GraphPad Mindkét
software
grafikonon
feltüntettük a PMCA4b kalmodulin hiányában (teli négyzet) és jelenlétében (teli kör) mért adatait. Az Asp1080 ? Ala (DA) mutánst üres kör, az Asp1080 ? Lys mutánst (DK) teli rombusz, az Asp1080 ? Asn mutánst (DN) pedig teli háromszög jelöli. A feltüntetett adatok három független kísérlet alapján számolt átlagok ± S.E.
Vizsgáltuk az Asp1080 mutációjának az enzim kalmodulin iránti affinitására kifejtett hatását úgy, hogy egyensúlyi viszonyok között mértük a mutánsok Ca2+ transzport aktivitását a kalmodulin-koncentráció függvényében. Míg az Asp1080 mutánsok kalmodulin iránti affinitása nagyobb a vad típusú pumpáénál, addig az Asp1077 mutánsé nem tér el attól szignifikánsan (22. ábra). A három Asp1080 mutáns közül 50
azoknak volt nagyobb a kalmodulin iránti affinitása (1.táblázat), amelyek alap-aktivitása nagyobb mértékben emelkedett meg (Asp1080 ? Ala és Asp1080 ? Lys mutáns).
1,0
DA
v-v0/v max-v0
DK
DN vt, D1077A
0,5
0,0
0
50
100
150
200 400 600
kalmodulin (nM)
22. ábra A vad típusú PMCA4b, valamint az Asp1080 és az Asp1077 mutánsok Ca 2+ transzport aktivitása a kalmodulin-koncentráció függvényében A Ca2+ transzport aktivitást egyensúlyi viszonyok között alacsony Ca2+koncentráció (0,3 ? M) mellett vizsgáltuk. Erre azért volt szükség, mert ilyen körülmények
között
a
kalmodulin
hatására
bekövetkezo
stimuláció
mértéke nagyobb mint telítési Ca2+-koncentrációnál. A stimuláció mértékét az F=v-v0 /vmax-v0 egyenlet alapján számoltuk (v0 =kalmodulin hiányában, vmax=telítési
kalmodulin-koncentrációnál,
v=adott
kalmodulin-
koncentrációnál mért transzport aktivitás), és az így kapott értékeket a kalmodulin-koncentráció függvényében ábrázoltuk. Az adatokra GraphPad Prism software segítségével hiperbola görbét illesztettünk. A vad típusú PMCA4b-t (vt) teli négyzet, az Asp1080 ? Ala (DA) mutánst teli rombusz, az Asp1080 ? Lys mutánst (DK) üres kör, az Asp1080 ? Asn mutánst (DN) teli háromszög, az Asp1077 ? Ala mutánst (D1077A) pedig üres háromszög jelöli. A feltüntetett adatok három független kísérlet alapján számolt átlagok ± S.E.
K0,5 (nM) Vad típus (vt) 63 ? 13 1077 1077 Asp ? Ala (D A) 60 ? 12 Asp1080? Asn (DN) 35 ? 6 1080 Asp ? Ala (DA) 14 ? 2 1080 Asp ? Lys (DK) 17 ? 3 1.táblázat A PMCA4b, valamint az Asp1080 és az Asp1077 mutánsok kalmodulin iránti affinitása 51
A kalmodulin iránti affinitás növekedésének hátterében vagy a kalmodulinnal történo aktiválódás sebességének növekedése, vagy az inaktiválódás sebességének csökkenése állhat. A PMCA4b izoforma aktiválódásának sebessége igen lassú (t1/2,akt = 40-60 s, 235 nM kalmodulin és 500 nM szabad Ca2+-koncentráció mellett ), és a pumpa inaktiválódása még lassabban következik be (t1/2,inakt ? 20 perc) (20). A vad típusú pumpán
végzett
vizsgálatoknak
megfeleloen
megmértük
az
Asp1080 ? Ala és
Asp1080 ? Asn mutánsok aktiválódásának sebességét. 500 nM szabad Ca2+-koncentráció mellett kalmodulin hiányában engedtük, hogy a pumpa ATPáz aktivitása stacionárius állapotot érjen el, majd 235 nM kalmodulin hozzáadása után idoben követtük az aktivá lódást. A mért adatokból sebességi állandókat számoltunk (2. táblázat). Az aktiválódási sebességi állandó (kakt ) értéke az Asp1080 ? Asn és Asp1080 ? Ala mutáns esetében 2-3-szor nagyobb volt, mint a vad típusú Ca2+ATPáz esetében. A megemelkedett aktiválódási sebesség már önmagában megmagyarázza a mutáció hatására 2-4-szeresére növekedett kalmodulin iránti affinitást, ezért a mutáns és a vad típusú fehérjék inaktiválódásának sebességében nem vártunk számottevo különbséget. Összehasonlítottuk az Asp1080 ? Asn mutáns és a vad típusú kalcium pumpa inaktiválódásának sebességét. Megvártuk, amíg 500 nM Ca2+ és 235 nM kalmodulin jelenlétében a PMCA4b enzim és a mutáns fehérje ATPáz aktivitása konstans értéket ér el, majd a miozin könnyulánc-kináz kalmodulin-köto szekvenciáját reprezentáló szintetikus peptidet adtunk a reakcióközeghez nagy mennyiségben. A miozin könnyulánc-kináz peptid nem kötodik a Ca2+ATPáz katalitikus centrumához, de megköti a PMCA-ról disszociáló kalmodulin molekulákat. A mérésekbol nyert inaktiválódási sebességi állandókat a 2. táblázatban foglaltuk össze. vad típus Asp1080? Asn Asp1080? Ala
k akt(s -1,M -1 )? S.E. 0,58 ? 105 ? 0,09 ? 105 1,28 ? 105 ? 0,14 ? 105 1,85 ? 105 ? 0,12 ? 105
k inakt(s -1 )? S.E. 0,84 ? 10-3 ? 0,13 ? 10-3 0,58 ? 10-3 ? 0,19 ? 10-3 Nincs adat ?
Kd (nM) 14,5 7,9 4,6
2. táblázat A PMCA4b és az Asp1080 mutánsok kinetikai adatai ? Asp1080 ? Ala mutáns esetében az inaktiválódási sebességi állandót nem határoztuk meg. Helyette a vad típusú PMCA4b pumpa adatát használtuk fel a Kd érték kiszámolásához.
