A plazmamembrán típusú Ca2+ATPáz intramolekuláris kölcsönhatásainak vizsgálata Doktori (Ph.D.) értekezés tézisei
Padányi Rita
Témavezetok:
Dr. Enyedi Ágnes Dr. Sarkadi Balázs
Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Molekuláris Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola Pathobiokémia program
Készült az Ors zágos Gyógyintézeti Központ Hematológiai és Immunológiai Intézetének Molekuláris Sejtbiológia Osztályán. Budapest, 2003.
A doktori (Ph.D.) értekezés alapjául szolgáló kísérletek 1998 és 2002 között az Országos Gyógyintézeti Központ Haematológiai és Immunológiai Intézet, Dr. Sarkadi Balázs egyetemi tanár vezette Molekuláris Sejtbiológia Osztályán készültek, Dr. Enyedi Ágnes tudományos fomunkatárs közvetlen irányítása alatt.
7. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK A dolgozat alapjául szolgáló közlemények:
1. ÖSSZEFOGLALÁS Élo sejtek számára létfontosságú az alacsony intracelluláris Ca2+
Padányi R., Pászty K., Penheiter,A.R., Filoteo,A.G., Penniston,J.T., Enyedi Á.: Intramolecular interactions of the regulatory region with the catalytic core in the plasma membrane calcium pump. Journal of Biological Chemistry, 2003, Vol. 278, No. 37, Issue of September 12, pp. 3579835804
koncentráció biztosítása. Ebben játszik kulcsszerepet a plazmamembrán
Pászty K., Penheiter,A.R., Verma,A.K., Padányi R., Filoteo,A.G., Penniston,J.T., Enyedi Á.: Asp1080 upstream of the calmodulin-binding domain is critical for autoinhibition of hPMCA4b. Journal of Biological Chemistry, 2002, Vol. 277, No. 39, Issue of September 27, pp. 3614636151
sejtben kölcsönhatásba lép az enzim katalitikus centrumával, és gátolja az
Egyéb közlemények:
típusú Ca2+ATPáz (PMCA), amely ATP hidrolízis energiájának terhére Ca2+ ionokat pumpál a citoszolból az extracelluláris térbe. A PMCA C-terminális regulátor régiója tartalmaz egy kalmodulin-köto szekvenciát, amely nyugvó enzim aktivitását. Aktivált sejtben a Ca2+-kalmodulin komplex kötodik a kalmodulin-köto szekvenciához, aminek hatására a katalitikus régió felszabadul a belso gátlás alól, a pumpa aktiválódik. Az aktiválódás során bekövetkezo szerkezeti változásokon kívül, az enzimciklus közben is folyamatosan változik a pumpa konformációja a nagy Ca2+-affinitású (E1) és
Pászty K., Verma,A.K., Padányi R., Filoteo,A.G., Penniston,J.T., Enyedi Á.: Plasma membrane Ca2+ATPase isoform 4b is cleaved and activated by caspase-3 during the early phase of apoptosis. Journal of Biological Chemistry 2002, Vol. 277, No. 9, Issue of March 1, pp. 6822-6829.
a kis Ca2+-affinitású (E2) állapotok között.
