4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Identitas Rumput Laut Coklat Rumput laut coklat dalam penelitian ini didapat dari perairan di sekitar Pulau Talango, Kabupaten Sumenep, Propinsi Jawa Timur pada bulan April 2008. Morfologi rumput laut coklat uji dapat dilihat pada Gambar 6.
c
d
b a
Gambar 6. Morfologi rumput laut coklat uji Keterangan: a = pelekap, b = tangkai utama, c = thallus, d = penyanggah
Gambar 6 memperlihatkan bahwa pelekap rumput laut coklat uji berbentuk cakram dan tidak mempunyai pelekap sekunder. Tangkai utama menggalah dan gepeng serta tidak mempunyai tulang belakang. Thallus pada batang utamanya berbentuk silindris namun pada percabangannya gepeng. Alat kelamin berada dalam satu rumah artinya tidak berjenis kelamin. Penyanggah gepeng, tidak berspiral, tersusun menyerupai rangkaian bunga dan bagian ujungnya meruncing. Pinggiran daun tidak berduplikasi.
Gelembung udara (vesicle) lonjong,
tangkainya gepeng dan ujungnya gepeng meruncing. Noiraksar dan Ajisaka (2008) melaporkan bahwa rumput laut coklat yang bercirikan seperti tersebut di atas diidentifikasi sebagai S. echinocarpum. Pusat Penelitian Oseanografi (P 2 O), Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) telah mengidentifikasi rumput laut
48 coklat uji ini dan menyatakan bahwa rumput laut coklat uji adalah S. echinocarpum. Sertifikat identifikasi rumput laut coklat bahan uji oleh P 2 O, LIPI dapat dilihat pada Lampiran 1. 4.2 Aktivitas antioksidan dan Identitas florotanin 4.2.1 Rendemen Data pengamatan dan analisis data rendemen ekstrak S. echinocarpum hasil pelarutan dalam berbagai pelarut dapat dilihat pada Lampiran 2. Pengaruh pelarut terhadap rerata rendemen, kadar florotanin dan aktivitas antioksidan ekstrak S. echinocarpum dapat dilihat pada Tabel 5. Tabel 5. Rendemen, kadar florotanin dan aktivitas antioksidan ekstrak S. echinocarpum1 Pelarut
Rendemen (%)
Florotanin Aktivitas Antioksidan Setara Tokoferol (setara mg floroglusinol/g ekstrak) (mg/100 mg ekstrak) a Etanol p.a. 3,05 ± 0,08 4,25 ± 0,11 100,79 ± 27,95 a Metanol p.a. 4,82 ± 0,09b 6,75 ± 0,21b 656,29 ± 133,14b 12,16 ± 0,17f Aseton 70% 8,93 ± 0,03e 56,99 ± 12,64a 6,49 ± 0,06c 7,71 ± 0,09c 52,91 ± 10,63 a Etanol 80% d d 7,39 ± 0,06 7,99 ± 0,03 141,75 ± 44,56 a Metanol 80% 10,83 ± 0,12e 24,24 ± 0,56f 33,48 ± 6,75 a Akuades 1 Data adalah rerata ± simpangan baku. Rerata dalam kolom yang sama dengan notasi huruf yang berbeda berarti berbeda sangat nyata (α = 1%, sidik ragam satu arah, BNT) a
Tabel 5 memperlihatkan rendemen ekstrak S. echinocarpum hasil pelarutan dengan akuades paling banyak dibanding pelarut lainnya. Hasil analisis data menunjukkan bahwa rendemen ekstrak S. echinocarpum dipengaruhi sangat nyata oleh jenis pelarut (p < 0,01) (Lampiran 2). Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak rumput laut coklat uji mempunyai polaritas tinggi. Wang et al. (2009) melaporkan bahwa rendemen rumput laut bila diekstrak dengan air dapat mencapai 45 %. Abdel-Fattah et al. (1978) menyatakan hampir 90 % penyusun rumput laut merupakan komponen yang mudah larut air. Namun demikian tidak keseluruhan komponen tersebut akan terlarut air. Hal ini terjadi karena ikatan hidrogen antara polisakarida penyusun struktur rumput laut coklat dengan ekstrak jauh lebih kuat dibanding ikatan hidrogen antara pelarut dengan ekstrak (Wang et al. 2009). Kuatnya ikatan hidrogen antara stuktur penyusun
S. echinocarpum dengan
ekstrak di dalamnya dapat menjadi penghalang terlarutnya seluruh komponen polar S. echinocarpum dalam air.
49 4.2.2 Florotanin Data pengamatan dan analisis data kadar florotanin ekstrak S. echinocarpum hasil pelarutan dalam berbagai pelarut dapat dilihat pada Lampiran 3. Tabel 5 memperlihatkan kadar florotanin berbagai ekstrak S. echinocarpum berkisar antara 4-12 mg/g berat ekstrak atau 0,4-1,2 % berat ekstrak. Koivikko et al. (2005) melaporkan bahwa florotanin yang terkandung dalam rumput laut coklat Fucus vesiculocus berkisar 0,1-6,2 % tiap berat sampel, Shibata et al. (2004) mendapatkan kandungan florotanin Eisenia bicyclis 3,1 %, E. cava 3,3 %, dan E. kurome 3,0 %, dan Arnold and Targett (1998) menyatakan bahwa florotanin dalam L. variegata 3,5 %, S. pteropleuron 5,5 %, dan F. distichus 4,7 %. Lebih lanjut dinyatakan bahwa florotanin rumput laut coklat di daerah beriklim dingin sedang berkisar 5-12 % tiap berat bahan, sedang di daerah tropis < 2 % tiap berat bahan. Hal ini menunjukkan bahwa kandungan florotanin S. echinocarpum uji sangat kecil dibanding yang dilaporkan oleh para peneliti terdahulu. Arnold dan Targett (1998), Pavia dan Toth (2000), dan Arnold dan Targett (2002) menyatakan bahwa keberadaan florotanin dalam rumput laut coklat sangat dipengaruhi oleh faktor lingkungan habitat rumput laut tersebut hidup, seperti: kadar radiasi, ketersediaan nutrisi, kepadatan herbivora dan musim. Pengambilan S. echinocarpum di perairan pulau Talango pada musim hujan menjadi faktor penyebab rendahnya kadar florotanin rumput laut coklat uji. Pada musim ini kadar radiasi dan kadar nutrisi perairan rendah. Saat nutrisi perairan sedikit, herbivora yang berada di dalamnya juga sedikit. Hasil analisis data menunjukkan bahwa kadar florotanin ekstrak S. echinocarpum dipengaruhi sangat nyata oleh jenis pelarut (p < 0,01) (Lampiran 3). Tabel 5 memperlihatkan kadar florotanin ekstrak S echinocarpum yang dilarutkan aseton 70% paling banyak dibanding pelarut lainnya. Hal ini menunjukkan bahwa florotanin ekstrak S. echinocarpum mempunyai indeks polaritas yang hampir menyerupai aseton 70%. Menurut aturan like dissolve like bahwa suatu ekstraktan akan terlarut dalam pelarut karena perbedaan nilai polaritasnya tidak jauh berbeda. Ada beberapa faktor penyebab terjadinya pelarutan: (1) adanya interaksi antara bahan terlarut dengan pelarut, (2) interaksi hidrogen antara pelarut dengan gugus fungsional senyawa yang dilarutkan, (3)
50 banyaknya ikatan hidrogen pada senyawa tersebut, dan (4) energi interaksi antara bahan terlarut dengan pelarut dalam keadaan berkeseimbangan dan perbedaan indeks Hildebrand antar solut dan solvent kurang dari 7 (Snyder 1974; Barwick 1997; Houghton dan Raman 1998; Tantishaiyakul et al. 2006; Xu dan RedmanFurey 2007). Tabel 5 memperlihatkan aseton 70% dapat melarutkan florotanin lebih optimal dibanding pelarut lainnya. Hal ini dimungkinkan karena pelarut ini dapat mengurangi interaksi antara florotanin dengan protein dan bahkan dapat memutus ikatan hidrogen yang terbentuk antara florotanin dengan protein struktur sel. Koivikko et al. (2005) menyatakan florotanin mempunyai sifat yang sama dengan tanin yaitu berkemampuan membentuk banyak ikatan hidrogen dengan protein. 4.2.3 Aktivitas Antioksidan Hasil analisis data menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan ekstrak S. e echinocarpum dipengaruhi sangat nyata oleh jenis pelarutnya (p < 0,01)
(Lampiran 4). Tabel 5 memperlihatkan aktivitas antioksidan ekstrak S echinocarpum hasil pelarutan dengan metanol paling kuat dibanding pelarut lainnya. Chandini et al. (2008) melaporkan hasil serupa bahwa aktivitas antioksidan ekstrak S. marginatum, P. tetrasomatica dan T. conoides hasil ekstraksi dengan metanol lebih kuat dibanding pelarut lainnya. Valgimigli et al. (1995), Litwinienko dan Ingold (2003), dan Nielsen dan Ingold (2006) menjelaskan bahwa metanol mempunyai sifat mudah memposisikan atom hidrogen atau gugus hidroksil senyawa untuk membentuk ikatan hidrogen. Adanya ikatan ini mengakibatkan perpindahan proton ke radikal bebas akan lebih mudah (Wright et al. 2001). Litwinienko dan Ingold (2004) menambahkan bahwa efisiensi laju pemindahan hidrogen ke radikal bebas dipengaruhi oleh kemampuan pelarut untuk menerima atom hidrogen. Bila suatu pelarut tidak mampu menerima atom hidrogen maka abstraksi atom hidrogen ke radikal bebas tidak terjadi. Kuatnya aktivitas antioksidan florotanin dalam ekstrak juga dipengaruhi oleh banyaknya gugus hidroksilnya. Sanchez-Moreno et al. (1998) dan Pinelo et al. (2004) menjelaskan aktivitas pemungutan radikal bebas oleh senyawa fenol mengikuti aturan hubungan struktur-aktivitas. Senyawa fenol yang mempunyai gugus hidroksil lebih banyak akan lebih mudah membentuk ikatan hidrogen
51 dengan radikal bebas dan selanjutnya akan lebih mudah juga dalam memindahkan protonnya ke radikal bebas. Villano et al. (2007) menggambarkan bahwa senyawa polifenol yang mempunyai gugus hidroksil lebih banyak akan memiliki stoikiometri antioksidan yang lebih besar, artinya total radikal bebas yang direduksi oleh antioksidan akan lebih banyak. Kuatnya aktivitas antioksidan florotanin dalam ekstrak juga dipengaruhi oleh konformasi strukturnya. Hal ini berkaitan dengan karakteristik stabilisasi internal florotanin sesaat setelah mendonorkan protonnya. Florotanin mempunyai struktur sebagai polifenol, yaitu senyawa yang kaya elektron. Keberadaan gugus hidroksil yang menempel pada cincin aromatis polifenol berperan sangat penting dalam kemampuan pereduksian radikal bebas. Polifenol bila ada radikal bebas cenderung mendonorkan elektronnya untuk menjadi radikal fenoksil (PhO*). Radikal ini selanjutnya distabilisasi secara internal melalui mekanisme: (1). delokalisasi resonansi elektron radikal fenoksil tidak berpasangan ke posisi orto dan para cincin, (2). stabilisasi melalui ikatan hidrogen antara radikal fenoksil dengan gugus hidroksil, dan (3). stabilisasi radikal ini melalui dimerisasi antar radikal fenoksil untuk menghasilkan ikatan CC atau CO baru (Nakai et al. 2006; Kang et al. 2006; Shibata et al. 2008; Li et al. 2009). Tabel 5 memperlihatkan bahwa kandungan florotanin terbanyak didapat dalam ekstrak aseton 70% dan aktivitas antioksidan terkuat didapatkan pada ekstrak metanol. Hubungan kadar florotanin dan aktivitas antioksidan ekstrak S. echinocarpum dalam berbagai pelarut dapat dilihat pada Gambar 7. Florotanin
Florotanin (eq mg floroglusinol/g ekstrak)
Akt. Antioksidan
800
600 10 400 5 200
0
de s ku a A
80 % et an ol
80 % M
Et an ol
70 %
se to n A
et an ol M
Et an ol
p.
