(11) Lajstromszám: E (13) T2 EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA (I)

!HU000005812T2! (19)

HU

(11) Lajstromszám:

E 005 812

(13)

T2

MAGYAR KÖZTÁRSASÁG Magyar Szabadalmi Hivatal

EURÓPAI SZABADALOM SZÖVEGÉNEK FORDÍTÁSA C07D 401/12

(21) Magyar ügyszám: E 04 780791 (22) A bejelentés napja: 2004. 08. 11. (96) Az európai bejelentés bejelentési száma: EP 20040780791 (97) Az európai bejelentés közzétételi adatai: EP 1664026 A1 2005. 03. 03. (97) Az európai szabadalom megadásának meghirdetési adatai: EP 1664026 B1 2009. 01. 21.

(51) Int. Cl.:

(30) Elsõbbségi adatok: 495637 P 2003. 08. 15. 563580 P 2004. 04. 19.

(73) Jogosult: Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey 070650907 (US)

US US

(72) Feltalálók: COLEMAN, Paul, J., Rahway, NJ 07065-0907 (US); COX, Christopher, D., Rahway, NJ 07065-0907 (US); GARBACCIO, Robert, M., Rahway, NJ 07065-0907 (US); HARTMAN, George, D., Rahway, NJ 07065-0907 (US) (54)

(2006.01) C07D 417/14 (2006.01) A61K 31/454 (2006.01) A61K 31/497 (2006.01) A61K 31/506 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) C07D 401/14 (2006.01) C07D 413/14 (2006.01) (87) A nemzetközi közzétételi adatok: WO 05019206 PCT/US 04/026012

(74) Képviselõ: dr. Fehérvári Flóra, DANUBIA Szabadalmi és Jogi Iroda Kft., Budapest

Mitotikus kinezin inhibitorok

(57) Kivonat A jelen találmány (I) képletû

HU 005 812 T2

(I)

dihidropirrolszármazékokra vonatkozik, amelyek sejtproliferációs betegségek, KSP kinezin aktivitásával kapcsolatos rendellenességek kezelésére és KSP kinezin gátlására alkalmazhatók. A találmány kiterjed az ezen vegyületeket tartalmazó gyógyszerkészítményekre és ezek alkalmazásával emlõsök esetén rák kezelésére szolgáló módszerekre is.

A leírás terjedelme 76 oldal (ezen belül 2 lap ábra) Az európai szabadalom ellen, megadásának az Európai Szabadalmi Közlönyben való meghirdetésétõl számított kilenc hónapon belül, felszólalást lehet benyújtani az Európai Szabadalmi Hivatalnál. (Európai Szabadalmi Egyezmény 99. cikk (1)) A fordítást a szabadalmas az 1995. évi XXXIII. törvény 84/H. §-a szerint nyújtotta be. A fordítás tartalmi helyességét a Magyar Szabadalmi Hivatal nem vizsgálta.

1

HU 005 812 T2

A találmány háttere A jelen találmány 2,2-diszubsztituált 2,5-dihidropirrolszármazékokra vonatkozik, amelyek a mitotikus kinezinek inhibitorai, különösen a mitotikus kinezin KSP inhibitora, és sejtproliferációs betegségek, például rák, szövetburjánzás, restenosis, szívnagyobbodás, immunrendellenességek és gyulladás kezelésében hasznosak. A rák kezelésére alkalmazott terápiás ágensek közé tartoznak a taxánok és vinkaalkaloidák. A taxánok és a vinkaalkaloidák mikrotubulusokra hatnak, amelyek különbözõ sejtszerkezetekben vannak jelen. A mikrotubulusok a mitotikus orsó elsõdleges szerkezeti elemet. A mitotikus orsó felelõs a genom másolatainak a sejt osztódásából származó két utódsejtbe történõ szétosztásáért. Feltételezik, hogy a mitotikus orsó ezen hatóanyagok által történõ szétzúzása eredményezi a ráksejt osztódásának gátlását és a ráksejt elhalását. A mikrotubulusok azonban másfajta sejtszerkezeteket is képeznek, ilyenek az idegi folyamatokban végbemenõ intracelluláris transzport útvonalak. Mivel ezek az ágensek nemspecifikusan veszik célba a mitotikus orsókat, olyan mellékhatásokat mutatnak, amelyek korlátozzák használhatóságukat. Jelentõs érdek fûzõdik a rák kezelésére használt ágensek specificitásának javításához azon terápiás elõnyök miatt, amelyek realizálódhatnának, ha az ezen ágensek adagolásával kapcsolatos mellékhatások csökkenthetõk lennének. A rák kezelésében bekövetkezõ ugrásszerû javulások hagyományosan az új mechanizmuson keresztül ható terápiás ágensek azonosításával kapcsolatosan következnek be. Erre példaképpen nemcsak a taxánok említhetõk, hanem a topoizomeráz I inhibitorok kamptotecincsoportja is. Az említett mindkét szempontból a mitotikus kinezinek ígéretes célpontot képviselnek az új rákellenes ágensek számára. A mitotikus kinezinek olyan enzimek, amelyek alapvetõen fontosak a mitotikus orsó összeállításához és funkciójához, azonban általában nem részei más mikrotubuláris szerkezeteknek, így például az idegi folyamatokban részt vevõknek. A mitotikus kinezinek lényeges szerepet játszanak a mitózis minden fázisa során. Ezek az enzimek olyan „molekuláris motorok”, amelyek az ATP hidrolízisével felszabaduló energiát mechanikus erõvé alakítják, amely a celluláris szállítmányok mikrotubulusok mentén való irányított mozgását vezetik. Az e feladathoz megfelelõ katalitikus domén egy körülbelül 340 aminosavból álló tömör szerkezet. A mitózis során a kinezinek a mikrotubulusokat egy kétpólusú szerkezetbe, azaz a mitotikus orsóba rendezik. A kinezinek közvetítik a kromoszómák mozgását az orsó mikrotubulusok mentén, valamint a mitózis egyes fázisaival kapcsolatos szerkezeti változásokat a mitotikus orsóban. A mitotikus kinezinek funkciójának kísérleti zavarása a mitotikus orsó hibás formáját vagy rendellenes mûködését okozza, ami gyakran a sejtciklus leállásához és sejtpusztuláshoz vezet.

5

10

15

20

25

30

35

40

2

Az azonosított mitotikus kinezinek közé tartozik a KSP. A KSP a plusz-vég irányú mikrotubulus motorok evolúciósan konzervált kinezinalcsoportjába tartozik, amelyek kétpólusú, antiparalel homodimerekbõl álló homotetramerekké rendezõdnek. A mitózis során a KSP a mitotikus orsó mikrotubulusaival asszociálódik. A KSP ellen irányuló antitestek humán sejtekbe való mikroinjektálása megakadályozza, hogy az orsó pólusai a prometafázis során elváljanak, így egypólusú orsók képzõdnek, leáll a mitózis, és programozott sejtpusztulás indukálódik. A KSP és a nem humán szervekben elõforduló más rokon kinezinek csomóba fûzik az antiparalel mikrotubulusokat és egymáshoz képest elcsúsztatják, így kényszerítik, hogy a két orsópolus egymástól távolra kerüljön. A KSP közvetítheti az anafázisú B orsóban a megnyúlást és a mikrotubulusok orsópolusoknál való fókuszálódását. A humán KSP¹t (más néven HsEg5¹öt) már ismertették [Blangy, et al., Cell, 83:1159–69 (1995); Whitehead, et al, Arthritis Rheum., 39:1635–42 (1996); Galgio et al, J. Cell Biol., 135:339–414 (1996); Blangy, et al, J. Biol. Chem., 272:19 418–24 (1997); Blangy, et al, Cell Motil Cytoskeleton, 40:174–82 (1998); Whitehead and Rattner, J. Cell Sci., 111:2551–61 (1998); Kaiser, et al, JBC 274:18 925–31 (1999); GenBank accession numbers: X85137, NM004523 and U37426], valamint a KSP gén (TRIP5) fragmensét már ismertették [Lee, et al., Mol. Endocrinol., 9:243–54 (1995); GenBank accession number L40372]. Beszámoltak Xenopus KSP homológokról (Eg5), valamint Drosophila K¹LP61 F/KRP 130 jelû homológokról. Nem régen bizonyos kinazolinonokat mint KSP inhibitorokat ismertettek [WO 01/30768 számú (2001. május 3.) PCT publikáció]. A mitotikus kinezinek vonzó célpontok új mitotikus kemoterapeutikumok felfedezéséhez és kifejlesztéséhez. Ennek megfelelõen a találmány célja olyan vegyületek, módszerek és kompozíciók biztosítása, amelyek a KSP, egy mitotikus kinezin gátlására alkalmasak.

A találmány rövid ismertetése A jelen találmány dihidropirrolszármazékokra vo45 natkozik, amelyek sejtproliferációs betegségek kezelésére, KSP kinezin aktivitással kapcsolatos rendellenességek kezelésére, valamint a KSP kinezin gátlására alkalmazhatók. 50

55

A rajzok rövid ismertetése Az 1. ábra a 2–5. képletû vegyület ORTEP rajza. A 2. ábra a 3–1. képletû vegyület ORTEP rajza. A rajz egyszerûsítése érdekében a hidrogénatomok legtöbbjét nem ábrázoltuk.

A találmány részletes ismertetése A jelen találmány szerinti vegyületek alkalmazhatók mitotikus kinezinek gátlására, és ezeket egy I képletû 60 vegyület 2

1

HU 005 812 T2

I

vagy annak gyógyszerészetileg elfogadható sója vagy sztereoizomerje szemlélteti, ahol R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1–6 szénatomos alkilcsoport. A jelen találmány szerinti megoldás egy további megvalósítási formáját egy II képletû vegyület

2

(2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(2R,4R)-2-(fluor-metil)1-metil-piperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil2,5-dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid, (2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(2S,4S)-2-(fluor-metil)5 1-metil-piperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil2,5-dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid, (2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3S,4R)-3-fluor-1-metil1-oxi-dopiperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil2,5-dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid, (2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3S,4R)-3-fluor10 piperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil]-2-fenil]-2,5dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid, (2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3S,4R)-3-fluor-1izopropil-piperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil15 2,5-dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid, (2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3S,4S)-3-fluorpiperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil-2,5dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid és ezek gyógyszerészetileg elfogadható sói és szte20 reoizomerjei. A jelen találmány szerinti vegyületek közelebbi példái a következõk:

25 II

30

vagy annak gyógyszerészetileg elfogadható sója vagy sztereoizomerje szemlélteti, ahol R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom vagy 1–6 szénatomos alkilcsoport. A jelen találmány szerinti vegyület közé tartoznak például a következõk: (2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3S,4R)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil-2,5dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid, (2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3R,4S)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil-2,5dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid, (2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3R,4S)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil-2,5dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid, (2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3R,4S)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil-2,5dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid, (2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3S,4R)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-N¹metil-2,5-dihidro-1H¹pirrol-1karboxamid, (2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3R,4S)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-N¹metil-2-fenil-2,5-dihidro-1H¹pirrol-1karboxamid, (2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3R,4R)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-N¹metil-2-fenil-2,5-dihidro-1H¹pirrol-1karboxamid,

(2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3S,4S)-3-fluor-1-metil35 piperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil-2,5-dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid,

40

45

(2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3S,4R)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil-2,5-dihid50 ro-1H¹pirrol-1-karboxamid,

55

60 3

1

HU 005 812 T2

(2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3R,4S)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil-2,5-dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid, 5

10

(2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(2R,4R)-2-(fluor-metil)-1metil-piperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil-2,5dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid,

15

20

25

(2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3R,4S)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-N¹metil-2,5-dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid és ezek gyógyszerészetileg elfogadható sói és sztereoizomerjei. A jelen találmány szerinti vegyületek tartalmazhatnak aszimmetriacentrumokat, királis tengelyeket és királis síkokat (amint ezt a következõ szakirodalmi helyen ismertetik: E. L. Eliel és S. H. Wilen, Stereochemistry of Carbon Compounds, John Wiley & Sons, New York, 1994, 1119–1190. oldal), és racemátok, racém elegyek és egyes diasztereomerek formájában fordulhatnak elõ, minden lehetséges izomerjükkel és ezek keverékével, beleértve az optikai izomereket is, és az összes ilyen sztereoizomer a jelen találmány tárgykörébe tartozik. Emellett az itt ismertetett vegyületek tautomerek formájában létezhetnek, és mindkét tautomer forma a találmány tárgykörébe tartozik, még akkor is, ha csak az egyik tautomer formát ábrázoltuk. Ha egy változó bármely alkotóelemben egynél többször fordul elõ, annak definíciója minden egyes megjelenés estén független az összes többi megjelenéstõl. A szubsztituensek és változók kombinációi csak abban az esetben megengedhetõek, ha az ilyen kombinációk stabil vegyületeket eredményeznek. A szubsztituensek felõl a gyûrûrendszerbe rajzolt vonalak azt képviselik, hogy az adott kötés bármelyik szubsztituálható gyûrûatomhoz kapcsolódhat. A gyûrûrendszer policiklusos, azt kívántuk jelezni, hogy a kötés csak a közelebbi gyûrû valamely szubsztituálható szénatomjához kapcsolódhat.

30

35

40

45

50

55

60 4

2

Nyilvánvaló, hogy a jelen találmány szerinti vegyületek szubsztituenseit és szubsztituensmintázatait a szakterületen jártas szakember úgy választhatja meg, hogy kémiailag stabil vegyületek képzõdjenek, amelyek egyszerûen szintetizálhatók a technika állása szerint ismert módszerekkel, valamint az alábbiakban ismertetett módszerekkel, egyszerûen hozzáférhetõ kiindulási anyagokból. Ha egy szubsztituens maga egynél több csoporttal van szubsztituálva, nyilvánvaló, hogy ezek a többszörös csoportok lehetnek ugyanazon a szénatomon vagy különbözõ szénatomokon, mindaddig, míg stabil szerkezetek alakulnak ki. Az „adott esetben egy vagy több szubsztituenssel szubsztituált” kifejezés egyenértékû az „adott esetben legalább egy szubsztituenssel szubsztituált” kifejezéssel, és ilyen esetekben az elõnyös megvalósítási forma 0–3 szubsztituenst tartalmazhat. Az „alkilcsoport” kifejezésen – ahogy itt használjuk – a megadott szénatomszámú mind elágazó, mind egyenes szénláncú alifás szénhidrogéncsoportokat kívánunk érteni. Így például az „1–10 szénatomos alkilcsoport” kifejezésben az 1–10 szénatomos magában foglalja az 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 vagy 10 szénatomos egyenes vagy elágazó elrendezésû csoportokat. Így például az „1–10 szénatomos alkilcsoport” kifejezés közelebbrõl magában foglalja a metil¹, etil¹, n¹propil¹, i¹propil¹, n¹butil¹, t¹butil¹, i¹butil¹, pentil¹, hexil¹, heptil¹, oktil¹, nonil¹, decil- és így tovább csoportokat. A „cikloalkilcsoport” kifejezésen monociklusos telített alifás szénhidrogéncsoportokat értünk, amelyek a megadott számú szénatomokat tartalmazzák. A jelen találmány szerinti megoldás magában foglalja a vegyületeket szabad formáját, valamint ezek gyógyszerészetileg elfogadható sóit és sztereoizomerjeit. Néhány példaképpen közelebbrõl itt megadott vegyület az aminszármazékok protonált sóit képviseli. A „szabad forma” kifejezésen az aminszármazékok nem só formáját értjük. A gyógyszerészetileg elfogadható sók az itt megadott vegyületeknek nemcsak a példaképpen ismertetett sóit foglalják magukban, hanem a vegyületek szabad formájának tipikus gyógyszerészetileg elfogadható sóit. Az ismertetett vegyületek adott sójának szabad formája a technika állása szerint ismert módszerekkel izolálható. Így például a szabad formát úgy állíthatjuk helyre, hogy a sót egy alkalmas hígított vizes lúgoldattal, így például hígított vizes nátrium-hidroxiddal, kálium-karbonáttal, ammóniával vagy nátrium-hidrogén-karbonáttal kezeljük. A szabad formák a megfelelõ sóformájuktól valamennyire különbözhetnek bizonyos fizikai tulajdonságaikban, így poláros oldószerekben való oldhatóságban, a savas és bázisos sók azonban egyébként gyógyszerészetileg ekvivalensek a megfelelõ szabad formáikkal a találmány szempontjából. A vegyületek gyógyszerészetileg elfogadható sói szokásos kémiai módszerekkel a találmány szerinti olyan vegyületekbõl szintetizálhatók, amelyekkel bázisos vagy savas csoportot tartalmaznak. A bázisos vegyületek sóit általában ioncserélõ kromatográfia útján, vagy pedig úgy állítjuk elõ, hogy a szabad bázist sztö-

1

HU 005 812 T2

chiometrikus mennyiségben vagy fölöslegben vett, a kívánt sót képzõ szervetlen vagy szerves savval reagáltatjuk alkalmas oldószerben vagy oldószerek különbözõ kombinációiban. Hasonlóképpen a savas vegyületek sóit alkalmas szervetlen vagy szerves bázissal végzett reakcióval képezzük. Így a jelen találmány szerinti vegyületek gyógyszerészetileg elfogadható sói a találmány szerinti vegyületek szokásos nem toxikus sói, amelyek a vegyület szervetlen vagy szerves savakkal történõ reagáltatásával képzõdnek. Így például a szokásos nem toxikus sók közé tartoznak a szervetlen savakkal, például sósavval, hidrogén-bromiddal, kénsavval, szulfaminsavval, foszforsavval, salétromsavval és hasonlókkal képzett sók, valamint a szerves savakkal, például ecetsavval, propionsavval, borostyánkõsavval, glükolsavval, sztearilsavval, tejsavval, almasavval, borkõsavval, citromsavval, aszkorbinsavval, pamolinsavval, maleinsavval, hidroxi-maleinsavval, fenil-ecetsaval, glutaminsavval, benzoesavval, szalicilsavval, szufanilsavval, 2¹acetoxibenzoesavval, fumársavval, toluolszulfonsavval, metánszulfonsavval, etánszulfonsavval, oxálsavval, izetionsavval, trifluor-ecetsavval és hasonlókkal elõállított sók. Ha a jelen találmány szerinti vegyület egy sav, az alkalmas „gyógyszerészetileg elfogadható sók” kifejezés olyan sókat jelent, amelynek gyógyszerészetileg elfogadható nem toxikus bázisokkal, így szervetlen és szerves bázisokkal képezhetõk. Szervetlen bázisokkal képzett sók közé tartoznak az alumínium¹, ammónium¹, kalcium¹, réz¹, vas(II)¹, vas(III)¹, lítium¹, magnézium¹, mangán(III)¹, mangán(IV)¹, mangán(II)¹, kálium- és nátriumsók. Különösen elõnyösek az ammónium¹, kalcium¹, magnézium¹, kálium- és nátriumsók. A gyógyszerészetileg elfogadható nem toxikus szerves bázisok sói közé tartoznak a primer, szekunder és tercier aminok sói, a szubsztituált aminok, így a természetben elõforduló szubsztituált aminok, ciklusos aminok és bázisos ioncserélõ gyanták segítségével készült sók, így arginin, betain, kaffein, kolin, N,N’-dibenzil-etilén-diamin, dietil-amin, 2¹dietil-amino-etanol, 2¹dimetilamino-etanol, etanol-amin, etilén-diamin, N¹etil-morfolin, N¹etil-piperidin, glukamin, glükózamin, hisztidin, hidrabamin, izopropil-amin, lizin, metil-glukamin, morfolin, piperazin, piperidin, poliamingyanták, prokain, purinok, teobromin, trietil-amin, trimetil-amin, tripropil-amin, trometán-amin és hasonlók sói. A fent említett gyógyszerészetileg elfogadható sók és más tipikus gyógyszerészetileg elfogadható sók elõállítását részletesebben ismertetik a következõ irodalmi helyen: Berg és munkatársai, „Pharmaceutical Salts,” J. Pharm. Sci., 1977:66:1–19. Megjegyzendõ, hogy a jelen találmány szerinti vegyületek lehetnek belsõ sók vagy zwitterionok, és mivel fiziológiás körülmények között a vegyület deprotonált savas csoportja, például a karboxilcsoport lehet anionos és ez az elektromos töltést azután belsõleg kiegyensúlyozódhat egy protonált vagy alkilezett bázisos csoport, például kvaterner nitrogénatom kationos töltésével.

