4. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Preparasi Organ Dalam Bahan utama penelitian adalah organ dalam ikan bandeng. Apabila tidak langsung digunakan untuk penelitian,
sampel organ dalam
dikemas dalam
kantung plastik dan segera disimpan pada suhu -20 oC (Kim et al. 2002; Park et al. 2002; Byun et al 2002). Pembekuan merupakan salah satu cara penyimpanan dan amobilisasi enzim. Aoki et al. (2002) menggunakan suhu -80 oC untuk menyimpan bahan utama pemurnian kolagenase yaitu hepatopankreas udang (Pandalus oeus) sebelum diteliti. Gambar organ dalam bandeng dapat dilihat pada Lampiran 4. Penimbangan pada setiap organ dalam dilakukan untuk mengetahui jumlah bahan utama pemurnian enzim kolagenase sehingga dapat diketahui yield hasil pemurnian. Berdasarkan hasil penimbangan, maka berat ikan bandeng 188–547 g/ekor atau dengan berat rata-rata 375,57 g/ekor mempunyai prosentase berat usus sebesar 2,49%, hati sebesar 1,23% dan pilorik kaeka sebesar 1,26%. Data hasil prosentase berat organ dalam ikan bandeng selengkapnya terlampir pada Lampiran 5. Prosentase ini berbeda dengan penelitian yang dilakukan Heruwati (1997) pada ikan nila (Oreochromis niloticus), kakap merah (Lutjanus sp), Tongkol (Katsuwonus pelamis). Perbedaan ini disebabkan oleh perbedaan fisiologi ikan antara lain spesies ikan, ukuran ikan, cara makan dan jenis makanan, habitat dan tingkat kematangan gonad (Clucas & Ward 1996). Hasil prosentase organ dalam beberapa spesies ikan dan ikan bandeng hasil penelitian disajikan pada Tabel 6. Tabel 6 Prosentase organ dalam beberapa spesies ikan. Jenis ikan Manyunga Tongkola Kakap meraha Nilaa Salmonb Bandengc
Pilorik Kaeka 0,23 1,58 0,23 0,95 1,26
Lambung
Intestin
Hati
2,78 1,44 0,61 0,81 -
1,59 0,37 0,48 2,87 2,49
1,5-2 1,23
Keterangan: a = Heruwati (1997);b= Clucas dan Ward (1996); c=hasil penelitian
29
4.2 Ekstraksi Kolagenase Ekstraksi merupakan tahap awal pemurnian kolagenase, secara terpisah terhadap tiga organ dalam, yaitu hati, usus dan pilorik kaeka ikan bandeng yang telah berada pada fase post rigor.
Pada penelitian ini, ekstraksi kolagenase
menggunakan buffer Tris-HCl dengan pH 8,0 untuk menjaga lingkungan enzim, sehingga tidak terjadi perubahan pH yang ekstrim selama proses ekstraksi. Triton X-100 sebesar 0,25% w/v ditambahkan untuk memisahkan enzim kolagenase yang masih melekat pada dinding sel atau sisa polimer substrat (Suhartono 1989). Selanjutnya sebesar CaCl2 100 mM ditambahkan dalam proses ekstraksi untuk menjaga kemungkinan terjadinya penurunan aktivitas enzim, sebab ion Ca2+ dapat digunakan sebagai kofaktor (Bollag & Edelstein 1991). Penampang organ dalam ikan bandeng disajikan pada Lampiran 4. Hasil ekstraksi berupa ekstrak kasar kolagenase. Ekstrak kasar tersebut kemudian diuji aktivitas kolagenasenya. Hasil uji aktivitas kolagenase terhadap ekstrak kasar kolagenase memperlihatkan bahwa terdapat aktivitas kolagenase pada ketiga organ dalam tersebut. Aktivitas kolagenase beberapa organ dalam dapat dilihat pada Gambar 11. Aktivitas kolagenase tertinggi terdapat pada usus yaitu sebesar 0,141 Unit/ml dan konsentrasi proteinnya adalah 1,712 mg/ml. Aktivitas kolagenase Unit/m
0,16 0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0 sisa organ dalam
usus
pilorik kaeka Organ dalam
hati
Gambar 11 Aktivitas kolagenase pada berbagai organ dalam ikan bandeng fase post rigor. Kolagenase diproduksi oleh sel-sel jenis sel stromal, sel ephitel, makrofagus dan leukosit (Strenlicht & Werb 2001). pencernaan yang terbangun dari sel-sel epitelium.