p.
a.
a.
0
Akt. Antioksidan Setara Tokoferol (mg/g ekstrak)
15
Gambar 7. Hubungan kadar florotanin dan aktivitas antioksidan ekstrak S. echinocarpum dalam berbagai pelarut
52
Gambar 7 menunjukkan bahwa florotanin dalam ekstrak metanol mempunyai aktivitas antioksidan yang paling kuat. Lopez et al. (2011) melaporkan bahwa makin tinggi kadar polifenol rumput laut maka makin kuat aktivitas antioksidannya, namun Nakai et al. (2006), Shibata et al. (2008), dan Li et al. (2009)
melaporkan bahwa yang berperan kuat terhadap aktivitas
antioksidan rumput laut coklat adalah struktur konformasi florotaninnya. Hal ini menunjukkan bahwa florotanin yang terlarut dalam metanol mempunyai konformasi struktur yang mudah mengabstraksi hidrogen. Shibata et al. (2008) menjelaskan bahwa keberadaan gugus hidroksil yang menempel pada cincin aromatis berperan sangat penting dalam kemampuan pereduksian radikal bebas. Kuatnya aktivitas antioksidan florotanin dalam ekstrak juga dipengaruhi oleh entalpi disosiasi ikatan hidrogennya. Bila entalpi disosiasi ikatan hidrogen suatu polifenol kecil, maka pemindahan hidrogen ke radikal bebas akan lebih mudah (Nielsen dan Ingold 2006). Berdasar penjelasan di atas tampak bahwa florotanin dalam ekstrak metanol S. echinocarpum mempunyai gugus hidroksil yang lebih banyak, konformasinya lebih mudah dalam menstabilisasi struktur, dan mempunyai entalpi disosiasi ikatan hidrogen yang lebih kecil dibanding florotanin dalam ekstrak S. echinocarpum dalam pelarut lainnya. 4.2.4 Identitas florotanin Berdasarkan hasil uji aktivitas antioksidan, maka ekstrak metanol dipilih untuk diuji lebih lanjut, yaitu: elusidasi struktur florotanin yang terkandung dalam ekstrak, uji toksisitas, uji disfungsi sel endotelium aorta, dan uji stres oksidatif. Elusidasi
struktur
florotanin
yang
terkandung
dalam
ekstrak
S.
echinocarpum melalui beberapa tahap, yaitu: partisi, fraksinasi, dan identifiksi. Ekstrak metanol S. echinocarpum dipartisi dietil eter, air, kloroform dan metanol pada corong pemisah, lalu fase metanol ditampung. Hasil partisi terhadap ekstrak metanol S. echinocarpum berupa partisi metanol dapat dilihat pada Gambar 8.
53
Gambar 8. Partisi metanol dari ekstrak metanol S. echinocarpum Partisi metanol yang didapat selanjutnya difraksinasi dalam kolom kromatografi berisi silika gel G-60, 200-500 µm (20 cm, id 1 cm). Elusi dilakukan dengan kloroform:metanol (8:2), kloroform:metanol (5:5) dan kloroform:metanol (2:8) masing-masing 40 mL. Hasil penampungan eluat dalam botol 2,5 mL didapatkan dua eluat, yaitu: eluat pertama pada fraksi nomer 11-20 dan eluat kedua pada fraksi nomer 33-37. Kedua eluat tersebut dapat dilihat pada Gambar 9. A
B
(fraksi no 11-20) Gambar 9. Eluat pertama (A) dan eluat kedua (B) Kedua eluat selanjutnya diidentifikasi kandungannya pada kromatografi lapis tipis (KLT) silika gel F254 dengan eluen kloroform:metanol:air:asam asetat (53:38:6:3) dan menggunakan floroglusinol sebagai senyawa standar. Sebelum di identifikasi dengan KLT, eluat dipekatkan, ditambah Na 2 CO 3 anhidrat, dicuci metanol tiga kali, dibekukan semalam dan didapatkan kristal putih. Hasil identifikasi eluat pada KLT berupa noktah dapat dilihat pada Gambar 10.
54
Eluat pertama
Floroglusinol
Eluat kedua
Gambar 10. Noktah floroglusinol, eluat pertama dan kedua Gambar 10 memperlihatkan bahwa faktor retensi (R f) noktah eluat pertama menyerupai R f senyawa standar yaitu 0,92 dan dapat dinyatakan bahwa eluat pertama adalah floroglusinol. Sementara itu R f noktah eluat kedua adalah 0,26. Karena belum didapatkan identitas pada eluat kedua maka dilakukan identifikasi lebih lanjut dengan metode spektroskopi. Metode spektroskopi ultra ungu bertujuan untuk mendapatkan gambaran transisi energi dari elektron terluar. Hasil serapan ultra ungu eluat kedua dari ekstrak metanol S. echinocarpum dapat dilihat pada Gambar 11. 190.6 1.10 1.00 0.90 0.80
AU
0.70 0.60 0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 200.00
250.00
300.00 nm
350.00
Gambar 11. Spektra serapan ultra ungu eluat kedua dari ekstrak metanol S. echinocarpum
55 Gambar 11 memperlihatkan bahwa serapan ultra ungu eluat kedua dari ekstrak metanol S. echinocarpum berupa serapan tunggal pada panjang gelombang maksimal sekitar 210 nm. Shibata et al. (2006) melaporkan tipikal profil spektra ultra ungu senyawa florotanin berada pada panjang gelombang 210 nm. Glombitza dan Rosener (1974) melaporkan bahwa serapan maksimal ultra ungu bifuhalol dari rumput laut coklat (Bifurcaria bifurcata) pada 209,5 nm. Silverstein et al. (2005) menyatakan serapan ultra ungu tunggal dengan intensitas rendah hingga menengah terjadi pada panjang gelombang di bawah 220 nm menunjukkan adanya transisi n → σ*. Transisi ini oleh Pavia et al. (2009) dinyatakan sebagai transisi senyawa yang mengandung gugus fungsional alkohol dan eter. Benzena mempunyai dua serapan maksimal yaitu serapan primer pada panjang gelombang 180 dan 202 nm, dan serapan sekunder pada 255 nm (Pavia et al. 2009). Saat atom hidrogennya tersubstitusi gugus hidroksil, serapan ini akan mengalami pergeseran batokromis sekitar 8 nm untuk serapan primer dan 16 nm untuk serapan sekunder. Namun bila senyawa ini dilarutkan dalam pelarut polar serapan sekundernya akan tidak nampak. Hal inilah yang menyebabkan spektra ultra ungu eluat kedua hanya tunggal. Sementara itu Pretsch et al. (2009) menyatakan bahwa suatu polisubstitusi benzena dengan substituennya berupa gugus hidroksil akan mempunyai serapan maksimal 209-210,5 nm. Berdasarkan interpretasi terhadap serapan ultra ungu, maka eluat kedua adalah senyawa yang mengandung gugus fungsional alkohol, eter dan benzena. Benzena yang terdapat pada eluat ini bersubstituen berupa polihidroksil. Metode spektroskopi infra merah bertujuan untuk mendapat gambaran gugus fungsional suatu molekul. Hasil serapan infra merah eluat kedua dari ekstrak metanol S. echinocarpum dapat dilihat pada Gambar 12.
56
100 %T 95
2694.56
90
2052.26
85
80
883.40
950.91
1637.56 1624.06
55
545.85
680.87 653.87
60
605.65
1078.21
65
1035.77
1303.88
1247.94 1217.08
70
1404.18
%T
2943.37
75
45
3550.95 3477.66 3439.08 3406.29 3381.21 3344.57 3313.71
50
40
35 4000 3600 SARGASSUM
3200
2800
2400
2000
1800
1600
1400
1200
1000
800
600 1/cm
1/cm
Gambar 12. Spektra serapan infra merah eluat kedua dari ekstrak metanol S. echinocarpum Gambar 12 memperlihatkan adanya beberapa puncak serapan yang menunjukkan gugus fungsional pembentuk senyawa dari eluat metanol kedua. Puncak serapan itu antara lain: 3406 cm-1, 2943 cm-1, 2694 cm-1, 2052 cm-1, 1637 cm-1, 1404 cm-1, 1303 cm-1, 1247 cm-1, 1217 cm-1, 1078 cm-1, 1035 cm-1, 950 cm1
, 883 cm-1, 680 cm-1, 653 cm-1, 605 cm-1, dan 545 cm-1. Menurut Pavia et al.