2

A reakcióvázlatokon, és a példákban a következõ rövidítéseket használjuk:

5

10

15

20

25

CDI

1,1’-karbonil-diimidazol

CSP HPLC

királis stacioner fázisú nagy sebességû folyadékkromatográfia

DAST

(dietil-amino)-kén-trifluorid

DCE

1,2-dikloro-etán

DCM

diklór-metán

DMF

dimetil-formamid

DMSO

dimetil-szulfoxid

EtOAc

etil-acetát

IPAC

izopropil-acetát

LAH

lítium-alumínium-hidrid

LiHMDS

lítium-hexametil-diszilazid

MsCl

metánszulfonil-klorid

NaHMDS

nátrium-hexametil-diszilazid

NOE

mag Overhauser-hatás

PTC

fázistranszfer katalizátor

TBSCl

terc-butil-dimetil-szilil-klorid

TEA

trietil-amin

TFA

trifluor-ecetsav

THF

tetrahidrofurán

A jelen találmány szerinti vegyületek a következõ reakcióvázlatokon bemutatott reakciók útján állíthatók 30 elõ, a szakirodalomból ismert vagy a kísérleti részben bemutatott eljárások szerinti standard manipulációk mellett. Ezért az alábbi, illusztrációképpen bemutatott reakcióvázlatok nem korlátozódnak a megadott vegyületekre, vagy pedig az illusztráció céljából alkalmazott 35 adott szubsztituensekre. A reakcióvázlatokon bemutatott szubsztituensszámozás nem szükségszerûen egyezik az igénypontokban megadottakkal, és gyakran az érthetõség céljából egyetlen, a vegyülethez kapcsolódó szubsztituenst ábrázoltunk, ahol a fenti definíciók 40 értelmében több szubsztituens is lehetséges.

45

50

55

60 5

Reakcióvázlat Amint az A. reakcióvázlaton bemutatjuk, az A–8 képletû kulcsvegyület, a 2,2-diszubsztituált dihidropirrol intermedier könnyen elõállítható hozzáférhetõ, megfelelõen szubsztituált a¹allil-fenil-glicinekbõl. A Van Betsbrugge és munkatársai (Tetrahedron, 1997, 53, 9233–9240) szakirodalmi helyen ismertetett eljárás szerint elõállítjuk az A–3 képletû a¹allil-a-fenil-glicint. Az észter redukálásával és karbonil-diimidazollal végzett ciklizálással kapjuk az A–4 képletû intermediert. Az allil-olefin ruténiummal végzett oxidálásával, majd észterképzéssel és a nitrogén alkilezésével az A–5 képletû intermediert kapjuk. Ciklizálás és dekarboxilezés az A–6 képletû intermediert eredményezi. A gyûrû-karbonil-csoport azután használható egy megfelelõen szubsztituált fenilcsoport bevitelére. Az ezután végzett elszappanosítás és oxigénvédés a védett A–8 képletû intermedierhez vezet. Az A–8 képletû vegyület enantiomerjeit gyakran királis kromatográfiás módszerek fel-

1

HU 005 812 T2

használásával választhatjuk el. A gyûrû-nitrogénatom ezután trifoszgénnel reagáltatható az A–9 képletû aktivált karbonil-klorid-származék elõállítására. A B. reakcióvázlat a B–5 képletû fluorozott aminopiperidin elõállítását mutatja be, az N¹védett piperidonból kiindulva. A cisz és transz diasztereomerpár gyakran szilikagélen végzett kromatográfiával választható el, és az enantiomerek gyakran királis kromatográfiás módszerek alkalmazásával választhatók el. Amint a C. reakcióvázlaton bemutatjuk, az ilyen fluorozott amino-piperidin azután A–9 képletû dihidropirrol intermedierrel reagáltatható, így a találmány szerinti C–1 képletû vegyületeket kapjuk. A D. reakcióvázlat a 2¹fluor-metil-4-amino-piperidinszármazékok elõállítását, és a találmány szerinti vegyületekbe az ilyen csoportok bevitelét mutatja be. Megjegyzendõ, hogy a D–3 intermedier hidroxiloldalláncának fluoriddal való kiszorítása gyakran mind a kívánt D–4 képletû intermedierhez, mind a gyûrûhomológ D–5 képletû vegyülethez vezet. Ezek az intermedier vegyületek szilikagélen végzett kromatográfiával elválaszthatók. Az E. reakcióvázlat a 2¹fluor-metil-3-aminopiperidin-származékok alternatív elõállítását mutatja be, ahol héttagú gyûrû izomer nem képzõdik. Amint az F. és G. reakcióvázlat mutatja, az A–9 képletû vegyület hidroxilcsoportja különbözõ reagensekkel alkilezhetõ. Amint a H. reakcióvázlat bemutatja, a C–1 képletû vegyület hidroxilcsoportjának alkalmas szubsztituált aminnal történõ kicserélése a megfelelõ H–1 képletû aldehiden keresztül, majd reduktív alkilezéssel megy végbe, így a találmány szerinti H–2 képletû vegyületeket kapjuk.

5

10

15

20

25

30

2

Az I. reakcióvázlat a találmány szerinti 2¹monoszubsztituált dihidropirrolszármazékok szintézisét mutatja be. Az elõállítás és az I–7 képletû intermedier metil-imidazolil-csoportjának kiszorítása amino-piperidinnel a találmány szerinti I–8 képletû vegyületeket eredményezi. A J. reakcióvázlat a 2¹alkiloldallánc homológgá alakítását mutatja be, így a találmány szerinti J–3 és J–4 képletû vegyületeket kapjuk. A K–M. reakcióvázlatok a C–2 alkiloldallánc további módosítását mutatják be a H–1 képletû intermedierbõl kiindulva. Így a K. reakcióvázlat szerint a H–1 képletû aldehidet Grignard-reagenssel, így alkil-Grignardreagenssel kezeljük, így a K–1 képletû hidroxiszármazékot kapjuk. Az L. reakcióvázlat a C–2 oldallánc homológgá alakítását mutatja be. A H–1 képletû aldehidet foszfonoacetáttal kezeljük, és ezután a konjugált kettõs kötést redukáljuk, így az L–1 észtert kapjuk. Az észter rákövetkezõ redukciója, majd az alkohol oxidációja az L–3 képletû aldehidet eredményezi, amelyet azután megfelelõen szubsztituált aminnal reduktív alkilezésnek vethetünk alá, így a találmány szerinti L–4 képletû vegyületeket kapjuk. Az L–4 képletû vegyületek további alkilezését szintén bemutattuk. Az M. reakcióvázlat a C–2 oldallánc fluorozását mutatja be, majd a hidroxilcsoport azutáni átalakítását amincsoporttá a megfelelõ triflát nátrium-aziddal történõ kiszorításán keresztül. Az N. reakcióvázlat egy difluor-metil-csoport bevitelét mutatja a C–2 oldalláncba. A következõ reakcióvázlatokon a változókat az igénypontok szerinti szerkezet megfelelõ helyzeteiben levõ változókkal egyezõen definiáltuk.

A. reakcióvázlat

A–2

A–1

A–3

A–4

A–5

A–6 6

HU 005 812 T2

A–8 A–7

A–9 B. reakcióvázlat

B–2 B–1

B–5 B–3

B–4 C. reakcióvázlat

C–1

A–9

7

HU 005 812 T2

D. reakcióvázlat

D–1

D–2

D–3

D–4

D–6a

D–6b

E. reakcióvázlat

8

D–5

HU 005 812 T2

F. reakcióvázlat

C–1

F–1

G. reakcióvázlat

C–1

G–1

G–2

9

HU 005 812 T2

H. reakcióvázlat

C–1

H–1

H–2

I. reakcióvázlat

I–1

I–2

I–3

I–4

I–5

I–6

I–8 I–7

10

HU 005 812 T2

J. reakcióvázlat

H–1

J–1

J–1

J–2

J–3

J–2

J–4

K. reakcióvázlat

H–1

K–1

11

HU 005 812 T2

L. reakcióvázlat

H–1

L–1

L–2

L–3

L–5

L–4

M. reakcióvázlat

H–1

12

1

HU 005 812 T2

2

M–2 M–1

M–3

N. reakcióvázlat

L–1

N–1

N–2

Hasznosság A találmány szerinti vegyületek különbözõ területeken alkalmazhatók. A szakterületen jártas szakember számára nyilvánvaló, hogy a mitózis különféle módokon változtatható meg; azaz a mitózist befolyásolhatjuk a mitotikus útvonal egy komponense aktivitásának fokozásával vagy csökkentésével. Másképpen szólva a

mitózis befolyásolható (például megszakítható) az 55 egyensúly megzavarásával, egyes komponensek gátlásával vagy aktiválásával. Hasonló megközelítés alkalmazható a meiózis megváltoztatására. A találmány szerinti megoldás egy elõnyös formájában a találmány szerinti vegyületeket a mitotikus orsó 60 kialakulásának modulálására használjuk, így a sejtcik13

1

HU 005 812 T2

lus elnyújtott leállítását okozzuk a mitózisban. A „modulálás” kifejezésen itt a mitotikus orsó kialakulásának megváltoztatását értjük, beleértve az orsóképzõdés fokozását és csökkentését. A „mitotikus orsó képzõdése” kifejezésen itt a mikrotubulusok mitotikus kinezinek hatására történõ kétpólusú szerkezetekbe való szervezõdését értjük. A „mitotikus orsó rendellenes mûködése” kifejezésen itt a mitózis leállását és egypólusú orsó képzõdését értjük. A találmány szerinti vegyületek használhatók arra, hogy egy mitotikus kinezint megkössünk és/vagy egy mitotikus kinezin aktivitását moduláljuk. Egy elõnyös megvalósítási forma szerint a mitotikus kinezin egy a mitotikus kinezinek bimC alcsoportjának tagja (amint ezt az US 6 284 480 számú irat 5. oszlopában ismertetik). Egy másik elõnyös megvalósítási forma szerint a mitotikus kinezin humán KSP, azonban más szervezetekbõl származó mitotikus kinezinek aktivitása is modulálható a jelen találmány szerinti vegyületek segítségével. Ebben az összefüggésben modulálás kifejezésen az orsópólusok szétválásának fokozását vagy lassítását értjük, ami a mitotikus orsó pólusainak deformáltságát, azaz ferde kihajlását, vagy pedig a mitotikus orsó más morfológiai zavarát okozza. E célokra a KSP definíciójába beletartoznak a KSP variánsai és/vagy fragmensei is. Ezenkívül más mitotikus kinezinek is gátolhatók a jelen találmány szerinti vegyületekkel. A jelen találmány szerinti vegyületeket sejtproliferációs betegségek kezelésére alkalmazzuk. Az itt biztosított módszerekkel és kompozíciókkal kezelhetõ betegségek például – azonban nem kizárólag – a rák (amelyet az alábbiakban tovább tárgyalunk), autoimmun betegségek, ízületi gyulladás, beültetett szerv/szövet kilökõdése, gyulladásos bélbetegség, gyógyító eljárás, például – de nem kizárólag – sebészeti, érsebészeti beavatkozás után indukált proliferáció és hasonlók. Megjegyzendõ, hogy néhány esetben a sejtek esetleg nincsenek hiper- vagy hipoproliferációs állapotban (abnormális állapotban), mégis szükség van kezelésre. Így például sebgyógyulás során a sejtek „normális” proliferációt mutathatnak, kívánatos lehet azonban a proliferáció fokozása. A fent tárgyaltakhoz hasonlóan, a mezõgazdaság terén, a sejtek „normális” állapotban lehetnek, kívánatos lehet azonban a proliferáció modulálása, hogy fokozzuk egy termény termelését, a termény növekedésének közvetlen fokozásával, vagy pedig egy olyan növény vagy szervezet növekedésének gátlásával, amely károsan befolyásolja a terményt. Így egy megvalósítási formában a találmány itt magában foglal olyan sejtekre vagy egyedekre való alkalmazást, amelyek az ilyen rendellenességek vagy állapotok bármelyikétõl szenvednek, vagy ettõl függnek. Az itt biztosított vegyületeket, kompozíciókat és módszereket különösen alkalmasnak ítéljük rák, beleértve a szilárd tumorokat, így bõr¹, emlõ¹, agy¹, nyaki karcinómák, herekarcinóma stb. kezelésére. Még közelebbrõl a találmány szerinti vegyületekkel, kompozíciókkal és módszerekkel kezelhetõ rákok például – de nem kizárólag –: szív esetén: szarkóma (angiosarcoma, fibrosarcoma, rhabdomyosarcoma, liposarcoma),

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 14

2

myxoma, rhabdomyoma, fibroma, lipoma és teratoma; tüdõ esetén: bronchogén karcinóma (pikkelyes sejt, nemdifferenciálódott kissejt, nem differenciálódott nagysejt, adenocarcinoma), alveoláris (hörgõ) carcinoma, hörgõ adenoma, sarcoma, lymphoma, porcos hamartoma, mezothelioma; gyomor-bél rendszer esetén: nyelõcsõ (pikkelyes sejt carcinoma, adenocarcinoma, leiomyosarcoma, lymphoma), gyomor (carcinoma, lymphoma, leiomyosarcoma), hasnyálmirigy (duktális adenocarcinoma, inzulinoma, glucagonoma, gastrinoma, carcinoid tumorok, vipoma), vékonybél (adenocarcinoma, lymphoma, carcinoid tumorok, Kaposi-szarkóma, leiomyoma, hemangioma, lipoma, neurofibroma, fibroma), vastagbél (adenocarcinoma, tubuláris adenoma, bélbolyhadenoma, hamartoma, leiomyoma); húgyivari traktus esetén: vese [adenocarcinoma, Wilm-tumor (nephroblastoma), lymphoma, leukémia], hólyag és húgycsõ (pikkelyes sejt karcinóma, átmeneti sejt karcinóma, adenocarcinoma), prosztata (adenocarcinoma, sarcoma), herék (seminoma, teratoma, embrionális carcinoma, teratocarcinoma, choriocarcinoma, sarcoma, interstitialis sejt carcinoma, fibroma, fibroadenoma, adenomatoid tumorok, lipoma); máj esetén: hepatoma (hepatocelluláris carcinoma), cholangiocarcinoma, hepatoblastoma, angiosarcoma, hepatocelluláris adenoma, hemangioma; csontok esetén: csontszarkóma, (osteosarcoma), fibrosarcoma, malignus rostos histiocytoma, chondrosarcoma, Ewing-szarkóma, malignus limphoma (hálózati sejt szarkóma), többszörös myeloma, malignus óriássejtes tumor chordoma, osteochronfroma (csont-porc kinövés), benignus chondroma, chondroblastoma, chondromyxofibroma, csontszerû osteoma és óriássejtes tumorok; idegrendszer esetén: koponya (osteoma, hemangioma, granuloma, xanthoma, osteitis deformans), agyhártyák (meningioma, meningosarcoma, gliomatosis), agy [astrocytoma, medulloblastoma, glioma, ependymoma, germinoma (tobozmirigy-daganat), glioblastoma multiform, oligodendroglioma, Schwann-daganat, retinoblastoma, veleszületett tumorok], gerincagy (neurofibroma, meningioma, glioma, sarcoma); nõgyógyászat területén: méh (endometriális carcinoma), méhnyak (méhnyakkarcinóma, pretumoros méhnyakfejlõdési zavar), petefészkek [petefészek-karcinóma (súlyos cisztás adenocarcinoma, nyákszerû cisztás adenocarcinoma, nem rendszerezett carcinoma), granulosa-hüvelysejt tumorok, Sertoli-Leydig sejt tumorok, dysgerminoma, malignus teratoma], vulva (pikkelyes sejt karcinóma, intraepiteliális carcinoma, adenocarcinoma, fibroblastoma, melanoma), vagina (áttetszõ-sejt karcinóma, pikkelyes sejt karcinóma, fürtszerû sarcoma, embrionális rhabdomyosarcoma), petevezetékek (carcinoma); hematológiai területen: vér [myeloid leukémia (akut és krónikus), akut lymphoblastás leukémia, krónikus lymphocytás leukémia, myeloproliferatív betegségek, többszörös myeloma, myelodysplastiás tünetegyüttes)], Hodgkinbetegség, nem Hodgkin lymphoma (malignus lymphom); bõr esetén: malignus melanoma, bazális sejt karcinóma, pikkelyes sejt karcinóma, Kaposi-szarkóma, rendellenes fejlõdésû üszögös anyajegy, lipo-

1

HU 005 812 T2

ma, angioma, dermatofibroma, keloidok, psoriasis; és mellékvesék esetén: neuroblastoma. A „rákos sejt” kifejezésen tehát itt olyan sejtet értünk, amelyet a fent említett állapotok bármelyike sújt. A jelen találmány szerinti vegyületek alkalmazhatók továbbá gombaellenes ágensekként is, azáltal, hogy modulálják a bimC kinezin alcsoport gombatagjainak aktivitását, amint ezt az US–6 284 480 számú iratban ismertetik. A találmány szerinti vegyületek adagolhatók emlõsöknek, elõnyösen embereknek, vagy önmagukban, vagy pedig elõnyösen gyógyszerészetileg elfogadható vivõanyagokkal, excipiensekkel vagy hígítószerekkel kombinálva gyógyszerkészítményekben, a standard gyógyszerészeti gyakorlatnak megfelelõen. A vegyületek adagolhatók orálisan vagy parenterálisan, beleértve az intravénás, intramuszkuláris, intraperitoneális, szubkután, rektális és topikális adagolási utakat. A „kompozíció” kifejezésen olyan terméket kívánunk érteni, amely az adott komponenseket az adott mennyiségekben tartalmazza, valamint bármilyen olyan terméket, amely közvetlenül vagy közvetetten az adott komponensek adott mennyiségeinek kombinációjából adódik. A hatóanyagot tartalmazó gyógyszerkészítmények lehetnek orális adagolásra alkalmas formában, így például lehetnek tabletták, pirulák, nagy pasztillák, vizes vagy olajos szuszpenziók, diszpergálható porok vagy granulátumok, emulziók, kemény vagy lágy kapszulák, vagy szirupok vagy elixírek. Az orális adagolásra szánt kompozíciók bármilyen a technika állása szerint gyógyszerkészítmények elõállítására szolgáló módszerrel elõállíthatók, és az ilyen kompozíciók tartalmazhatnak egy vagy több ágenst a következõk közül: édesítõszerek, ízesítõszerek, színezékek, konzerválószerek, hogy gyógyszerészetileg választékos és fogyasztható készítményeket kapjunk. A tabletták az aktív komponenst nem toxikus, gyógyszerészetileg elfogadható excipienssel keverve tartalmazzák, amelyek alkalmasak a tabletták elõállításához. Az ilyen excipiensek lehetnek például inert hígítószerek, például kalcium-karbonát, nátrium-karbonát, laktóz, kalcium-foszfát vagy nátrium-foszfát; granuláló- és dezintegrálószerek, például mikrokristályos cellulóz, nátrium-kroszkarmellóz, kukoricakeményítõ vagy alginsav; kötõágensek, például keményítõ, zselatin, poli(vinil-pirrolidon) vagy akácmézga, és síkosítóágensek, például magnézium-sztearát, sztearinsav vagy talkum. A tabletták lehetnek bevonat nélküliek, vagy pedig ismert módszerekkel bevonhatók, hogy a hatóanyag kellemetlen ízét eltakarjuk, vagy pedig késleltessük az emésztést és abszorpciót a gyomor-bél rendszeri traktusban, és így elnyújtott hatást biztosítsunk hosszabb idõszakon keresztül. Így például vízoldható, ízmaszkírozó anyagok, így hidroxi-metilcellulóz vagy hidroxi-propil-cellulóz, vagy pedig késleltetõ anyagok, így etil-cellulóz, cellulóz-acetát-butirát alkalmazható. Az orális adagolásra szánt készítmények biztosíthatók keményzselatin-kapszulák formájában is, ahol a hatóanyagot egy szilárd inert hígítószerrel, kalcium-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 15