Azért csak az Asp1080 ? Asn mutáns inaktiválódását mértük, mert ez a mutáns aktiválódik legnagyobb mértékben (2,5-szer), és így ebben az esetben tudtuk meghatározni legnagyobb pontossággal az inaktiválódási sebességi állandót (kinakt). A 52
vártnak megfeleloen az Asp1080 mutációja nem befolyásolta a kinakt értékét, a mutáns fehérje és a vad típusú enzim sebességi állandói közel azonosak voltak. A kakt és a kinakt ismeretében kiszámoltuk a mutánsok és a vad típusú fehérje disszociációs konstansait (K d). A mutánsok esetében a Kd értékek 2-3-szor kisebbek voltak, mint a vad típusú PMCA4b esetében, amelyek jól egyeznek az egyensúlyi kísérletek eredményeivel.
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az autoinhibítor régión kívül, a 10. transzmembrán hélixet és a kalmodulin-köto szekvenciát összeköto régióban egyetlen aszparaginsav (Asp1080 ) mutációja megemeli az enzim kalmodulin nélküli alapaktivitását. A Ca 2+-kalmodulin komplex kötodése még tovább képes növelni a pumpa aktivitását, de sokkal kisebb mértékben, mint a vad típusú enzim esetében. Ezenkívül a vad típusú enzimhez viszonyítva nagyobb az Asp1080 mutánsok kalmodulin iránti affinitása, aminek hátterében az áll, hogy a mutáns enzimek nagyobb sebességgel aktiválódnak. Ezeknek a változásoknak valószínuleg az az oka, hogy a mutáció következtében a Ca 2+ATPáz nyitottabb szerkezetet vesz fel (? nagyobb alapaktivitás), gyengébb a C-terminális régió és a katalitikus centrum kölcsönhatása, és így a Ca 2+-kalmodulin komplex számára jobban hozzáférheto a kalmodulin-köto szekvencia (? nagyobb aktiválódási sebesség).
53
8 Megbeszélés, következtetések A PMCA C-terminális régiójában található nagy affinitású kalmodulin-köto szekvencia a pumpa inaktív állapotában a katalitikus centrumhoz kapcsolódik, és gátolja annak aktivitását. Kalmodulin kötodése olyan változásokat idéz elo a fehérje szerkezetében, aminek eredményeképpen az intramolekuláris kölcsönhatás gyengül, és a pumpa aktiválódik. Szorosabb intramolekuláris kapcsolattal rendelkezo izoformára alacsony alapaktivitás és lassú aktiválódás jellemzo. Erre példa a PMCA4b izoforma, amely az izoformák között a legalacsonyabb alapaktivitású és leglassabban aktiválódó variáns. A PMCA4b izoforma belso gátlásáért nagyrészt a kalmodulin-köto szekvencia felelos, de mutációs vizsgálatokkal bizonyították, hogy ettol a szekvenciától Cterminálisan található másodlagos autoinhibítor régió szintén szükséges az alacsony alapaktivitás kialakításához. Kísérleteinkben a hPMCA4b variáns intramolekuláris kölcsönhatásait és a Ca2+-kalmodulin komplex kötodése által kiváltott konformációs változásokat tanulmányoztuk a C-terminális régióban hasító proteázok segítségével. A kalmodulin-köto szekvenciától N-terminálisan az Asp1080 után hasítja a PMCA4b izoformát a kaszpáz-3, amely egy apoptotikus proteáz (77). A hasítás eredményeként az enzim elveszti teljes autoinhibítor régióját, és egy olyan 120 kDa-os N-terminális fragment képzodik, amely kalmodulin hiányában is maximálisan aktív. Kísérleteink azt mutatják, hogy ezen a helyen a hasítás nagy mértékben függ a pumpa konformációs állapotától. Ca2+ hiányában, ami a katalitikus centrum E2 konformációs állapotának kedvez, alig képzodik a 120 kDa-os fragment. Ca2+ jelenlétében, E1 konformációs állapotban a hasítási hely már jobban elérheto a proteáz számára, az enzim részlegesen fragmentálódik. Ca2+-kalmodulin komplex kötodése a kalmodulinköto szekvenciához pedig olyan szerkezeti változásokat idéz elo, aminek hatására az Asp1080 könnyen hozzáférheto lesz a kaszpáz-3 számára, és így a pumpa teljesen degradálódik. Kalpainnal és kimotripszinnel vizsgáltuk a PMCA4b C-terminális régióját a kalmodulin-köto szekvenciától C-terminálisan, a másodlagos autoinhibítor régióban. A Ser1113 és Pro1134 aminosavak közötti peptidszakaszon mindkét proteáznak egy domináns hasítási helye van. A Ca2+ATPáz ebben a régióban is konformáció-függo módon degradálódott, hasonlóan a kaszpáz-3 hasítási helyhez. Ca2+ hiányában alig keletkezett a megfelelo kimotripszines fragment. (A kalpaint ebben az esetben nem tudtuk használni, mert Ca2+-függo enzim.) Ca2+ kötodése a fehérjéhez elérhetobbé tette a kimotripszin hasítási helyét, kalpainnal és kimotripszinnel is részleges fragmentációt 54
figyeltünk meg. A legnagyobb mértéku fragmentképzodést azonban ezeknél a proteázoknál is Ca2+-kalmodulin komplex jelenlétében detektáltuk. A domináns hasítási helyen kívül a kalpain egy másik a kalmodulin- köto szekvenciához közelebb eso helyen is hasítja a pumpát. Ez a hely azonban Ca2+-kalmodulin komplex hiányában kevéssé elérheto a kalpain számára, kalmodulin kötodése pedig teljesen megvédi a proteázzal szemben. Korábbi keresztkötési kísérletek arra utalnak, hogy a PMCA kalmodulin-köto szekvenciája két helyen lép kölcsönhatásba a katalitikus centrummal: az egyik a nagy hurkon, az enzimciklus során foszforilálódó aszparaginsav és az ATP-köto régió között (PMCA4b esetében az 537. és 544. aminosavak között), a másik a kis hurkon (PMCA4b esetében a 206. és 271. aminosavak között) található (41,42). Ezeknek a régióknak a környezete homológ a PMCA és a SERCA fehérjékben, ezért a SERCA kristályszerkezetének ismeretében PMCA homológia modell segítségével következtetni tudunk a kalmodulin-köto szekvenciával kapcsolatba lépo régiók szerkezeti jellegzetességeire. A homológia modell alapján a két kölcsönható hely a citoplazmatikus A- illetve Ndoménen belül található. Az A- és az N-domének a fehérje E1 állapotában jól elkülönülnek egymástól. E2 konformációban azonban lényegesen zártabb struktúrát alkotnak, amelyet többek között az A-N domének határfelülete között kialakult hidrogénhidak is stabilizálnak. A citoplazmatikus domének tehát az E2? E1 állapotváltozás során egymáshoz viszonyítva is jelentos mozgást végeznek. Azáltal, hogy az enzim inaktív állapotában a C-terminális autoinhibítor régió kölcsönhat mindkét doménnel, gátolja ezeket a mozgásokat, így lassítja az enzimciklust. Kísérleteink során a zárt szerkezetu fehérje fragmentációját vizsgáltuk EGTA jelenlétében, amikor a katalitikus centrum konformációja az E2 állapot felé tolódik, illetve Ca2+ jelenlétében, ami az E1 állapotnak kedvez. Eredményeink alátámasztják a homológia modell alapján leírt szerkezeti változásokat. E2 állapotban a katalitikus centrum zárt konformációjú, ehhez valószínuleg szorosan kapcsolódik a C-terminális autoinhibítor régió, és így proteázokkal szemben védetté válik. E1 állapotban a citoplazmatikus domének kicsit távolabb helyezkednek el egymástól, ezért ez a szerkezeti egység nem képes olyan szorosan lefedni a C-terminális régiót, mint E2 formában, így a hasítási helyek elérhetobbek. Ca2+-kalmodulin komplex kötodése a kalmodulin-köto szekvenciához valószínuleg jelentos konformációs változásokat indukál a C-terminális régió és a katalitikus cent rum kapcsolatában, aminek eredményeképpen a proteázok könnyen hozzáférnek a hasítási helyekhez (23. ábra).