Usus adalah organ
Khojasteh et al. (2009)
30
melaporkan bahwa secara histologi, struktur dinding sel usus halus pada ikan rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) hampir sama dengan hewan vertebtara lain. Usus halus merupakan tempat sebagian pencernaan secara kimiawi terjadi. Sebagian besar enzim pencernaan yang bekerja pada usus disekresikan oleh pankreas melalui pankreatik duct. Khojasteh et al. (2009) juga menyatakan usus halus terbentuk dari mukosa tonika dangan jaringan penghubung tonika muskularis (di bagian dalam berbentuk lingkaran, di bagian luar searah dengan daging) dan lapisan tonika serosa. Mukosa muskolaris terdapat diantara lamina propria dan submukosa, dan kelenjar mukosal turbular. Lapisan tipis jaringan penghubung bersifat asam memisahkan mukosa dan sub mukosa. Pada permukaan mukosa terdapat villi, mengurangi lebar bagian depan dan ujung usus, dan epitelium yang membentuk lapisan tunggal kolom sel dengan basal nukleus yang mengandung nukleus, garis apical brush dan sitoplasma asidofilik. Kolagenase dari usus ini selanjutnya digunakan oleh organ-organ tertentu yang memerlukannya dengan mekanisme transport sel. Penampang dinding usus disajikan pada Gambar 12.
Gambar 12 Penampang dinding usus. Sumber:http://www.anselm.edu/homepage/jpito cch/genbio/intestwallcells.JPG. [5 Februari 2010] Kandungan enzim protease tinggi, pada jeroan dan daging. Jeroan (organ dalam) ikan mempunyai prosentase yang besar, yaitu sekitar 5%. Proteinase telah ditemukan dalam usus ikan, seperti tripsin, kimotripsin, kolagenase, elastase,
31
karboksipeptidase dan karboksi esterase, yang secara normal disekresikan oleh pilorik kaeka dan pankreas (An & Vessesanguan 2000). Terdapat aktivitas kolagenase pada sisa organ dalam yaitu campuran organ seperti ginjal, lambung, pankreas, dan empedu.
Adanya aktivitas tersebut,
menandakan bahwa pada organ-organ tersebut juga merupakan sumber kolagenase. Kolagenase telah dimurnikan dengan metode yang berbeda pada hepatopankreas udang (Pandalus eous) (Aoki et al. 2003) dan hepatopankreas kepiting raja (Paralithodes camtschaticus) (Rudenskaya et al. 2004). Beberapa sumber kolagenase dari hewan perairan dan metode pemurniannya disajikan pada Tabel 7. Tabel 7 Sumber kolagenase dan metoda pemurniannya. Kelipatan pemurnian 39,5
Yield (%) 0,1
pengendapan ammonium sulfat; Penukar ion DEAE Sephadex A-50 dua kali; Gel filtrasi Sephadex G-150
92,4
10,9
Pilorik kaeka ikan tuna(Thunnus thynnus) Byun et al. (2002)
pengendapan aceton; gel filtrasi Sephadex G100;penukar ion DEAE Sephadex A-50;gel filtrasi Sephadex G-75
30,5
Hepatopancreas udang (Pandalus eous) Aoki et al. (2003)
pengendapan aceton; kolom hydroxypapatite; kolom MonoQ
37,4
Sumber
Metode pemurnian
Organ dalam ikan makarel (Scomber japanicus) Park et al. (2002).
pengendapan aceton; Penukar ion DEAE Sephadex A-50; Gel filtrasi Sephadex G-100; Penukar ion DEAE Sephacel; Gel filtrasi G-75
Organ dalam ikan filefish (Novoden modestrus) Kim et al. (2002) .
0,023
2,9
4.3. Pengendapan Pengendapan ekstrak kasar kolagenase dari usus ikan bandeng garam ammonium sulfat (NH4(SO4)2). Konsentrasi NH4(SO4)2 yang ditambahkan yaitu dari 30 sampai dengan 80% (w/v) tingkat kejenuhan NH4(SO4)2. Ammonium
32
sulfat dipilih karena sifatnya yang mudah larut, murah dan umumnya tidak mempengaruhi struktur protein pada konsentrasi tertentu (Beynon & Bond 2000). Penambahan ammonium sulfat pada ekstrak kasar menghasilkan endapan dan supernatan, yang masing-masing diuji aktivitas kolagenasenya. Hasil uji aktivitas terhadap hasil pengendapan diperoleh aktivitas tertinggi terdapat pada endapan dengan penambahan 70% (w/v) tingkat kejenuhan NH4(SO4)2, yaitu sebesar 0,496 unit/ml dengan konsentrasi protein sebesar 1,185 mg/ml, dan aktivitas spesifiknya 35,42 Unit/mg. Meningkatnya aktivitas enzim pada endapan hingga penambahan ammonium sulfat 70% disebabkan berkurangnya pengotor, seperti non protein (karbohidrat), protein non enzim dan lain-lain (Suhartono 1989).
Konsentrasi protein pada hasil pengendapan menggunakan ammonium
sulfat 30-80% disajikan pada Gambar 13.