2

karbonáttal, kalcium-foszfáttal vagy kaolinnal keverjük, vagy pedig lágy zselatinkapszulákban, ahol a hatóanyagot vízoldható vivõanyaggal, mint polietilénglikollal, vagy pedig olajos közeggel, például földimogyoróolajjal, folyékony paraffinnal vagy olívaolajjal keverjük. A vizes szuszpenziók a hatóanyagot vizes szuszpenzió elõállításához alkalmas excipienssel keverve tartalmazzák. Az ilyen excipiensek lehetnek szuszpendálóágensek, például nátrium-karboxi-metil-cellulóz, metil-cellulóz, hidroxi-propil-metil-cellulóz, nátrium-alginát, poli(vinil-pirrolidon), tragakantgyanta és akácmézga; diszpergáló- vagy nedvesítõágensek lehetnek a természetesen elõforduló foszfatidok, például lecitin, vagy pedig alkilén-oxid zsírsavakkal alkotott kondenzációs termékei, például polioxi-etilén-sztearát, vagy pedig hosszú szénláncú alifás alkoholok etilén-oxiddal képzett kondenzációs termékei, például heptadekaetilén-oxi-cetanol, vagy pedig zsírsavakból vagy hexitolból származó részleges észterek etilén-oxiddal képzett kondenzációs termékei, például polioxi-etilén-szobitmonooleát, vagy pedig zsírsavak és hexitanhidridek részleges észtereinek etilén-oxiddal képzett kondenzációs termékei, például polietilén-szorbitán-monooleát. A vizes szuszpenziók tartalmazhatnak egy vagy több konzerválószert, például etil- vagy n¹propil-p-hidroxibenzoátot, egy vagy több színezéket, egy vagy több ízesítõágenst és egy vagy több édesítõszert, így szacharózt, szacharint vagy aszpartámot. Az olajos szuszpenziók úgy állíthatók elõ, hogy a hatóanyagot növényi olajban, például földimogyoróolajban, olívaolajban, szezámolajban vagy kókuszdióolajban, vagy pedig ásványi olajban, így folyékony paraffinban szuszpendáljuk. Az olajos szuszpenziók tartalmazhatnak sûrítõszert, például méhviaszt, kemény paraffint vagy etil-alkoholt. Adagolhatók édesítõszerek, például a fent felsoroltak, valamint ízesítõszerek, hogy fogyasztható orális készítményt kapjunk. Ezek a kompozíciók tartósíthatók antioxidáns, például butilezett hidroxi-anizol vagy a¹tokoferol adagolásával. A vizes szuszpenziók víz hozzáadásával történõ elõállításához alkalmas diszpergálható porok és granulátumok, a hatóanyag diszpergáló- vagy nedvesítõszerrel, szuszpendálószerrel és egy vagy több konzerválószerrel alkotott keverékét biztosítják. Alkalmas diszpergáló- vagy nedvesítõszerek és szuszpendálószerek például azok, amelyeket a fentiekben már említettünk. További excipiensek, például édesítõ¹, ízesítõés színezõágensek szintén lehetnek jelen. A készítmények antioxidáns, például aszkorbinsav adagolásával konzerválhatók. A találmány szerinti gyógyszerkészítmények lehetnek „olaj a vízben” emulzió formájában is. Az olajos fázis lehet növényi olaj, például olívaolaj vagy földimogyoró-olaj, vagy pedig ásványi olaj, például folyékony paraffin vagy ezek keveréke. Alkalmas emulgeálószerek lehetnek a természetben elõforduló foszfatidok, például szójalecitin, továbbá zsírsavak és hexitanhidridek észterei vagy részleges észterei, például szorbitán-monooleát, valamint az említett részleges észterek etilén-oxiddal képzett kondenzációs termékei, például

1

HU 005 812 T2

polioxi-etilén-szorbitán-monooleát. Az emulziók szintén tartalmazhatnak édesítõ¹, ízesítõágenseket, konzerválószereket és antioxidánsokat. A szirupok és elixírek készíthetõk édesítõszerekkel, például glicerinnel, propilénglikollal, szorbittal vagy szacharózzal. Az ilyen készítmények szintén tartalmazhatnak puhító¹, konzerváló¹, ízesítõ¹, színezõágenseket és antioxidánsokat. A gyógyszerkészítmények lehetnek steril injektálható vizes oldatok formájában. Az alkalmazható elfogadható vivõanyagok és oldószerek közé tartalmaznak a víz, Ringer-oldat és az izotóniás nátrium-klorid-oldat. A steril injektálható készítmények lehetnek steril injektálható „olaj a vízben” mikroemulziók is, ahol a hatóanyagot az olajos fázisban oldjuk. Így például a hatóanyagot elõször oldhatjuk szójaolaj és lecitin keverékében. Majd az olajos oldatot víz és glicerin keverékéhez adjuk, és mikroemulzióvá dolgozzuk fel. Az injektálható oldatok és mikroemulziók a beteg véráramába helyi bóluszinjekció formájában adagolhatók. Elõnyös lehet, ha a oldatot vagy mikroemulziót oly módon adagoljuk, hogy az adott vegyület konstans cirkuláló koncentrációját tartsuk fenn. Ilyen konstans koncentráció fenntartásához folyamatos intravénás adagolóeszköz alkalmazható. Ilyen eszköz például a CADDPLUS™ model 5400 intermedier pumpa. A gyógyszerkészítmények lehetnek intramuszkuláris vagy szubkután adagolásra szánt steril injektálható vizes vagy olajos szuszpenziók formájában. Ilyen szuszpenziók ismert módon állíthatók elõ, alkalmas diszpergáló- vagy nedvesítõszerek és szuszpendálószerek alkalmazásával, amelyeket fent említettünk. A steril injektálható készítmények lehetnek továbbá nem toxikus, parenterálisan elfogadható hígítószerrel vagy oldószerrel készített steril injektálható oldatok vagy szuszpenziók, ilyen például az 1,3-butándiollal készült oldat, ezenkívül steril fixált olajokat szokás alkalmazni oldószerként vagy szuszpendálóközegként. Erre a célra bármilyen enyhe fixált olajat, így szintetikus mono- és diglicerideket alkalmazhatunk. Emellett zsírsavakat, például olajsavat is alkalmazhatunk injektálható készítmények elõállításához. A vegyületek adagolhatók kúpok formájában is, a hatóanyag rektális adagolásához. Ezek a készítmények úgy állíthatók elõ, hogy a hatóanyagot alkalmas nem irritáló excipienssel keverjük, amely normál hõmérsékleten szilárd, a végbél hõmérsékletén azonban folyékony, és ezért a végbélben el fog olvadni, hogy a hatóanyag felszabaduljon. Ilyen anyagok például a kakaóvaj, glicerinezett zselatin, hidrogénezett növényi olajok, különbözõ molekulatömegû polietilénglikolok keverékei és polietilénglikol zsírsav-észterei. Helyi alkalmazáshoz a vegyületet tartalmazó krémek, kenõcsök, zselék, oldatok vagy szuszpenziók stb. alkalmazhatók. (A jelen találmány céljaira a helyi alkalmazások körébe tartoznak a szájöblítõ szerek és gargarizálószerek is.) A jelen találmány szerinti vegyületek adagolhatók intranazálisan alkalmas intranazális, vivõanyag és szállítóeszköz topikális alkalmazásával, vagy pedig

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 16

2

transzdermális úton a szakterületen jártas szakember által jól ismert transzdermális bõrflastromok alkalmazásával. A transzdermális szállítórendszerrel való adagoláshoz a dózis adagolásának természetesen inkább folyamatosnak, mint megszakítottnak kell lennie a teljes adagolási idõszakban. A jelen találmány szerinti vegyületek adagolhatók továbbá kúp formájában, kúpalapok alkalmazásával, ilyenek a kakaóvaj, glicerinezett zselatin, hidrogénezett növényi olajok, különbözõ molekulatömegû polietilénglikolok keveréke és a polietilénglikol zsírsav-észterei. Ha egy találmány szerinti vegyületet embernek adagolunk, a napi dózist normálisan az elõíró orvos határozza meg, és a dózis általában a kortól, testtömegtõl, nemtõl, az egyedi beteg válaszkészségétõl, valamint a beteg tüneteinek súlyosságától függõen változik. Egy példaképpen bemutatott alkalmazás esetén a vegyület megfelelõ mennyiségét rák elleni kezelésben részesülõ emlõsnek adagoljuk. Az adagolás naponta testtömeg-kg-onként kb. 0,1 mg, és kb. 60 mg közötti mennyiségben, elõnyösen naponta testtömeg-kg-onként 0,5 mg és kb. 40 mg közötti mennyiségben történik. A jelen vegyületek alkalmazhatók ismert terápiás ágensekkel és rákellenes ágensekkel kombinálva is. Így például a jelen vegyületek hasznosak ismert rákellenes ágensekkel kombinálva. A jelenleg ismertetett vegyületek más rákellenes vagy kemoterápiás ágensekkel való kombinációja a találmány tárgykörébe tartozik. Ilyen ágenseket ismertetnek például a következõ szakirodalmi helyen: V. T. Devita and S. Hellman (szerk.): Cancer Principles and Practice of Oncology, 6. kiadás (2001. február 15.), Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Egy szakterületen jártas szakember el tudja dönteni, hogy a hatóanyagok adott jellemzõi és az érintett rák alapján milyen ágensek kombinációja használható. Ilyen rákellenes ágensek például – azonban nem kizárólag – ösztrogénreceptor-modulátorok, androgénreceptor-modulátorok, retinoidreceptor-modulátorok, citotoxikus-citosztatikus ágensek, antiproliferatív ágensek, prenil-protein-transzferáz inhibitorok, HMG-CoA reduktáz inhibitorok és más angiogenezisinhibitorok, sejtproliferáció és túlélési szignalizálás inhibitorai, apoptózisindukáló ágensek, valamint a sejtciklus ellenõrzõ pontjaival interferáló ágensek. A jelen vegyületek különösen hasznosak, ha radioterápiával együtt adagoljuk. Egy megvalósítási mód szerint a jelen vegyületek hasznosak ismert rákellenes ágensekkel való kombinációban is, ilyenek például a következõk: ösztrogénreceptor-modulátorok, androgénreceptor-modulátorok, retinoidreceptor-modulátorok, citotoxikus ágensek, antiproliferatív ágensek, prenil-protein-transzferáz inhibitorok, HMG-CoA reduktáz inhibitorok, HIV-proteáz-inhibitorok, reverz transzkriptáz inhibitorok és más angiogenezisinhibitorok. Az „ösztrogénreceptor-modulátorok” kifejezésen olyan vegyületeket értünk, amelyek interferálnak az ösztrogénreceptorhoz való kötõdésével, vagy pedig gátolják azt, függetlenül annak mechanizmusától. Ösztrogénreceptor-modulátorok például – azonban nem kizá-

1

HU 005 812 T2

rólag – tamoxifen, raloxifen, idoxifen, LY353381, LY117081, toremifen, fulvestrant, 4¹[7¹(2,2-dimetil-1oxo-propoxi-4-metil-2-[4¹[2¹(¹piperidinil)-etoxi]-fenil]-2H1-benzo-pirán-3¹il]-fenil-2,2-dimetil-propanoát, 4,4’-dihidroxi-benzofenon-2,4-dinitro-fenil-hidrazon és SH646. Az „androgénreceptor-modulátor”¹ok kifejezésen olyan vegyületeket értünk, amelyek interferálnak az androgénreceptorhoz való kötõdésével, vagy pedig gátolják azt, függetlenül annak mechanizmusától. Androgénreceptor-modulátorok például a finaszterid és más 5a-reduktáz inhibitorok, nilutamid, flutamid, bicalutamid, liarozole, és abirateron-acetát. A „retinoidreceptor-modulátorok” kifejezésen olyan vegyületeket értünk, amelyek interferálnak az retinoid receptorhoz való kötõdésével, vagy pedig gátolják azt, függetlenül annak mechanizmusától. Retinoidreceptormodulátorok például a bexaroten, tretinoin, 13¹cisz-retinoinsav, 9¹cisz-retinoinsav, a¹difluor-metil-omitin, ILX23–7553, transz-N-(4’-hidroxi-fenil)-retinamid és N¹4-karboxi-fenil-retinamid. A „citotoxikus/citosztatikus ágensek” kifejezésen olyan vegyületeket értünk, amelyek sejtpusztulást okoznak, vagy pedig primer módon gátolják a sejtproliferációt a sejtfunkciókkal közvetlenül interferálva, vagy pedig interferálnak a sejtmitózissal, vagy gátolják azt, ilyen vegyületek például az alkilezõágensek, tumornekrózis-faktorok, interkalátorok, hipoxiaaktiválható vegyületek, a mikrotubulus inhibitorok/mikrotubulusstabilizáló ágensek, mitotikus kinezinek inhibitorai, a mitózis lefolyásában részt vevõ kinázok inhibitorai, antimetabolitok; biológiai válasz módosítók; hormonális antihormonális terápiás ágensek, haematopoietikus növekedési faktorok, monoklonális antitesttel célba juttatott terápiás ágensek, topoizomerázinhibitorok, proteaszomainhibitorok és ubiquitin-ligáz-inhibitorok. Citotoxikus ágensek például – de nem kizárólag – sertenef, kachektin, ifoszfamid, tazonermin, lonidamin, karboplatin, altretamin, prednimusztin, dibromodulcitol, ranimustin, fotemustin, nedaplatin, oxaliplatin, temozolomid, heptaplatin, estramustin, improszulfán-tozilát, trofoszfamid, nimusztin, dibrospidium-klorid, pumitepa, lobaplatin, satraplatin, profiromicin, ciszplatin, irofulven, dexifoszfamid, cisz-amin-diklór-(2¹metil-piridin)-platina, benzil-guanin, glufoszfamid, GPX100, (transz, transz, transz)-bisz-mu-(hexán-1,6-diamin)-mu-[diamin-platina(II)]-bisz[diamin-(klór)-platina(II)]-tetraklorid, diarizidinilspermin, arzén-trioxid, 1¹(11-dodecil-amino-10-hidroxi-undecil)-3,7-dimetil-xantin, zorubicin, idarubicin, daunorubicin, biszantrén, mitoxantron, pirarubicin, pinafid, valrubicin, amrubicin, antineoplaston, 3’¹dezamino-3’morfolino-13-dezoxo-10-hidroxi-karminomicin, annamicin, galarubicin, elinafid, MEN10755 és 4¹dezmetoxi-3deamino-3-aziridinil-4-metil-szulfonil-daunorubicin (lásd WO 00/50032). Hipoxiaaktiválható vegyületek példája a tirapazamin. Proteaszomainhibitorok példái – de nem kizárólag – a laktacisztin és a bortezomib. Mikrotbulusgátló inhibitorok/mikrotubulusstabilizáló ágensek a paclitaxel, vindezin-szulfát, 3’,4’-didehidro4’-dezoxi-8’-norvinkaleukoblasztin, docetaxol, rizoxin,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 17

2

dolasztatin, mivobulin-izetionát, aurisztatin, kemadotin, RPR109881, BMS184476, vinflunin, criptoficin, 2,3,4,5,6-pentafluor-N-(3¹fluor-4-metoxi-fenil)-benzolszulfonamid, anhidrovinblasztine, N,N-dimetil-L-valil-Lvalil-N-metil-L-valil-L-prolil-L-prolin-t-butil-amid, TDX258 és epotilonok (lásd például az US 6 284 781 és 6 288 237 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást), és BMS188797. Néhány topoizomerázinhibitor például topotekan, hikaptamin, irinotekan, rubitekan, 6¹etoxi-propionil¹3’,4’-O-exo-benzilidén-karteuzin, 9¹metoxi¹N,Ndimetil-5-nitro-piazolo[3,4,5¹kl]akridin-2-(6H)propánamin, 1¹amino-9-etil-5-fluor-2,3-dihidro-9-hidroxi-4-metil¹1H,12H-benzo[de]pirano[3’,4’:b,7]indolizino[1,2b]kinolin¹10,13(9H,15H)dion, lurtotekan, 7¹[2¹(N¹izopropilamino)-etil]-(20S)-kaptotecin, BNP1350, BNPI1100, BN80915, BN80942, etopozid-foszfát, tenipozid, sobuzoxán, 2’¹dimetil-amino-2’-dezoxi-etoposid, GL331, N¹[2¹(dimetil-amino)-etil]-9-hidroxi-5,6-dimetil-6Hpirido[4,3¹b]karbazol-1-karboxamid, aszulakrin, (5a, SaB, 8aa,9b)-9-[2¹[N¹[2¹(dimetil-amino)-etil]-N-metilamino]-etil]-5-[4¹hidroxi-3,5-dimetoxi-fenil]5,5a,6,8,8a,9-hexohidrofuro(3’,4’:6,7)nafto(2,3¹d)-1,3dioxol-6¹on, 2,3-(metilén-dioxi)-5-metil-7-hidroxi-8metoxi-benzo[c]fenantridinium, 6,9-bisz[(2¹amino-etil)amino]-benzo[g]izokinolin-5,10-dion, 5¹(3¹amino-propilamino)-7,10-dihidroxi-2-(2¹hidroxi-etil-amino-metil)-6Hpirazolo[4,5,1¹de]akridin-6¹on, N¹[1¹[2(dietil-amino)-etilainino]-7-metoxi-9-oxo-9H-tioxantén-4-il-metil]-formamid, N¹(2¹(dimetil-amino)-etil)-akridin-4-karboxamid, 6¹[[2¹(dimetil-amino)-etil]-amino]-3-hidroxi-7H-indeno[2,1¹c]kinolin-7¹on és dimeszna. Mitotikus kinezinek inhibitorait, különösen a humán mitotikus kinezin KSP¹t ismertetik például a következõ iratok: WO 01/30768 és WO 01/98278, WO 03/050,064 (2003. június 19.), WO 03/050,122 (2003. június 19.), WO 03/049,527 (2003. június 19.), WO 03/049,679 (2003. június 19.), WO 03/049,678 (2003. június 19.) és WO 03/39460 (2003. május 15.) számú PCT publikációk és US03/06403 (2003. március 4.), US03/15861 (benyújtás napja: 2003. május 19.), US03/15810 (benyújtás napja: 2003. május 19.), US03/18482 (benyújtás napja: 2003. június 12.) és US03/18694 (benyújtás napja: 2003. június 12.). és függõ nemzetközi PCT bejelentések. Egy megvalósítási forma szerint a mitotikus kinezinek inhibitorai közé tartoznak – de nem kizárólag – KSP inhibitorai, MKLP1 inhibitorai, CENP¹E inhibitorai, MCAK inhibitorai, Kifl4 inhibitorai, Mphosphl inhibitorai és Rab6-KIFL inhibitorai. A „mitózis lefolyásában részt vevõ kinázok inhibitorai” közé tartoznak – de nem kizárólag – aurora kináz inhibitorai, Polo-szerû kinázok (PLK) inhibitorai (különösen PLK–1 inhibitorai), bub-1-inhibitorai és bub¹R1 inhibitorai. Az „antiproliferatív ágensek” közé tartoznak az antiszensz RNS és DNS oligonukleotidok, így G3139, ODN698, RVASKRAS, GEM231 és INX3001 és antimetabolitok, így enocitabin, karmofur, tegafur, pentosztatin, doxifluridin, trimetrexát, fludarabin, capecitabin, galocitabin, citarabin-oktofoszfát, foszteabin-nátrium-

1

HU 005 812 T2

hidrát, raltitrexed, paltitrexid, emitefur, tiazofurin, decitabin, nolatrexed, pemetrexed, nelzarabin, 2’dezoxi-2’metilidén-citidin, 2’¹fluor-metilén-2’-dezoxicitidin, N¹[5¹(2,3-dihidrobenzo-furil)-szulfonil]-N’¹(3,4-diklórfenil)-karbamid, N6¹[4¹dezoxi-4-[N2-[2(E),4(E)-tetradekadienoil]-glicil-amino]-L-glicero-B-L-mannoheptopiranozil]-adenin, aplidin, ekteinascidin, troxacitabin, 4¹[2¹amino-4-oxo-4,6,7,8-tetrahidro-3H-pirimidino[5,4¹b][1,4]tiazin-6-il¹(S)-etil]-2,5-tienoil-L-glutaminsav, aminopterin, 5¹fluro-uracil, alanozin, 11¹acetil-8(karbamoil-oxi-metil)-4-formil-6-metoxi-14-oxa-1,11diaza-tetraciklo(7.4.1.0.0)tetradeka-2,4,6-trien-9-ilecetsav-észter, swainsonin, lometrexol, dexrazoxán, metionináz, 2’¹ciano-2’-dezoxi-N4-palmitoil-1-B-Darabino-furanozil-citozin és 3¹amino-piridin-2-karboxaldehid-tioszemikarbazon. Monoklonális antitest által célba juttatott terápiás ágensek az olyan terápiás ágensek, amelyek ráksejtre specifikus vagy célba vett sejtre specifikus monoklonális antitesthez kapcsolt citotoxikus ágenseket vagy radioizotópokat tartalmaznak. Ilyen például a Bexxar. A „HMG-CoA reduktáz inhibitorok” kifejezés alatt a 3¹hidroxi-3-metil-glutaril-CoA-reduktáz inhibitorait értjük. A HMG-CoA reduktáz aktivitását gátló vegyületek könnyen azonosíthatók a technika állása szerint ismert vizsgálati módszerekkel. Ilyen vizsgálatokat ismertetnek, illetve hivatkoznak ilyenekre a következõ iratokban: US 4 231 938, 6. oszlop és WO 84/02131, a 30–33. oldalon. A „HMG-CoA reduktáz inhibitor” és a „HMG-CoA reduktáz inhibitora” ugyanazt jelenti, ahogyan itt használjuk. Alkalmazható HMG-CoA reduktáz inhibitorok például – de nem kizárólag – lovastatin (MEVACOR®; lásd US 4 231 938, 4 294 926 és 4 319 039 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom) simvastatin (ZOCOR®; lásd US 4 444 784, 4 820 850 és 4 916 239 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom), pravastatin (PRAVACHOL®; lásd US 4 346 227, 4 537 859, 4 410 629, 5 030 447 és 180 589 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom) fluvastatin (LESCOL®; lásd US 5 354 772, 4 911 165, 4 929 437, 5 189 164, 5 118 853, 5 290 946 és 356 896 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom), atorvastatin (LIPITOR®; lásd US 5 273 995, 4 681 893, 5 489 691 és 5 342 952 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom). Ezen alkalmazható és további HMG-CoA reduktáz inhibitorok szerkezeti képletét ismertetik a következõ irodalmi helyeken: M. Yalpani, „Cholesterol Lowering Drugs”, Chemistry & Industry, pp. 85–89 (1996. február 5) és US 4 782 084 és 4 885 314 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom. A HMG-CoA reduktáz inhibitor kifejezés, ahogyan itt használjuk, magában foglalja az összes gyógyszerészetileg elfogadható lakton és szabad sav formát (azaz ahol a laktongyûrû kinyílt és szabad savat képezett), valamint a HMG-CoA reduktáz inhibitor aktivitással rendelkezõ vegyületek só¹ és észterformáit, és ezért az ilyen só¹, észter¹, nyitott sav és laktonformák alkalmazása a jelen találmány tárgykörébe tartoznak. A laktonrész és annak megfelelõ kinyílt savforma szemléltetése az alábbi I. és II. képlet.