55
A,
B,
kaszpáz-3
kalmodulin
kalpain
kimotripszin
kaszpáz-3 kalpain kalpain
kimotripszin
PMCA4b inaktív állapotban
Aktivált PMCA4b
23. ábra A C-terminális régió és a katalitikus centrum kölcsönhatásának sematikus modellje inaktív és aktív PMCA4b enzimben A, Inaktív állapotban a PMCA4b kalmodulin-köto szekvenciája (alfa hélix) a katalitikus centrumhoz (ovális alakzat) kapcsolódik. Az intramolekuláris kölcsönhatást a kalmodulin-köto szekvenciától N- („csukló” régió) és Cterminális (másodlagos autoinhibítor régió) irányba eso régiók stabilizálják (csíkos négyszögek). Gátolt állapotban a kaszpáz-3, a kalpain és a kimotripszin hasítási helyek (szaggatott nyilak) nehezen elérhetoek a proteázok számára. B, A kalmodulint kötött aktív szerkezetu PMCA4b esetében a proteázok könnyen hozzáférnek a hasítási helyekhez (vastag nyilak).
A kalmodulin-köto szekvenciában található Trp1093 mutációjának már vizsgálták a PMCA4b aktivitására kifejtett hatását. Amennyiben a triptofánt alaninra cserélték megemelkedett a pumpa alapaktivitása, az enzim kalmodulinnal gyorsabban aktiválódott, ami mind arra utalt, hogy az intramolekuláris kölcsönhatás a mutáns fehérjében kevésbé szoros (78). Kísérleteinkben limitált proteolízissel kimutattuk, hogy a Trp1093 ? Ala mutáns esetében a kalmodulin-köto szekvencia kapcsolata a katalitikus centrummal gyengébbé válik, és egyébként elérhetetlen hasítási helyek hozzáférhetové válnak a vizsgált protázok számára (24. ábra). Vad típusú PMCA4b esetében a kalpain emésztés során alig képzodik a kisebb molekulatömegu, 124 kDa-os fragment. A Trp1093 ? Ala mutáns esetében azonban ez a fragment lesz domináns. Még látványosabb a különbség a két pumpa kimotripszines proteolízise között. A mutáns fragmentációja során egy olyan új 123 kDa-os fragment jelenik meg, amit a vad típusú PMCA4b degradációja során egyáltalán nem detektálunk. A 123 kDa-os fragmentet eredményezo kimotripszines hasítási hely valószínuleg a kalmodulin-köto szekvencián belül, a Phe1094 után, míg a mutáció hatására elérhetobbé vált kalpainos hasítási hely a kalmodulin-köto szekvencia C-terminálisa közelében található. 56
Ala
B, A, Trp1093
Asp1080
kimotripszin
kalpain
Trp1093 ? Ala mutáns C, Ala
Vad típusú PMCA4b
Asp1080? Ala mutáns
24. ábra A Trp1093 és a Asp1080 aminosav mutációjának hatása a PMCA4b intramolekuláris kölcsönhatására A, A vad típusú PMCA4b esetében inaktív állapotban a kalmodulin-köto szekvencia
(alfa
kapcsolódik.
Az
hélix)
a
katalitikus
intramolekuláris
centrumhoz
kölcsönhatást
a
(ovális
alakzat)
kalmodulin-köto
szekvenciától N- („csukló” régió) és C-terminális (másodlagos autoinhibítor régió) irányba eso régiók stabilizálják (csíkos négyszögek). B, a Trp1093? Ala mutáns modellje. A fehérjét a mutációhoz közel eso helyeken intenzíven hasítja a kalpain és a kimotripszin (nyilak). C, Asp1080 ? Ala mutáns modellje.
Ca2+-kalmodulin komplex jelenlétében egyik fragment sem képzodik, ami szintén bizonyítja, hogy ezek a helyek a kalmodulin-köto szekvencián belül helyezkednek el. A
kalmodulin-köto
szekvenciától
távolabbi
hasítási
helyeken
bekövetkezo
fragmentációt a mutáció nem befolyásolta, ami azt mutatja, hogy az aminosavcsere hatása lokális és specifikus. Bár a mutáció közvetlen környezete lazábban kötodik a katalitikus centrumhoz, ez a hatás nem terjed ki a kalmodulin-köto szekvencián kívülre. Eredményeink megerosítik, hogy a Trp1093 aminosavnak kitüntetett szerepe van kalmodulin-köto szekvencia és a katalitikus centrum kölcsönhatásában.
A 10. transzmembrán hélixet a kalmodulin-köto szekvenciával összeköto peptidszakasz nem tartozik sem a katalitikus centrumhoz, sem az autoinhibítor régióhoz. 57
Ebben a „csukló” régióban található az az aszparaginsav (Asp1080 ), amely mellett a kaszpáz-3 enzim hasítja a PMCA4b izoformát. Megvizsgáltuk, hogy az Asp1080 mutációja milyen hatással van az enzim aktivitására. Három különbözo mutáns (Asp1080 ? Ala,
Asp1080 ? Lys, Asp1080 ? Asn)
kinetikai
analízisét
végeztük
el.