(2009) serapan pada 3406 cm-1 menunjukkan adanya gugus hidroksil, pasangan serapan 1637 cm-1 dan 1404 cm-1 menunjukkan aromatis eter, pasangan serapan 1247 cm-1 dan 1035 cm-1 menunjukkan keberadaan fenil eter, serapan pada 1217 cm-1 menunjukkan gugus C-O fenol, dan pasangan serapan 883 cm-1 dan 680 cm-1 menunjukkan out of plane dari suatu model trisubstitusi 1, 3, dan 5. Berdasar interpretasi serapan infra merah tersebut dapat disimpulkan bahwa senyawa yang terkandung dalam eluat metanol kedua merupakan senyawa fenil eter yang mengandung senyawa hidroksil pada posisi atom karbon nomer 1, 3, dan 5.
57 Metode kromatografi cair kinerja tinggi dapat digunakan untuk menentukan kemurnian suatu zat dari suatu hasil isolasi. Kromatogram eluat metanol kedua dari ekstrak metanol S. echinocarpum dapat dilihat pada Gambar 13. 2.00
AU
1.50 1.00 0.50 0.00 2.00
4.00
6.00 Minutes
8.00
10.00
Gambar 13. Kromatogram eluat kedua dari ekstrak metanol S. echinocarpum Gambar 13 memperlihatkan bahwa eluat kedua dari ekstrak metanol S. echinocarpum yang diinjeksi dan dielusikan dalam kolom High Performace Liquid Chromatography (HPLC) hanya berupa puncak tunggal. Berdasarkan hasil elusi ini dapat dikatakan bahwa eluat hanya mengandung satu senyawa. Gambar 13 juga memperlihatkan bahwa eluat uji yang dielusikan pada sistem kromatografi ini termasuk senyawa polar. Hal ini dimungkinkan karena fase gerak dalam sistem kromatografi ini adalah pelarut polar (95% H 2 O + 0.05% asam format, 5% asetonitril). Berdasar interaksi inter dan intra molekular senyawa dengan fase diam atau dengan fase gerak didapatkan bahwa senyawa sudah terelusi pada sekitar menit ke-2. Artinya bahwa interaksi inter dan intra molekular senyawa uji dengan eluen lebih kuat dibanding dengan fase diam. Niessen (2006) menjelaskan bahwa dalam sistem kromatografi fase terbalik interaksi ikatan hidrogen senyawa uji polar terhadap fase diam sangat lemah dibanding ikatannya dengan eluen. Lebih lanjut Niessen (2006) menyatakan bahwa retensi senyawa uji polar pada kromatografi fase terbalik akan makin menurun dengan makin meningkatnya polaritas senyawa uji. Metode spektroskopi spektra massa bertujuan untuk mendapatkan berat molekul senyawa uji.
Spektra massa eluat kedua dari ekstrak metanol S.
echinocarpum yang dianalisis dengan High Performance Liquid Chromatography
58 Electrospray Ionization Time of Flight Mass Spectrometry (HPLC-ESI-TOF-MS) mode ion positif dapat dilihat pada Gambar 14.
m/z
Gambar 14. Spektra massa eluat kedua ekstrak metanol S. echinocarpum Gambar 14 memperlihatkan bahwa eluat kedua ekstrak rumput laut coklat (S. echinocarpum) mempunyai m/z dominan pada 288,2715. Berat molekul analat ini menunjukkan suatu dimer floroglusinol dengan rumus molekul C 12 H 10 O 7 . Gross (2004) menyatakan ion yang terbentuk dari metode electrospray ionization (ESI) sangat tergantung pada polaritas analat dan karakteristik pelarut. Berdasar waktu retensi analat dengan HPLC menunjukkan bahwa senyawa uji ini adalah senyawa polar. Gross (2004) menyatakan bahwa ion yang terbentuk dari suatu senyawa polar pada sistem ESI mode ion positif akan berupa [M+Na]+. Bila digambarkan struktur senyawa ekstrak metanol terlihat pada Gambar 15. OH
OH
Na HO
O
O OH
OH
Gambar 15. Struktur senyawa eluat kedua Berdasar rumus molekul senyawa C 12 H 10 O 7 yang kehilangan proton dan diganti dengan ion Na, maka akan didapat berat molekul senyawa sebesar 266. Artinya senyawa dalam ekstrak metanol S. echinocarpum dapat dinyatakan sebagai bifuhalol. Nakai et al. (2006) mendapati ekstrak metanol S. ringgoldianum berstruktur oligomer dari bifuhalol. Singh dan Bharate (2006)
59 menyatakan bahwa bifuhalol adalah senyawa turunan floroglusinol atau dimer floroglusinol yang berberat molekul 266 Da. Berdasar analisis spektrometrik ultra ungu, infra merah dan spektra massa di atas maka dapat disimpulkan bahwa senyawa yang terkandung dalam eluat kedua ekstrak metanol S. echinocarpum adalah bifuhalol. Berarti secara keseluruhan ekstrak metanol S. echinocarpum mengandung floroglusinol dan bifuhalol. 4.3 Toksisitas Akut Seluruh prosedur pemeliharaan, penggunaan dan perlakuan terhadap hewan uji telah disetujui oleh komisi etik penelitian hewan, Universitas Brawijaya dengan nomer 34-KE tahun 2009. Surat keterangan tentang kelaikan penggunaan hewan uji dan perlakuannya dalam penelitian ini dapat dilihat pada Lampiran 5.
4.3.1 Berat badan Data pengamatan kenaikan berat badan mencit strain BALB/c uji akibat pemberian ekstrak metanol S. echinocarpum selama masa uji toksisitas dapat dilihat pada Lampiran 6. Hasil analisis data menunjukkan bahwa kenaikan berat badan mencit antar perlakuan pada akhir masa penelitian berbeda sangat nyata (p < 0,01), kecuali antara perlakuan dosis 2500 mg/kg BB dengan 5000 mg/kg BB yang tidak menunjukkan perbedaan (p = 0,341) (Lampiran 6). Kenaikan berat badan mencit uji akibat pemberian ekstrak metanol rumput laut coklat (S.
Kenaikan berat badan (%
echinocarpum) selama masa uji toksisitas dapat dilihat pada Gambar 16. 16 14 12 10 8 6 4 2 0 -2 -4 -6
d c b
0 mg/kg 625 mg/kg 1250 mg/kg
a
2500 mg/kg 5000 mg/kg
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14
Lama (hari)
Gambar 16. Persentase kenaikan berat badan mencit akibat pemberian ekstrak metanol S. echinocarpum.
60 Gambar 16 menunjukkan bahwa kenaikan berat badan hewan uji mengalami hambatan akibat pemberian ekstrak metanol S. echinocarpum. Perlakuan dosis 625 mg/kg BB menunjukkan kecenderungan kenaikan yang hampir sama dengan perlakuan kontrol negatif, walau pada akhir masa uji keduanya mengalami perbedaan sangat nyata (p < 0,01). Hal ini menunjukkan bahwa perlakuan ekstrak metanol S. echinocarpum dosis 625 mg/kg BB tidak mengakibatkan gangguan metabolisme dalam hewan uji. Nagayama et al. (2002) melaporkan bahwa mencit yang diberi florotanin E. kurome menunjukkan tidak mengalami gangguan pertumbuhan. Targett dan Arnold (1998) melaporkan ada beberapa herbivora laut yang makanannya adalah rumput laut coklat dan menunjukkan bahwa herbivora tersebut tetap tumbuh. Herbivora ini tetap tumbuh karena rumput laut yang dimakan < 10 g per hari. Perlakuan ekstrak metanol S. echinocarpum dosis 1250 mg/kg BB, 2500 mg/kg BB dan 5000 mg/kg BB pada awal perlakuan mengakibatkan hambatan dan penurunan berat badan hewan uji, namun selanjutnya hewan uji mengalami kenaikan berat badan. Stern et al. (1996) menyatakan florotanin dapat menghambat pertumbuhan organisme bila kadar yang dikonsumsikan > 10 g tiap kg berat badan. Hal ini diakibatkan adanya kemampuan florotanin untuk membentuk ikatan hidrogen dengan protein termasuk enzim dalam saluran pencernaan. 4.3.2 Dosis kematian 50% (LD 50 ) Hasil uji menunjukkan bahwa pemberian ekstrak metanol S. echinocarpum sekali secara oral hingga dosis 5000 mg/kg BB tidak mengakibatkan kematian pada mencit uji. Hal serupa dilaporkan oleh Nagayama et al. (2002) bahwa ekstrak rumput laut dari Ecklonia kurome yang diperlakukan pada mencit pada suatu uji toksisitas akut dengan dosis mencapai 5000 mg/kg tidak mengakibatkan kematian pada mencit uji tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa komponen atau senyawa yang terkandung dalam ekstrak metanol S. echinocarpum tergolong senyawa yang relatif tidak toksik. Derelanko dan Holinger (1995) menyatakan bahwa suatu bahan atau senyawa bila dikonsumsikan secara oral pada hewan percobaan dengan dosis 5000 mg/kg BB dan tidak mengakibatkan kematian, maka bahan atau senyawa tersebut digolongkan relatif tidak toksik.