2

5

lakton I 10

15 kinyílt sav II Az olyan HMG-CoA reduktáz inhibitorok esetén, 20 amelyek kinyílt sav formában létezhetnek, a só és észterformák a kinyílt savból képzõdhetnek, és az összes ilyen forma a „HMG-CoA reduktáz inhibitor” kifejezés jelentésébe tartozik, ahogyan itt használjuk. Egy megvalósítási forma szerint a HMG-CoA reduktáz inhibitort 25 a lovastatin és simvastatin közül választjuk, egy további megvalósítási forma szerint simvastatin. Itt a HMGCoA reduktáz inhibitorra vonatkozóan a „gyógyszerészetileg elfogadható sók” kifejezés a jelen találmány szerint alkalmazott vegyületek nem toxikus sóit jelenti, 30 amelyeket általában úgy állítunk elõ, hogy a szabad savat egy alkalmas szerves vagy szervetlen bázissal reagáltatjuk, ilyenek különösen a kationokból képzett sók, ilyenek például a nátrium, kálium, alumínium, kalcium, lítium, magnézium, cink és tetrametil-ammónium35 kationok, valamint az olyan sók, amelyek az aminokból képzõdnek, ilyenek például az ammónia, etilén-diamin, N¹metil-glukamin, lizin, arginin, ornitin, kolin, N,N’-dibenzil-etilén-diamin, klór-prokain, dietanol-amin, prokain, N¹benzil-fenetil-amin, 1¹p-klór-benzil-2-pirrolidin40 1’-il-metil-benzimidazol, dietil-amin, piperazin és trisz(hidroxi-metil)-amino-metán. A HMG-CoA reduktáz inhibitorok további sóformái például – azonban nem kizárólag – acetát, benzolszulfonát, benzoát, bikarbonát, biszulfát, bitartarát, borát, bromid, kalcium-edetát, kam45 szilát, karbonát, klorid, klavulanát, citrát, dihidroklorid, edetát, edizilát, esztolát, ezilát, fumarát, gluceptát, glukonát, glutamát, glikollil-arzanilát, hexil-rezorcinát, hidrabamin, hidrobromid, hidroklorid, hidroxi-naftoát, jodid, izotionát, laktát, laktobionát, laurát, malát, maleát, 50 mandelát, mezilát, metil-szulfát, mukát, napszilát, nitrát, oleát, oxalát, pamoát, palmitát, pantotenát, foszfát/difoszfát, poligalacturonát, szalicilát, sztearát, szubacetát, szukcinát, tannát, tartarát, teoklát, tozilát, trietiodid és valerát. Az ismertetett HMG-CoA reduktáz inhibitor vegyü55 letek észterszármazékai elõhatóanyagként hathatnak, amelyek egy meleg vérû állat véráramában abszorbeálódva oly módon hasadnak, hogy a hatóanyagforma felszabadul, és lehetõvé teszi, hogy a hatóanyag javí60 tott terápiás hatékonyságot fejtsen ki. 18

1

HU 005 812 T2

A „prenil-protein-transzferáz inhibitor” kifejezésen olyan vegyületeket értünk, amelyek a prenil-proteintranszferáz enzimek egyikét vagy bármilyen kombinációját gátolják, ilyenek például farnezil-protein-transzferáz (FPTáz), geranil-geranil-protein-transzferáz I típus (GGPTáz¹I) és geranil-geranil-protein-transzferáz típus II (GGPTáz¹II, más néven Rab GGPTáz). Prenil-protein-transzferáz gátló vegyületek például (±)-6-[amino(4¹klór-fenil)-(1¹metil-1H-imidazol-5¹il)-metil]-4-(3¹klórfenil)-1-metil-2(1H)-kinolinon, (–)-6-[amino-(4¹klór-fenil)(1¹metil-1H-imidazol-5¹il)-metil]-4-(3¹klór-fenil)-1-metil2(1H)-kinolinon, (+)-6-[amino-(4¹klór-fenil)-(1¹metil-1Himidazol-5¹il)-metil]-4-(3¹klór-fenil)-1-metil-2(1H)-kinolinon, 5(S)-n-butil-1¹(2,3-dimetil-fenil)-4-[1¹(4¹ciano-benzil)-5-imidazolil-metil]-2-piperazinon, (S)-1-(3¹klór-fenil)4-[1¹(4¹ciano-benzil)-5-imidazolil-metil]-5-[2¹(etánszulfonil)-metil)-2-piperazinon, 5(S)-n-butil-1-(2¹metil-fenil)-4[1¹(4¹ciano-benzil)-5-imidazolil-metil]-2-piperazinon, 1¹(3¹klór-fenil)-4-[1¹(4¹ciano-benzil)-2-metil-5-imidazolilmetil]-2-piperazinon, 1¹(2,2-difenil-etil)-3-[N¹(1¹(4¹cianobenzil)-1H-imidazol-5-il-etil)-karbamoil]-piperidin, 4¹{5¹[4¹hidroxi-metil-4-(4¹klór-piridin-2-il-metil)-piperidin1-il-metil]-2-metil-imidazol-1-il-metil}-benzonitril, 4¹{5¹[4¹hidroxi-metil-4-(3¹klór-benzil)-piperidin-1-il-metil]-2-metil-imidazol-1-il-metil}-benzonitril, 4¹{3¹[4¹(2¹oxo2H-piridin-1¹il)-benzil]-3H-imidazol-4-il-metil}-benzonitril, 4¹{3¹[4¹(5¹klór-2-oxo-2H¹[1,2’]bipiridin-5’-il-metil]-3Himidazol-4-il-metil}-benzonitril, 4¹{3¹[4¹(2¹oxo2H¹[1,2’]bipiridin-5’-il-metil]-3H-imidazol-4-il-metil}-benzonitril, 4¹[3¹(2¹oxo-1-fenil-1,2-dihidropiridin-4-il-metil)3H-imidazol-4-il-metil]-benzonitril, 18,19-dihidro-19-oxo5H,17H-6,10:12,16-dimeteno-1H-imidazo[4,3c][1,11,4]dioxa-aza-ciklononadecin-9-karbonitril, (±)¹19,20-dihidro-19-oxo-5H¹18,21-etano¹12,14-eteno6,10-meteno-22H¹benzo[d]imidazo[4,3-k][1‚6,9,12]oxatriaza-ciklooktadecin-9-karbonitril, 19,20-dihidro-19oxo-5H,17H¹18,21-etano-6,10:12,16-dimeteno-22H¹imidazo[3,4-h][1,8,11,14]oxa-triaza-cikloeikozin-9-karbonitril és (±)¹19,20-dihidro-3-metil-19-oxo-5H¹18,21-etano¹12,14-eteno-6,10-meteno-22H¹benzo[d]imidazo[4,3k][1‚6,9,12]oxa-triaza-ciklooktadecin-9-karbonitril. További prenil-protein-transzferáz inhibitorokat ismertetnek a következõ iratok: WO 96/30343, WO 97/18813, WO 97/21701, WO 97/23478, WO 97/38665, WO 98/28980, WO 98/29119, WO 95/32987, US. 5 420 245, US 5 523 430, US 5 532 359, US 5 510 510, US 5 589 485, US 5 602 098 t, EP 0 618 221 A1, EP 0 675 112 A1, EP 0 604 181 A1, EP 0 696 593 A1, WO 94/19357, WO 95/08542, WO 95/11917, WO 95/12612, WO 95/12572, WO 95/10514, US 5 661 152, WO 95/10515, WO 95/10516, WO 95/24612, WO 95/34535, WO 95/25086, WO 96/05529, WO 96/06138, WO 96/06193, WO 96/16443, WO 96/21701, WO 96/21456, WO 96/22278, WO 96/24611, WO 96/24612, WO 96/05168, WO 96/05169, WO 96/00736, US 5 571 792, WO 96/17861, WO 96/33159, WO 96/34850, WO 96/34851, WO 96/30017, WO 96/30018, WO 96/30362, WO 96/30363, WO 96/31111,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 19

2

WO 96/31477, WO 96/31478, WO 96/31501, WO 97/00252, WO 97/03047, WO 97/03050, WO 97/04785, WO 97/02920, WO 97/17070, WO 97/23478, WO 97/26246, WO 97/30053, WO 97/44350, WO 98/02436 és US 5 532 359. Egy prenil-protein-transzferáz inhibitor angiogenezisben játszott szerepét ismertetik az European J. of Cancer, 35, 9, 1394–1401 o. (1999) irodalmi helyen. Az „angiogenezisinhibitorok” kifejezésben olyan vegyületeket értünk, amelyek gátolják az új véredények kialakulását, függetlenül annak mechanizmusától. Angiogenezisinhibitorok például – de nem kizárólag – tirozin-kináz-inhibitorok, a tirozin-kináz-receptorok ilyen inhibitorai az Flt¹1 (VEGFR1) és Flk-1/KDR (VEGFR2), epidermális eredetû, fibroblaszteredetû, vagy vérlemezke-eredetû növekedési faktorok inhibitorai, MMP (mátrix metalloproteáz) inhibitorok, integrinblokkolók, interferon¹a, interleukin–12, pentozán-poliszulfát, ciklooxigenázinhibitorok, így nemszteroid gyulladásgátlók (NSAIDs) például aspirin és ibuprofen, valamint szelektív ciklooxigenáz-2-inhibitorok, például celecoxib és rofecoxib [PNAS, 89, 7384 o. (1992); JNCI, 69, 475. o. (1982); Arch. Opthalmol., 108, 573. o. (1990); Anat. Rec, 238, 68. o. (1994); FEBS Letters, 372, 83. o. (1995); Clin, Orthop. 313, 76. o. (1995); J. Mol. Endocrinol., 16, 107. o. (1996); Jpn. J. Pharmacol., 75, 105. o. (1997); Cancer Res., 57, 1625. o. (1997); Cell, 93, 705. o. (1998); Intl. J. Mol. Med., 2, 715. o. (1998); J. Biol. Chem., 274, 9116. o. (1999)], szteroid gyulladásgátlók (mint például kortikoszteroidok, mineralkortikoidok, dexametazon, prednizon, prednizolon, metilpred, betametazon), karboxi-amido-triazol, kombretasztatin A–4, szkvalamin, 6¹(O¹klór-acetil-karbonil)-fumagillol, talidomid, angiosztatin, troponin-1, angiotenzin II antagonisták [lásd Fernandez és mtsai, J. Lab. Clin. Med. 105:141–145 (1985)], és VEGF elleni antitestek [lásd, Nature Biotechnology, 17, 963–968. o. (1999 október); Kim és mtsai, Nature, 362, 841–844 (1993); WO 00/44777 és WO 00/61186]. További olyan terápiás ágensek, amelyek az angiogenezist modulálják vagy gátolják és a jelen találmány szerinti vegyületekkel kombinálva alkalmazhatók, az olyan ágensek, amelyek a koagulációt és fibrinolízisrendszereket modulálják vagy gátolják [áttekintést lásd: Clin. Chem. La. Med. 38:679–692 (2000)]. Ilyen, a koagulációt és fibrinolízis-útvonalakat moduláló vagy gátló ágensek például – azonban nem kizárólag – a heparin [lásd Thromb. Haemost. 80:10–23 (1998), kis molekulatömegû heparinok és karboxipeptidáz¹U inhibitorok (amelyek aktív trombinnal aktiválható fibrinolízisinhibitorokként [TAFIa] is ismeretesek [lásd Thrombosis Res. 101:329–354 (2001)]. TAFIa inhibitorokat ismertetnek a WO 03/013,526 számú PCT publikációban és az US 60/349 925 számú (2002. január 18¹án benyújtott) szabadalmi leírásban. A „sejtciklus ellenõrzõ pontjaival interferáló ágensek” kifejezésen olyan vegyületeket értünk, amelyek a sejtciklus ellenõrzõ pontjainak szignáljait átvivõ proteinkinázokat gátolják, ezáltal a ráksejtet a DNS-károsító ágensekkel szemben érzékennyé teszik. Ilyen ágensek

1

HU 005 812 T2

2

például az ATR, ATM, Chk1 és Chk2 kinázok inhibitorai, valamint a cdk és cdc kináz inhibitorok, ilyen például közelebbrõl a 7¹hidroxi-staurosporin, flavopiridol, CYC202 (Cyclacel) és BMS–387032. A „sejtproliferációt és túlélési szignalizáló útvonalat gátló vegyületek” kifejezésen olyan gyógyszerészeti ágenseket értünk, amelyek a sejtfelületi receptorokat és az ilyen sejtfelületi receptorokról a szignálátvivõ kaszkádokat gátolják. Ilyen ágensek például az EGFR inhibitorai (például gefitinib és erlotinib), az ERB–2 inhibitorai (transztuzumab), az IGFR inhibitorai, a citokinreceptorok inhibitorai, MET inhibitorai, PI3K inhibitorai (például LY294002), szerin/treonin kináz inhibitorok (például de nem kizárólag az Akt inhibitorai, ilyeneket ismertetnek a következõ iratok: WO 02/083064, WO 02/083139, WO 02/083140 és WO 02/083138), valamint a Raf kináz inhibitorai (például BAY–43–9006), MEK inhibitorai (például CI–1040 és PD–098059) és mTOR inhibitorai (például Wyeth CCI–779). Az ilyen ágensek közé tartoznak a kis molekulájú gátló vegyületek és antitest antagonisták. Az „apoptozist indukáló ágensek” közé tartoznak a TNF-receptorcsalád tagjainak aktivátorai (például a TRAIL receptorok). Az NSAID-kkel való kombinációk az olyan NSAID¹k alkalmazására vonatkozik, amelyek hatékony COX–2 gátló ágensek. A jelen leírás céljaira egy olyan NSAID tekinthetõ hatékonynak, ha annak a COX–2 gátlására vonatkozó IC50 értéke 1 mM vagy annál kevesebb, sejt vagy mikroszóma vizsgálatokban mérve. A találmány tárgykörébe tartoznak az olyan NSAIDkkel való kombinációk is, amelyek szelektív COX–2 inhibitorok. A jelen leírás céljaira a COX-2¹re nézve szelektív gátló NSAID-ket úgy határozzuk meg, mint amelyek a COX-2¹t a COX-1¹en keresztül legalább 100szoros specificitással gátolják, a COX–2 IC50-értékének és a COX–1 IC50-értékének arányával mérve, a sejt- vagy mikroszómavizsgálatokban. Ilyen vegyületek például – de nem kizárólag – a következõ iratokban ismertetett vegyületek: US 5 474 995, megadás dátuma: 1995. december 12., US 5 861 419 megadás dátuma: 1999. január 19., US 6 001 843, megadás dátuma: 1999. december 14., US 6 020 343, megadás dátuma: 2000. február 1., US 5 409 944, megadás dátuma: 1995. április 25., US 5 436 265, megadás dátuma: 1995. július 25., US 5 536 752, megadás dátuma: 1996. július 16., US 5 550 142, megadás dátuma:

1996. augusztus 27., US 5 604 260, megadás dátuma: 1997. február 18., US 5 698 584, megadás dátuma: 1997. december 16., US 5 710 140, megadás dátuma: 1998. január 20. számú amerikai egyesült államokbeli 5 szabadalmi irat, WO 94/15932, közzétett: 1994. július 21., US 5 344 991, megadás dátuma: 1994. június 6., US 5 134 142, megadás dátuma: 1992. július 28., US 5 380 738, megadás dátuma: 1995. január 10., US 5 393 790, megadás dátuma: 1995. február 20., 10 US 5 466 823, megadás dátuma: 1995. november 14., US 5 633 272, megadás dátuma: 1997. május 27. és US 5 932 598, megadás dátuma: 1999. augusztus 3., amelyeket hivatkozásként említetünk. A jelen kezelési eljárásokban különösen elõnyösen 15 alkalmazható COX–2 inhibitorok a következõk: 3-fenil-4-(4¹(metil-szulfonil)-fenil)-2-(5H)-furanon; és

valamint ezek gyógyszerészetileg elfogadható sói.

60

20

25 5-klór-3-(4¹metil-szulfonil)-fenil-2-(2¹metil-5-piridinil)-piridin;

30

35 valamint ezek gyógyszerészetileg elfogadható sói. A COX–2 vegyületek elõállításának általános és közelebbi szintetikus módszereit ismertetik például a 40 következõ iratok: US 5 474 995, megadás dátuma: 1995. december 12., US 5 861 419, megadás dátuma: 1999. január 19. és US 6 001 843, megadás dátuma: 1999. december 14., amelyeket itt hivatkozásként említettük. 45 A COX–2 inhibitor specifikus inhibitoraiként ismertetett vegyületek, amelyeket a jelen találmány szerint használhatunk, például – de nem kizárólag – a következõk:

20

1

HU 005 812 T2

A COX–2 specifikus inhibitoraiként ismertetett vegyületek tehát alkalmazhatók a találmány szerint, ezek szintézisének módszereit a következõ iratok ismertetik: WO 94/15932, közzététel dátuma: 1994. július 21., US 5 344 991, megadás dátuma: 1994. június 6., US 5 134 142, megadás dátuma: 1992. július 28., US 5 380 738, megadás dátuma: 1995. január 10., US 5 393 790, megadás dátuma: 1995. február 20., US 5 466 823, megadás dátuma: 1995. november 14., US 5 633 272, megadás dátuma: 1997. május 27. és US 5 932 598, megadás dátuma: 1999. augusztus 3. A COX–2 specifikus inhibitoraiként ismertetett vegyületek tehát alkalmazhatók a találmány szerint, ezek szintézisének módszereit a következõ iratok ismertetik: US 5 474 995 megadás dátuma: 1995. december 12., US 5 861 419 megadás dátuma: 1999. január 19., US 6 001 843 megadás dátuma: 1999. december 14., US 6 020 343 megadás dátuma: 2000. február 1., US 5 409 944 megadás dátuma: 1995. április 25., US 5 436 265 megadás dátuma: 1995. július 25., US 5 536 752 megadás dátuma: 1996. július 16., US 5 550 142 megadás dátuma: 1996. augusztus 27., US 5 604 260 megadás dátuma: 1997. február 18., US No. 5 698 584 megadás dátuma: 1997. december 16. és US 5 710 140 megadás dátuma: 1998. január 20. További angiogenezisinhibitorok – azonban nem kizárólag – endostatin, ukrain, ranpirnáz, IM862, 5¹metoxi-4-[2¹metil-3-(3¹metil-2-butenil)-oxiranil]-1-oxa-spiro[2,5]okt-6-il-(klór-acetil)-karbamát, acetil-dinanalin, 5¹amino-1-[[3,5-diklór-4-(4¹klór-benzoil)-fenil]-metil]1H-1,2,3-triazol-4-karboxamid, CM101, szkvalamin, kombretasztatin, RPI4610, NX31838, szulfatált mannopentaóz-foszfát, 7,7-(karbonil-bisz[imino-N-metil-4,2pirrolo-karbonil-imino-[N¹metil-4,2-pirrol]-karbonil-imino]-bisz(1,3-naftalén-diszulfonát) és 3¹[(2,4-dimetilpirrol-5¹il)-metilén]-2-indolinon (SU5416). Ahogyan a fentiekben használtuk az „integrinblokkolók” kifejezésen olyan vegyületeket értünk, amelyek az anb3 integrin fiziológiás ligandumát szelektíven antagonizálják, gátolják vagy annak kötõdésével ellentétesen hatnak, valamint olyan vegyületeket, amelyek az anb5 integrin fiziológiás ligandumát szelektíven antagonizálják, gátolják vagy azzal ellentétesen hatnak, továbbá mind az anb3 integrin, mind az anb5 integrin fiziológiás ligandumát antagonizálják, gátolják vagy annak kötõdésével ellentétesen hatnak, továbbá olyan vegyületeket, amelyek a kapilláris endotéliumsejteken expresszálódó bizonyos integrinek aktivitását antagonizálják, gátolják, vagy azzal ellentétesen hatnak. A kifejezés a következõ integrinek antagonistáira is vonatkozik: anb6, anb8, a1b1, a2b1, a5b1, a6b1 és a6b4 integrin. A kifejezés továbbá a következõ integrinek bármilyen kombinációjának antagonistáira is vonatkozik: anb3, anb5, anb6, anb8, a1b1, a2b1, a5b1, a6b1 és a6b4 integrinek kombinációja. A tirozin-kináz-inhibitorok néhány képviselõje a következõ: N¹(trifluor-metil-fenil)-5-metil-izoxazol-4karboxamid, 3¹[(2,4-dimetil-pirrol-5¹il)-metilidenil)-indolin-2¹on, 17¹(allil-amino)-17-demetoxi-geldanamicin,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 21