Kalmodulin hiányában minden esetben megemelkedett alapaktivitást mértünk. Abban az esetben növekedett nagyobb mértékben az alapaktivitás, amikor az aszparaginsavat apoláris alanira, vagy bázikus karakteru oldalláncot tartalmazó lizinre cseréltük. Az aszparaginsav – aszparagin
csere
kisebb
hatással
volt
a
pumpa
aktivitására.
Feltételezzük, hogy olyan másodlagos kötések hálózata bomlik meg az aszparaginsav eltávolításával, amelyek a C-terminális régió és a katalitikus centrum kapcsolatát rögzítik. Így, bár ez a régió nem vesz részt közvetlenül a katalitikus centrum gátlásában, az inaktív szerkezet stabilizásával hozzájárul az enzim alacsony alapaktivitásához. Az aszparagin mutáns belso gátlása erosebb, mint a többi mutánsé. Ez arra utal, hogy az aszparaginsav karboxil csoportjának oxigénatomja részt vesz az intramolekuláris kölcsönhatás rögzítésében. Kísérleteink azt mutatták, hogy az Asp1080 mutánsok kalmodulin iránti affinitása is megemelkedett, amelynek hátterében a kalmodulinnal történo aktiválódás sebességének növekedése áll. Az inaktiválódás sebességét nem befolyásolta a mutáció. A kalmodulin iránti affinitás növekedése azokban a mutánsokban volt nagyobb, amelyek alapaktivitása nagyobb mértékben emelkedett (alanin, lizin mutánsok). Valószínu, hogy az Asp1080 mutánsok azért aktiválódnak gyorsabban, mint a vad típusú enzim, mert a kalmodulin-köto szekvencia és a katalitikus centrum kölcsönhatása lazább, és így a kalmodulin könnyebben hozzáfér a kalmodulin-köto szekvenciához. A gyengébb intramolekuláris kölcsönhatás másrészt kevésbé gátolja a katalitikus centrumot, így a mutánsok alapaktivitása magasabb. Úgy tunik emiatt a struktúrális kapcsolat miatt, az enzim alapaktivitása és az aktiválódásának sebessége között összefüggés van. Eddigi vizsgálatok alapján minden olyan mutáns (Trp1093 , Asp1080 , ct92) gyorsabban aktiválódik kalmodulinnal, amelynek az alapaktivitása emelkedett (20,78,3). Lényeges megemlíteni, hogy az Asp1080 mutáció hatása specifikus, hiszen az attól mindössze három aminosavnyira lévo Asp1077 mutációja nem befolyásolta számottevoen a fehérje egyik paraméterét sem. Limitált proteolízissel megvizsgáltuk, hogy ez a szerkezeti változás a C-terminális régió mely részét érinti. Az Asp1080 mutációja megvédi a PMCA4b-t a kaszpáz-3 enzimmel szemben, így ezzel a módszerrel a kalmodulin-köto szekvenciától C-terminálisan nem tanulmányozhattuk konformációs változásokat. Kalpainos és kimotripszines emésztéssel 58
viszont az Asp1080 -tól C-terminális irányba eso, távolabbi régiókban vizsgálhattuk az intramolekuláris
kölcsönhatást.
A
vad
típusú
enzim
és
a
mutáns
fehérje
fragmentációjában nem tapasztaltunk szignifikáns eltérést. Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy az Asp1080 mutációja lokális változást idéz elo a C-terminális régió és a katalitikus centrum struktúrális kapcsolatában (24. ábra).
Amennyiben a fehérje intramolekuláris kölcsönhatásában valamely kapcsolódási helyet megbontunk – pl. a kalmodulin-köto szekvenciában (Trp1093 ), a másodlagos autoinhibítor régióban (ct92 mutáns), vagy a „csukló” régióban (Asp1080 ) –, sérül az enzim intramolekuláris gátlása, a mutánsok alapaktivitása emelkedett, aktiválódásuk gyorsabb. Limitált proteolízissel kimutattuk, hogy a mutációk hatása lokális. Az Asp1080 mutációja nem befolyásolta a kalmodulin- köto szekvencián belül illetve az attól Cterminálisan található hasítási helyek szerkezetét. A Trp1093 ? Ala mutáns esetében pedig csak a Trp1093 közvetlen környezetében található hasítási helyek lettek elérhetobbek a proteázok számára. Ezekkel a lokális hatásokkal szemben a kalmodulin kötodése az egész C-terminális régióban szerkezeti változásokat indukált, mivel az összes vizsgált helyen bekövetkezo hasítás kifejezetebbé vált.
Összefoglalva, a PMCA4b izoforma belso gátlásáért nagyrészt a Cterminális régióban található kalmodulin-köto szekvencia felelos. Az erre az izoformára jellemzo alacsony alapaktivitáshoz azonban szükség van a kalmodulinköto szekvencia mellett C-terminálisan elhelyezkedo másodlagos autoinhibítor régióra és a szekvenciától N-terminálisan található „csukló” régióra is. Ezek a régiók valószínuleg stabilizálják kalmodulin-köto szekvencia és az általa gátolt katalitikus centrum szerkezeti egységét. Kimutattuk, hogy a „csukló” régióban található Asp1080 fontos szerepet játszik az intramolekuláris kölcsönhatás rögzítésében. A kalmodulin-köto szekvenciában található triptofánnak (Trp1093 ) pedig kitüntetett szerepe van kalmodulin-köto szekvencia és a katalitikus centrum kölcsönhatásában.
Limitált
proteolízissel
bizonyítottuk,
hogy
ezeknek
az
aminosavaknak a mutációja lokális változást okoz a C-terminális régió szerkezetében.