Konsentrasi protein mg/m
1,600 1,400 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 30
40
50
60
70
80
Konsentrasi Ammonium sulfat % kejenuhan
Gambar 13 Konsentrasi protein pada hasil pengendapan menggunakan supernatan ammonium sulfat 30-80%. endapan Aktivitas kolagenase pada konsentrasi ammonium sulfat tingkat kejenuhan 80% menurun. Penurunan ini disebabkan karena ammonium sulfat tidak bersifat buffer dan dapat membebaskan ammonia, sehingga memungkinkan terjadinya kenaikan pH (Boyer 1993).
Ammonium sulfat dipilih karena sifatnya yang
mudah larut, murah dan umumnya tidak mempengaruhi struktur protein pada konsentrasi tertentu (Beynon & Bond 2000). Akibatnya, aktivitas enzim menjadi menurun, karena aktivitasnya tersebut dipengaruhi oleh faktor lingkungan, seperti pH.
Aktivitas enzim menurun ketika pH lingkungan enzim melebihi pH
33
optimumnya. Hasil uji aktivitas kolagenase pada endapan dan supernatan larutan enzim kolagenase yang ditambah dengan NH4(SO4)2 dalam berbagai tingkat Aktivitas kolagenase Unit/m
kejenuhannya disajikan pada Gambar 14. 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 30 40 50 60 70 80 Konsentrasi ammonium sulfat % kejenuhan
Gambar 14
Aktivitas kolagenase (Unit/ml) hasil pengendapan menggunakan NH4(SO4)2 . supernatan
pemisahan dengan endapan
Kim et al. (2002) mengendapkan ekstrak kasar kolagenase dari organ dalam ikan filefish (Novodon modestrus) menggunakan garam NH4(SO4)2 secara bertingkat dari 30% hingga 80% w/v tingkat kejenuhan.
Park et al. (2002)
menggunakan aseton dingin untuk mengendapkan ekstrak kasar kolagenase dari organ dalam ikan makarel (Scromber japanicus).
Aktivitas spesifik pada
pengendapan ekstrak kolagenase dari ikan filefish yaitu 145,34 Unit/mg, lebih besar dibandingkan aktivitas spesifik ekstrak kasar kolagense dari ikan makarel, yaitu 42,3 Unit/mg.
4.4 Dialisis Dialisis dilakukan untuk mengurangi kadar garam (desalting) yang tersisa dari pengendapan menggunakan garam NH4(SO4)2. Perbedaan tekanan osmosis dari larutan buffer yang mengandung konsentrasi garam rendah (hipotonik) dengan larutan enzim dalam kantong dialisis yang mengandung garam tinggi (hipertonik) menyebabkan garam terdifusi keluar membran kantung dialisis, biasanya bersifat semipermeabel. Dialisis mengeluarkan protein dengan ukuran yang lebih kecil dari ukuran pori-pori kantung dialisis. Dialisis yang dilakukan
34
dengan mengganti buffer beberapa kali akan meningkatkan kemurnian enzim (Syukri 1999). Lama waktu diffusi dan ukuran kantong dialisis serta konsentrasi buffer menentukan hasil dialisis (Bollag & Edelstein 1991). Aktivitas kolagenase pada
Aktivitas kolagenase Unit/m
jenis ukuran kantong dan waktu dialisis disajikan pada Gambar 15. 0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 8 mwco
12 mwco
Ukuran kantong dialisis
Gambar 15 Aktivitas kolagenase pada jenis ukuran kantong dan waktu 6 jam 12 jam dialisis. Aktivitas kolagenase hasil presipitasi adalah 0,496 U/ml. didialisis, aktivitas kolagenase mengalami penurunan.
Setelah
Dialisis selama 6 jam
menggunakan kantong dialisis dengan ukuran 8 kDa MWCO, menghasilkan aktivitas tertinggi yaitu 0,451 U/ml dibandingkan dengan proses dialisis menggunakan kantong dialisis dengan ukuran 12kDa MWCO pada waktu yang sama yaitu 0,101 U/ml sedangkan proses dialisis selama 12 jam menggunakan kantong dialisis dengan ukuran 8 kDa MWCO, menghasilkan aktivitas kolagenase yaitu 0,289 U/ml dibandingkan dengan proses dialisis menggunakan kantong dialisis dengan ukuran 12 kDa MWCO pada waktu yang sama yaitu 0,079 U/ml. Aktivitas kolagenase pada kantong yang sama yaitu 8 kDa dengan lama waktu dialisis yang berbeda menyebabkan terjadinya penurunan aktivitas kolagenase. Perlakuan fisik dapat menyebabkan turunnya aktivitas kolagenase. Pada ukuran kantong dialisis yang berbeda yaitu 12 kDa, aktivitas kolagenase mengalami penurunan yang cukup tinggi.