2

4¹(3¹klór-4-fluor-fenil-amino)-7-metoxi-6-[3¹(4¹morfolinil)-propoxil]-kinazolin, N¹(3¹etinil-fenil)-6,7-bisz(2¹metoxi-etoxi)-4-kinazolin-amin, BIBX1382, 2,3,9,10,11,12hexahidro-10-(hidroxi-metil)-10-hidroxi-9-metil-9,12e p o x i - 1 H - d i i n d o l o [ 1 , 2 , 3 ¹ f g : 3 ’ , 2 ’ , 1 ’ ¹ k l ] p i r r olo[3,4¹i][1,6]benzo-diazocin-1¹on, SH268, genistein, STI571, CEP2563, 4¹(3¹klór-fenil-amino)-5,6-dimetil7H-pirrolo[2,3¹d]pirimidin-metán-szulfonát, 4¹(3¹bróm4-hidroxi-fenil)-amino-6,7-dimetoxi-kinazolin, 4¹(4’-hidroxi-fenil)-amino-6,7-dimetoxi-kinazolin, SU6668, STI571A, N¹4-klór-fenil-4-(4¹piridil-metil)-1-ftalazinamin és EMD121974. A jelen módszerek körébe tartoznak a rákellenes vegyületektõl eltérõ más vegyületekkel való kombinációk is. Így például az itt igényelt vegyületek PPAR¹g agonistákkal (azaz PPAR-gamma) és PPAR¹d (azaz PPAR-delta) agonistákkal való kombinációja alkalmas bizonyos rosszindulatú betegségek kezelésére. A PPAR¹g és PPAR¹d a mag peroxiszóma proliferátorral aktivált g és d receptorok. A PPAR¹g endotéliumsejteken való expresszióját és az angiogenezisben való részvételét ismertetik a következõ szakirodalmi helyen: J. Cardiovasc. Pharmacol. 1998; 31:909–913; J. Biol. Chem. 1999; 274: 9116–9121; Invest. Ophthalmol Vis. Sci. 2000; 41:2309–2317. Nemrég kimutatták, hogy a PPAR¹g in vitro gátolja a VEGF¹re adott angiogén válaszreakciót; mind a troglitazon, mind a roziglitazon maleát gátolja a retinális neovaszkularizáció kifejlõdését egerekben (Arch. Ophthalmol. 2001; 119:709–717). PPAR¹g agonisták és PPAR- g/a agonisták például – de nem kizárólag – tiazolidindionok (így DRF2725, CS–011, troglitazon, roziglitazon és pioglitazon), fenofibrate, gemfibrozil, klofibrát, GW2570, SB219994, AR¹H039242, JTT–501, MCC–555, GW2331, GW409544, NN2344, KRP297, NP0110, DRF4158, NN622, GI262570, PNU182716, DRF552926, 2¹[(5,7dipropil-3-trifluor-metil-1,2-benzizoxazol-6¹il)-oxi]-2-metil-propionsav (US 09/782 856 számú szabadalmi bejelentés) és 2(R)-7-(3¹(2¹klór-4-(4¹fluor-fenoxi)-fenoxi)propoxi)-2-etil-kromán-2-karbonsav (US 60/235 708 és 60/244 697 számú szabadalmi bejelentés). A jelen találmány szerinti megoldás egy másik megvalósítási formája az itt igényelt vegyületek alkalmazása génterápiával kombinálva rák kezelésére. A rák kezelésére vonatkozó genetikai stratégiák áttekintését lásd például: Hall és mtsai (Hum. Genet. 61:785–789, 1997) és Kufe és mtsai (Cancer Medicine, 5. kiadás, 876–889. o., BC Decker, Hamilton 2000). A génterápia alkalmazható bármilyen tumorszuppresszáló gén szállítására. Ilyen gének például – azonban nem kizárólag – a p53, amely rekombináns vírussal közvetített géntranszferrel szállítható (lásd például US 6 069 134 számú iratot), egy uPA/uPAR antagonista [„Adenovirus-Mediated Delivery of a uPA/uPAR Antagonist Suppresses Angiogenesis-Dependent Tumor Growth and Dissemination in Mice,” Gene Therapy, 1998. augusztus; 5(8): 1105–13], valamint interferongamma (J. Immunol. 2000; 164: 217–222). A jelen találmány szerinti vegyületek adagolhatók továbbá inherens több hatóanyag elleni rezisztencia

1

HU 005 812 T2

(MDR), különösen transzporterproteinek nagymértékû expressziójával kapcsolatos MDR inhibitorával kombinálva. Ilyen MDR inhibitorok például a p¹glikoprotein (P¹gp) inhibitorai, így LY335979, XR9576, OC144–093, R101922, VX853 és PSC833 (valspodar). A jelen találmány szerinti vegyületek alkalmazhatók émelygés, hányás kezelésére szolgáló hányás elleni ágensekkel, beleértve az akut, késleltetett, késõ fázisú és korábbi hányást, amelyeket a jelen találmány szerinti vegyületek önmagukban vagy radioterápiával együtt történõ alkalmazása okozhat. A hányás kezelésére vagy megelõzésére a jelen találmány szerinti vegyületeket más hányásellenes ágensekkel együtt is alkalmazhatjuk, ilyenek a neurokinin¹1 receptor antagonisták, 5HT3 receptor antagonisták, így ondansetron, granisetron, tropisetro és zatisetron, GABAB receptor agonisták, így baclofen, a kortikoszteroid, így a Decadron (dexametazon), Kenalog, Aristocort, Nasalide, Preferid, Benecorten vagy mások, amelyeket a következõ iratokban ismertetnek: US 2 789 118, 2 990 401, 3 048 581, 3 126 375, 3 929 768, 3 996 359, 3 928 326 és 3 749 712, egy antidopaminerg hatóanyagok, így fenotiazinok, (például proklorperazin, flufenazin, tioridazin és mezoridazin), metoklopramid és dronabinol. A jelen találmány szerinti vegyületek adagolásából eredõ hányás kezelésére vagy megelõzésére különösen elõnyös az olyan kapcsolódó kezelés, amelyben egy neurokinin¹1 receptor antagonista, 5HT3 receptor antagonista és kortikoszteroid közül választott hányásellenes ágenst alkalmazunk. A jelen találmány szerinti vegyületekkel kombinálva alkalmazható neurokinin¹1 receptor antagonistákat ismertetnek teljesen például a következõ iratokban: US 5 162 339, 5 232 929, 5 242 930, 5 373 003, 5 387 595, 5 459 270, 5 494 926, 5 496 833, 5 637 699, 5 719 147; EP 0 360 390, 0 394 989, 0 428 434, 0 429 366, 0 430 771, 0 436 334, 0 443 132, 0 482 539, 0 498 069, 0 499 313, 0 512 901, 0 512 902, 0 514 273, 0 514 274, 0 514 275, 0 514 276, 0 515 681, 0 517 589, 0 520 555, 0 522 808, 0 528 495, 0 532 456, 0 533 280, 0 536 817, 0 545 478, 0 558 156, 0 577 394, 0 585 913, 0 590 152, 0 599 538, 0 610 793, 0 634 402, 0 686 629, 0 693 489, 0 694 535, 0 699 655, 0 699 674, 0 707 006, 0 708 101, 0 709 375, 0 709 376, 0 714 891, 0 723 959, 0 733 632 és 0 776 893, WO 90/05525, 90/05729, 91/09844, 91/18899, 92/01688, 92/06079, 92/12151, 92/15585, 92/17449, 92/20661, 92/20676, 92/21677, 92/22569, 93/00330, 93/00331, 93/01159, 93/01165, 93/01169, 93/01170, 93/06099, 93/09116, 93/10073, 93/14084, 93/14113, 93/18023, 93/19064, 93/21155, 93/21181, 93/23380, 93/24465, 94/00440, 94/01402, 94/02461, 94/02595, 94/03429, 94/03445, 94/04494, 94/04496, 94/05625, 94/07843, 94/08997, 94/10165, 94/10167, 94/10168, 94/10170, 94/11368, 94/13639, 94/13663, 94/14767, 94/15903, 94/19320, 94/19323, 94/20500, 94/26735, 94/26740, 94/29309, 95/02595, 95/04040, 95/04042, 95/06645, 95/07886, 95/07908, 95/08549, 95/11880, 95/14017, 95/15311, 95/16679, 95/17382, 95/18124, 95/18129, 95/19344, 95/20575, 95/21819, 95/22525, 95/23798, 95/26338, 95/28418,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 22

2

95/30674, 95/30687, 95/33744, 96/05181, 96/05193, 96/05203, 96/06094, 96/07649, 96/10562, 96/16939, 96/18643, 96/20197, 96/21661, 96/29304, 96/29317, 96/29326, 96/29328, 96/31214, 96/32385, 96/37489, 97/01553, 97/01554, 97/03066, 97/08144, 97/14671, 97/17362, 97/18206, 97/19084, 97/19942 és 97/21702; GB 2 266 529, 2 268 931, 2 269 170, 2 269 590, 2 271 774, 2 292 144, 2 293 168, 2 293 169 és 2 302 689 számú iratokban. Az ilyen vegyületek elõállítását teljes mértékben ismertetik az említett szabadalmi leírásokban, illetve publikált szabadalmi bejelentésekben, amelyeket hivatkozásként említettünk. Egy megvalósítási mód szerint a jelen találmány szerinti vegyületekkel alkalmazható neurokinin¹1 receptor antagonistákat a következõ vegyületek közül választjuk: 2¹(R)-(1¹(R)¹(3,5-bisz(trifluor-metil)-fenil)etoxi)-3¹(S)-(4¹fluor-fenil)-4-(3¹(5¹oxo¹1H,4H-1,2,4-triazolo)-metil)-morfolin vagy ezek gyógyszerészetileg elfogadható sói, amelyeket az US 5 719 147 számú iratban ismertetnek. A jelen találmány szerinti vegyületek adagolhatók továbbá vérszegénység kezelésére szolgáló ágensekkel is. Ilyen, vérszegénység kezelésére szolgáló ágens például a folyamatos eritropoezis receptor aktivátor (például epoetin-alfa). A jelen találmány szerinti vegyületek adagolhatók továbbá egy neutropenia kezelésére szolgáló ágenssel együtt is. Ilyen neutropenia kezelõ ágens például a hematopoietikus növekedési faktor, amely a neutrofilek, így a humán granulocita kolóniastimuláló faktor (G¹CSF) termelését és mûködését szabályozza. Egy G¹CSF például a filgrastim. A jelen találmány szerinti vegyületek adagolhatók továbbá immunerõsítõ hatóanyaggal, így levamiszollal, izoprinoszinnal és zadaxinnal együtt is. Így a találmány tárgykörébe tartoznak a találmány szerinti vegyületek alkalmazása egy második vegyülettel kombinálva, amelyet a következõk közül választunk: 1) ösztrogénreceptor-modulátor, 2) androgénreceptormodulátor, 3) retinoid receptor modulátor, 4) citotoxikus/citosztatikus ágens, 5) antiproliferatív ágens, 6) prenil-protein-transzferáz-inhibitor, 7) HMG-CoA reduktáz inhibitor, 8) HIV-proteáz-inhibitor, 9) reverz transzkriptáz inhibitor, 10) angiogenezisinhibitor, 11) PPAR¹g agonisták, 12) PPAR¹d agonisták, 13) inherens több hatóanyag elleni rezisztenciainhibitor, 14) hányásellenes ágens, 15) vérszegénység kezelésére használható alkalmazható ágens, 16) neutropenia kezelésre alkalmazható ágens, 17) immunerõsítõ hatóanyag, 18) sejtproliferáció és túlélési szignalizáció inhibitor, 19) a sejtciklus ellenõrzõ pontjaival interferáló ágens és 20) apoptózist indukáló ágens. Az „adagolás” kifejezésen és annak változatain (például egy vegyületet „adagolunk”) a találmány szerinti vegyületekkel kapcsolatosan azt értjük, hogy egy vegyületet a vegyületet vagy a vegyületnek egy elõhatóanyagát a kezelésre szoruló állat szervezetébe juttatunk. Ha egy találmány szerinti vegyületet vagy annak elõhatóanyagát egy vagy több más aktív ágenssel (pl. citotoxikus ágenssel stb.) kombinálva biztosítunk, az

1

HU 005 812 T2

„adagolás” kifejezés annak változatai magukban foglalják a vegyület vagy annak elõhatóanyaga és a többi ágens párhuzamos vagy egymás utáni bejuttatását. Ahogyan itt használjuk, a „kompozíció” kifejezésen olyan terméket kívánunk érteni, amely a megadott komponenseket a megadott mennyiségben tartalmazza, valamint bármely olyan terméket, amely a megadott komponensek megadott mennyiségének kombinációjából közvetlenül vagy közvetett módon adódik. A „terápiásan hatékony mennyiség” kifejezésen, ahogyan itt használjuk, az aktív vegyület vagy gyógyszerészeti ágens olyan mennyiségét értjük, amely egy szövetben, szervben, állatban vagy emberben olyan biológiai vagy gyógyító válaszreakciót vált ki, amelyet a kutató orvos, állatorvos vagy más klinikus keresett. A „rák kezelése” kifejezésen egy rákos állapottal sújtott emlõsnek való adagolást értünk, és olyan hatásra vonatkozik, amely enyhíti a rákos állapotot a rákos sejtek pusztításával, azonban olyan hatásra is, amely a rák növekedésének és/vagy metasztázisának gátlásából ered. Egy megvalósítási forma szerint a második vegyületként alkalmazható angiogenezist gátló inhibitort a következõk közül választjuk: tirozin-kináz-inhibitor, epidermális eredetû növekedési faktor inhibitor, fibroblaszteredetû növekedési faktor inhibitor, vérlemezkeeredetû növekedési faktor inhibitor, MMP (mátrix metalloproteáz) inhibitor, integrinblokkoló, interferon¹a, interleukin–12, pentozán-poliszulfát, ciklooxigenázinhibitor, karboxiamidotriazol, kombretasztatin A–4, szkvalamin, 6¹O-klór-acetil-karbonil-fumagillol, talidomid, angiosztatin, troponin¹1 vagy VEGF elleni antitest. Egy megvalósítási mód szerint az ösztrogénreceptor-modulátor tamoxifen vagy raloxifen. A találmány tárgykörébe tartozik továbbá a vegyületek alkalmazása rák kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására, amellyel a vegyület terápiásan hatékony mennyiségét adagoljuk, radioterápiával és/vagy egy vegyülettel kombinálva, amelyet a következõk közül választunk: 1) ösztrogénreceptor-modulátor, 2) androgénreceptor-modulátor, 3) retinoid receptor modulátor, 4) citotoxikus/citosztatikus ágens, 5) antiproliferatív ágens, 6) prenil-protein-transzferáz-inhibitor, 7) HMGCoA reduktáz inhibitor, 8) HIV-proteáz-inhibitor, 9) reverz transzkriptáz inhibitor, 10) angiogenezisinhibitor, 11) PPAR¹g agonisták, 12) PPAR¹d agonisták, 13) inherens több hatóanyag elleni rezisztenciainhibitor, 14) hányásellenes ágens, 15) vérszegénység kezelésére használható alkalmazható ágens, 16) neutropénia kezelésre alkalmazható ágens, 17) immunerõsítõ hatóanyag, 18) sejtproliferáció és túlélési szignalizáció inhibitor, 19) a sejtciklus ellenõrzõ pontjaival interferáló ágens és 20) apoptózist indukáló ágens. A találmány egy még további megvalósítási formája a vegyületek alkalmazása rák kezelésére szolgáló gyógyszer elõállítására, amellyel a vegyület terápiásan hatékony mennyiségét adagoljuk paklitaxellel és trasztuzumabbal kombinálva. A találmány tárgykörébe tartozik továbbá a vegyületek alkalmazása rák kezelésére és megelõzésére

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 23

2

szolgáló gyógyszer elõállítására, amellyel a vegyület terápiásan hatékony mennyiségét adagoljuk COX–2 inhibitorral kombinálva. A találmány továbbá olyan gyógyszerkészítményre vonatkozik, amely rák kezelésére és megelõzésére szolgál, amellyel a vegyület terápiásan hatékony mennyiségét adagoljuk egy, a következõk közül választott vegyülettel: 1) ösztrogénreceptor-modulátor, 2) androgénreceptor-modulátor, 3) retinoidreceptor-modulátor, 4) citotoxikus/citosztatikus ágens, 5) antiproliferatív ágens, 6) prenil-protein-transzferáz-inhibitor, 7) HMG-CoA reduktáz inhibitor, 8) HIV-proteáz-inhibitor, 9) reverz transzkriptáz inhibitor, 10) angiogenezisinhibitor, 11) PPAR¹g agonisták, 12) PPAR¹d agonisták, 13) sejtproliferáció és túlélési szignalizáció inhibitor, 14) a sejtciklus ellenõrzõpontjaival interferáló ágens, 15) apoptózist indukáló ágens. A találmány továbbá a jelen vegyületeknek KSPhez kötõdõ más vegyületek szkrínelésében történõ alkalmazására is vonatkozik. Ahhoz, hogy a találmány szerinti vegyületeket olyan módszerben alkalmazzuk, amelyben a KSP kinezinhez kötõdõ más vegyületeket szkrínelünk, a KSP¹t hordozóanyaghoz kötjük, és egy a találmány szerinti vegyületet (amely egy mitotikus ágens) a vizsgálóelegyhez adunk. Eljárhatunk úgy is, hogy a találmány szerinti vegyületet kötjük hordozóanyaghoz, és a KSP¹t adagoljuk. A vegyületek azon csoportjai, amelyek között új kötõágenst kereshetünk, lehetnek specifikus antitestek, nem természetes, kémiai könyvtárak szkrínelésével azonosított kötõágensek, peptidanalógok stb. Különösen fontos az olyan ágens jelöltek szkrínelése, amelyek kevéssé toxikusak a humán sejtekre. Erre a célra a vizsgálatok széles köre alkalmazható, így jelöléses in vitro protein-protein kötési vizsgálatok, elektroforetikus mobilitás eltolódási vizsgálatok, proteinkötésre vonatkozó immunvizsgálatok, funkcionális vizsgálatok (foszforilezési vizsgálatok stb.) és hasonlók. A mitotikus ágens KSP-hez való kötõdésének meghatározását különféle módokon végezhetjük. Egy elõnyös megvalósítás forma szerint a mitotikus ágenst (a találmány szerinti vegyületet) jelöléssel, például fluoreszcens vagy radioaktív csoporttal látjuk el, és a kötõdést közvetlenül határozzuk meg. Ezt végezhetjük például úgy, hogy a KSP egészét vagy egy részét szilárd hordozóhoz kötjük, hozzáadjuk a jelöléssel ellátott mitotikus ágenst (például egy olyan találmány szerinti vegyületet, amelyben legalább egy atomot detektálható izotóppal cseréltünk ki), a reagens fölöslegét kimossuk, és meghatározzuk, hogy a jelölés mennyisége megfelel¹e annak, amely a szilárd hordozón van jelen. Különbözõ, a technika állása szerint ismert blokkolási és mosási lépések alkalmazhatók. A „jelöléssel ellátott” kifejezésen itt azt értjük, hogy a vegyület közvetlenül vagy közvetetten olyan jelöléssel van ellátva, amely detektálható jelet szolgáltat, ilyenek például a radioizotópok, fluoreszcens toldalékok, enzimek, antitestek, részecskék, így mágneses részecskék, kemilumineszcens toldalékok vagy specifikus kötõmolekulák stb. A specifikus kötõmolekulák le-