Eloadások:
kölcsönhatásait. Három különbözo proteázt választottunk, amelyek a C-
Padányi R., Pászty K., Lór K., Verma,A.K., Penniston,J.T., Enyedi Á.: Phosphorylation of the plasma membrane calcium pump isoform 4b with PKC prevents proteolysis by calpain, European Calcium Society VI. European Symposium, Franciaország, Párizs, absztrakt 51.o.(2000)
terminális régióban a kalmodulin-köto szekvenciától N-terminális (kaszpáz-
Limitált proteolízissel és pontmutációk segítségével tanulmányoztuk a PMCA4b
C-terminális
régiójának
és
katalitikus
centrumának
3) illetve C-terminális (kimotripszin, kalpain) irányban hasítják a pumpát. Mindhárom
proteáz
esetében
azt
tapasztaltuk,
hogy
a
fehérje
konformációjától függoen változott a fragmentképzodés intenzitása. Inaktív fehérje esetében, amennyiben az enzim konformációja E2 állapot felé tolódik (Ca2+ hiányában), alig képzodött fragment, mivel a szoros intramolekuláris kölcsönhatás miatt a proteázok kevéssé férnek hozzá a hasítási helyekhez. Inaktív szerkezetu, de E1 konformációjú fehérje esetében (Ca2+ jelenlétében) valamivel nagyobb mértéku fragmentációt detektáltunk. Ez arra utal, hogy ebben az esetben a C-terminális régió lazábban kapcsolódik a katalitikus centrumhoz. A leggyengébb intramolekuláris kölcsönhatást bizonyító,
legintenzívebb degradációt a Ca2+-kalmodulin komplexet kötött, aktív
6. EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA
szerkezetu fehérje esetében figyeltünk meg. Kísérleteink alapján a C-
Különbözo konformációs állapotokban vizsgáltuk a hPMCA4b izoforma intramolekuláris kölcsönhatásait a fehérje C-terminális régiójában ható proteázok (kalpain, kimotripszin, kaszpáz-3) segítségével. Eredményeink szerint Ca2+ és kalmodulin hiányában (inaktív szerkezet, a katalitikus centrum E2 konformációjú) az intramolekuláris kölcsönhatások erosek, fragmentációt alig vagy egyáltalán nem észleltünk. Ca2+ jelenlétében (inaktív szerkezet, katalitikus centrum E1 konformációjú) a fragmentáció kifejezetebb, ami azt mutatja, hogy E1 állapotban az intramolekuláris kölcsönhatások gyengébbek. Ca2+-kalmodulin komplex kötodése a kalmodulin-köto szekvenciához jelentos konformációs változásokat indukál a fehérje szerkezetében (aktív szerkezet), és ennek hatására a hasítási helyek könnyen hozzáférhetové válnak a proteázok számára. Ez a konformációs változás a „csukló” régiótól egészen a másodlagos autoinhibítor régióig terjed.
terminális régió szerkezeti változásai a kalmodulin-köto szekvenciától Nterminális és C-terminális irányba is kiterjednek a pumpa muködése során. Ezzel ellentétben, amennyiben az 1093. triptofánt (Trp1093 , a kalmodulin-köto szekvencia egyik fontos eleme) alaninra cseréltük, csak a kalmodulin-köto szekvencián belül található hasítási helyek lettek hozzáférhetobbek a proteázok számára. Kimutattuk továbbá, hogy az 1080. aszparaginsav (Asp1080 , emellett hasít a kaszpáz-3), bár a kalmodulin-köto szekvencián kívül
helyezkedik
stabilizálásához.
el,
jelentosen
hozzájárul
az
inaktív
szerkezet
Eredményeink megerosítik, hogy a Trp1093 kitüntetett szerepet játszik a kalmodulin-köto szekvencia és a katalitikus centrum kölcsönhatásában, mivel a Trp1093 mutációjának hatására egyébként elérhetetlen hasítási helyek hozzáférhetové válnak bizonyos proteázok számára. Ez a hatás azonban – a kalmodulin globális hatásával szemben – csak a kalmodulin-köto szekvencián belül figyelheto meg. Bizonyítottuk, hogy a kalmodulin-köto szekvenciától N-terminális irányba eso, ún. „csukló” régió is fontos szerepet játszik a belso gátlás kialakításában, valószínuleg azáltal, hogy stabilizálja a kalmodulin-köto szekvencia és a katalitikus centrum kapcsolatát. Az ebben a régióban található 1080. aszparaginsav mutációja jelentosen növeli a kalmodulin nélkül mért aktivitást. Ezenkívül a mutáns fehérje aktiválódása kalmodulinnal gyorsabb, mint a vad típusú fehérje esetében. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a mutáns fehérjében az intramolekuláris kölcsönhatások gyengébbek, és a kalmodulin-köto szekvencia könnyebben hozzáférheto a Ca2+-kalmodulin komplex számára. A mutáció hatása ebben az esetben is lokális, a változás nem terjed a „csukló” régión kívülre.