Hal ini disebabkan karena
kemungkinan adanya molekul-molekul enzim yang keluar bersamaan dengan keluarnya ion dari garam NH4(SO4)2.
35
4.5 Kromatografi Penukar ion Penelitian ini menggunakan matriks DEAE Sephadex A 50. Matriks ini termasuk dalam golongan fungsional diethylaminoethyl, terbuat dari dextran, sejenis polysakarida. Dextran termasuk dalam golongan penukar ion yang lemah. Kode A-50 adalah penukar ion jenis anionik dengan kapasitas 50, artinya jumlah 50 muatan dan potensi muatannya per unit berat atau miliequivalen grup ion per miligram berat kering matrik (Boyer 1993). Hasil kromatografi pertukaran ion 0,7
0,8
0,6
0,7
0,5
0,6
0,4
0,5
0,3
0,4
0,2
0,3
0,1
0,2
0
Konsentrasi NaCl M
Aktivitas kolagenase Unit/ml; Absorban 280 n
disajikan pada Gambar 16.
0,1 0
10
20
30
40
-0,1
50
60
70 0
Nomer fraksi
Gambar 16 Hasil kromatografi penukar ion. (◊) absorban pada 280 nm, (■) aktivitas kolagenase Terdapat tiga puncak aktivitas kolagenase. Aktivitas kolagenase tertinggi terdapat pada fraksi yang ke-11 sebesar 0,658 U/menit dengan absorban 0,352 pada panjang gelombang 280 nm. Fraksi yang ke-11 ini selanjutnya dimurnikan lagi menggunakan gel filtrasi. 4.6 Kromatogafi Gel Filtrasi Purifikasi kolagenase selanjutnya adalah kromatografi gel filtrasi. Penelitian ini kromatografi menggunakan matriks Sephadex G-100. Kode G-100 artinya adalah matriks untuk gel filtrasi dengan perkiraan berat molekul yang akan dipisahkan
sebesar 4.000-150.000 Dalton.
Selanjutnya fraksi-fraksi yang
dihasilkan, diuji aktivitas kolagenase dan proteinnya. Hasil kromatografi gel filtrasi disajikan pada Gambar 17.
0,14
0,14
0,12
0,12
0,1
0,1
0,08
0,08
0,06
0,06
0,04
0,04
0,02
0,02
0
Absorban 280 nm
Aktivitas kolagenase Unit/m
36
0
1
10
19
28
37
46
55
Nomer Fraksi
Gambar 17 Hasil kromatografi gel filtrasi. (◊) aktivitas kolagenase, (■) absorban pada 280 nm. Aktivitas kolagenase tertinggi terdapat pada fraksi yang ke-7 sebesar 0,133 U/ml dengan absorban 0,126 pada panjang gelombang 280 nm. Gel Sephadex G100 dapat digunakan untuk memisahkan kolagenase dengan pengotor lainnya. Tahapan proses pemurnian telah berjalan dengan baik hal ini dapat dilihat dengan peningkatan kelipatan pemurniannya Kelipatan tingkat pemurnian kolagenase disajikan pada Tabel 8. Purifikasi kolagenase dari organ dalam ikan bandeng, menghasilkan tingkat kemurnian akhir sebesar 114,371 kali dan yield sebesar 1,26%. Tabel 8 Hasil pemurnian kolagenase. Tahapan Ekstraksi Hasil pengendapan 70% ZA Dialisis DEAE Sephadex A-50 Sephadex G100
450
Aktvitas enzim Unit/ml 0,141
45
0,496
2,32
20
0,451
5 5
Volume (ml)
Konsentrasi protein (mg/ml) 63 0,785
Aktivitas (U)
Derajat Protein Aktivitas Yield (mg) spesifik U/mg kemurnian 353,25
0,178
1,00 100,00
1,185
53,325
0,419
2,347 35,42
9,020
1,020
23,260
0,388
2,484 14,32
0,657
1,314
0,095
0,190
6,916
38,778
2,08
0,133
0,798
0,0065
0,039
20,462
114,731
1,26
37
4.4 Karakterisasi Faktor-faktor utama yang mempengaruhi aktivitas enzim adalah konsentrasi enzim, substrat, produk, senyawa inhibitor dan aktivator, pH dan jenis pelarut yang terdapat pada lingkungan, kekuatan ion dan suhu (Suhartono 1989). Karakterisasi kolagenase dilakukan untuk mengetahui sifat-sifat katalitik enzim sehingga dapat diketahui pula kondisi optimum aktivitas enzim. Kolagenase dari berbagai sumber, mempunyai sifat-sifat katalitik yang berbeda.
Perbedaan
tersebut disebabkan oleh faktor-faktor seperti spesies, umur, jenis makanan, kualitas air, suhu lingkungan. Perbedaan sifat katalitik enzim juga terdapat pada spesies yang sama yang disebabkan oleh faktor interspesies.