Ezzel
szemben
kalmodulin
kötodése
a
kalmodulin-köto
szekvenciához olyan általános szerkezeti változásokat idéz elo, amely mindhárom, a gátlásban szerepet játszó régióra kiterjed. Hasonlóan globális, de az intramolekuláris kölcsönhatás erosségére nézve kisebb mértéku hatása van a katalitikus centrum szerkezeti változásainak az E2 illetve E1 konformációk között. 59
9 Köszönetnyilvánítás
Hálás köszönettel tartozom Dr. Enyedi Ágnesnek, aki munkámat megalapozta, szakmai elorehaladásomot mindvégig irányította és támogatta. Szeretnék köszönetet mondani Dr. Sarkadi Balázsnak, akinek értékes tapasztalatai, hasznos tanácsai nélkülözhetetlen segítséget jelentettek diplomamunkám elkészítésében. Külön köszönettel tartozom Dr. Pászty Katalinnak, aki mindvégig biztatott, és sok nehézségen átsegített. Köszönetet szeretnék mondani Dr. Kovács Tündének és Lór Krisztinának türelmükért és segítokészségükért. Egyben megköszönöm osztályunk valamennyi munkatársának, hogy munkám során segítségemre voltak. Végül szeretném megköszönni családomnak, hogy végig biztattak, segítettek, és türelemmel figyelték a dolgozat elkészülését. Legvégül köszönöm kislányomnak, Rékának, hogy egészen másfél éves koráig kétszer aludt napközben.
60
10 Irodalomjegyzék
1. Adamo,H.P., Verma,A.K., Sanders,M.A., Heim,R.,Salisbury,J.L., Wieben,E.D., Penniston,J.T. (1992): Overexpression of the erythrocyte plasma membrane Ca2+ pump in COS-1 cells. Biochem J., 285, 791-797 2. Adebayo,A.O., Enyedi Á., Verma,A.K., Filoteo,A.G., Penniston,J.T. (1995): Two residues that may ligate Ca2+ in transmembrane domain six of the plasma membrane Ca2+-ATPase. J.Biol.Chem., 270, 27812-27816 3. Ba-Thein,W., Caride,A.J., Enyedi Á., Pászty K., Croy,C.L., Filoteo,A.G., Penniston,J.T. (2001):Chimaeras reveal the role of the catalytic core in the activation of the plasma membrane Ca2+ pump. Biochem.J., 356, 241-245 4. Berridge,M.J. (1993): Inositol trisphosphate and calcium signalling. Nature, 361, 315-325 5. Berridge,M.J. (1995): Capacitative calcium entry. Biochem.J., 312, 1-11 6. Berridge,M.J. (2002): The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle. Cell Calcium, 32, 235-249 7. Berridge,M.J.,
Bootman,M.D.,
Roderick,H.L.
(2003):
Calcium
signalling:
dynamics, homeostasis and remodelling. Nat.Rev.Mol.Cell.Biol., 4, 517-529 8. Berridge,M.J., Lipp,P., Bootman,M.D. (2000): The versatility and universality of calcium signalling, Nat rev.mol.cell bio., 1, 11-21 9. Bian,J., Ghosh,T.K., Wa ng,J.C., Gill,D.L. (1991): Identification of intracellular calcium pools. J.Biol.Chem., 266, 8801-8806 10. Blaustein,M.P., Lederer,W.J. (1999): Sodium/calcium exchange:its physiological implications. Physiol.Rev., 79,763-854 11. Bootman,M.D., Lipp,P. (1999): Calcium signalling: Ringing changes to the ‘bellshaped curve’. Curr.Biol. 9,876-878 12. Boulay,G., Brown,D.M., Qin,N., Jiang,M., Dietrich,A., Zhu,M.X., Chen,Z., Birnbaumer,M., Mikoshiba,K., Birnbaumer,L. (1999): Modulation of Ca2+ entry by polypeptides of the inositol 1,4, 5-trisphosphate receptor (IP3 R) that bind transient receptor potential (TRP): evidence for roles of TRP and IP3 R in store depletionactivated Ca2+ entry. Proc.Natl.Acad.Sci., 96, 14955-14960 13. Brodin,P., Falchetto,R., Vorherr,T., Carafoli,E. (1992): Identification of two domains which mediate the binding of activating phospholipids to the plasma membrane Ca2+ pump. Eur.J.Biochem., 204, 939-946
61
14. Brushia,R.J., Walsh,D.A. (1999): Phosphorylase kinase: the complexity of its regulation is reflected in the complexity of its structure. Front.Biosci., 4, 618-641. 15. Burnashev,N. (1998): Calcium permeability of ligand-gated channels. Cell Calcium, 24, 325-332. 16. Cancela,J.M., Peterson,O.H. (1998):The cyclic ADP ribose antagonist 8-NH2cADP-ribose blocks cholecystokinin-evokedcytosolic Ca2+ spiking in pancreatic acinar cells. Pfluger’s Arch., 435, 746-748 17. Carafoli,E. (1994): Biogenesis: Plasma membrane calcium ATPase: 15 years of work on the purified enzyme. FASEB J., 8, 993-1002 18. Carafoli,E., Molinari,M. (1998): Calpain: A protease in search of function? Biochem Biophys Res Commun, 247, 193-203 19. Carafoli,E.: The calcium-signalling saga: tap water and protein crystals. Nat.Rev.Mol.Cell.Biol., 4, 326-332 20. Caride,A.J.,
Elwess,N.L.,
Verma,A.K.,
Filoteo,A.G.,
Enyedi
Á.,
Bajzer,Z.,
Penniston,J.T. (1999): The rate of activation by calmodulin of isoform 4 of the plasma membrane Ca2+ pump is slow and is changed by alternative splicing. J.Biol.Chem., 274, 35227-35232 21. Caride,A.J., Filoteo,A.G., Penheiter,A.R., Pászty K., Enyedi Á., Penniston,J.T. (2001): Delayed activation of the plasma membrane calcium pump by a sudden increase in Ca2+: fast pumps reside in fast cells. Cell calcium, 30, 49-57 22. Caride,A.J., Penheiter,A.R., Filoteo,A.G., Bajzer,Z., Enyedi Á., Penniston,J.T. (2001): The plasma membrane calcium pump displays memory of past calcium spikes. J.Biol.Chem., 276, 39797-39804 23. Chapman,E.R. (2002): Synaptotagmin: a Ca2+ sensor that triggers exocytosis? Nat.Rev.Mol.Cell.Biol., 3, 498-508 24. Chicka,M.C., Strehler E.E. (2003): Alternative splicing of the first intracellular loop of plasma membrane Ca2+.ATPase isoform 2 alters its membrane targeting. J.Biol.Chem., 278, 18464-18470 25. Clapham,D.E. (1995): Calcium signalling. Cell, 80, 259-268 26. Csordás G., Thomas,A.P., Hajnóczky G. (1999): Quasi-synaptic calcium signal transmission between endoplasmic reticulum and mitochondria. EMBO J., 18, 96108 27. Dean,W.L., Chen,D., Brandt,P.C., Vanaman,T.C. (1997): Regulation of platelet plasma membrane Ca2+-ATPase by cAMP-dependent and tyrosine phosphorylation. J.Biol.Chem., 272, 15113-15119 62