gyengébb a C-terminális régió és a katalitikus centrum kölcsönhatása, és így
2. BEVEZETÉS
a Ca 2+-kalmodulin komplex számára jobban hozzáférheto a kalmodulin-köto régió (? nagyobb aktiválódási sebesség). Limitált proteolízissel kimutattuk,
A sejt jelátviteli folyamatainak egyik kulcsszereploje a Ca2+ ion. A
hogy az Asp1080 mutációja lokális változást idéz elo a C-terminális régió és a
sejt nyugalmi állapotában az intracelluláris Ca2+ koncentráció igen alacsony
katalitikus centrum struktúrális kapcsolatában, és hatása nem terjed a
(kb. 0,1 ?M), öt nagyságrenddel kisebb, mint az extracelluláris térben. A
„csukló” régión kívülre.
sejtet éro szignálok hatására az intracelluláris Ca2+ koncentráció átmenetileg megemelkedik (kb 0,5-1 ?M értékre), ami számos, sejttípustól és stimulustól függo
sejtválaszt
indíthat
el
neurotranszmitter-felszabadulás). transzportrendszerek
(pl.
A
izomkontrakció,
sejtaktivációt
– plazmamembrán
típusú
szekréció,
követoen
a
Ca2+ATPáz
Ca2+
(PMCA),
2+
szarko/endoplazmás retikulum típusú Ca ATPáz (SERCA), Na+-Ca2+ cseretranszporter – eltávolítják a Ca2+-t a citoszolból, és visszaállítják a nyugalmi Ca2+ szintet. A
sejt
egyik
általánosan
elterjedt,
nagy
affinitású
Ca2+
transzportrendszere a plazmamembrán típusú Ca2+ATPáz, amely a Ca2+-t a citoszolból az extracelluláris térbe távolítja el. A PMCA a Ca2+ transzlokációjához szükséges energiát ATP hidrolízisébol nyeri. A többi Ptípusú
ATPázhoz
hasonlóan
az
iontranszporttal
párhuzamosan
foszforilálódik, és egy nagy energiájú foszforilált intermediert képez. Az enzimciklus során a Ca2+ ionok kötése és a foszforiláció váltakozik a Ca2+ transzporttal
és
az
ATP
hidrolízissel.
A
folyamatot
a
fehérje
konformációváltozása kíséri, aminek következtében a Ca2+ köto helyek Ca2+ iránti affinitása megváltozik. Az E1 konformációjú szerkezet nagy affinitással, míg az E2 forma kis affinitással köti a Ca2+-ot. A PMCA topológiája hasonlít a többi P-típusú ATPázhoz: 10 transzmembrán hélix és két nagyobb citoplazmatikus hurok alkotja. A transzmembrán régióban találhatóak azok az aminosavak, amelyek a Ca2+ kötésében vesznek részt. A 4. és az 5. transzmembrán hélixeket ös szeköto
ún. nagy hurok tartalmazza a fo katalitikus doméneket: ATP-köto hely, az
A kalmodulin-köto szekvenciától távolabb (mind N-, mind C-terminális
enzimciklus során foszforilálódó aszparaginsav. A többi P-típusú ATPáztól
irányban) lévo hasítási helyeken bekövetkezo fragmentációt a mutáció
eltéroen a PMCA rendelkezik egy hosszú C-terminális szabályozó régióval,
azonban nem befolyásolja. Ez arra utal, hogy az aminosavcsere hatása lokális
amely tarlamaz egy nagy affinitású kalmodulin-köto szekvenciát. Az enzim
és specif ikus: bár a mutáció közvetlen környezete lazábban kötodik a
inaktív állapotában a kalmodulin-köto szekvencia kölcsönhatásba lép a
katalitikus centrumhoz, ez a hatás nem terjed ki a kalmodulin-köto
katalitikus centrummal, és gátolja a pumpa aktivitását. A Ca2+ szint
szekvencián kívülre. Eredményeink szerint a Trp1093 aminosavnak kitüntetett
emelkedését követoen, a kialakult Ca2+-kalmodulin komplex kötodik a C-
szerepe van kalmodulin-köto szekvencia és a katalitik us centrum
terminá lis régióban található kalmodulin-köto szekvenciához. Ennek hatására
kölcsönhatásában.