61
4.3.3 Histopatologis hati dan ginjal Data pengamatan histopatologis hati mencit uji akibat pemberian ekstrak metanol S. echinocarpum dapat dilihat pada Lampiran 7. Hasil analisis data menunjukkan bahwa skor histologis hati mencit antar perlakuan berbeda sangat nyata (p < 0,01). Fotomikrograf dan skor histologis hati mencit yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum dapat dilihat pada Gambar 17 dan 18. A
B
E
D
C
◄
Gambar 17. Fotomikrograf hati mencit yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum dosis 0 mg/kg BB (A), 625 mg/kg BB (B), 1250 mg/kg BB (C), 2500 mg/kg BB (D), dan 5000 mg/kg BB (E). (Perbesaran 400 x) (Pewarnaan H&E) ( = 15 µm) Keterangan: ◄ = sel radang,
= nekrosis,
= vakuola, dan
= steatosis
3
Skor histologis
2.5
2.06
2 1.50
d 2.11
bc
ab
1.5 1
cd
0.58
a
1.00
0.5 0 0
625
1250
2500
5000
Dosis (mg/kg BB)
Gambar 18. Skor histologis hati mencit yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum
62 Gambar 17 dan 18 menunjukkan bahwa pemberian ekstrak metanol S. echinocarpum dosis > 1250 mg/kg BB pada mencit uji telah dapat mengakibatkan perubahan histologis pada hepatosit hingga mengalami nekrosis. Sudha et al. (2008) dan Hsu et al. (2011) menunjukkan bahwa pemberian tanin > 1500 mg/kg BB dapat mengakibatkan kerusakan hati dan hepatotoksik. Ada dua hal yang memungkinkan tanin pada dosis tersebut bersifat hepatotoksik, yakni: (1) pada dosis tersebut, tanin dapat merusak membran mitokondria. Perusakan ini akan memicu pembentukan spesies oksigen reaktif hingga dapat memberi efek sitotoksik. (2) pemberian dosis yang sangat besar sekaligus dapat mengakibatkan kerusakan jaringan. Damjanov (1996) menyatakan bila rangsangan luar yang mengenai jaringan atau sel melebihi kapasitas sel beradaptasi, maka akan terjadi cedera sel tak imbal balik dan akhirnya sel mati (nekrosis). Data pengamatan histopatologis ginjal mencit uji akibat pemberian ekstrak metanol S. echinocarpum dapat dilihat pada Lampiran 7. Hasil analisis data menunjukkan bahwa skor histologis ginjal mencit antar perlakuan berbeda sangat nyata (p < 0,01). Fotomikrograf dan skor histologis ginjal mencit yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum dapat dilihat pada Gambar 19 dan 20. B
A
C
D
E ◄
Gambar 19. Fotomikrograf tubulus ginjal mencit yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum dosis 0 mg/kg BB (A), 625 mg/kg BB (B), 1250 mg/kg BB (C), 2500 mg/kg BB (D), dan 5000 mg/kg BB (E). (Perbesaran 400 x) (Pewarnaan H&E) ( = 15 µm) Keterangan: ◄ = dilatasi,
= nekrosis,
= epitel terkelupas
63
3 2.43
Skor histologis
2.5 2.03 2
d
c
1.60 b
1.5 1 0.5
0.30
a
0.53
a
0 0
625
1250
2500
5000
Dosis (mg/kg BB)
Gambar 20. Skor histologis ginjal mencit yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum Gambar 19 dan 20 menunjukkan bahwa pemberian ekstrak metanol S. echinocarpum dosis > 1250 mg/kg BB pada mencit uji telah dapat mengakibatkan perubahan histologis pada tubulus ginjal hingga mengalami nekrosis. Sudha et al. (2008) dan Hsu et al. (2011) menunjukkan bahwa pemberian tanin > 1500 mg/kg BB dapat mengakibatkan kerusakan ginjal dan nefrotoksik. Hal ini dimungkinkan karena adanya efek lipid peroksidasi dan pemekatan tanin pada tubulus. Rodrigo dan Rivera (2002) menyatakan kerusakan atau kematian sel ginjal dapat diakibatkan oleh stres oksidatif. Hervas et al. (2003) menyatakan lipid peroksidasi dapat dipicu oleh pemberian tanin > 1500 mg/kg BB dengan mekanisme perusakan membran mitokondria. Desphande (2002) menyatakan bahwa tubulus mudah mengalami kerusakan atau nekrosis oleh zat dari luar karena jaringan ini merupakan tempat pemekatan zat sebelum diekskresikan dari tubuh.
Bioaktivitas ekstrak metanol S. echinocarpum pada tikus diabetes melitus Penggunaan hewan uji diperlukan untuk mendapatkan gambaran stres oksidatif tikus dan disfungsi sel endotelium aorta diabetes melitus yang diperlakukan dengan ekstrak metanol S. echinocarpum. Pengamatan stres oksidatif meliputi: malondialdehid (MDA), superoksida dismutase (SOD), katalase, glutation peroksidase (GSH-Px) serum dan profil Cu,Zn-SOD hati dan ginjal. Pengamatan disfungsi sel endotelium meliputi: vasorelaksasi, kepekaan (sensitivitas) reseptor sel endotelium aorta, dan rasio sel endotelium aorta.
64 4.4 Stres oksidatif 4.4.1 Berat badan Data pengamatan dan analisis data perubahan berat badan tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum dapat dilihat pada Lampiran 8. Hasil analisis data menunjukkan bahwa kenaikan berat badan tikus antar perlakuan pada akhir masa penelitian berbeda sangat nyata (p < 0,01). Kenaikan berat badan tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum selama masa penelitian dapat dilihat pada Gambar 21. Kenaikan berat badan (g)
75 50
e Normal DM + S0
25 d
0
c
DM + S150 DM + S300 DM + S450
b
-25
a
-50 0
2
4
6
8
10
12
Waktu (minggu)
Gambar 21. Kenaikan berat badan tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum selama masa penelitian Gambar 21 memperlihatkan berat badan tikus normal hingga akhir masa penelitian mengalami kenaikan, sedang tikus diabetes melitus mengalami penurunan. Chandra et al. (2007) juga melaporkan bahwa berat badan tikus normal selama masa penelitian terus mengalami peningkatan, sedang tikus diabetes melitus mengalami penurunan. Hal ini disebabkan tikus diabetes melitus mengalami kegagalan sintesis glikogen dalam sel. Grover et al. (2002) menjelaskan glikogenesis tidak terjadi pada diabetes akibat defisiensi ataupun insensitivitas insulin. Keadaan tersebut mengakibatkan glukosa tidak dapat masuk ke dalam sel sehingga pembentukan glikogen dalam sel hati dan otot tidak terjadi. Sementara itu karena tidak ada sumber energi (glukosa) yang masuk, sel akan melakukan glukoneogenesis. Glukoneogenesis merupakan mekanisme sintesis glukosa dengan membongkar lemak dan protein dari hati dan jaringan lemak. Bila
65 proses ini berlangsung kronis berakibat pada penurunan berat badan (Brody, 1999). Gambar 21 memperlihatkan bahwa kenaikan berat badan tikus diabetes yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum berbeda sangat nyata (p < 0,01). Tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak rumput laut coklat dosis 450 mg/kg pada akhir masa penelitian menunjukkan adanya kenaikan berat badan. Hal ini dimungkinkan karena florotanin dalam ekstrak metanol S. echinocarpum pada dosis tersebut dapat meningkatkan ambilan glukosa. Iwai (2008) dan Nwosu et al. (2010) melaporkan bahwa hewan diabetes melitus yang diberi ekstrak Ecklonia stolonifera dan Ascophyllum nodosum memperlihatkan kenaikan berat badan. Kenaikan ini kemungkinan akibat florotanin dalam rumput laut tersebut mengaktivasi AMPK (adenosine monophosphate-activated protein kinase). AMPK yang teraktivasi dapat berperan dalam pengaturan metabolisme seluler pengambilan glukosa (Kang et al. 2010; Fogarty dan Hardie 2010). Kinase ini meningkatkan pengambilan glukosa dari darah ke organ target melalui fosforilasi protein kinase B (PKB atau Akt substrat 160 kDa) (Hwang et al. 2009). Menurut Zhang et al. (2009) AMPK pada otot dapat meningkatkan ekspresi dan translokasi glucose transporter 4, serta aktivitas heksokinase, sehingga glukosa masuk dalam sel, dan selanjutnya dapat meningkatkan kadar glikogen dan berat badan.
4.4.2 Glukosa Darah Data pengamatan dan analisis data perubahan glukosa darah tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum dapat dilihat pada Lampiran 9. Hasil analisis data menunjukkan bahwa kadar glukosa darah tikus antar perlakuan pada akhir masa penelitian berbeda sangat nyata (p < 0,01). Perubahan kadar glukosa darah tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol dilihat pada Gambar 22.
S. echinocarpum selama masa penelitian dapat
66
Glukosa darah (mg/dL)
600 500
e d
400
c
Normal DM + S0 DM + S150
300
b
200
DM + S300 DM + S450
a 100 0 0
2
4
6
8
10
12
Waktu (m inggu)
Gambar 22. Kadar glukosa darah tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum selama masa penelitian Gambar 22 memperlihatkan bahwa glukosa darah tikus normal selama masa penelitian tetap normal, sedang tikus diabetes melitus glukosa darahnya hingga akhir masa penelitian tetap di atas 200 mg/dL. Iwai (2008) dan Frode dan Medeiros (2008) melaporkan bahwa kadar glukosa darah hewan uji diabetes yang diinduksi streptozotocin (STZ) lebih tinggi berbeda sangat nyata dibanding hewan uji normal. Hiperglikemik pada hewan coba diabetes tersebut terjadi akibat defisiensi insulin. Frode dan Medeiros (2008) menjelaskan defisiensi insulin pada hewan diabetes yang diinduksi STZ terjadi karena masuknya STZ ke dalam sel β pankreas. STZ dapat masuk ke dalam sel β pankreas melalui glukosa transporter 2 (Glut 2), karena STZ struktur α atau β anomernya berupa glukosa. Masuknya STZ dalam sel β pankreas menyebabkan alkilasi DNA sel β tersebut dan akhirnya sel β pankreas mengalami nekrosis. Gambar 22 memperlihatkan bahwa kadar glukosa darah tikus diabetes yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum mengalami penurunan sangat nyata dibanding tikus diabetes (p < 0,01). Pada akhir masa penelitian perlakuan ekstrak metanol S. echinocarpum dosis 450 mg/kg berat badan dapat menurunkan kadar glukosa darah tikus diabetes melitus hingga di bawah 200 mg/dL. Lamella et al. (1989) juga telah melaporkan bahwa Sargassum sp mempunyai sifat hipoglikemik terhadap kelinci normal maupun diabetes. Penurunan ini dimungkinkan karena florotanin dalam ekstrak metanol S. echinocarpum mampu menghambat aktivitas α glukosidase dan menunjukkan aktivitas seperti insulin (insulin mimic).