28. DeMarco,S.J., Chicka,M.C., Strehler E.E. (2002): Plasma membrane Ca2+ ATPase isoform 2b interacts preferentially with Na+/H+ exchanger regulatory factor 2. J.Biol.Chem., 277, 10506-10511 29. DeMarco,S.J., Strehler,E.E. (2001): Plasma membrane Ca2+-ATPase isoforms 2b and
4b
interact
promiscuously
and
selectively
with
members
of
the
membrane.associated guanylate kinase family of PDZ (PSD95/Dlg/ZO-1) domaincontaining proteins. J.Biol.Chem., 276, 21594-21600 30. Dixon,D.A., Haynes,D.H. (1989): Kinetic characterization of the Ca2+-pumping ATPase of cardiac sarcolemma in four states of activation. J.Biol.Chem., 264, 13612-13622 31. Duchen,M.R. (1999): Contributions of mitochondria to animal physiology: from homeostatic sensor to calcium signalling and cell death. J.Physiol., 516, 1-17 32. Elwess,N.L., Filoteo,A.G., Enyedi Á., Penniston,J.T. (1997): Plasma membrane Ca2+ pump isoforms 2a and 2b are unusually responsive to calmodulin and Ca2+. J.Biol.Chem., 272, 17981-17986 33. Enyedi Á., Elwess,N.L., Filoteo,A.G., Verma,A.K., Pászty K., Penniston,J.T. (1997): Protein kinase C phosphorylates the “a” forms of plasma membrane calcium pump isoforms 2 and 3 and prevents binding of calmodulin. J.Biol.Chem., 272, 2752527528 34. Enyedi Á., Filoteo,A.G., Gárdos G., Penniston,J.T. (1991): Calmodulin-binding domains from isozymes of the plasma membrane Ca2+ pump have different regulatory properties. J.Biol.Chem., 266, 8952-8956 35. Enyedi Á., Flura,M., Sarkadi B., Gárdos G. and Carafoli,E. (1987): The maximal velocity and the calcium affinity of the red cell calcium pump may be regulated independently. J.Biol.Chem., 262, 6425-6430 36. Enyedi Á., Penniston,J.T. (1993): Autoinhibitory domains of various Ca2+ transporters cross-react. J.Biol.Chem., 268, 17120-17125 37. Enyedi Á., Sarkadi B., Földes-Papp Z., Monostory S., Gárdos G. (1986): Demonstration of two distinct calcium pumps in human platelet membrane vesicles. J.Biol.Chem., 261, 9558-9563 38. Enyedi Á., Verma,A.K., Filoteo,A.G., Penniston,J.T. (1993): A highly active 120 kDa truncated mutant of the plasma membrane Ca2+ pump. J.Biol.Chem., 268, 10621-10626 39. Enyedi Á., Verma,A.K., Filoteo,A.G., Penniston,J.T. (1996): Protein kinase C activates the plasma membrane Ca2+ isoform 4b by phosphorylation of an inhibitory 63
region downstream of the calmodulin-binding domain. J.Biol.Chem., 271, 3246132467 40. Enyedi Á., Vorherr,T., James,P., McCormick,D.J., Filoteo,A.G., Carafoli,E., Penniston,J.T. (1989): The calmodulin binding domain of the plasma membrane Ca2+ pump interacts both with calmodulin and with another part of the pump. J.Biol.Chem., 264, 12313-12321 41. Falchetto,R., Vorherr,T., Brunner,J., Carafoli,E. (1991): The plasma membrane Ca2+ pump contains a site that interacts with its calmodulin-binding domain. J.Biol.Chem., 266, 2930-2936 42. Falchetto,R., Vorherr,T., Carafoli,E. (1992): The calmodulin-binding site of the plasma membrane Ca2+ pump interacts with the transduction domain of the enzyme. Protein Sci., 12, 1613-1621 43. Farah,C.S., Reinach,F.C. (1995): The troponin complex and regulation of muscle contraction. FASEB J., 9, 755-767. 44. Ferris CD, Huganir RL, Supattapone S, Snyder SH (1989): Purified inositol 1,4,5trisphosphate receptor mediates calcium flux in reconstituted lipid vesicles. Nature, 342, 87-89 45. Filoteo,A.G., Enyedi Á., Verma,A.K., Elwess,N.L., Penniston,J.T. (2000): Plasma membrane Ca2+ pump isoform 3f is weakly stimulated by calmodulin. J.Biol.Chem., 275, 4323-4328 46. Gerke,V., Moss,S.E. (2002): Annexins: from structure to function. Physiol.Rev., 82, 331-371 47. Goldberg,J., Nairn,A.C., Kuriyan,J. (1996): Structural basis for the autoinhibition of calcium/calmodulin-dependent protein kinase I., Cell, 84, 875-887 48. Green,N.M., MacLennan,D.H. (2002): Calcium callisthenics. Nature, 418, 598-599 49. Guerini,D., Foletti,D., Vellani,F., Carafoli,E. (1996): Mutation of conserved residues in transmembrane domains 4, 6 and 8 causes loss of Ca2+ transport by the plasma membrane Ca2+ pump. Biochemistry, 35, 3290-3296 50. Guerini,D., Zecca-Mazza,A., Carafoli,E. (2000): Single amino acid mutations in transmembrane domain 5 confer to the plasma membrane Ca2+ pump properties typical of the Ca2+ pump of endo(sarco)plasmic reticulum. J.Biol.Chem., 275, 31361-31368 51. Hao,L., Rigaud,J-L., Inesi,G. (1994): Ca2+/H+ countertransport and electrogenicity in proteoliposomes containing erythrocyte plasma membrane Ca-ATPase and exogenous lipids. J.Biol.Chem., 269, 14268-14275 64