1

HU 005 812 T2

hetnek párok, így biotin és sztreptavidin, digoxin és antidigoxin stb. A specifikusan kötõdõ tagokhoz a komplementer tagot normálisan olyan molekulával jelölnénk, amely az ismert módszerek szerint detektálható jelet szolgáltat, amint ezt fentebb ismertettük. A jelölés szolgáltathatja közvetlenül vagy közvetetten a detektálható jelet. Egyes megvalósítás formák szerint a komponenseknek csak az egyikét látjuk el jelöléssel. Így például a kinezin proteinek a tirozinhelyzetekben láthatók el jelöléssel, 125I vagy fluoroforok alkalmazásával. Alternatív megoldásként egynél több komponenst láthatunk el különbözõ jelölésekkel, a proteinekhez 125I¹t, míg a mitotikus ágensekhez például egy fluorofort alkalmazva. A találmány szerinti vegyületek alkalmazhatók továbbá kompetitorokként további hatóanyagjelöltek szkrínelésére. A „bioaktív ágens jelölt” vagy „hatóanyagjelölt” vagy ezek nyelvtani megfelelõi kifejezéseken – ahogyan itt használjuk – bármely, bioaktivitásra nézve tesztelendõ molekulát értünk, így például proteint, oligopeptidet, kis szerves molekulát, poliszacharidot, polinukleotidot stb. Ezek képesek lehetnek közvetlenül vagy közvetetten megváltoztatni a sejtproliferációs fenotípust vagy egy sejtproliferációs szekvencia, akár nukleinsavszekvencia, akár proteinszekvencia expresszióját. Más esetekben a sejtproliferációs protein kötõdésének és/vagy aktivitásának megváltozására nézve végezzük a szkrínelést. Az ilyenfajta szkrínelést végezhetjük mikrotubulusok jelenlétében vagy a nélkül. Abban az esetben, ha proteinkötõdésre vagy aktivitásra nézve végezzük a szkrínelsét, az elõnyös megvalósítási formák közül kizárjuk azokat a molekulákat, amelyekrõl már ismert, hogy az adott proteinhez kötõdnek, így például a polimer szerkezeteket, így a mikrotubulusokat és az energiaforrásokat, így az ATP¹t. Az itt ismertetett vizsgálatok elõnyös megvalósítási formái közé tartoznak az olyan ágensjelöltek, amelyek endogén natív állapotban nem kötõdnek a sejtproliferációs proteinhez, ezeket itt „exogén” ágenseknek nevezzük. Egy másik elõnyös megvalósítási formában az exogén ágensek közül ki vannak zárva továbbá a KSP elleni antitestek. Az ágensjelöltek számos vegyületcsoportba tartozhatnak, tipikusan azonban szerves molekulák, elõnyösen kis szerves vegyületek, amelyek molekulatömege 100 daltonnál nagyobb és körülbelül 2500 daltonnál kisebb. Az ágensjelöltek a proteinekkel való szerkezeti kölcsönhatáshoz, különösen hidrogénkötéshez és lipofil kötõdéshez szükséges funkciós csoportokat tartalmaznak, és tipikusan legalább egy amino¹, karbonil¹, hidroxil¹, éter- vagy karboxilcsoportot, elõnyösen legalább két kémiai funkciós csoportot foglalnak magukban. Az ágensjelöltek gyakran széngyûrûs vagy heterociklusos szerkezeteket és/vagy aromás vagy poliaromás szerkezeteket tartalmaznak, amelyek az említett funkciós csoportokkal vannak szubsztituálva. Ágensjelöltek találhatók a biomolekulák, így a peptidek, szacharidok, zsírsavak, szteroidok, purinok, pirimidinek, ezek származékai, szerkezeti analógjai vagy ezek kombinációi között is. Különösen elõnyösek a peptidek.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 24

2

Ágensjelöltek a források széles körébõl, így szintetikus vagy természetes vegyületek könyvtáraiból nyerhetõk. Így például számos eszköz áll rendelkezésre szerves vegyületek és biomolekulák széles körének véletlenszerû vagy irányított szintetizálására, idetartozik a randomizált oligonukleotidok expresszáltatása. Más módszerek szerint rendelkezésre állnak vagy könnyen elõállíthatók természetes vegyületek könyvtárai baktérium¹, gomba¹, növényi és állati eredetû extraktumok formájában. Ezenkívül a természetes vagy szintetikus úton készített könyvtárak és vegyületek szokásos kémiai, fizikai és biokémiai eszközökkel egyszerûen módosíthatók. Ismert farmakológiai ágensek irányított vagy véletlenszerû kémiai módosításoknak, így acilezésnek, alkilezésnek, észterezésnek, amidálásnak vethetõk alá szerkezeti analógjaik elõállításához. A kompetitív szkrínelési vizsgálatok végezhetõk oly módon, hogy egy elsõ mintában a KSP¹t és egy hatóanyagjelöltet kombinálunk. Egy második minta tartalmazza a mitotikus ágenst, KSP¹t és egy hatóanyagjelöltet. Ez végezhetõ mikrotubulusok jelenlétében vagy a nélkül. A hatóanyagjelölt kötõdését mindkét minta esetén meghatározzuk, és a két minta esetén a kötõdés változása, vagy az azok közötti különbség egy olyan ágens jelenlétére utal, amely képes kötõdni a KSP-hez és potenciálisan modulálni annak aktivitását. Azaz, ha a hatóanyagjelölt kötõdése a második mintában az elsõ mintától eltérõ, a hatóanyagjelölt képes a KSP-hez kötõdni. Egy elõnyös megvalósítási forma szerint az ágensjelölt kötõdését kompetitív kötõdési vizsgálattal határozzuk meg. Ebben a megvalósítási formában kompetitorként egy olyan kötõcsoportot így egy antitestet, peptidet, kötõpartnert, ligandumot stb. alkalmazunk, amely ismert módon kötõdik a KSP-hez. Bizonyos körülmények között az ágensjelölt és a kötõcsoport között a kompetitív kötõdés olyan lehet, hogy a kötõcsoport kiszorítja az ágensjelöltet. Egy megvalósítási forma szerint az ágensjelöltet jelöléssel látjuk el. Elõször vagy az ágensjelöltet, vagy a kompetitort, vagy mindkettõt hozzáadjuk a KSP-hez, annyi idõre, amely elegendõ ahhoz, hogy a kötõdés létrejöjjön, ha egyáltalán végbemegy. Az inkubálást végezhetjük bármely olyan hõmérsékleten, amely elõsegíti az optimális aktivitást, ez tipikusan körülbelül 4 °C és körülbelül 40 °C közötti. Az inkubálás idõtartamát az optimális aktivitáshoz választjuk meg, azonban optimalizálható a gyors, nagy áteresztõképességû szkrínelés elõsegítéséhez is. Tipikusan 0,1 és 1 óra közötti idõtartam elegendõ kell, hogy legyen. A reagens fölöslegét általában eltávolítjuk vagy kimossuk. Ezután adagoljuk a második komponenst, ezt követi a jelöléssel ellátott komponens jelenléte vagy hiánya, hogy jelezze a kötõdést. Egy elõnyös megvalósítási forma szerint elõször a kompetitort, majd az ágensjelöltet adagoljuk. A kompetitor kiszorítása azt jelzi, hogy az ágensjelölt kötõdik a KSP-hez, ezért képes kötõdni és potenciálisan modulálni a KSP aktivitását. Ebben a megvalósítási formá-

1

HU 005 812 T2

ban bármelyik komponens ellátható jelöléssel. Így például ha a kompetitort látjuk el jelöléssel, a jelölés jelenléte a mosóoldatban az ágens által kifejtett kiszorítást jelzi. Alternatív módon, ha az ágensjelöltet látjuk el jelöléssel, a kiszorítást a jelölés hordozón való jelenléte jelzi. Egy másik megvalósítási forma szerint elõször az ágensjelöltet adagoljuk, inkubálással és mosással, ezt követõen pedig a kompetitort. A kompetitor kötõdésének hiánya jelezheti, hogy az ágensjelölt nagyobb affinitással kötõdött a KSP-hez. Így ha az ágensjelöltet látjuk el jelöléssel, a jelölés jelenléte a hordozón a kompetitor kötõdésének hiányával párosulva, jelezheti, hogy az ágensjelölt képes kötõdni a KSP-hez. Hasznos lehet, ha azonosítjuk a KSP kötési helyét. Ez különféle módokon végezhetõ. Egy megvalósítási forma szerint ha azonosítottuk, hogy a KSP kötõdik a mitotikus ágenshez, a KSP¹t fragmentáljuk vagy módosítjuk, és a vizsgálatokat megismételjük a kötéshez szükséges komponensek azonosítására. A modulálást az olyan ágensjelöltekre nézve végzett szkríneléssel teszteljük, amelyek képesek modulálni a KSP aktivitását, amelynek során egy ágensjelöltet a fenti módon KSP-vel kombinálunk, és meghatározzuk a KSP biológiai aktivitásában bekövetkezett változást. Így ezen megvalósítási forma szerint az ágensjelöltnek mind kötõdnie kell a KSP-hez (bár ez nem szükségszerû), mind meg kell változtatnia annak biológiai vagy biokémiai aktivitását, amint ezt itt definiáltuk. A módszerek közé tartoznak mind in vitro szkrínelési módszerek, mind sejtek in vivo szkrínelése a sejtciklus eloszlásában, sejtek életképességében való változásokra, vagy pedig a mitotikus orsók jelenlétére, morfológiájára, aktivitására, eloszlására vagy mennyiségére nézve, amint a fentiekben általánosan vázoltuk. Eljárhatunk úgy is, hogy differenciálszkrínelést végzünk az olyan ágensjelöltek azonosítására, amelyek kötõdnek a natív KSP-hez, azonban nem tudnak kötõdni a módosított KSP-hez. A vizsgálatokban pozitív és negatív kontrollméréseket végzünk. Elõnyösen az összes kontroll- és tesztmintát legalább háromszoros ismétlésben alkalmazzuk, hogy statisztikusan szignifikáns eredményeket kapjunk. Az összes minta inkubálását annyi ideig végezzük, amely elegendõ ahhoz, hogy az ágens a proteinhez kötõdjön. Az inkubálást követõen a mintákat a nemspecifikusan kötõdött anyagoktól mentesre mossuk, és meghatározzuk a kötõdés, általában a jelöléssel ellátott ágens mennyiségét. Így például, ha radiojelzést alkalmazunk, a mintákat egy szcintillációs számlálóban számláljuk, hogy meghatározzuk a kötõdött vegyület mennyiségét. A szkrínelési vizsgálatokba számos más reagens is belevonható. Ide tartoznak reagensek, így sók, semleges proteinek, például albumin, detergensek stb., amelyek azért alkalmazhatók, hogy elõsegítsük az optimális protein-protein kötõdést, és/vagy csökkentsük a nemspecifikus háttérkölcsönhatásokat. Alkalmazhatók olyan reagensek is, amelyek más módon javítják a vizsgálat hatékonyságát, ilyenek a proteázinhibitorok,

5

2

nukleázinhibitorok, antimikrobiális ágensek stb. A komponensek keverékét bármilyen sorrendben adagolhatjuk, amely a kellõ kötõdéshez hozzájárul. A találmány ezen és más szempontjai nyilvánvalóak lesznek az itt közölt kitanításokból.

Vizsgálatok A jelen találmány szerinti, a példákban ismertetett vegyületeket az alábbiakban ismertetett vizsgálatok10 ban teszteltük, és úgy találtuk, hogy kinázgátló aktivitással rendelkeznek. Más vizsgálatok ismertek a szakirodalomból, és ezeket a szakterületen jártas szakember egyszerûen el tudja végezni. 15

20

25

30

35

I. Kinezin ATP¹áz in vitro vizsgálat Humán polihisztidinvégzõdéssel ellátott KSP motor domén [KSP(367H)] klónozása és expresszáltatása A humán KSP motordomén konstrukció expresszáltatására szolgáló plazmidokat klónoztunk PCR-technikával, templátként pBluescript teljes hosszúságú humán KSP konstrukciót alkalmazva [Blangy et al., Cell, 83:1159–1169, 1995]. A motordomén és a nyak linkerrégió amplifikálására az 5’¹GCAACGATT AATATG GCGTCGCAGCCAAATTCGTCTGCGAAG (SEQ. ID. NO.: 1) N¹terminális primert és az 5’¹GCA ACGCTCG A G T C A G T G A T G A T G G T G G T G A T G C T G A T TCACTTCAGGCTTATTCAATAT (SEQ. ID. NO.: 2) C¹terminális primert alkalmaztuk. A PCR-termékeket AseI és XhoI segítségével emésztettük, pRSETa (Invitrogen) NdeI/XhoI emésztési termékébe ligáltuk, és E. coli BL21 (DE3) sejtekbe transzformáltuk. A sejteket 37 °C¹on 0,5 OD600 értékig növesztettük. Miután a tenyészetet szobahõmérsékletre lehûtöttük, a KSP expresszióját 100 mM IPTG-vel indukáltuk, majd egy éjszakán át inkubáltuk. A sejteket centrifugálással ülepítettük, és jéghideg PBS-sel egyszer mostuk. Az üledéket gyorsan lefagyasztottuk, és –80 °C¹on tároltuk.

40

45

50

55

60 25

Protein tisztítása A sejtüledéket jégen felengedtettük, és újraszuszpendáltuk lizálópufferben [50 mM K¹HEPES, pH=8,0, 250 mM KCl, 0,1% Tween, 10 mM imidazol, 0,5 mM Mg¹ATP, 1 mM PMSF, 2 mM benzimidin, 1×komplett proteázinhibitor-koktél (Roche)]. A sejtszuszpenziót 1 mg/ml lizozimmal és 5 mM b¹merkapto-etanollal jégen 10 percig inkubáltuk, majd háromszor 30 másodpercig ultrahanggal kezeltük. Az összes ezutáni mûveletet 4 °C¹on végeztük. A lizátumokat 40 percig 40 000×g-vel centrifugáltuk. A felülúszókat hígítottuk, és A pufferben (50 mM K¹HEPES, pH=6,8, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 10 mM Mg¹ATP, 1 mM DTT) SP Sepharose oszlopra (Pharmacia, 5 ml töltet) töltöttük, és 0–750 mM KCl-gradienst tartalmazó A pufferrel eluáltuk. A KSP¹t tartalmazó frakciókat összegyûjtöttük, és egy óra hosszat Ni¹NTA gyantával (Qiagen) inkubáltuk. A gyantát B pufferrel (lizálópuffer PMSF nélkül és proteázinhibitor-koktél nélkül) háromszor mostuk, majd ezt három 15 perces inkubálás és B pufferrel

1

HU 005 812 T2

végzett mosás követte. Végül a gyantát inkubáltuk és mostuk háromszor 15 percig C pufferrel (megegyezik a B pufferrel, de pH=6,0), és oszlopra töltöttük. A KSP¹t eluálópufferrel (megegyezik a B pufferrel, de 150 mM KCl¹ot és 250 mM imidazolt tartalmaz) eluáltuk. A KSP¹t tartalmazó frakciókat összegyûjtöttük, szacharózban 10%¹ra állítottuk be, és –80 °C¹on tároltuk. Mikrotubulusokat állítunk elõ szarvasmarhaagyból izolált tubulinból. 1 mg/ml tisztított (>97%-ban MAPmentes) tubulint 37 °C¹on 10 mM paclitaxel, 1 mM DTT, 1 m MG TP jelenlétében BRB80-pufferben (80 mM K¹PIPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, pH=6,8) polimerizálunk. A kapott mikrotubulusokat a nem polimerizálódott tubulintól ultracentrifugálással és a felülúszók eltávolításával elválasztjuk. A mikrotubulusokat tartalmazó üledéket óvatosan újraszuszpendáljuk 10 mM paclitaxelt, 1 mM DTT¹t, 50 mg/ml ampicillint és 5 mg/ml kloramfenikolt tartalmazó BRB80-ban. A kinezin motordomént 23 °C¹on inkubáljuk a mikrotubulusokkal, 1 mM ATP-vel (1:1 MgCl2:NaATP) és a vegyülettel pufferben, amely 80 mM K¹HEPES¹t (pH=7,0), 1 mM EGTA¹t, 1 mM DTT¹t, 1 mM MgCl2¹ot és 50 mM KCl¹ot tartalmaz. A reakciót 80 mM HEPES¹t és 50 mM EDTA¹t tartalmazó végsõ pufferkompozícióval végzett 2–10-szeres hígítással állítjuk le. Az ATP hidrolízisébõl származó szabad foszfátot kinaldin-vörös/ammónium-molibdát vizsgálattal mérjük 150 ml kvencs C puffer adagolásával, amely 2:1 arányban tartalmaz kvencs A:kvencs B elegyet. Kvencs A 0,1 mg/ml kinaldin-vöröst és 0,14% poli(vinil-alkohol)¹t; kvencs B pedig 1,15 M kénsavban 12,3 mM ammónium-molibdát-tetrahidrátot tartalmaz. A reakcióelegyet 10 percig 23 °C¹on inkubáljuk, és a foszfor-molibdát-komplex abszorbanciáját 540 nm¹nél mérjük. A példák 3–1., 4–2., 5–3., 5–4., 7–1., 7–2., 7–3., 8–6a/8–6b., 9–1., 10–2., 11–1., 12–1. és 12–3. képletû vegyületeit teszteltük a fenti vizsgálatban, és úgy találtuk, hogy IC50£50 mM. II. Sejtproliferációs vizsgálat Sejteket szélesztünk 96 mérõhelyes szövettenyésztõ edényekben olyan sûrûséggel, amely lehetõvé teszi a logaritmikus növekedést 24, 48 és 72 óra alatt, és hagyjuk egy éjszaka alatt megtapadni. A következõ napon az összes lemezhez hozzáadjuk a vegyületeket 10 pontos egy-fél log titrálással. Minden titrálási sorozatot háromszoros ismétléssel végzünk, és a konstans 0,1% DMSO-koncentrációt a teljes vizsgálat során fenntartjuk. A kontrollokat önmagában 0,1% DMSO-val végezzük. A vegyülethígításokat szérummentes közeggel végezzük. A vizsgálatban a szérum végsõ koncentrációja 5% 200 ml térfogatú közegben. A lemez minden minta és kontroll mérõhelyéhez a hatóanyag adagolása után 24, 48 és 72 órával hozzáadunk 20 ml Alamar-kék festõreagenst, és tovább inkubáljuk 37 °C¹on. Az Alamar-kék fluoreszcenciát 6–12 óra múlva CytoFluor II lemezolvasóval elemezzük, 530–560 nm hullámhosszon végzett gerjesztéssel és 590 nm¹nél mért emisszióval.