67 Iwai (2008), Lee et al. (2009), Lee et al. (2010a), dan Nwosu et al. (2010) melaporkan florotanin dapat menurunkan glukosa darah karena mampu menghambat aktivitas α amilase dan α glukosidase. Sisi aktif enzim tersebut diikat oleh florotanin hingga aktivitas pemecahan pati menjadi glukosa oleh enzim tersebut di saluran pencernaan menjadi terhambat. Sementara itu Kang et al. (2010) menjelaskan bahwa florotanin dapat bersifat seperti insulin karena mampu meningkatkan pengambilan glukosa darah ke dalam otot melalui pengaktifan lintasan AMPK. Hwang et al. (2009) dan Borriello et al. (2010) menyatakan pengaktifan AMPK oleh polifenol dapat meningkatkan aktivitas Akt sehingga glucose transproter 4 segera di-translokasikan ke membran sel. Keberadaan glucose transporter ini bermanfaat mengambil glukosa dalam darah ke dalam otot. 4.4.3 Hemoglobin A 1 c (HbA 1 c) Data pengamatan dan analisis data perubahan HbA 1 c tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum dapat dilihat pada Lampiran 10. Hasil analisis data menunjukkan bahwa HbA 1 c tikus antar perlakuan berbeda sangat nyata (p < 0,01). Persentase HbA 1 c tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum dapat dilihat pada Gambar 23. 19.5 16.80
e
HbA 1c (%)
14.81
d
12.48
13
c
b
8.46 6.5
5.33
a
0 Normal
DM + S0
DM + S150
DM + S300
DM + S450
Gambar 23. Persentase HbA 1 c tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum Gambar 23 memperlihatkan bahwa persentase HbA 1 c tikus diabetes lebih tinggi dibanding tikus normal. Persentase HbA 1 c tikus diabetes melitus selalu
68 lebih tinggi dibanding tikus normal. Hal ini berkaitan dengan tingginya tingkat glikasi antara radikal bebas dengan asam amino lisin dari hemoglobin. Selvaraj et al. (2006) menyatakan makin besarnya persentase HbA 1 c berkaitan dengan makin banyaknya radikal bebas, utamanya malondialdehid (MDA), yang telah berinteraksi dengan lisin dari hemoglobin. Gugus aldehid MDA mempunyai kemampuan untuk bereaksi dengan lisin dari hemoglobin untuk membentuk N(h)-lisin amino akrolein (h-LAA). Akrolein ini selanjutnya bereaksi dengan aldehid glukosa untuk membentuk HbA 1 c. Gambar 23 menunjukkan bahwa persentase HbA 1 c tikus diabetes yang diperlakukan dengan ekstrak metanol S. echinocarpum menurun. Ekstrak metanol S. echinocarpum dosis 450 mg per kg berat badan dapat menurunkan persentase HbA 1 c tikus diabetes hingga dua kali lipat. Penurunan ini terjadi dimungkinkan karena florotanin yang terkandung dalam ekstrak metanol
S. echinocarpum
mampu mencegah glikasi dan mereduksi radikal bebas. Sengupta dan Swenson (2005) menjelaskan glikasi hemoglobin dapat dihambat oleh polifenol melalui pengikatan gugus karbonil (sisi reaktif) glukosa oleh gugus hidroksil antioksidan. Sementara itu Selvaraj et al. (2006) menyatakan penurunan MDA oleh polifenol dapat mencegah bereaksinya radikal tersebut dengan lisin hemoglobin. Rendahnya akrolein yang terbentuk berpengaruh pada makin sedikitnya akrolein yang bereaksi dengan aldehid glukosa dan akhirnya pembentukan HbA1c makin sedikit. 4.4.4 Malondialdehid (MDA) Data pengamatan dan analisis data kadar MDA serum tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum dapat dilihat pada Lampiran 11. Hasil analisis data menunjukkan bahwa MDA tikus antar perlakuan berbeda sangat nyata (p < 0,01). MDA serum tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum pada akhir masa penelitian dapat dilihat Gambar 24.
69 8
e
MDA (nmol/mL)
6.76 6
d
4.60 4
c
2.63 2 0.28
0.98
a
b
0 Normal
DM + S0
DM + S150
DM + S300
DM + S450
Gambar 24. Kadar MDA serum tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum Gambar 24 memperlihatkan bahwa kadar MDA tikus diabetes melitus tinggi lebih tinggi dibanding tikus normal. Hal ini menunjukkan bahwa tikus diabetes melitus mengalami stres oksidatif. Karasu (1999), Feillet-Choudray et al. (1999), Kesavulu et al. (2001), dan Marra et al. (2002)
melaporkan bahwa
diabetesi memiliki kadar MDA yang lebih tinggi dibanding bukan diabetes. Hal ini dimungkinkan karena pada kondisi hiperglikemia, pembentukan radikal bebas dapat terjadi melalui banyak mekanisme sehingga memicu banyaknya radikal bebas yang terbentuk.
Baynes and Thorpe (1999) menyatakan pembentukan
radikal bebas saat hiperglikemia dapat terjadi melalui autooksidasi glukosa dan glikasi protein, sedang Dickinson et al. (2002) dan Valko et al. (2007) menyatakan pembentukan tersebut dapat terjadi melalui: (1) pembentukan anion superoksida di komplek II membran mitokondria, (2) aktivasi NADPH oksidase, (3) autooksidasi glukosa, dan (4) aktivitas Nitric Oxida Synthase (NOS) yang tidak sempurna. Lintasan ini selanjutnya menyumbang spesies oksigen radikal bebas pada diabetesi. Radikal bebas ini, khususnya hidroksil radikal, selanjutnya mengoksidasi komponen lipida membran sel tubuh hingga membentuk banyak lipid peroksida. Gambar 24 memperlihatkan bahwa pemberian ekstrak metanol S. echinocarpum dapat menurunkan kadar MDA tikus diabetes melitus. Hal ini dimungkinkan
florotanin
yang
terkandung
dalam
ekstrak
metanol
S.
echinocarpum dapat membersihkan radikal bebas. Sabu et al. (2002), Kang et al. (2004), Raghavendran et al. (2005), Jung et al. (2008), Lee et al. (2010b), dan
70 Heo et al. (2010) menyatakan bahwa florotanin dapat menurunkan kadar MDA akibat hiperglikemik. Penurunan ini akibat florotanin yang terkandung di dalam rumput laut coklat mampu membersihkan radikal bebas dan mencegah pembentukan spesies oksigen reaktif melalui donor proton atau abstraksi hidrogen. 4.4.5 Superoksida Dismutase (SOD) Data pengamatan dan analisis data aktivitas SOD serum tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak S. echinocarpum dapat dilihat pada Lampiran 12. Hasil analisis data menunjukkan bahwa aktivitas SOD serum tikus antar perlakuan berbeda sangat nyata (p < 0,01). Aktivitas SOD serum tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak S. echinocarpum pada akhir masa penelitian dapat dilihat pada Gambar 25. 50
Akt. SOD (U/mL)
40
38.92
e d
31.29 c
30
25.30 b
20
a
17.81
12.92 10 0 Normal
DM + S0
DM + S150
DM + S300
DM + S450
Gambar 25. Aktivitas SOD serum tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak S. echinocarpum Gambar 25 memperlihatkan bahwa aktivitas SOD serum tikus diabetes melitus lebih rendah dibandingkan dengan tikus normal. Hal serupa dilaporkan oleh Kesavulu et al. (2001), Flekac et al. (2008), Xu et al., (2010), dan Saravanan dan Ponmurugan (2011) bahwa aktivitas SOD pada diabetes tipe 1 dan 2 dan tikus diabetes melitus yang diinduksi STZ lebih rendah dibanding tikus normal. Hal ini dimungkinkan karena hiperglikemik telah menurunkan aktivitas dan produksi SOD melalui mekanisme glikasi. Kawamura et al. (1992) dan Flekac et al. (2008) menunjukkan bahwa SOD akan terglikasi akibat hiperglikemik. SOD yang terglikasi mengakibatkan DNA-nya mengalami kerusakan sehingga ekspresi
71 ataupun aktivitasnya menurun (Wiernsperger 2003a; Wiernsperger 2003b; Culotta et al. 2006). Fujita et al. (2005) menjelaskan bahwa hiperglikemik telah menyebabkan kegagalan ekspresi mRNA SOD, sehingga aktivitas SOD akan rendah. Qin et al. (2008) menyatakan bahwa SOD dalam plasma utamanya adalah ekstra selular SOD (ecSOD), SOD ini mempunyai peran menurunkan anion superoksida (O 2 -) esktra selular dan mempertahankan bioaktivitas nitrit oksida. Fattman et al. (2003) menyatakan kandungan ecSOD dapat menurun akibat hiperglikemik. Saat hiperglikemik ecSOD akan terglikasi dan berubah menjadi ecSOD terglikasi (glu-ecSOD). Keberadaan glu-ecSOD ini akan dapat merusak heparin ecSOD yaitu tempat penempelan SOD pada eritrosit atau albumin hingga kadar ecSOD darah menurun. Ciechanowski et al. (2005) menambahkan bahwa efek glikasi dapat menurunkan aktivitas ecSOD diabetes karena radikal bebas yang dihasilkan saat hiperglikemik memberi efek sitotoksik pada sel penghasil dan tempat beraktivitas ecSOD. Gambar 25 memperlihatkan bahwa aktivitas SOD serum tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum
lebih tinggi dibanding
kontrol positif. Sabu et al. (2002), Li et al. (2006), Feillet-Choudry et al. (2009), dan Fernandez-Pachon et al. (2009)
menyatakan bahwa pemberian polifenol
dapat mempertahankan aktivitas SOD serum tetap tinggi. Rodrigo et al. (2011) menjelaskan polifenol dapat mempertahankan aktivitas SOD melalui dua cara, yaitu secara tidak langsung, yakni terlebih dahulu membersihkan radikal bebas dan mengkelat logam, sehingga aktivitas ecSOD yang terhambat akibat terglikasi menjadi aktif kembali. Cara kedua yaitu, polifenol meningkatkan ekspresi SOD melalui aktivasi AP-2 faktor transkripsi, ekspresi gen, dan mRNA SOD (Zelko et al. 2002 dan Fernandez-Pachon et al. 2009). 4.4.6 Cu,Zn-SOD Ginjal Data pengamatan dan analisis data profil Cu,Zn-SOD ginjal tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum dapat dilihat pada Lampiran 13. Hasil analisis data menunjukkan bahwa persentase jumlah sel tubuli renalis pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD ginjal tikus antar perlakuan berbeda sangat nyata (p < 0,01). Fotomikrograf dan persentase