Faktor-faktor
tersebut antara lain umur, ukuran jenis kelamin, fase spawning, riwayat spawning, komposisi makanan, riwayat stress dan lain-lain (Haard 2000). Perbedaan sifatsifat katalitik kolagenase dari berbagai sumber, termasuk mikroorganisme disajikan pada Tabel 9.
4.4.1 Suhu Optimum Enzim memiliki aktivitas maksimum pada suhu tertentu, aktivitasnya meningkat seiring dengan peningkatan suhu hingga mencapai suhu optimum. Setelah kenaikan suhu lebih lanjut, akan menyebabkan aktivitas menurun (Pelezar & Chan 1988). Suhu optimum kolagenase yang diperoleh dari ekstrak kasar dan hasil pengendapan adalah sebesar 50 oC. Kolagenase baik dari ekstrak kasar maupun hasil pengendapan ammonium sulfat 70% kejenuhan, mempunyai aktivitas 0,151 dan 0,36 Unit/ml pada suhu 20 o
C. Aktivitasnya semakin bertambah hingga suhu 50 oC, yaitu 0,669 dan 1,056
Unit/ml. Kecepatan reaksi maksimum memerlukan temperatur optimum. Di atas temperatur optimum, kecepatan reaksi menurun tajam, terutama disebabkan denaturasi oleh panas. Hasil karakterisasi suhu ekstrak kasar kolagenase dan hasil pengendapan disajikan pada Gambar 18.
38
Tabel 9 Karakteristik kolagenase dari berbagai sumber. spesifitas substrat
Berat molekul kDa
Jenis kolagen ase
kolagen tipe I
14,8
serin
K+, Li+, Ba2+, Ca2+, Mg2+
-
27,0
serin
-
-
kolagen tipe I
22,0-23,0
serin
Hg2+, Zn2+
-
kolagen tipe I
15,0
serin
type I collagen
29,27,26
metallo
Mg2+, Ca2+, Ba2+
gelatin dan kolagen type I
116, 97
metallo
gelatin
125
metallo
ion logam
pH optimum
Suhu optimum oC
Inhibitor
organ dalam ikan makarel (Scomber japanicus) (Park et al. 2002).
7,5
55
PMSF, TLCK, Soybean trypsin inhibitor
Hg2+, Zn2+
organ dalam ikan filefish (Novoden modestrus) (Kim et al. 2002) .
7,0-8,0
55
TLCK
Zn2+, Cd2+, Cu2+ Ni2+
7,5-8,5
40-45
PMSF , antipain
7,5
55
PMSF, TLCK, Soybean trypsin inhibitor
20
1,10-phenanthroline, cysteine±zinc
Sumber
hepatopancreas udang (Pandalus eous) (Aoki et al. 2003) . Pilorik kaeka ikan tuna (Thunnus thynnus) (Byun et al. 2002) Rainbow trout Oncorhynchus mykiss tail (RTT) (Saito et al. 2000)
Penghambat
Streptomyces strain 3B (Petrova et al. 2005)
7,5
37
1,10-phenanthroline, EDTA
Bacillus subtillus FS-2 (Nagano & Kim 1999)
9
50
EDTA, Soybean tripsin inhibitor, iodoecetamida, iodoacetic acid
Ca2+ , Mg2+ , dan Zn2+
7,2
42
1,10-phenanthroline
Ca2+ , Mg2+ dan Zn2+
120
metallo
Zn2+, Co2+
74
metallo
47, 95
metallo
Clostridium perfringens (Matshishita et al.1994) Photorhabdus luminescens (Marokhazi et al. 2004) Daging ikan Pasific rockfish (Sebastes sp) (Brocho & Haard 1995)
1,10-phenanthroline and EDTA
7,0 7,5-8,5
60-70
1,10-phenanthroline and EDTA
Cu2+, Zn2+ Hg2+, Fe2+
Pengaktif
Mn2+ dan Ca2+
Ca2+
Lingcod skin type I collagen, Gelatln
39
Aktivitas kolagenase U/m
1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 20
30
40
50
60
70
o
Suhu C
Gambar 18 Aktivitas kolagenase dari ekstrak kasar dan hasil pengendapan kolagenase pada berbagai suhu. (◊) ekstrak kasar, (□) hasil pengendapan Enzim pada umumnya mempunyai temperatur optimum seperti temperatur sel. Enzim yang terdapat dalam mikroorganisme yang hidup di mata air panas, mempunyai suhu optimum mendekati titik didih air. Kenaikan kecepatan reaksi di bawah temperatur optimum disebabkan oleh kenaikan energi kinetika molekulmolekul yang bereaksi. Akan tetapi bila temperatur tetap dinaikkan terus, energi kinetika molekul menjadi sedemikian besar sehingga melampaui penghalang energi untuk memecahkan ikatan-ikatan sekunder yang mempertahankan enzim dalam keadaan aktifnya atau keadaan katalitik aktif. Akibatnya struktur sekunder dan tersier hilang disertai dengan hilangnya aktivitas katalitiknya (Boyer 1993). Suhu optimum kolagenase dari ikan bandeng, yaitu 50 oC, lebih tinggi dari suhu optimum kolagenase dari hepatopancreas udang (Pandalus eous) (Aoki et al. 2003), yaitu 40-45 oC.