a katalitikus centrum felszabadul a belso gátlás alól, a pumpa aktiválódik. A PMCA-t 4 gén kódolja (PMCA1-4). E négy génrol átíródott premRNS-rol, az alternatív splicing során több mint 20 különbözo izoforma
5.3. Az autoinhibítor régiótól N-terminálisan található aszparaginsav (Asp1080) szerepe a hPMCA4b izoforma belso gátlásában
keletkezhet. A PMCA1 és 4 izoformák szinte minden szövetféleségben elofordulnak, míg a PMCA2 és PMCA3 gén termékei foként ideg-, váz- és
A 10. transzmembrán hélixet a kalmodulin-köto szekvenciával összeköto, ún.
szívizomsejtekben expresszálódnak.
„csukló” régióban található az az aszparaginsav (Asp1080 ), ahol a kaszpáz-3
Az egyes PMCA izoformák szabályozása – alapaktivitásuk,
enzim hasítja a PMCA4b izoformát. Az 5.1. fejezetben leírtuk, hogy a
kalmodulin iránti affinitásuk, aktiválódásuk és inaktiválódásuk sebessége –
kaszpáz-3 proteázzal vizsgált „csukló” régió fragmentációja jelentosen függ
nagyon eltéro. Az izoformák közül a PMCA4b izoforma rendelkezik a
az intramolekuláris kölcsönhatás erosségétol. Ezek az eredmények azt
legalacsonyabb alapaktivitással, és ez a variáns stimulálható a legnagyobb
mutatják, hogy a „csukló” régiónak is szerepe lehet az enzim inaktív
mértékben kalmodulinnal. A PMCA4b alacsony alapaktivitása arra utal,
szerkezetének kialakításában.
hogy a C-terminális régió és a katalitikus centrum kölcsönhatása szoros. A
Ezért vizsgáltuk, hogy az Asp1080 mutációja (Asp1080? Ala, Asp1080? Lys
PMCA4b izoforma belso gátlásáért nem csak a kalmodulin-köto szekvencia,
Asp1080 ? Asn mutánsok) milyen hatással van az enzim transzportaktivitására
hanem kisebb részben, ettol a szekvenciától C-terminálisan található
és a kalmodulinnal történo aktiválhatóságára. Kimutattuk, hogy mindhárom
másodlagos autoinhibítor régió is felelos.