52. Hasselbach,W., Wass,W. (1982): Energy coupling in sarcoplasmic reticulum Ca2+ transport. An overview. Ann.NY.Acad.Sci., 402, 459-469 53. James,P., Inui,M., Tada,M., Chiesi,M., Carafoli,E. (1989): Nature and site of phospholamban regulation of the Ca2+ pump of sarcoplasmic reticulum. Nature, 342, 90-92 54. James,P., Maeda,M., Fischer,R., Verma,A.K., Krebs,J., Penniston,J.T., Carafoli,E. (1988): Identification and primary structure of a calmodulin-binding domain of the Ca2+ pump of human erythrocytes. J.Biol.Chem., 263, 2905-2910 55. James,P., Pruschy,M., Vorherr,T., Penniston,J.T., Carafoli,E. (1989): Primary structure of the cAMP-dependent phosphorylation site of the plasma membrane calcium pump. Biochemistry, 28, 4253-4258 56. James,P.,
Vorherr,T.,
Krebs,J.,
Morelli,A.,
Castello,G.,
McCormick,D.J.,
Penniston,J.T., DeFlora,A., Carafoli,E. (1989): Modulation of erythrocyte Ca2+ATPase by selective calpain cleavage of the calmodulin-binding domain. J.Biol.Chem., 264, 8289-8296 57. Kakkar,R., Raju,R.V., Sharma,R.K. (1999): Calmodulin-dependent cyclic nucleotide phosphodiesterase (PDE1). Cell.Mol.Life.Sci., 55, 1164-1186. 58. Kamm,K.E., Stull,J.T. (2001): Dedicated Myosin Light Chain Kinases with Diverse Cellular Functions. J.Biol.Chem., 276, 4527-4530 59. Katz,S., Blostein,R. (1975): Ca2+-stimulated membrane phosphorylation and ATPase activity of the human erythrocyte. Biochim.Biophys.Acta, 389, 314-324 60. Keeton TP, Burk SE, Shull GE (1993): Alternative splicing of exons encoding the calmodulin binding domains and C-termini of plasma membrane Ca2+-ATPase isoforms 1, 2, 3 and 4. J.Biol.Chem., 268, 2740-2748 61. Kimura,Y., Kurzydlowski,K., Tada,M., MacLennan,D.H. (1996): Phospholamban regulates the Ca2+-ATPase through intramembrane interactions. J.Biol.Chem., 271, 21726-21731 62. Kip,S.N., Strehler,E.E. (2003): Characterization of PMCA isoforms and their contribution to transcellular Ca2+ flux in MDCK cells. Am.J.Physiol.Renal.Physiol., 284, 122-132 63. Kiselyov,K.I., Shin,D.M., Wang,Y., Pessah,I.N., Allen,P.D., Muallem,S. (2000): Gating of store-operated channels by conformational coupling to ryanodine receptors. Mol.Cell., 6, 421-431 64. Klee,C.B., Ren,H., Wang,X. (1998) : Regulation of the Calmodulin-stimulated Protein Phosphatase, Calcineurin. J.Biol.Chem., 273, 13367-13370 65
65. Koh,T.W., Bellen,H.J. (2003): Synaptotagmin I, a Ca2+ sensor for neurotransmitter release. Trends.Neurosci., 26, 413-422 66. Lee,H.C., Aarhus,R., Graeff,R., Gurnack,M.E., Walseth,T.F. (1994): Cyclic ADP ribose activation of the ryanodine receptor is mediated by calmodulin. Nature, 370, 307-309 67. Levy,D., Seigneuret,M., Bluzat,A., Rigaud,J. (1990): Evidence for proton countertransport by sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase during calcium transport in reconstituted proteoliposomes with low ionic permeability. J.Biol.Chem., 265, 19524-19534 68. McFadzean,I., Gibson,A. (2002): The developing relationship between receptoroperated and store-operated calcium channels in smooth muscle. Br.J.Pharmacol., 135, 1-13. 69. Means,A.R., Dedman,J.R. (1980): Calmodulin--an intracellular calcium receptor. Nature, 285, 73-77 70. Michalak,M., Robert Parker,J.M., Opas,M. (2002): Ca2+ signaling and calcium binding chaperones of the endoplasmic reticulum. Cell Calcium, 32, 269-278 71. Moller,J.V., Juul,B., le Maire,M. (1996): Structural organization, ion transport, and energytransduction of ATPases. Biochim.Biophys.Acta, 1286, 1-51. 72. Moreno Davila,H. (1999): Molecular and functional diversity of voltage- gated calcium channels. Ann.NY.Acad.Sci., 868, 102-117. 73. Naito,Y., Watanabe,Y., Yokokura,H., Sugita,R., Nishio,M., Hidaka,H. (1997): Isoform-specific activation and structural diversity of calmodulin kinase I. J.Biol.Chem., 272, 32704-32708. 74. Newton,A.C. (1995): Protein kinase C: structure, function, and regulation. J.Biol.Chem., 270, 28495-8 75. Neyses,L., Reinlib,L., Carafoli,E. (1985): Phosphorylation of tha Ca2+pumping ATPase of heart sarcolemma and erythrocyte plasma membrane by the cAMPdependent protein kinase. J.Biol.Chem., 260, 10283-10287 76. Nishizuka,Y. (1992): Intracellular signalling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase C. Science, 258, 607-614 77. Pászty K., Verma,A.K., Padányi R., Filoteo,A.G., Penniston,J.T., Enyedi Á. (2002): Plasma membrane Ca2+ ATPase isoform 4b is cleaved and activated by caspase-3 during the early phase of apoptosis. J.Biol.Chem., 277, 6822-6829
66
78. Penheiter,A.R., Caride,A.J., Enyedi Á., Penniston,J.T. (2002): Tryptophan 1093 is largely responsible for the slow off rate of calmodulin from plasma membrane Ca2+ pump 4b. J.Biol.Chem., 277, 17728-17732 79. Penniston,J.T. and Enyedi Á (1994): Plasma membrane Ca2+ pump, Recent developments. Cell.Physiol.Biochem., 4, 148-159 80. Penniston,J.T., Enyedi Á. (1998): Modulation of the plasma membrane Ca2+ Pump. J.Membr.Biol., 165, 101-109 81. Petersen,O.H., Fedirko,N.V. (2001): Calcium signalling: store-operated channel found at last. Curr.Biol., 11, 520-523 82. Pin,J.P., Duvoisin,R. (1995): The metabotropic glutamate receptors: structure and functions. Neuropharmacology, 34, 1-26 83. Pozzan,T., Rizzuto,R., Volpe,P., Meldolesi,J. (1994): Molecular and cellular physiology of intracellular calcium stores. Physiol.Rev., 74, 595-636 84. Rizutto,R., Brini,M., Murgia,M., Pozzan,T. (1993): Microdomains with high Ca2+ close to IP3 -sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria. Science, 262, 744-747 85. Sarkadi B., Enyedi Á., Földes-Papp
Z.,
Gárdos
G.