Namun suhu optimum ini lebih rendah dari suhu
optimum kolagenase dari daging ikan Pasific rockfish (Sebastes sp) (Brocho & Haard 1995), yaitu 60-70 oC. Hal ini disebabkan karena ikan adalah hewan yang bersifat poikiloterm yaitu suhu badannya dipengaruhi oleh suhu lingkungan perairan. Perbedaan suhu lingkungan dapat menyebabkan perbedaan sifat enzim (Clucas & Ward 1996). Kiessling et al. (2006) menyatakan manipulasi suhu lingkungan perairan mempengaruhi mutu tekstur daging ikan, akibat keterlibatan
40
enzim-enzim endogeneus. Namun pada ikan Antartik krill (Euphausia superba, Dana), kolagenase inaktiv secara sempurna pada suhu 50 oC (Kolakowski & Sikorski 2000). 4.4.2 pH Optimum Kolagenase dari organ dalam ikan bandeng mempunyai pH optimum 7-9. Aktivitas kolagenase dari ekstrak kasar dan hasil pengendapan pada berbagai pH disajikan pada Gambar 19. Nilai ini sesuai dengan pernyataan bahwa pada umumnya proteinase dari organ pencernaan hewan laut mempunyai sifat unik, yaitu energi aktivitas Arrhenius yang rendah, konstanta Michaelis-Menten tinggi, stabil pada suhu dingin, mempunyai suhu optimum yang rendah, mempunyai pH optimum yang tinggi (Simpson 2000). Pada spesies yang lain, seperti ikan makarel (Scomber japanicus) (Park et al. 2002) dan ikan tuna (Thunnus thynnus) ( (Byun et al. 2002), kolagenase mempunyai pH optimum 7,5. Kolagenase lain, yaitu dari udang (Aoki et al. 2003) dan Daging ikan Pasific rockfish (Sebastes sp) (Brocho & Haard 1995), mempunyai pH optimum 7,5-8,5. Sedangkan kolagenase dari Bacillus subtillus FS-2 (Nagano & Kim 1999) mempunyai pH optimum 9,0. Aktivitas kolagenase U/ml
0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 4
5
6
7
8
9
10
11
pH
Gambar 19 Aktivitas kolagenase dari ekstrak kasar dan hasil pengendapan pada berbagai pH. (◊) ekstrak kasar, (□) hasil pengendapan
41
Profil aktivitas pH enzim menggambarkan pH pada saat gugus pemberi atau penerima proton yang penting pada sisi katalitik enzim berada pada tingkat ionisasi yang diinginkan. Kadang pH optimum enzim tidak sama dengan pH lingkungan normalnya, sedikit di atas atau di bawah pH lingkungannya. Aktivitas katalitik enzim di dalam sel diatur sebagian oleh perubahan pada pH lingkungannya (Lehninger 1993). 4.4.3 Pengaruh Ion Logam Penambahan ion logam seperti Mn2+ dan Co2+, kolagenase mengalami penurunan aktivitas, tetapi penambahan ion Ca2+ dan Na+ dapat meningkatkan aktivitas kolagenase. Pada ion logam yang sama, tetapi konsentrasinya berbeda, terjadi perbedaan aktivitas. Hal ini disebabkan karena pada konsentrasi tertentu, ion logam dapat berfungsi sebagai aktivator, dan pada konsentrasi tertentu pula ion logam dapat bertindak sebagai inhibitor (Bollag & Edelstein 1991). Hasil uji aktivitas kolagenase terhadap pengaruh ion logam pada ekstrak kasar kolagenase
Aktivitas relatif (%
dan hasil pengendapan disaji pada Gambar 20. 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 Kontrol
Ca 1 mM
Ca 5 mM
Co 1 mM
Co 5 mM
Ion logam
Mn 1 mM
Mn 5 mM
Na 1 mM
Na 5 mM
Gambar 20 Pengaruh ion logam terhadap ekstrak kasar kolagenase dan pengendapan hasil pengendapan. ekstrak kasar Penambahan ion logam sebagai kofaktor dapat mempengaruhi stabilitas enzim. Kolagenolitik proteinase yang dipurifikasi oleh Kristjánsson et al. (1995)
42