aminosavcsere jelentosen megemeli az enzim kalmodulin nélküli alapaktivitását. Ezenkívül a vad típusú enzimhez viszonyítva nagyobb az Asp1080 mutánsok kalmodulin iránti affinitása, aminek hátterében az áll, hogy a mutáns enzimek nagyobb sebességgel aktiválódnak. Ezeknek a változásoknak valószínuleg az az oka, hogy a mutáció következtében a Ca2+ATPáz nyitottabb szerkezetet vesz fel (? nagyobb alapaktivitás),
Ca2+-affinitású, E1 állapotnak kedvez. Azt tapasztaltuk, hogy Ca2+ hiányában
3. CÉLKITUZÉSEK
alig degradálódik a pumpa, míg a Ca2+-t kötött fehérje esetében a Cterminális régió elérhetobb a proteázok számára. Ezek az adatok azt mutatják, hogy E2 állapotban a C-terminális autoinhibítor régió szorosan kapcsolódik a katalitikus centrumhoz. A SERCA háromdimenziós szerkezete alapján feltételeztük, hogy E1 állapotban a katalitikus centrum doménjei jobban elkülönülnek egymástól, ezért ez a szerkezeti egység nem képes olyan szorosan lefedni a C-terminális régiót, mint E2 formában. Kísérleteink azt mutatták, hogy ilyenkor a hasítási helyek valóban elérhetobbek a proteázok számára. Maximális fragmentképzodést mindhárom proteázzal a
A PMCA sokrétu szabályozhatóságának szerkezeti alapját a katalitikus centrum és a C-terminális régió kölcsönhatása képezi. Kísérleteinkben a humán PMCA4b izoforma (hPMCA4b) intramolekuláris kölcsönhatásait vizsgáltuk limitált proteolízissel. A katalitikus centrum és a C-terminális régió közötti kölcsönhatás erosségétol függoen változhat egy adott hasítási hely elérhetosége egy C-terminális régióban hasító proteáz számára. Így a fragmentképzodés intenzitásából következtethetünk az intramolekuláris kölcsönhatások erosségére. Vizsgálni kívántuk továbbá, hogy a kalmodulin-
kalmodulin-kötött, aktív szerkezetu Ca2+ATPáz esetében figyeltünk meg.
köto szekvenciától N-terminális irányban létrehozott mutációk hogyan
Eredményeink megerosítik korábbi elképzeléseinket, miszerint a Ca2+-
befolyásolják a pumpa aktivitását. Kísérleteink során a következo célok
kalmodulin komplex kötodése a kalmodulin-köto szekvenciához jelentos konformációs változásokat indukál a C-terminális régió és a katalitikus
illetve kérdések merültek fel: ?
A hPMCA4b C-terminális autoinhibítor régiójában hasító proteázok (kalpain, kimotripszin, kaszpáz-3) hasítási helyeinek meghatározása in
centrum kapcsolatában.
situ a membránban. 5.2. A kalmodulin-köto szekvenciában található Trp1093 mutációjának
?
Vizsgálni kívántuk a hPMCA4b izoforma fragmentációját különbözo konformációs állapotokban.
hatása a hPMCA4b intramolekuláris kölcsönhatásaira ?
Limitált proteolízis segítségével tanulmányozni kívántuk, hogy a
A kalmodulin-köto szekvenciában található triptofán (Trp1093 ) mutációjának
hPMCA4b kalmodulin-köto szekvenciájában található triptofán (Trp1093 )
hatására (Trp1093? Ala mutáns) megemelkedik a pumpa alapaktivitása, az
mutációjának
enzim gyorsabban aktiválódik kalmodulin nal, ami arra utal, hogy az
kölcsönhatásaira.
intramolekuláris kölcsönhatások a mutáns esetében gyengébbek.
?
Vizsgálni
milyen
kívántuk,
hatása
hogy
a
van
a
fehérje
intramolekuláris
kalmodulin-köto szekvenciától N-
Kimutattuk, hogy a Trp1093 ? Ala mutáns esetében a kalmodulin-köto
terminálisan elhelyezkedo, ún. „csukló” régióban található aszparginsav
szekvencián belül egyébként elérhetetlen hasítási helyek hozzáférhetové
(Asp1080 ) mutációja milyen hatással van az enzim aktivitására.
válnak a vizsgált protázok számára. Ez azt bizonyítja, hogy a mutánsnál a kalmodulin-köto szekvencia kapcsolata a katalitikus centrummal gyengébb, mint a vad típusú enzim esetében.