2

A citotikus EC50-értéket egy olyan görbébõl határozzuk meg, amelyet a vegyületek koncentrációjának az x tengelyen, az egyes titrálási pontokhoz tartozó sejtnövekedés-gátlás átlagos százalékos értékének 5 pedig az y tengelyen való felvételével rajzolunk meg. A sejtnövekedést a kontroll mérõhelyeken, amelyeket csak vivõanyaggal kezeltünk, 100% növekedésként definiáljuk a vizsgálathoz, és a vegyületekkel kezelt sejtek növekedését ehhez az értékhez viszonyítjuk. 10 Egy saját, házon belüli szoftvert alkalmazunk a citotoxicitás százalékos értékeinek és az inflexiós pontoknak a kiszámításához, 4 paraméteres logisztikus görbeillesztés alkalmazásával. A citotoxicitás százalékos értékét a következõ 15 egyenlettel határozzuk meg: Citotoxicitás (%)=(fluoreszcenciakontroll)– (fluoreszcenciaminta)×100×(fluoreszcenciakontroll)–1 Az inflexiós pontot tekintjük citotoxikus EC50-értéknek. 20 III. A mitózis leállításának és az apoptózisnak a kiértékelése FACS segítségével FACS-elemzést alkalmazunk a vegyület azon képességének kiértékelésére, hogy leállítja a mitózist és 25 apoptózist indukál, a kezelt sejtpopuláció DNS-tartalmának mérésével. Egy 6 cm2¹es szövettenyésztõ edényt 1,4×106 sejt mennyiségben beoltunk sejtekkel, és egy éjszakán át hagyjuk megtapadni. Ezután a sejteket vivõanyaggal (0,1% DMSO), illetve a vegyület tit30 rálási sorozatával kezeljük 8–16 óra hosszat. A kezelés után a sejteket összegyûjtjük, az adott idõpontban végzett tripszines kezeléssel és centrifugálással. A sejtüledéket PBS-sel öblítjük, 70%¹os etanolban fixáljuk, és 4 °C¹on tároljuk egy éjszakán át vagy 35 hosszabb ideig. A FACS-elemzéshez legalább 500 000 fixált sejtet ülepítünk, és a 70%¹os etanolt leszívatással eltávolítjuk. A sejteket ezután RN¹áz A¹val (50 Kunitz egység/ml) és propidium-jodiddal (50 mg/ml) 30 percig 40 4 °C¹on inkubáljuk, és Becton Dickinson FACSCaliber alkalmazásával elemezzük. Az adatokat (10 000 sejtet) a Modifit cell cycle analysis modeling (Verity Inc.) szoftver alkalmazásával elemezzük. A mitózis leállítására nézve az EC50-értéket olyan 45 görbébõl határozzuk meg, amelyet a vegyületek koncentrációjának az x tengelyen, valamint az egyes titrálási pontokhoz tartozó, a sejtciklus G2/M fázisában levõ sejtek százalékának (amint azt propidium-jodidfluoreszcenciával mértük) az y tengelyen történõ felvé50 telével rajzolunk meg. Az adatok elemzését a SigmaPlot program alkalmazásával végezzük egy inflexiós pont számolásához, 4 paraméteres logisztikus görbeillesztés alkalmazásával. Az inflexiós pontot vesszük EC50-értéknek a mitózis leállítására nézve. Hasonló 55 módon határozzuk meg a vegyület EC50-értékét az apoptózisra nézve. Ehhez az egyes titrálási pontokhoz tartozó apoptotikus sejtek százalékát (amint azt propidium-jodid-fluoreszcenciával mértük) vesszük fel az y tengelyen, és a fent ismertetetthez hasonló elemzést 60 végzünk. 26

1

HU 005 812 T2

VI. Immunfluoreszcenciás mikroszkópia az egypólusú orsók detektálására A DNS, tubulin és pericentrin immunfluoreszcens festésének módszereit lényegében véve úgy végezzünk, amint a következõ szakirodalmi helyen ismertetik: Kapoor et al, J. Cell Biol, 150:975–988 (2000). A sejttenyészetek vizsgálatához a sejteket szövettenyészettel kezelt üvegkamrás lemezeken szélesztjük, és egy éjszakán át hagyjuk megtapadni. Ezután a sejteket a kérdéses vegyülettel 4–16 óra hosszat inkubáljuk. Miután az inkubálás befejezõdött, a közeget és a hatóanyagot leszívatjuk, és a kamrát és a tömítést eltávolítjuk az üveglemezrõl. Ezután a sejteket permeabilizáljuk, fixáljuk, mossuk és a nemspecifikus antitestkötõdésre blokkoljuk az idézett protokoll szerint. A paraffinba ágyazott tumormetszetekrõl a paraffint xilollal eltávolítjuk, és blokkolás elõtt etanolsorozattal rehidráljuk. A lemezeket primer antitestekben (egér monoklonális anti-a-tubulin antitest, DM1A klón Sigmától, 1:500 arányban hí-

2

gítva; nyúl poliklonális antipericentrin antitest Covancetõl, 1:2000 arányban hígítva) egy éjszakán át 4 °C¹on inkubáljuk. Mosás után a lemezeket 15 mg/ml¹re hígított, konjugált szekunder antitestekkel (FITC-vel konju5 gált, tubulinnal szembeni, szamárban termelt antinyúl IgG; Texas-vörössel konjugált, pericentrinnel szembeni, szamárban termelt antinyúl IgG) egy óra hosszat szobahõmérsékleten inkubáljuk. A lemezeket ezután mossuk, és Hoechst 33342 jelû festékkel megfestjük a 10 DNS láthatóvá tételére. Az immunfestett mintákról 100×olajimmerziós objektívvel felszerelt Nikon epifluoreszcens mikroszkóppal felvételt készítünk, Metamorph dekonvolúció és képalkotó szoftver segítségével. 15

Példák A következõ példákkal a találmány jobb megértését kívánjuk segíteni. Az adott alkalmazott anyagokkal, fajtákkal és körülményekkel a találmányt kívánjuk illusztrálni, nem pedig korlátozni annak ésszerû oltalmi körét.

1. reakcióvázlat

1–2 1–1

1–3 1–4

1–6

1–5

1–8 1–7

1–9

27

1

HU 005 812 T2

1. lépés: 4¹Allil-4-fenil-1,3-oxazolidin-2¹on (1–4) 15,8 g (416 mmol) LAH-por 600 ml of dietil-éterrel készült szuszpenziójához hozzáadtunk 18,3 g (90 mmol) a¹allil-a-fenil-glicin-etil-észter (1–3, amelyet a következõ irodalmi helyen ismertetett módon állítottunk elõ: Van Betsbrugge és munkatársai Tetrahedron, 1997, 53, 9233–9240) 75 ml dietil-éterrel készült elegyét, olyan sebességben, hogy enyhe visszafolyást tartsunk fenn. Miután az elegyet egy éjszakán át szobahõmérsékleten kevertük, óvatosan hígítottuk 27 ml vízzel, majd 27 ml 15%¹os nátrium-hidroxiddal, és végül 82 ml vízzel. Hozzáadtunk egy nátrium-szulfátmennyiséget, és az elegyet 1 óra hosszat kevertük. A szilárd komponenst leszûrtük, és az oldatot bepároltuk. A maradékot 300 ml diklór-metánban feloldottuk, nátrium-szulfáton szárítottuk és bepároltuk, így az amino-alkoholt kaptuk színtelen olaj formájában. Az amino-alkoholt (4,5 g, 25 mmol) feloldottuk 50 ml diklórmetánban, és lehûtöttük 0 °C¹ra. Hozzáadtunk 5,4 ml (53 mmol) trietil-amint és 4,5 g (28 mmol) 1,1’-karbonildiimidazolt, majd az elegyet szobahõmérsékletre melegítettük, és 4 óra hosszat kevertük. Ezután a reakcióelegyet egy választótölcsérbe töltöttük, 1 M sósavval, vízzel kétszer mostuk, nátrium-szulfáton szárítottuk, és bepároltuk, így az 1–4 oxazolidinont színtelen olaj formájában kaptuk. Az 1–4 képletû vegyület adatai: 1H–NMR (500 MHz, CDCl ) d 7,4–7,2 (m, 5H), 6,6 (s, 3 1H), 5,6–5,5 (m, 1H), 5,2 (m, 2H), 4,5 (d, 1H), 4,35 (d, 1H), 2,8 (m, 1H), 2,6 (m, 1H) ppm.

és hexán elegyével eluáltuk, így a metil-észtert kaptuk halvány narancsszínû gumiszerû anyag formájában. Ezt a maradékot feloldottuk 500 ml THF-ben, 0 °C¹ra lehûtöttük, és hozzáadtunk 32,6 ml (220,5 mmol) terc5 butil-bróm-acetátot, majd 10,6 g nátrium-hidridet (264,6 mmol), 60%¹os szuszpenzió. Miután az elegyet hagytuk szobahõmérsékletre melegedni, és egy éjszakán át kevertük, telített ammónium-klorid-oldattal hígítottuk, és etil-acetáttal kétszer extraháltuk. Az egyesí10 tett szerves fázisokat ezután sóoldattal mostuk, nátrium-szulfáton szárítottuk, bepároltuk, és a maradékot szilikagélen kromatográfiásan tisztítottuk, eluálószerként etil-acetát és hexán elegyét alkalmaztuk, így az 1–5 képletû vegyületet kaptuk sûrû halványsárga gumi15 szerû anyag formájában. Az 1–5 képletû vegyület adatai: 1H–NMR (500 MHz, CDCl3) d 7,4–7,3 (m, 5H), 4,65 (d, 1H), 4,55 (d, 1H), 3,9 (d, 1H), 3,65 (s, 3H), 3,5 (d, 1H), 3,35 (d, 1H), 3,2 (d, 1H), 1,4 (s, 9H) ppm. HRMS (ES) M+Na a C18H23NO6 összegképlet alapján számí20 tott: 372,1423. Talált: 372,1412.

25

30 2. lépés: Diészter (1–5) 68 g (334,6 mmol) 1–4 képletû vegyület 500 ml diklór-metánnal készült oldatát lehûtöttük –78 °C¹ra, és az oldaton ózont buborékoltattunk át, míg a halványkék szín meg nem maradt. Ezután oxigént buborékoltattunk át az oldaton 15 percig, majd nitrogént 30 percig. Ekkor hozzáadtunk 491 ml (6,7 mol) dimetil-szulfidot, és az oldatot egy éjszakán át kevertük, miközben lassan hagytuk szobahõmérsékletre melegedni. Az illékony komponenseket filmbepárlóban eltávolítottuk, így barna olajat kaptunk. Ezt az anyagot 1 l terc-butanolban szuszpendáltuk, és hozzáadtunk 200 ml (1,9 mol) 2¹metil-2-butént. Ehhez az oldathoz azután cseppenként hozzáadtuk 160 g (1,33 mol) NaH2PO4 és 70 g (774 mmol) NaClO2 800 ml vízzel készült elegyét. Miután az adagolást befejeztük, az elegyet további 4 óra hosszat kevertük. Miután a fázisokat elválasztottuk, a szerves fázist filmbepárlóban bepároltuk, a maradékot etil-acetátban oldottuk, és egy választótölcsérbe töltöttük a reakcióból származó vizes fázissal együtt. Miután elválasztottuk, a vizes fázist háromszor extraháltuk etil-acetáttal, metil-szulfáton szárítást végeztünk, majd bepároltuk, így 90 g sárga gumiszerû terméket kaptunk. Ezt a maradékot 500 ml metanolban szuszpendáltuk, és sósavgázt buborékoltattunk át az oldaton, amíg az majdnem forrásba nem jött. Ezután a lombikot lezártuk, és egy éjszakán át kevertük, miközben szobahõmérsékletre hûlt. Az illékony komponenseket filmbepárlóban eltávolítottuk, a maradékot szilikagél oszlopra töltöttük diklór-metánban, és etil-acetát

2

35

40

3. lépés: 7a¹Fenil-dihidro-1Hpirrolo[1,2¹c][1,3]oxazol-3,6(5H)-dion (1–6) 18,6 g (53 mmol) 1–5 képletû vegyület 150 ml THFfel készült oldatához –78 °C¹on cseppenként hozzáadtuk 58,6 ml (58,6 mmol) 1M THF¹es LiHMDS-oldatot. Miután az elegyet ezen a hõmérsékleten 1 óra hosszat kevertük, a hûtõfürdõt eltávolítottuk, és a reakcióelegyet hagytuk szobahõmérsékletre melegedni, és egy éjszakán át kevertük. Ezután az elegyet telített ammónium-klorid-oldattal hígítottuk, etil-acetáttal kétszer extraháltuk, konyhasóoldattal kétszer mostuk, nátriumszulfáton szárítottuk és bepároltuk. A maradékot feloldottuk 60 ml hangyasavban, és 24 óra hosszat 100 °C¹on hevítettük. Az illékony komponenseket vákuumban eltávolítottak, és a maradékot diklór-metán, hexánok és dietil-éter elegyével trituráltuk, így az 1–6 képletû vegyületet kaptuk bézs színû szilárd anyag formájában. Az 1–6 képletû vegyület adatai: 1H–NMR (500 MHz, CDCl3) d 7,5–7,3 (m, 5H), 4,7 (d, 1H), 4,3 (d, 1H), 4,2 (d, 1H), 3,5 (d, 1H), 3,1 (d, 1H), 2,95 (d, 1H), 2,9 (d, 1H) ppm.

4. lépés: 6¹(2,5-Difluor-fenil)-7a-fenil-5,7a-dihidro1H-pirrolo[1,2¹c][1,3]oxazol-3¹on (1–7) 2,2 g (10 mmol) 1–7 képletû vegyület 150 ml THFfel készült szuszpenziójához –78 °C cseppenként hozzáadtuk 12,2 ml (12,2 mmol) 1 M THF¹es NaHMDS-oldatot. Miután az elegyet 30 percig kevertük, az oldatot 50 hagytuk 0 °C¹ra melegedni, és ezen a hõmérsékleten tartottuk 1 óra hosszat. Ezután az oldatot visszahûtöttük –78 °C¹ra, és hozzáadtuk 4,35 g (12,2 mmol) N¹fenilbisz(trifluor-metánszulfonimid) 10 ml THF-fel készült oldatát. Ezután a hûtõfürdõt eltávolítottak, és az elegyet 55 hagytuk szobahõmérsékletre melegedni, és egy éjszakán át kevertük. Ezután az elegyet telített ammóniumklorid-oldattal hígítottak, etil-acetáttal kétszer extraháltak, sóoldattal kétszer mostak, nátrium-szulfáton szárítottak és bepároltak. A maradékot feloldottak 75 ml 60 DME és 18 ml víz elegyében. A kapott elegyhez hozzá45

28

1

HU 005 812 T2

adtunk 1,29 g (30 mmol) lítium-kloridot, 3,2 g (30 mmol) nátrium-karbonátot és 4,8 g (30 mmol) 2,5-difluor-fenilbórsavat. Az oldatot nitrogén segítségével 1 percig gázmentesítettük, majd hozzáadtunk 630 mg (0,5 mmol) tetrakisz(trifenil-foszfin)-palládium(0)¹t. A reakcióelegyet 90 °C¹on 3 óra hosszat hevítettük, szobahõmérsékletre lehûtöttük, telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal hígítottak, és etil-acetáttal kétszer extraháltak. Az egyesített szerves fázisokat konyhasóoldattal mostak, nátrium-szulfáton szárítottak, bepároltak, és a maradékot szilikagélen kromatográfiásan tisztítottuk, elálószerként diklór-metán és hexánok elegyét alkalmaztak, így az 1–7 képletû vegyületet kaptak fehér szilárd anyag formájában. Az 1–7 képletû vegyület adatai: 1H–NMR (500 MHz, CDCl3) d 7,5–7,3 (m, 5H), 7,1–6,9 (m, 3H), 6,8 (s, 1H), 4,9 (d, 1H), 4,75 (d, 1H), 4,5 (d, 1H), 4,25 (d, 1H) ppm. HRMS (ES) M+H a C18H13F2NO2 összegképletre számítva: 314,0987. Talált: 314,0993. 5. lépés: 2¹({[terc-Butil-(dimetil)-szilil]-oxi}-metil)4¹(2,5-difluor-fenil)-2-fenil-2,5-dihidro-1H-pirrol (1–8) 1,75 g (5,6 mmol) 1–7 képletû vegyület 15 ml etanollal és 10 ml 3 M nátrium-hidroxiddal készült szuszpenzióját 60 °C¹on 3 óra hosszat melegítettük, majd szobahõmérsékletre lehûtöttük, és etil-acetáttal és sóoldattal együtt elválasztótölcsérbe töltöttük. A fázisokat elválasztottuk, a vizes fázist etil-acetáttal kétszer extraháltak, az egyesített szerves fázisokat kétszer mostak, nátrium-szulfáttal szárítottak és bepároltuk, így fehér szilárd anyagot kaptunk. Ebbe a lombikba bemértünk 30 ml diklór-metánt, 1,5 g (22,3 mmol) imidazolt és 1,76 g (11,7 mmol) TBSCl¹t, és a kapott szuszpenziót egy éjszakán át kevertük. Ezután a reakcióelegyet diklór-metánnal hígítottuk, vízzel kétszer mostuk, nátrium-szulfáton szárítottak, bepároltak, és a maradékot

5

2

szilikagélen kromatográfiásan tisztítottak, eluálószerként etil-acetát és hexánok elegyét alkalmaztuk, így az 1–8 képletû vegyületet kaptuk fehér szilárd anyag formájában. Az 1–8 képletû vegyület adatai: 1H–NMR (500 MHz, CDCl3) d 7,6–7,3 (m, 5H), 7,1–6,9 (m, 3H), 6,75 (s, 1H), 4,25 (d, 1H), 4,1 (d, 1H), 3,95 (d, 1H), 3,75 (d, 1H), 0,9 (s, 9H), 0,1 (s, 3H), 0,05 (s, 3H) ppm.

6. lépés: 1–8 képletû intermedier enantiomer rezolválása Az enantiomerek rezolválását kromatográfiásan végeztük, Chiralpak AD© 10×50 cm¹es oszlopon 1%¹os hexános izopropanollal (0,1% dietil-aminnal), 150 ml/perc sebességgel. Az eluens 4×–250 mm Chi15 ralpak AD® oszlopon 1%¹os hexános izopropanollal (0,1% dietil-aminnal) 1 ml/perc sebességgel végzett analitikai HPLC elemzése azt mutatta, hogy az elõször eluálódó aktív enantiomer esetén Rt=5,5 perc, míg a második enantiomer esetén Rt=6,9 perc. 20 7. lépés: (2S)-2-({[terc-Butil-(dimetil)-szilil]-oxi}metil)-4¹(2,5-difluor-fenil)-2-fenil¹2.5-dihidro-1Hpirrol-1-karbonil-klorid (1–9) 1,95 g (6,6 mmol) of trifoszgén 25 ml THF-fel készült 25 oldatához 0 °C¹on hozzáadtuk 1,31 g (3,3 mmol) az 1–8 képletû vegyület elõször eluálódó enantiomerjét és 915 ml (6,6 mmol) trietil-amin 10 ml THF-fel készült oldatát. A jeges fürdõt eltávolítottuk, és a reakcióelegyet hagytuk szobahõmérsékletre melegedni, és 3 óra 30 hosszat kevertük. Ezután a reakcióelegyet víz és etilacetát között megosztottuk, a szerves oldatot nátriumszulfáton szárítottuk és bepároltuk, így az 1–9 képletû vegyületet kaptuk barna olaj formájában. Az 1–9 képletû vegyület adatai: HRMS (ES) M+H a C24H28ClF2NO2Si 35 összegképlet alapján számított: 464,1619. Talált: 464,1625. 10

1A. reakcióvázlat

1–5

1–4 1–5 képletû vegyület szintézise más módszerrel 14,8 g (73 mmol) 1–4 képletû vegyület 110 ml diklórmetánnal, 110 ml metil-cianiddal és 320 ml vízzel készült kétfázisú elegyéhez hozzáadtunk kb. 200 mg ruténium(III)-klorid-hidrátot. Ezután erõteljes keverés közben 1 óra alatt részletekben hozzáadtunk (85,6 g, 400 mmol) nátrium-perjodátot. Miután az adagolást befejeztük, a reakcióelegyet további 4 óra hosszat szobahõmérsékleten kevertük. Ezután az elegyet 500 ml vízzel és 1,5 l etil-acetáttal hígítottuk, a szilárd komponenst leszûrtük. A szûrletet választótölcsérbe helyeztük, a fázisokat elválasztottuk, a vizes fázist etil-acetáttal kétszer extraháltuk, az egyesített szerves fázisokat konyhasóol-

dattal kétszer mostuk, és nátrium-szulfáton szárítottuk. Bepárlás után a kapott barna szilárd anyagot feloldottuk 50 250 ml metanolban, és az oldaton lassan sósavgázt vezettünk át olyan sebességgel, hogy az oldat hõmérséklete ne emelkedjen 35 °C fölé. 5 perc múlva a reakcióelegyet lezártuk, és egy éjszakán át szobahõmérsékleten kevertük. Ezután az illékony komponenseket filmbe55 párlóban eltávolítottuk, a maradékot szilikagélen kromatográfiásan tisztítottuk, eluálószerként etil-acetát és hexánok elegyét alkalmaztuk, így 13,6 g (58 mmol) metilésztert kaptunk viszkózus olaj formájában. Ezt a maradékot ezután 200 ml THF-ben feloldottuk, 0 °C¹ra lehû60 töttük és hozzáadtunk 10,3 ml (70 mmol) terc-butil29

1

HU 005 812 T2

bróm-acetátot, majd 2,8 g nátrium-hidridet (70 mmol, 60%¹os szuszpenzió). Miután az elegyet hagytuk szobahõmérsékletre melegedni és egy éjszakán át kevertük, telített ammónium-klorid-oldattal hígítottuk, és etil-acetáttal kétszer extraháltuk. Az egyesített szerves fáziso-

5

2

kat konyhasóoldattal mostuk, nátrium-szulfáttal szárítottuk, bepároltuk, és a maradékot szilikagélen kromatográfiásan tisztítottuk, eluálószerként etil-acetát és hexánok elegyét alkalmaztuk, így az 1–5 képletû vegyületet színtelen olaj formájában kaptuk.