dari usus ikan Atlantic cod (Gadus morhua) mempunyai sifat termo stabil, atau stabil pada suhu tinggi dengan penambahan ion Ca2+, tetapi tanpa ion tersebut, enzim ini tidak stabil pada suhu di atas 30oC. 4.4.4 Pengaruh Inhibitor Kolagenase ekstrak kasar dapat dihambat dengan baik oleh PMSF 1 mM hingga 47% dan tidak ada penghambatan yang berarti dari EDTA 1 dan 5 mM (aktivitas relatifnya 93-96%). Sedangkan pada kolagenase hasil pengendapan, penghambatan terhadap PMSF 1 mM dan 5 mM mencapai 30 % dan 26%. Pengaruh beberapa jenis inhibitor terhadap aktivitas kolagenase dari ekstrak kasar dan hasil pengendapan disajikan dalam Gambar 21. Terdapat lima jenis protease berdasarkan gugus fungsionalnya pada sisi aktif im protease. Protease tersebut yaitu serin protease, sistein protease, aspartik protease, dan metallo protease. Jenis protease tesebut dapat ditentukann dengan mengetahui pengaruh inhibitor spesifik tehadap aktivitas enzim. Adapun inhibitor spesifik itu antara lain DFP, PMSF, 3,4 DCl (inhibitor untuk serin protease); E64, cistatin, kimostatin (inhibitor untuk sistein protease); pepstatin (inhibitor untuk aspartik protease) dan EDTA, 1,10 phenantrolin (inhibitor untuk metallo protease) (Nagase & Salvesen 2000). Dari prosentase penghambatan dan jenis inhibitornya, terdapat dugaan bahwa kolagenase dari organ dalam ikan bandeng ini merupakan jenis serin protease.
43
120
Aktivitas relatif (%
100 80 60 40 20
Fo rm am id e
m M
PS M F
5
m M 1
PS M F
5
m M
m M ED TA
1
ED TA
ko nt ro l
0
inhibitor
Gambar 21 Pengaruh beberapa inhibitor spesifik terhadap ekstrak kasar kolagenase dan hasil pengendapan Ekstrak kasar Pengendapan
Gel suwari terbentuk ketika pasta surimi yang dibuat dengan mencampurkan daging dengan garam dipanaskan. Pembentukan gel suwari terjadi pada pemanasan dengan suhu mencapai 50 °C. Ketika pemanasan gel ditingkatkan hingga 50-60 °C, maka struktur gel tersebut akan hancur. Fenomena ini disebut dengan modori. Pada rentang suhu tersebut enzim alkali proteinase akan aktif. Enzim tersebut dapat menguraikan kembali struktur jaringan tiga dimensi gel yang telah terbentuk (Jiang 2000). Protease yang terlibat dalam degradasi gel surimi, hanya jenis serin dan sistein (Kang & Lanier 2000). Kolagenase jenis serin umumnya ditemukan pada ikan. Tetapi Brocho & Haard (1995) menemukan koalgenase jenis metallo pada daging ikan Pasific rockfish (Sebastes sp). Kolagenase jenis metallo dapat menghidrolisis kolagen dan gelatin dengan baik, tetapi kurang dapat menghidrolisis kolagen jenis fibrillar. Diduga kolagenase ini terlibat dalam degradasi kolagen dan softening pada produk seafood.
44
4.4.5 Kestabilan Terhadap Suhu Tujuan pengujian kestabilan kolagenase terhadap suhu adalah untuk mengetahui pada suhu berapa kolagenase tetap aktif selama masa penyimpanan 30 menit. Kolagenase stabil selama penyimpanan pada suhu 10-50 oC. Selanjutnya, kolagenase mengalami penurunan aktivitasnya setelah penyimpanan pada suhu 60 oC. Enzim-enzim dari organ pencernaan hewan laut mempunyai sifat bersifat termostabil yang rendah (Simpson 2000). Kestabilan kolagenase terhadap suhu disajikan pada Gambar 22. Aktivitas kolagenase Unit/m
1,400 1,200 1,000 0,800 0,600 0,400 0,200 0,000 10
20
30
40
50
60
70
80
o
Suhu C
Gambar 22 Kestabilan kolagenase terhadap suhu. (◊) ekstrak kasar, (□) hasil pengendapan Kolagenase dari ikan bandeng ini stabil pada penyimpanan 10 oC. Kestabilan aktivitas kolagenase pada suhu dingin ini, pada beberapa spesies ikan masih dapat mengakibatkan perubahan sifat tekstur daging ikan. Hernandez et al. (2003) melaporkan daging ikan cod (Gadus morhua) mengalami softening selama penyimpanan dingin akibat aktivitas kolagenase yang memecah protein myofibrilar.