4. MÓDSZEREK
5. EREDMÉNYEK
Sejtkultúra, transzfekció és membránpreparálás: A PMCA fehérjéket majomvese eredetu COS-7 sejtekben Lipofectamin reagens segítségével expresszáltuk. A tranziens expressziót követoen a sejtekbol mikroszómá lis
5.1. A hPMCA4b izoforma intramolekuláris kölcsönhatásainak vizsgálata limitált proteolízissel
membránpreparátumot készítettünk. Emésztés kalpainnal, kimotripszinnel és kaszpáz-3-mal: A PMCA-val transzfektált COS-7 sejtekbol preparált mikroszómális membránt in vitro 37 o
C-on emésztettük az egyes proteázokkal. A fragmentek képzodését
immunfestéssel követtük nyomon.
A PMCA Ca 2+ transzport aktivitását a C-terminális régió és a katalitikus centrum kölcsönhatása szabályozza. Kísérleteinkben a hPMCA4b izoforma intramolekuláris kölcsönhatásait a fehérje C-terminális régiójában hasító proteázok segítségével vizsgáltuk.
Gélelektroforézis és elektrotranszfer: A mintákat SDS-poliakrilamid gélen futtattuk, PVDF membránra blottoltuk, majd immunfestéssel (5F10: antiPMCA és JA9: anti-PMCA4b ellenanyagokkal) és ECL (Enhanced Chemiluminescence) technika segítségével tettük láthatóvá. A fehérjék mennyiségi megoszlását a BioRad Chemiluminescence Imaging System segítségével határoztuk meg, majd a Molecular Analyst és a GraphPad Prism programokkal értékeltük ki. Ca2+ transzport mérés: Ca2+ transzport mérés során a membránvezikulák 45
Ca2+ izotóppal jelzett Ca2+-felvételét mértük meg.
A PMCA aktiválódásának és inaktiválódásának kinetikai analízise: A tisztított PMCA fehérje aktiválódásának illetve inaktiválódásának sebességét az enzim ATPáz aktivitásának mérésével, kapcsolt enzimreakción (2-amino6-merkapto-7-metil-purin ribonukleozidot (MESG) foszforolízise) keresztül határoztuk meg. Az adatokat a GraphPad Prism program segítségével értékeltük ki.
5.1.1. Hasítási helyek meghatározása Vizsgálatainkhoz három olyan eltéro szubsztrát specificitású proteázt választottunk, amelyek a PMCA4b izoforma C-terminális régiójában hasítanak elsodlegesen (kalpain, kimotrips zin, kaszpáz-3). A PMCA4b DNSsel transzfektált COS-7 sejtekbol membránt preparáltunk, és a hasítást in situ a membránban – enzim természetes állapotához közel álló rendszerben – tanulmányoztuk. A keletkezett fragmentek és az ismert molekulatömegu ép PMCA4b illetve csonkolt PMCA4b mutánsok elektroforetikus vándorlása alapján határoztuk meg a hasítási helyeket. Kísérleti rendszerünkben a kalpainnak és a kimotripszinnek a kalmodulin-köto szekvencián kívül, attól C-terminális irányban (a másodlagos autoinhibítor régióban) egy-egy domináns hasítási helye volt. Ezzel ellentétében a kaszpáz-3 a kalmodulinköto szekvenciától N-terminálisan az 1080. aszparaginsav mellett hasítja a fehérjét.
A PMCA4b szerkezeti modellje: A PMCA4b szekvenciáját a SERCA1a fehérje szekvenciájával hasonlítottuk össze, majd a MODELLER 6v2 programmal a SERCA1a szerkezeti adatait (1EUL.pdb, 1IWO.pdb) felhasználva elkészítettük a PMCA4b fehérje homológia modelljét.
5.1.2. A hPMCA4b degradációja különbözo konformációs állapotokban Az inaktív szerkezetu fehérje fragmentációját vizsgáltuk egyrészt Ca2+ hiányában, amikor a katalitikus centrum konformációja a kis Ca2+-affinitású, E2 állapot felé tolódik, másrészt Ca 2+ jelenlétében, ami a