72 jumlah sel tubuli renalis pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD ginjal tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum dapat dilihat pada Gambar 26 dan 27. A
B ◄
D
C
E
Gambar 26. Fotomikrograf profil Cu,Zn-SOD ginjal tikus normal (A), tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum dosis 0 mg/kg (B), 150 mg/kg (C), 300 mg/kg (D), dan 450 mg/kg (E) (Perbesaran 1000 x) ( = 10 µm) Keterangan: ◄= positif kuat,
+++
= positif moderat,
++
++/-
= positif lemah, dan
= negatif
-
70
Jumlah (%)
60 50 40 30 20 10 0 Normal
DM + S0
DM + S150
DM + S300
DM + S450
Gambar 27. Persentase jumlah sel tubuli renalis pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD ginjal tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum
73 Gambar 26 memperlihatkan bahwa profil Cu,Zn-SOD ginjal tikus normal lebih tinggi dibandingkan pada tikus diabetes melitus. Gambar 27 memperlihatkan persentase jumlah sel tubuli renalis berkandungan positif Cu,Zn-SOD pada ginjal tikus normal lebih banyak dibanding pada tikus diabetes melitus. Hal ini menunjukkan bahwa ginjal tikus normal tidak mengalami stres oksidatif, sedangkan tikus diabetes melitus mengalami stres oksidatif. Dobashi et al. (1989) dan Frederiks dan Bosch (1997) memperlihatkan bahwa profil kandungan Cu,ZnSOD pada tubulus ginjal tikus normal adalah positif. Fujita et al. (2005) melaporkan ekspresi Cu,Zn-SOD pada tubulus mencit yang mengalami hiperglikemik selama 5 minggu masih bersifat positif, namun setelah 15 minggu menjadi negatif. Chang et al. (2002) menyatakan SOD adalah enzim yang responsif terhadap stres oksidasif, sehingga aktivitas ataupun ekspresinya akan meningkat sesaat tubuh mengalami stres oksidatif. Namun bila radikal bebas yang berada dalam tubuh sangat tinggi dan berlangsung kronis akan memberi efek sitotoksik sehingga aktivitas dan ekspresi SOD menjadi terhambat dan menurun. Satoh et al. (2005), Mehta et al. (2006), dan Sivitz dan Yorek (2010) menyatakan lintasan intraselular yang berperan dalam menghasilkan anion superoksida secara berlebih pada diabetesi, adalah: NADPH oksidase, eNOS, xantin oksidase dan enzim respirasi mitokondria. Namun Mehta et al. (2006) berpendapat bahwa respirasi mitokondria dan aktivitas eNOS yang berjalan secara abnormal adalah penyebab dihasilkannya anion superoksida secara berlebih pada diabetes, sedang Satoh et al. (2005) berpendapat bahwa tidak berjalannya aktivitas lintasan NADPH oksidase dan eNOS adalah penyebab anion superoksida diproduksi secara berlebih pada diabetes. Namun demikian Fujita et al. (2005) dan Mehta et al. (2006) mendapati tak berjalannya aktivitas eNOS secara normal menjadi penyebab paling penting terhadap penurunan ekspresi Cu,Zn-SOD. eNOS yang tidak berjalan normal akan menghasilkan anion superoksida. Radikal ini selanjutnya bereaksi dengan NO membentuk peroksinitrit. Terbentuknya radikal ini akan memberikan efek sitotoksik pada sel penghasil Cu,Zn-SOD sehingga menghentikan ekspresi Cu,Zn-SOD. Gambar 26 juga memperlihatkan bahwa pemberian ekstrak metanol S. echinocarpum dapat mempertahankan profil kandungan Cu,Zn-SOD ginjal tikus
74 diabetes melitus. Gambar 27 memperlihatkan bahwa pemberian ekstrak metanol S. echinocarpum
dosis 450 mg/kg BB pada tikus diabetes melitus dapat
mempertahankan persentase jumlah sel tubuli renalis berkandungan positif Cu,ZnSOD tetap tinggi dan berkandungan negatif Cu,Zn-SOD tetap rendah. Pemberian ekstrak metanol S. echinocarpum dosis 450 mg/kg BB telah mencegah tikus diabetes melitus dari kondisi stres oksidatif. Hal ini dimungkinkan florotanin yang terkandung pada ekstrak metanol S. echinocarpum dosis 450 mg/kg telah mampu berfungsi sebagai antioksidan yaitu membersihkan radikal bebas, mengaktivasi SOD dan meningkatkan ekspresi SOD. Rodrigo et al. (2011) menyatakan fungsi suatu polifenol sebagai antioksidan dapat melalui mekanisme: pembersih radikal bebas, pengkelat logam, modulasi enzim, modulasi pensignalan sel dan ekspresi gen. Shibata et al. (2008), Zaragoza et al. (2008), Li et al. (2009), dan Breton et al. (2011) telah memperlihatkan bahwa florotanin dari Ascophyllum nodosum,
6,6`bieckol,
dieckol dan fucodiphloretol dari Ecklonia cava, dan eckol, dieckol, bieckol dan florofurofukoeckol dari Eisenia bycyclis, Ecklonia cava dan E. kurome mampu membersihkan radikal bebas. O’Sullivan et al. (2011) memperlihatkan polifenol Fucus vesiculocus dan F. serratus mampu meningkatkan aktivitas SOD. Florotanin dalam ekstrak metanol S. echinocarpum dosis 450 mg/kg BB telah efektif membersihkan radikal bebas. Donor hidrogen florotanin ekstrak metanol S. echinocarpum telah menurunkan anion superoksida sehingga pembentukan peroksinitritpun menurun. Akibatnya efek sitotoksis peroksinitrit juga menurun hingga sel dapat beraktivas dan berekspresi menghasilkan Cu,Zn-SOD.
4.4.7 Cu,Zn-SOD Hati Data pengamatan dan analisis data profil Cu,Zn-SOD hati tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum dapat dilihat pada Lampiran 14. Hasil analisis data menunjukkan bahwa persentase jumlah sel hati pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD hati tikus antar perlakuan berbeda sangat nyata (p < 0,01). Fotomikrograf dan persentase jumlah sel hati pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD hati tikus normal dan tikus
75 diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum dapat dilihat pada Gambar 28 dan 29. A
B ◄
C
E
D
Gambar 28. Fotomikrograf profil Cu,Zn-SOD hati tikus normal (A), tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum dosis 0 mg/kg (B), 150 mg/kg (C), 300 mg/kg (D), dan 450 mg/kg (E) (Perbesaran 1000 x) ( = 10 µm) Keterangan: ◄= positif kuat,
+++
= positif moderat,
++
= positif lemah, dan
+/-
= negatif
-
70
Jumlah (%)
60 50 40 30 20 10 0 Normal
DM + S0
DM + S150
DM + S300
DM + S450
Gambar 29. Persentase jumlah sel hati pada berbagai tingkat kandungan Cu,Zn-SOD hati tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum Gambar 28 memperlihatkan bahwa profil kandungan Cu,Zn-SOD hati tikus normal positif lebih tinggi dibandingkan tikus diabetes melitus. Gambar 29 memperlihatkan persentase jumlah sel bereaksi terhadap kandungan positif
76 Cu,Zn-SOD pada hati tikus normal lebih banyak dibanding persentase jumlah sel bereaksi negatif, sedangkan pada tikus diabetes melitus persentase jumlah sel yang bereaksi negatifnya lebih banyak dibanding persentase jumlah sel yang bereaksi positif. Hal ini menunjukkan bahwa hati tikus normal tidak mengalami stres oksidatif sedang pada tikus diabetes melitus mengalami stres oksidatif. Lokalisasi Cu,Zn-SOD dalam hati menurut Liou et al. (1993) dan Weydert dan Cullen (2010) dominan terdapat pada sitoplasma dan nukleoplasma. Thaete et al. (1985), Dobashi et al. (1989), dan Frederiks dan Bosch (1997) mendapati profil kandungan Cu,Zn-SOD hepatosit tikus normal adalah moderat positif. Wresdiyati et al. (2003) menegaskan profil Cu,Zn-SOD hepatosit kera ekor panjang normal sekitar 65% sangat positif, 27% positif, 37% positif lemah dan 7% negatif. Weydert dan Cullen (2010) menjelaskan bahwa besarnya kandungan antioksidan enzim sangat tergantung pada konsentrasi radikal bebas intraselular. Gambar 28 memperlihatkan bahwa pemberian ekstrak metanol S. echinocarpum dapat mempertahankan profil kandungan Cu,Zn-SOD hati tikus diabetes melitus. Gambar 29 menunjukkan bahwa pemberian ekstrak S. echinocarpum
dosis 450
mg/kg
pada tikus diabetes
melitus dapat
mempertahankan persentase jumlah sel hati bereaksi positif Cu,Zn-SOD tetap tinggi dan persentase jumlah sel hati bereaksi negatif Cu,Zn-SOD tetap rendah. Hal ini dimungkinkan karena florotanin yang terkandung dalam ekstrak S. echinocarpum dosis 450 mg/kg telah berfungsi sebagai antioksidan dengan menurunkan kandungan radikal bebas, mencegah peroksidasi, meningkatkan aktivitas dan modulasi Cu,Zn-SOD dalam hepatosit. Wei et al. (2003), Kang et al. (2004), Nakai et al. (2006), Zaragoza et al. (2008), dan Shibata et al. (2008) menunjukkan bahwa florotanin dari S. kljelmanianum, Fucus vesiculocus, Eisenia bycyclis, Ecklonia cava, E. kurome, E. stolonifera mampu membersihkan anion superoksida dan mencegah peroksidasi lemak dalam hati. Sementara itu menyatakan Fernandez-Pachon et al. (2009) bahwa aktivitas dan ekspresi antioksidan enzim dapat dimodulasi oleh polifenol. Polifenol dapat meningkatkan aktivitas SOD yakni dengan memicu ekspresi SOD melalui aktivasi AP-2 transkripsi faktor, ekspresi gen dan mRNA SOD (Zelko et al. 2002).