Hultman dan Rustrad (2004) melaporkan, bahwa aktivitas
kolagenase stabil pada suhu dingin selama penyimpanan 5, 10 dan 14 hari pada fillet ikan Atlantic salmon (Salmo salar) walaupun fillet telah diiradiasi sinar γ selama 3,5 jam pada suhu 20-22 oC. Kolagenase sangat baik mengkatalisis reaksi
45
hidrolisis pada suhu rendah 0-12 oC pada ikan Antartik krill (Euphausia superba, Dana) (Kolakowski & Sikorski 2000).
4.4.6 Kestabilan terhadap pH Kolagenase dari ekstrak kasar dan hasil pengendapan diuji kestabilan terhadap pH.
Hal ini bertujuan untuk mengetahui kestabilan enzim ketika
disimpan pada pH tertentu selama 30 menit. Dari hasil analisis, terlihat bahwa kolagenase pada pH 3-4 mempunyai aktivitas yang rendah, tetapi pada pH 6-11 kolagenase mempunyai aktivitas yang masih tinggi.
Aktivitas tertinggi
kolagenase stabil pada pH 7-9. Kestabilan kolagenase terhadap pH ditunjukkan pada Gambar 23.
Aktivitas kolagenase Unit/m
0,900 0,800 0,700 0,600 0,500 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 4
5
6
7
8
9
10
11
pH
Gambar 23 Kestabilan kolagenase terhadap pH. (◊) ekstrak kasar, (□) hasil pengendapan Proteinase dari ikan mempunyai sifat stabil pada pH netral mendekati basa (Kim et al. 2008).
Tetapi kolagenolitik proteinase yang dipurifikasi oleh
Kristjánsson et al. (1995) dari usus ikan Atlantic cod (Gadus morhua) dengan berat molekul 24,1 kDa, mempunyai pH optimum 8,0-9,5 dan suhu optimum 4550 oC, tetapi enzim ini tidak stabil pada pH dibawah 7,0. Beberapa proteinase jenis serin yang mempunyai kestabilan pH 7-9 antara lain tripsin, kimotripsin dan elastase (Simpson 2000).
46
4.4.7 Penentuan Berat Molekul Penentuan berat molekul dilakukan terhadap sampel dari semua tahapan pemurnian dengan menggunakan elektroforesis. Berat molekul diketahui dengan membandingkannya dengan berat molekul marker yang telah diketahui. Berat molekul ditentukan berdasarkan kurva standar marker, Y=-1,253X+5,1929 dimana Y=log berat molekul (D), X=mobilitas relatif protein. Hasil pemurnian akhir terdapat dua band dan mempunyai berat molekul 27,61 kDa serta 14,36 kDa.
Hasil ini memperkuat dugaan bahwa kolagenase hasil purifikasi organ
dalam ikan bandeng fase post rigor tergolong dalam serin kolagenase. Hasil perhitungan berat molekul kolagenase dapat dilihat pada Lampiran 5. Elektrogram hasil pemurnian disajikan pada Gambar 24.
27,61 kDa 14,36 kDa
Gambar 24 Elektrogram hasil pemurnian Kolagenase jenis serin dari berbagai sumber diketahui mempunyai berat molekul bervariasi. Kolagenase dari ikan bandeng ini mempunyai berat molekul yang hampir sama dengan kolagenase yang ditemukan pada ikan makarel (Scromber japanicus), yaitu 14,8 kDa (Park et al. 2002) dan ikan filefish (Novodon modestrus), yaitu 27 kDa (Kim et al. 2002).
Kolagenase dari
hepatopankreas udang (Pandalus eous) mempunyai berat molekul 22-23 kDa (Aoki et al. 2003), kolagenase hepatopankreas kepiting raja (Paralithodes camtschaticus) mempunyai berat molekul 24,8 kDa dan 23,5 kDa (Rudenskaya et al. 2004), dan kolagenase dari pilorik kaeka
ikan tuna (Thunnus thynnus)
mempunyai berat molekul 15 kDa (Byun et al. 2002).
47
Kolagenase dari daging ikan Pasific rockfish (Sebastes sp) menyerupai kolagenase yang ditemukan pada hewan mamalia, mempunyai berat molekul 47 dan 95 kDa (Brocho & Haard 1995). Jenis mettalokolagenase ini telah banyak dipelajari dari berbagai jaringan mamalia, bakteri, dan bisa ular (Park et al. 2002). Berat molekul metallokolagenase dari Bacillus subtillus FS-2 125 kDa (Nagano & Kim 1999),
Clostridium perfringens 120 kDa (Matsusita et al.
1994),
Photorhabdus luminescens 74 kDa (Marokhazi et al. 2004), Streptomyces sp Strain 3B 116 kD dan 97 kDa (Petrova et al. 2006) dan Streptomyces parvulus 52 kDa (Sakurai et al. 2009).