(1986):
Molecular
characterization of the in situ red cell membrane calcium pump by limited proteolysis. J.Biol.Chem., 261, 9552-9557 86. Scharff,O., Foder,B. (1982): Rate constants for calmodulin binding to Ca2+-ATPase in erythrocyte membranes. Biochim.Biophys.Acta, 691, 133-143 87. Schuh,K., Uldrijan,S., Gambaryan,S., Röthlein,N., Neyses,L. (2003): Interaction of the plasma membrane Ca2+ pump 4b/CI with the Ca2+/calmodulin-dependent membrane-associated kinase CASK. J.Biol.Chem., 278, 9778-9783 88. Schuh,K., Uldrijan,S., Telkamp,M., Röthlein,N., Neyses,L. (2001): The plasma membrane calmodulin-dependent calcium pump: regulator of nitric oxide synthase I. J.Cell Biol., 155, 201-205 89. Soderling,T.R.,
Chang,B.,
Brickey,D.
(2001):
Cellular
Signaling
through
Multifunctional Ca2+/Calmodulin-dependent Protein Kinase II. J.Biol.Chem., 276, 3719-3722 90. Sorimachi,H., Ishiura,S., Suzuki,K. (1997): Structure and physiological function of calpains. Biochem.J., 328, 721-732 91. Spät A., Bradford,P.G., McKinney,J.S., Rubin,R.P., Putney,J.W.Jr. (1986): A saturable receptor for 3,2P- inositol-1,4,5-triposphate in hepatocytes and neutrophils. Nature, 319, 514-516 67
92. Stauffer,T.P., Guerini,D., Carafoli,E. (1995): Tissue distribution of the four gene products of the plasma membrane Ca2+ pump. A study using specific antibodies. J.Biol.Chem., 270, 12184-12190 93. Stauffer,T.P., Hilfiker,H., Carafoli,E., Strehler,E.E. (1993): Quantitative analysis of alternative splicing options of human plasma membrane calcium pump genes. J.Biol.Chem., 268, 25993-26003 94. Strehler,E.E., Zacharias,D.A. (2001): Role of alternative splicing in generating isoform diversity among plasma membrane calcium pumps. Physiological reviews, 81, 21-50 95. Strehler,E.E.,James P., Fischer,R., Heim,R., Vorherr T., Filoteo A.G., Penniston J.T., Carafoli E. (1990): Peptide sequence analysis and molecular cloning reveal two calcium pump isoforms in the human erythrocyte membrane. J.Biol.Chem., 265, 2835-2842 96. Sweadner,K.J., Donnet,C. (2001): Structural similarities of Na,K-ATPase and SERCA, the Ca2+-ATPase of the sarcoplasmic reticulum. Biochem. J., 356, 685-704 97. Toyoshima,C., Nakasako, M., Nomura, H., Ogawa, H. (2000): Crystal structure of the calcium pump of sarcoplasmic reticulum at 2.6 Å resolution. Nature, 405, 647655 98. Toyoshima,C., Nomura,H. (2002): Structural changes in the calcium pump accompanying the dissociation of calcium. Nature, 418, 605-610 99. Verma,A.K., Enyedi Á., Filoteo,A.G., Penniston,J.T. (1994): Regulatory region of plasma membrane Ca2+ pump. 28 residues suffice to bind calmodulin but more are needed for full auto- inhibition of the activity. J.Biol.Chem., 269, 1687-1691 100.
Verma,A.K., Enyedi Á., Filoteo,A.G., Strehler,E.E., Penniston,J.T. (1996):
Plasma membrane calcium pump isoform 4a has a longer calmodulin-binding domain than 4b. J.Biol.Chem., 271, 3714-3718 101.
Verma,A.K., Pászty K., Filoteo,A.G., Penniston,J.T., Enyedi Á. (1999): Protein
kinase C phosphorylates plasma membrane Ca2+ pump isoform 4a at its calmodulinbinding domain. J.Biol.Chem., 274, 527-531 102.
Wang,K.K.W., Roufogalis,B.D., Villalobo,A. (1988): Further characterization of
calpain- mediated proteolysis of the human erythrocyte plasma membrane Ca2+ATPase. Arch Biochem Biophys, 267, 317-327 103.
Wang,K.K.W., Villalobo,A., Roufogalis,B.D. (1988): Activation of the Ca2+-
ATPase of human erythrocyte membrane by an endogenous Ca2+-dependent neutral protease. Arch Biochem Biophys, 260, 696-704 68
104.
Wu,K.K. (2002): Regulation of endothelial nitric oxide synthase activity and
gene expression. Ann.NY.Acad.Sci., 962, 122-130 105.
Xu,C., Rice,W.J., He,W., Stokes,D.L. (2002): A structural model for the catalytic
cycle of Ca2+-ATPase. J.Mol.Biol., 316, 201-211 106.
Yano,K., Zarain- Herzberg,A. (1994): Sarcoplasmic reticulum calsequestrins:
structural and functional properties. Mol.Cell.Biochem., 135, 61-70 107.
Zabe,M., Dean,W.L. (2001): Plasma membrane Ca2+-ATPase associates with the
cytoskeleton in activated platelets through a PDZ-binding domain. J.Biol.Chem., 276, 14704-14709 108.
Zvaritch,E., James,P., Vorherr,T., Falchetto,R., Modyanov,N., Carafoli,E. (1990):
Mapping of functional domains in the plasma membrane Ca2+ pump using trypsinproteolysis. Biochemistry, 29, 8070-8076
69
11 Saját közlemények jegyzéke Az értekezés alapjául szolgáló közlemények:
Pászty K., Penheiter,A.R., Verma,A.K., Padányi R., Filoteo,A.G., Penniston,J.T., Enyedi Á. (2002): Asp1080 upstream of the calmodulin-binding domain is critical for autoinhibition of hPMCA4b. J.Biol.Chem., 277, 36146-36151
Padányi R., Pászty K., Penheiter,A.R., Filoteo,A.G., Penniston,J.T., Enyedi Á. (2003): Intramolecular interactions of the regulatory region with the catalytic core in the plasma membrane calcium pump. J.Biol.Chem., 278, 35798-35804
Egyéb közlemények:
Pászty K., Verma,A.K., Padányi R., Filoteo,A.G., Penniston,J.T., Enyedi Á. (2002): Plasma membrane Ca2+ ATPase isoform 4b is cleaved and activated by caspase-3 during the early phase of apoptosis. J.Biol.Chem., 277, 6822-6829
70