77 4.4.8 Katalase Data pengamatan dan analisis data aktivitas katalase serum tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum dapat dilihat pada Lampiran 15. Hasil analisis data menunjukkan bahwa aktivitas katalase serum tikus antar perlakuan berbeda sangat nyata (p < 0,01). Aktivitas katalase serum tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum pada akhir masa penelitian dapat dilihat pada Gambar 30. Aktv. Katalase (µmolH2 O2 /min/mL)
250
200
185.31
e
162.40 d 150 121.40 98.02 100 67.17
c
b
a
50
0 Normal
DM + S0
DM + S150
DM + S300
DM + S450
Gambar 30. Aktivitas katalase serum tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum Gambar 30 memperlihatkan bahwa aktivitas katalase serum tikus normal lebih tinggi dibanding tikus diabetes melitus. Goth and Eaton (2000), Kesavulu et al. (2001), Takemoto et al. (2009), dan Saravanan dan Ponmurugan (2011) mendapatkan bahwa aktivitas katalase hewan diabetes melitus yang diinduksi aloksan atau STZ, dan penyandang diabetes mengalami penurunan. Hal ini menunjukkan produksi hidrogen peroksida pada tikus diabetes melitus tinggi. Karasu (1999) telah melaporkan tingginya kadar hidrogen peroksida tikus diabetes melitus terinduksi STZ. Katalase adalah hemprotein yang mengkatalisis pereduksian hidrogen peroksidasi. Saat hiperglikemik aktivitasnya mengalami penurunan atau inaktif akibat terglikasi. Morgan et al. (2002) menyatakan darah penyandang diabetes mengandung glukosa yang sangat mudah bereaksi dengan arginin, sistein, lisin, atau histidin rantai samping enzim. Reaksi ini mengakibatkan enzim terglikasi dan enzim
78 menjadi inaktif. Flekac et al. (2008) melaporkan saat hiperglikemik katalase akan terglikasi. Katalase yang terglikasi mengakibatkan DNAnya rusak sehingga ekspresi ataupun aktivitasnya menurun (Wiernsperger 2003b). Gambar 30 memperlihatkan bahwa pemberian ekstrak metanol S. echinocarpum dapat mempertahankan aktivitas katalase serum tikus diabetes melitus. Kang et al. (2005a), Kang et al. 2005b, dan Kang et al. (2006) telah menunjukkan bahwa floroglusinol, eckol, dan triphloretol A dari Ecklonia cava dapat mencegah dan menurunkan kadar hidrogen peroksida dengan memicu kadar dan aktivas katalase. .
4.4.9 Glutation Peroksidase (GSH-Px) Data pengamatan dan analisis data aktivitas GSH-Px serum tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum dapat dilihat pada Lampiran 16. Hasil analisis data menunjukkan bahwa aktivitas GSHPx serum tikus antar perlakuan berbeda sangat nyata (p < 0,01). Aktivitas GSH-Px serum tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum pada akhir masa penelitian dapat dilihat pada Gambar 31.
Aktivitas GSH-Px (mU/min/mL)
3.5 3
c 2.55
bc
2.5
abc 2
ab
1.5
a
1
0.80
2.01
1.63
1.21
0.5 0 Normal
DM + S0
DM + S150
DM + S300
DM + S450
Gambar 31. Aktivitas GSH-Px serum tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum Gambar 31 memperlihatkan bahwa aktivitas GSH-Px serum tikus normal lebih tinggi dibanding tikus diabetes melitus. Racz et al. (1994), Kesavulu et al. (2001), Zitouni et al. (2005), dan Saravanan dan Ponmurugan (2011) memperlihatkan bahwa aktivitas GSH-Px pada darah tikus diabetes melitus diinduksi STZ, diabetisi tipe 1, dan tipe 2 mengalami penurunan. Penurunan
79 aktivitas GSH-Px pada diabetes dimungkinkan karena radikal bebas dan glikasi. Saravanan and Ponmuragan (2011) menyatakan penurunan aktivitas GSH-Px pada diabetis akibat inaktivasi oleh radikal bebas dan adanya glikasi terhadap GSH-Px. Gambar 31 memperlihatkan bahwa pemberian ekstrak metanol S. echinocarpum dapat mempertahankan aktivitas GSH-Px serum tikus diabetes melitus. Hal ini dimungkinkan karena florotanin dalam ekstrak metanol S. echinocarpum dapat mencegah glikasi dan membersihkan radikal bebas. Kang et al. (2003), Okada (2004), Iwai (2008), Kang et al. (2010), dan Lee et al. (2010a) melaporkan bahwa florotanin dapat mencegah glikasi dan membersihkan radikal bebas
akibat
hiperglikemik.
Pembersihan
radikal
bebas
berlebih
saat
hiperglikemia dapat menurunkan kadar radikal bebas total, sehingga GSH-Px dapat berfungsi dan beraktivitas secara normal dalam mereduksi hidrogen peroksida dalam tubuh penyandang diabetes.
4.5 Disfungsi sel endotelium 4.5.1Vasorelaksasi Data pengamatan vasorelaksasi tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum dapat dilihat pada Lampiran 17. Hasil analisis data menunjukkan bahwa persentase vasorelaksasi antar perlakuan sangat berbeda nyata (p < 0,01), namun perlakuan antara ekstrak metanol S. echinocarpum dosis 150 mg/kg BB pada tikus diabetes melitus tidak berbeda nyata dengan kontrol positif (p = 0,169). Vasorelaksasi tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum pada Gambar 32.
Vasorelaksasi (%)
100
91.97 d
75
67.84
50
40.17
c
b
23.66 a
25
a 14.41
0 Normal
DM + S0
DM + S150
DM + S300
DM + S450
Gambar 32. Vasorelaksasi tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak S. echinocarpum
80
Gambar 32 memperlihatkan bahwa vasorelaksasi tikus normal hampir 100%. Hal ini menunjukkan bahwa sel endotelium aorta tikus kontrol negatif (normal) tidak mengalami disfungsi sel endotelium. Sel endotelium aorta tikus kontrol negatif akan melepaskan substansi (nitrit oksida = NO) yang memicu relaksasi otot polos dalam merespons keberadaan asetilkolin. Aktivasi muskarinik reseptor sel endotelium aorta oleh asetilkolin memicu masuknya Ca2+ yang dapat mengaktifkan nitrit oksida sintase (NOS). NO disintesis oleh NOS dengan keberadaan L-arginin dengan kofaktor tetrahidrobiopterin (BH 4 ), cadmodulin (CaM), NADPH tereduksi, heme, FAD, dan FMN (Marin dan Rodriguez-Manaz, 1997; deVriese et al. 2000). NO yang dihasilkan ini secara cepat berdifusi ke dalam sel otot polos dan selanjutnya mengaktifkan soluble guanylate cyclase untuk menghasilkan dan meningkatkan kadar cyclic guanylate monophosphate (cGMP). cGMP ini akan memfosforilasi myosin light chain kinase untuk menghasilkan relaksasi pada otot polos (Furchgott dan Zawadzki 1980; Furchgott 1983; Rappoport dan Murad 1983; Rappoport et al. 1983; Griffith et al. 1984a; Griffith et al. 1984b; Palmer et al. 1987; Palmer et al. 1988; Furchgott dan Vanhoutte 1989; Ignarro et al. 1988; Ignarro 1989; Hurairah dan Ferro 2004; Hansen dan Nedergaard 1999). Gambar 32 memperlihatkan bahwa tikus diabetes melitus (kontrol positif) mengalami disfungsi sel endotelium. Hal ini ditandai dengan rendahnya substansi relaksasi yang dilepaskan dibanding substansi kontraksi. Pannirselvam et al. (2003) dan Perreira et al. (2008) menyatakan disfungsi sel endotelium pada diabetes dapat ditandai dengan rendahnya ketersediaan NO. Oyama et al. (1986), Altan et al. (1989), dan Rodriguez-Manaz (1998) menunjukkan tikus diabetes melitus akibat induksi aloksan dan streptozotocin mengalami disfungsi sel endotelium aorta yang ditandai pembuluh darahnya lebih kontraktif. Disfungsi sel endotelium terjadi pada diabetes melitus akibat adanya (1) perubahan struktur membran sel endotelium dan reseptor, sehingga sel endotelium kurang sensitif terhadap keberadaan agonis, (2) produksi substansi vasorelaksasi menurun,
sedangkan
produksi
substansi
vasokonstriksi
meningkat,
(3)
penghambatan difusi endothelium-derived hyperpolarization factor (EDHF) ke sel otot polos sehingga efflux K+ terhambat dan konsentrasi Ca2+ menjadi tinggi, (4)
81 penghambatan kerja ion K+ channel yang mengakibatkan konsentrasi K+ dalam sitosol otot polos tetap tinggi, dan (5) anion superoksida yang dihasilkan kondisi hiperglikemia berinteraksi dengan PGI 2 dan berakibat bioaktivitasnya untuk vasorelaksasi menurun (deVriese et al. 2000). Gambar 32 memperlihatkan vasorelaksasi relaksasi tikus diabetes melitus dipengaruhi oleh ekstrak metanol S. echinocarpum. Kang et al. (2003), Stochlet et al. (2004), Pratico (2005), dan Schini-Kerth et al. (2010) melaporkan penggunaan polifenol alga cokelat dapat memelihara fungsi sel endotelium dan mencegah gangguan vaskular, karena senyawa ini dapat meningkatkan kadar NO. Hal ini disebabkan polifenol secara genomik dapat meningkatkan ekspresi dan aktivitas eNOS (Schimtt dan Dirsch, 2009) dan non-genomik yaitu membersihkan radikal bebas. Kang et al. (2003) menunjukkan pemberian polifenol rumput laut coklat secara kronis dapat menormalisasi kondisi dan fungsi pembuluh darah penis dan Kang et al. (2004) menunjukkan florotanin dapat mencegah dan membersihkan radikal bebas. 4.5.2 Dosis efektif 50 (ED 50 ) Data pengamatan dan analisis data ED 50 tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak S. echinocarpum dapat dilihat pada Lampiran 18. Hasil analisis data menunjukkan bahwa ED 50 antar perlakuan berbeda nyata (p < 0,05). ED 50 tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak S. echinocarpum dapat dilihat pada Gambar 33. -5
ED50 (ACh [log M])
c
-5.49
-5.4
bc -5.71
-5.8
abc
-6.01 a
-6.2
ab
-6.23
-6.43
-6.6 -7 Normal
DM + S0
DM + S150
DM + S300
DM + S450
Gambar 33. ED 50 tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum
82 Gambar 33 memperlihatkan bahwa ED 50 pada tikus normal paling kecil di antara perlakuan. Berarti sensitivitas reseptor muskarinik sel endotelium aorta tikus normal terhadap agonis paling tinggi. Hal ini dimungkinkan karena reseptor pada sel endotelium tidak mengalami kerusakan. Brunner et al. (1990), Jovanovic et al. (1994), dan Sawyer et al. (1999) menunjukkan ED 50 arteri jantung anak sapi, arteri uterin manusia dan aorta torasis kelinci hanya -6,1136 (log M), -7,29 (log M) dan -9,98 (log M). Furchgott dan Zawadzki (1980), Brunner et al. (1990), dan Johns (1991) menyatakan bahwa relaksasi aorta oleh asetilkolin sangat membutuhkan adanya sel endotelium. Keberadaan reseptor muskarinik pada sel endotelium menjadi kebutuhan mutlak bagi relaksasi aorta (Sim and Manjeet, 1989). Reseptor muskarinik subtipe M3 merupakan jenis reseptor sel endotelium aorta yang secara spesifik mengikat asetilkolin (Dhein et al., 2001). Gambar 33 memperlihatkan bahwa ED 50 tikus diabetes melitus paling besar di antara perlakuan. Berarti sensitivitas reseptor muskarinik sel endotelium tikus diabetes melitus terhadap asetilkolin paling rendah. Hal serupa juga telah dilaporkan oleh Cameron and Cotter (1992) bahwa sensitivitas reseptor muskarinik terhadap asetilkolin pada aorta tikus diabetes melitus yang diinduksi streptozotocin
mengalami
penurunan
dibanding
tikus
normal.
Hal
ini
dimungkinkan karena kadar glukosa tinggi telah mengakibatkan kerusakan struktur dan konformasi reseptor, penurunan jumlah reseptor, dan gangguan mekanisme pengikatan reseptor muskarinik M3 (Oyama et al. 1986; Carrier et al. 1984; Cheng et al. 2007; Miike et al. 2008; Kazuyama et al. 2009). Kadar glukosa tinggi akan menghasilkan radikal bebas secara berlebih. Radikal bebas yang berlebih ini selanjutnya akan berinteraksi dengan komponen lipida dan protein membran sel, sehingga struktur sel, termasuk reseptor akan mengalami kerusakan dan pada akhirnya jumlahnya berkurang, serta kemampuan mengikat agonis menjadi rendah. Gambar 33 memperlihatkan bahwa ED 50 tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum makin mengecil. Berarti ekstrak metanol S. echinocarpum dapat meningkatkan sensitivitas reseptor muskarinik terhadap asetilkolin pada tikus diabetes melitus. Hal ini dapat dimungkinkan karena florotanin mampu menurunkan kadar glukosa darah, kandungan radikal bebas dan
83 stres oksidatif tubuh, termasuk dalam sel endotelium, sehingga struktur dan fungsi reseptor muskarinik pada sel endotelium aorta pun tetap terjaga. Azuma et al. (2006) melaporkan bahwa pengendalian glukosa darah dan stres oksidatif dapat memperbaiki vasodilatasi dengan ED 50 sebesar -7,25 (log M), sedangkan kontrol positif ED 50 nya sebesar -6,5 (log M). 4.5.3 Rasio Sel Endotelium Aorta Data pengamatan dan analisis data rasio sel endotelium aorta tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak S. echinocarpum dapat dilihat pada Lampiran 19. Hasil analisis data menunjukkan bahwa rasio sel endotelium aorta antar perlakuan berbeda sangat nyata (p < 0,01). Fotomikrograf dan rasio sel endotelium aorta tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak S. echinocarpum dapat dilihat pada Gambar 34 dan 35.
◄
A
B
◄ ◄
▼ C
E
D
Gambar 34. Fotomikrograf sel endotelium aorta tikus normal (A), tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum dosis 0 mg kg-1 (B), 150 mg kg-1 (C), 300 mg kg-1 (D), dan 450 mg kg-1 (E). (Perbesaran 1000 x) (Pewarnaan H&E) ( = 10 µm) Keterangan: ◄ = endotelium utuh,
= endotelium terlepas,
= bukaan, dan
= kawah
84 c
Rasio sel endotelium (%)
100
98.32 81.48 a
75
65.36
69.04
b
89.85
bc
a
50
25
0 Normal
DM + S0
DM + S150
DM + S300
DM + S450
Gambar 35. Rasio sel endotelium aorta tikus normal dan tikus diabetes melitus yang diberi ekstrak metanol S. echinocarpum Gambar 34 dan 35 memperlihatkan sel endotelium aorta tikus normal masih melekat, utuh dan rasio sel endoteliumnya hampir 100%, sedang sel endotelium aorta pada tikus diabetes melitus terlepas dan rusak hingga mencapai 35% dan intima mengalami penebalan, bukaan, dan kawah. Dolgov et al. (1982), Soltani et al. (2005), Azuma et al. (2006), dan Akgun-Dar et al. (2007) menunjukkan aorta hewan diabetes melitus kehilangan sel endotelium, memiliki zona de-endotelisasi yaitu berupa terbentuknya bukaan dan kawah, intima mengalami penebalan. Efek sitotoksik kadar glukosa tinggi kronis telah mengakibatkan sel endotelium mati dan terlepas dari intima aorta. Hiperglikemik kronis dapat meningkatkan akumulasi sorbitol pada aorta hingga radikal bebas banyak terdapat pada intima. Kadar radikal bebas yang banyak mengakibatkan intima mengalami pembengkakan, hingga difusi oksigen terganggu dan akhirnya sel endotelium mati dan terlepas (Stetz et al. 1979). Halliwell dan Gutteridge (1999) menyatakan terlepasnya sel endotelium dari aorta saat hiperglikemik terutama akibat oksidasi radikal bebas terhadap protein pembentuk sel, pelekat, migrasi, dan proliferasi sel endotelium. Mekanisme pelepasan sel endotelium dari aorta akibat radikal bebas, yaitu: (1) teroksidasinya gugus tiol (-SH) komponen protein sitoskeleton, molekul adesi, dan intercellular junction endotelium oleh radikal bebas, sehingga fungsi komponen protein ini sebagai penentu bentuk dan keutuhan sel rusak atau hilang, (2) teroksidasinya protein matriks ekstraselular sel. Matriks ini berupa serabut dan cairan viscous yang berfungsi sebagai pelekat, migrasi, dan proliferasi sel endotelium, dan bila
85 protein ini teroksidasi sel endotelium pun akan lepas, dan (3) teroksidasinya protein membran basalis. Protein ini berupa serabut kolagen dengan fungsi sebagai tempat perlekatan sel endotelium pada intima. Teroksidasinya protein ini mengakibatkan sel endotelium terlepas dari intima. Lebih lanjut Halliwell dan Gutteridge (1999) menyatakan bahwa oksidasi radikal bebas terhadap gugus thiol juga dapat mengakibatkan blebbing (pelepuhan) yaitu perubahan bentuk sel endotelium menjadi lebih bulat. Jika proses pelepuhan lebih parah, tonjolan sel akan mengalami rupture dan terbentuk lubang pada membran sehingga sel akan mati dan dapat membentuk bukaan atau kawah. Gambar 34 dan 35 memperlihatkan bahwa pemberian ekstrak metanol S. echinocarpum dengan dosis yang makin besar dapat mencegah kerusakan sel endotelium aorta tikus diabetes melitus. Hal ini dimungkinkan karena florotanin dalam ekstrak metanol S. echinocarpum dapat menurunkan kadar radikal bebas yang terbentuk saat hiperglikemik. Xu et al. (2010) telah menunjukkan bahwa kerusakan sel endotelium saat hiperglikemik dapat dicegah oleh polifenol. Nakai et al. (2004) telah menunjukkan bahwa florotanin dapat mencegah pembentukan spesies oksigen radikal, sedang Hwang et al. (2009) dan Lee et al. (2010) memperlihatkan florotanin dapat menurunkan kadar glukosa darah diabetesi. Penurunan glukosa darah oleh florotanin berakibat secara langsung pada penurunan pembentukan dan kadar radikal bebas.