1B. reakcióvázlat

1B–2

1B–1

1–6

1B–3 1. lépés: Metil-4-metilén-2-fenil-prolinát (1B–2) Fenil-glicin-metil-észter-hidroklorid (100 g) vizes oldatát (300 ml) 10 N nátrium-hidroxiddal pH=8 értékig semlegesítettük. A vizes oldatot etil-acetáttal (3×200 ml) extraháltuk. Az egyesített szerves extraktumokat magnézium-szulfáton szárítottuk, szûrtük és bepároltuk. A maradékot (56,7 g, 344 mmol) feloldottuk trimetil-orto-formátban (100 ml), és benzaldehiddel (34,9 ml, 36,4 g, 344 mmol) kezeltük. Miután 2 óra hosszat kevertük, a reakcióelegyet dietil-éterrel (200 ml) hígítottuk, és vízzel (3×50 ml) mostuk. A szerves oldatot magnézium-szulfáton szárítottuk, szûrtük és bepároltuk. Az iminmaradék egy részét (26,8 g, 100 mmol) feloldottuk diklór-metánban (240 ml), és 160 ml 10 N nátrium-hidroxiddal, majd metil-allildikloriddal (50,0 g, 400 mmol) és tetrabutil-ammóniumszulfáttal (3,59 g) kezeltük. Miután 10 óra hosszat szobahõmérsékleten kevertük, a reakcióelegyet diklór-metánnal hígítottuk, és a szerves oldatot elválasztottuk, magnézium-szulfáton szárítottuk, szûrtük és bepároltuk. A maradékot feloldottuk dietil-éter és 1 N sósav (200 ml/200 ml) elegyében, és 2 óra hosszat kevertük. A vizes fázist elválasztottuk, és 10 N nátrium-hidroxiddal pH=8 értékre semlegesítettük. A vizes elegyet etilacetáttal (3×200 ml) extraháltuk. Az egyesített szerves oldatokat magnézium-szulfáton szárítottuk, szûrtük és bepároltuk. A maradékot feloldottuk vízben, és pH=8 értékre semlegesítettük. Ezt az elegyet etil-acetáttal háromszor extraháltuk, magnézium-szulfáton szárítottuk, szûrtük és bepároltuk, így a nyers 1B–2 képletû vegyületet kaptuk. Ezt a maradékot gyorskromatográfiával (szilícium-dioxid; 30%¹os etil-acetát/hexánok) tisztítottuk, így a tiszta 1B–2 képletû vegyületet kaptuk.

Az 1B–2 képletû vegyület adatai: 1 H–NMR (500 MHz, CDCl3) d 7,51 (m, 2H), 7,42 (m, 3H), 5,03 (s, 1H), 4,95 (s, 1H), 3,71 (m, 5H), 3,41 (m, 1H), 2,80 30 (m, 1H) ppm.

35

40

45

50

55

60 30

2. lépés: 7a¹Fenil-dihidro-1Hpirrolo[1,2¹c][1,3]oxazol-3,6(5H)-dion (1–6) Lítium-alumínium-hidrid (7,14 g, 188 mmol) THF-fel (500 ml) készült szuszpenzióját lehûtöttük 0 °C¹ra, és az 1B–2 képletû észter (10,2 g, 47 mmol) THF-fel (50 ml) készült oldatával kezeltük 20 percig. Miután az elegyet 0 °C¹on 30 percig kevertük, az elegyet óvatosan hígítottuk vízzel (7,1 ml), 15%¹os vizes nátrium-hidroxiddal (7,1 ml), és vízzel (21,3 ml). Az elegyhez szilárd nátrium-szulfátot adtunk, és 40 percig kevertük. Ezután az elegyet leszûrtük és bepároltuk. A maradékot (8,2 g, 43,3 mmol) feloldottuk diklór-metánban (300 ml), és trietil-aminnal (9,0 ml, 6,5 g, 65,0 mmol), és karbonil-diimidazollal (9,14 g, 56,4 mmol) kezeltük. Miután szobahõmérsékleten 48 óra hosszat kevertük, a reakcióelegyet diklór-metánnal hígítottuk 1 N sósavval és konyhasóoldattal mostuk. A szerves oldatot bepároltuk és nem tisztítottuk tovább. Az 1B–3 képletû maradék (9,2 g, 42,8 mmol) diklór-metánnal (200 ml) készült oldatát lehûtöttük –78 °C¹ra, és az oldaton ózont vezettünk át, míg a kék szín állandó nem maradt. Ezután az oldatot kihajtottuk, és dimetil-szulfiddal (35 ml) kezeltük. Miután egy éjszaka alatt fokozatosan szobahõmérsékletre melegítettük, az oldatot bepároltuk, így sárga szilárd anyagot kaptunk. Ezt a szilárd anyagot dietil-éterrel trituráltuk, így a tiszta 1–6 képletû vegyületet kaptuk. Az 1–6 képletû vegyület adatai: 1H–NMR (500 MHz, CDCl3) d 7,5–7,3 (m, 5H), 4,7 (d, 1H), 4,3 (d, 1H), 4,2 (d, 1H), 3,5 (d, 1H), 3,1 (d, 1H), 2,95 (d, 1H), 2,9 (d, 1H) ppm.

1

HU 005 812 T2

2

1C. reakcióvázlat

1C–1

1C–2

1C–3

1C–4

1C–5

1C–6

1C–7

1. lépés: (2R)-[(Etoxi-karbonil)-amino]-(fenil)ecetsav (1C–2) (R)¹(–)-2-Fenil-glicin (1C–1, 4 kg) THF-fel és 5 N nátrium-hidroxiddal (10,6 1) készült 0 °C¹os elegyéhez 1 óra alatt etil-klór-formátot adtunk olyan sebességgel, hogy a belsõ hõmérséklet 10 °C alatt maradjon. Az adagolás befejezése után a reakcióelegyet 15 percig 0 és 10 °C között tartottuk, majd ellenõriztük a reakció végbemenetelét. Ezután az elegyet 37 °C¹os sósavval (2,3 l) pH=1 értékre hígítottuk olyan sebességgel, hogy a belsõ hõmérséklet 25 °C alatt maradjon. Ezután toluolt (20 l) adtunk az elegyhez, majd keverés ülepítés után a vizes fázist elválasztottuk. A szerves fázist a termékre nézve ellenõriztük, és az oldószert toluolra váltottuk. Az 1C–2 képletû vegyület szuszpenzióját közvetlenül felhasználtuk a következõ reakcióban. (2R)-[(Etoxi-karbonil)-amino]-(fenil)-ecetsav: op.: 154–156 °C; 1H–NMR (CDCl3, 400 MHz) a rotamerek 1,1:1 arányú keverékére utalt: d=12,12 (bs, 2H), 7,99 (d, J=5,3 Hz, 1H), 7,45–7,32 (m, 10 H), 5,78 (d, J=6,2 Hz, 1H), 5,41 (d, J=7,1 Hz, 1H), 5,25 (d, J=5,7 Hz, 1H), 4,12 (m, 2H), 4,05 (m, 2H), 1,24 (t, J=6,9 Hz, 3H), 1,06 (t, J=7,0 Hz, 3H); 13C–NMR (CDCl3, 100 MHz): d=175,1, 173,6, 157,3, 155,8, 137,4, 136,1, 129,0, 128,7, 128,6, 128,2, 127,2, 127,1, 62,1, 61,5, 58,3, 57,7, 14,4, 14,1; MS m/z 224 ([M+H]+, elemanalízis a C11H14NO4 összegképlet alapján számított: 224,09).

1C–8

35

40

45

50

55

60

31

1C–9

2. lépés: Etil-(2S,4R)-5-oxo-2,4-difenil-1,3oxazolidin-3-karboxilát (1C–3) Az 1C–2 képletû vegyület és PhSO3H (42,7 gm) toluollal készült 85 °C¹os oldatához csökkentett nyomáson (350 torr=46,6 kPa) 1¹2 óra alatt hozzáadtuk benzaldehid-dimetil-acetál (3 l) toluollal (5 ml/g) készült oldatát. A toluolt és metanolt a reakció során ledesztilláltuk. A reakció befejezése után az oldatot szobahõmérsékletre hûtöttük, és THF-fel (36 l) hígítottuk, míg homogén nem lett. A szerves oldatot 10%¹os nátriumhidrogén-szulfáttal (7,5 l), majd telített nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal (9 l) mostuk. Ezután az oldószert toluolra váltottuk, és toluollal 7,5 ml/g teljes térfogatra hígítottuk (a mért kihozatalra vonatkoztatva) a befejezésig. A szuszpenziót 75 °C¹ra melegítettük, és addig reagáltattuk, míg homogén nem lett. Lassú hûtés hatására kikristályosodott az 1C–3 képletû vegyület. Amikor a szuszpenzió hõmérséklete 40 °C¹ot ért el, heptánt (2,5 ml/g) adagoltunk. A szuszpenziót szobahõmérsékletre hûtöttük, és szûréssel elválasztottuk a szilárd komponenst. A szilárd anyagot toluol és heptán 1:1 arányú elegyével (5 ml/g) mostuk, majd tömegállandóságig szárítottuk nitrogénáramban. Etil-(2S,4R)-5-oxo-2,4-difenil-1,3-oxazolidin-3-karboxilát: op.:197–199 °C; 1H–NMR (CDCl , 400 Hz) d=7,46–7,37 (m, 10H), 6,77 3 (bs, 1H), 5,45 (bs, 1H), 3,96 (m, 2H), 3,86 (m, 2H), 0,84 (t, J=7,1 Hz, 3H); 13 C–NMR (CDCl 3 , 100 MHz): d=130,2, 129,1, 129,0, 218,8, 126,7, 90,3, 61,9, 60,3,

1

HU 005 812 T2

13,8; MS m/z 312 ([M+H]+, a C18H18NO4 összegképlet alapján számított: 312,12). 3. lépés: Etil-(2S,4S)-4-allil-5-oxo-2,4-difenil-1,3oxazolidin-3-karboxilát (1C–4) 1C–3 képletû vegyület és allil-bromid (1,67 l) THFfel (40 l) készült –10 °C¹os oldatához hozzáadtuk nátrium-bisz(trimetil-szilil)-amid 2 M THF¹es oldatát (7 l) 1 óra alatt, miközben a hõmérsékletet 5 °C alatt tartottuk. 5 perc múlva ellenõriztük a reakció végbemenetelét. Ezután a reakcióelegyet 1 N sósavval (22,5 l) leállítottuk, és heptánnal (20 l) hígítottuk. A vizes fázist elválasztottuk, és a szerves fázist telített konyhasóoldattal (12 l) mostuk. Az oldószert metanolra váltottuk, és a vizet azeotróposan eltávolítottuk, míg KF<900 ppm értéket el nem értük. Az 1C–4 képletû vegyület oldatát közvetlenül használtuk a következõ reakcióban. Etil(2S,4S)-4-allil-5-oxo-2,4-difenil-1,3-oxazolidin-3-karboxilát: 1H–NMR (CDCl3, 400 Hz) d=7,60–7,52 (m, 2H), 7,39–7,33 (m, 8H), 6,55 (m, 1H), 5,84 (m, 1H), 5,38 (m, 2H), 4,16 (m, 2H), 3,72–3,12 (m, 2H), 1,17 (t, J=7,0 Hz, 3H); 13C–NMR (CDCl3, 100 MHz): d=172,5, 164,0, 137,5, 131,0, 130,5, 129,7, 128,3, 128,1, 127,4, 126,2, 122,0, 89,5, 62,0, 42,2, 40,4, 14,2; MS m/z 352 ([M+H]+, a C21H22NO4 összegképlet alapján számított: 352,15). 4. lépés: Metil-(2S)-2-[(etoxi-karbonil)-amino]-2fenil-pent-4-enoát (1C–5) Az 1C–4 képletû vegyület metanollal (20 l) készült 23 °C¹os oldatához negyed óra alatt hozzáadtunk 30%¹os metanolos nátrium-metilátot (535 ml) adagoltuk, miközben a hõmérsékletet 30 °C alatt tartottuk. 4 óra múlva ellenõriztük a reakció végbemenetelét. A reakcióelegyet 5%¹os nátrium-szulfit-oldatra (40 l) öntöttük, és az izopropil-acetáttal (20 l) hígítottuk. A vizes fázist elválasztottuk, és a szerves fázist 10%¹os KH2PO4-oldattal (12 l) mostuk. Az oldószert metilcianidra váltottuk, és a következõ reakcióban közvetlenül felhasználtuk. Metil-(2S)-2-[(etoxi-karbonil)-amino]2-fenil-pent-4-enoát: 1 H–NMR (CDCl 3 , 400 Hz) d=7,46–7,43 (m, 2H), 7,39–7,27 (m, 3H), 6,23 (bs, 1H), 5,76–5,66 (m, 1H), 5,20–5,14 (m, 2H), 4,10–4,00 (m, 2H), 3,68 (s, 3H), 3,53 (bs, 1H), 3,20 (dd, J=13,7, 7,6 Hz, 1H) 1,27–1,15 (m, 3H); 13C–NMR (CDCl3, 100 MHz): d=172,6, 154,3, 139,8, 132,3, 128,4, 127,8, 125,9, 119,4, 65,0, 60,6, 53,1, 37,8, 14,4; MS m/z 300 ([M+Na]+, elemanalízis a C15H19NNaO4 összegképlet alapján számított: 300,12).

zist 6 N sósavval (35 l) extraháltuk. A szerves fázist eldobtuk. A vizes fázist lehûtöttük –10 °C¹ra, és izopropil-acetátot (35 l) adtunk hozzá, majd 22 1 10 N nátrium-hidroxiddal lassan semlegesítettük. A vizes fázist 5 elválasztottuk, és eldobtuk, és az 1C–6 képletû vegyület oldatát tároltuk. Metil-4-[(etoxi-karbonil)-oxi]-2-fenilD-prolinát: 1H–NMR (CDCl3, 400 Hz) a diasztereomerek 2:1 arányú keverékét mutatta: d=7,55–7,47 (m, 5H), 7,34–7,22 (m, 5H), 5,18–5,11 (m, 2H), 4,22–4,11 10 (m, 4H), 3,68 (s, 6H), 3,33–3,24 (m, 4H), 3,10 (d, J=14,1 Hz, 2H), 3,05 (b, 2H), 2,34 (dd J=14,3, 5,5 Hz, 1H), 2,22 (dd J=14,3, 4,1 Hz, 1H), 1,31–1,23 (m, 6H); 13C–NMR (CDCl , 100 MHz): d=175,2, 175,1, 154,7, 3 154,4, 142,0, 141,5, 128,3, 128,2, 127,5, 127,4, 126,0, 15 125,7, 78,5, 77,6, 71,7, 71,0, 63,8, 52,9, 52,8, 52,7, 52,0, 51,8, 43,2, 42,9, 14,1, 14,0; MS m/z 294 ([M+H]+, C15H20NO5 összegképlet alapján számított: 294,13). 6. lépés: (5S)-5-(Hidroxi-metil)-5-fenil-pirrolidin-3¹ol (1C–7) Az 1C–6 képletû karbonát (5,0 g, 17,0 mmol) THFfel (50 ml) készült oldatához –50 °C¹on Red¹A1 3,5 M toluolos oldatát (17,0 ml, 59,7 mmol, 3,5 mólekv.) ada25 goltuk. A reakcióelegyet szobahõmérsékletre melegítettük, és 2 óra hosszat állni hagytuk. Ezután 0 °C¹on hozzáadtunk 2,0 M Rochelle-sóoldatot (45 ml, kb. 1,5 mólekv. a Red-A1¹re vonatkoztatva), és 5 óra hosszat szobahõmérsékleten élénken kevertük. Miután 30 a vizes fázist elválasztottuk, a kevert szerves oldatot csökkentett nyomáson (kb. 20 torr=2,6 kPa, 60 °C) végzett azeotrop desztillációval n¹butil-acetátra váltottuk. Miután 200 ml n¹butil-acetátot adagoltunk, a THF, toluol és metoxi-etanol mennyiségét GC útján 0,1%-nál 35 kevesebbnek, és KF útján 0,11%-nak észleltük. MS m/z 194 ([M+H]+, C11H15NO2 összegképlet alapján számított: 193,11). 20

40

45

50 5. lépés: Metil-4-[(etoxi-karbonil)-oxi]-2-fenil-Dprolinát (1C–6) Az 1C–5 képletû vegyület metil-cianiddal (42 l) készült 23 °C¹os oldatához hozzáadunk vizet (12 l), majd jódot (8 kg) adtunk. 6 óra múlva a reakció ellenõrzése azt mutatta, hogy a reakció végbement. Ezután a reakciót 10%¹os nátrium-szulfittal (35 l) leállítottuk, az elegyet 50 tömeg%¹os nátrium-hidroxiddal (4 l) meglúgosítottuk, és izopropil-acetáttal (35 l) extraháltuk. A vizes fázist elválasztottuk, és kidobtuk, a szerves fá-

2

55

60 32

7. lépés: (7aS)-6-Hidroxi-7a-feniltetrahidro-1H-pirrolo[1,2¹c][1,2]oxazol3¹on (1C–8) A 6. lépés szerinti n¹butil-acetátos oldathoz részletekben hozzáadtunk CDI¹t (3,46 g, 21,3 mmol, 1,25 mólekv.), és szobahõmérsékleten 1 óra hosszat reagáltattuk. A reakcióelegyhez hozzáadtunk 30 ml 2 N sósavoldatot, és 1 óra hosszat reagáltattuk. A vizes fázist elválasztottuk, 30 ml n¹butil-acetáttal extraháltuk, miután 6,0 g nátrium-kloridot adtunk hozzá. Az egyesített szerves fázisokhoz 150 mg aktív szenet (Darco KB) adtunk, és az elegyet egy éjszakán át reagáltattuk. Ezután a szenet Solka-Floc rétegen át leszûrtük. Adatok: 1H–NMR (400 MHz, CDCl3) d 7,47–7,28 (m, 7H), 4,65 (d, J=8,3 Hz, 1H), 4,64–4,59 (m, 0,4H), 4,57–4,51 (m, 1H), 4,51 (d, J=8,8 Hz, 0,4H), 4,33 (d, J=8,3 Hz, 1H), 4,28 (dd, J=13,1, 6,7 Hz, 0,4H), 4,15 (d, J=8,8 Hz, 0,4H), 3,92 (d, J=12,7 Hz, 1H), 3,28 (dd, J=12,7, 3,9 Hz, 1H), 3,18 (dd, J=13,1, 2,7 Hz, 0,4H), 2,63 (d, J=13,6 Hz, 0,4H), 2,50 (dd, J=13,7, 5,1 Hz, 1H), 2,40 (széles d, J=13,7 Hz, 1H), 2,25 (dd, J=13,6, 6,8 Hz, 0,4H).

1

HU 005 812 T2

8. lépés: (7aS)-7a-Fenil-dihidro-1Hpirrolo[1,2¹c][1,3]oxazol-3,6(5H)-dion (1C–9) Az 1C–8 (nyers, a fenti oldat egy része, 1,40 g, 6,38 mmol) n¹butil-acetáttal készült oldatát csökkentett nyomáson bepároltuk, és a nyers kristályokhoz hozzáadtunk 14 ml metil-cianidot. Az oldószerarány a GC szerint n¹butil-acetát:metil-cianid=8:92 volt. Ehhez az oldathoz szobahõmérsékleten 30 perc alatt cseppenként hozzáadtunk ecetsavat (1,10 ml, 19,2 mmol, 3,0 mólekv.), TPAP (33,6 mg, 0,095 mmol, 1,5 mmol%) és NaOCl 2,0 M oldatát (9,5 ml, 19,2 mmol, 3,0 mólekv.) (HPLC útján kb. 5% klórozott termék volt látható). 30 perc múlva a reakcióelegyet 12 ml etil-acetáttal hígítottuk, és a vizes fázist elválasztottuk. A szerves fázist telített Na2S2O3 vizes oldatával és konyhasóoldattal mostuk. A szerves oldószert MTBE¹re váltottuk, és a kapott csapadékot leszûrtük és MTBE-vel mostuk. Így az 1C–9 képletû ketont kaptuk; 78% (1,08 g, 4,97 mmol, 99:4 terület%, 97,0 tömeg%, 0,5 terület% klórozott termék). 1D. reakcióvázlat (2S)-2-({[terc-Butil-(dimetil)-szilil]-oxi}-metil)-4¹(2,5difluor-fenil)-2-fenil-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-karbonilklorid 1–9 Egy felsõ keverõvel, hõkapcsolóval és nitrogén-vákuumbevezetéssel felszerelt lombikba bemértük 180 g szilárd 1–8 képletû S¹TBS pirrolint és hozzáadtunk 1‚26 l izopropil-acetátot. A keverést addig folytatjuk, míg az oldat homogén nem lett, ez kb. 30 perc volt. Egy másik, felsõ keverõvel, hõkapcsolóval és nitrogén-vákuumbevezetéssel felszerelt lombikba bemértünk 1,26 l izopropil-acetátot, és az oldatot –5 °C¹ra lehûtöttük. Hozzáadtunk 67 g trifoszgént, majd lassan 173 ml lutidint. Ehhez az oldathoz azután lassan hozzáadtuk az S¹TBS-pirrolin-oldatot. A reakciót HPLC útján követtük, és teljesnek tekintettük, amikor az amin termékké alakulása HPLC-vel 200 nm¹nél mérve >99 A%¹nak mutatkozott. A reakciót 1,8 l 10 tömeg%¹os vizes citromsav adagolásával leállítottuk. A fázisokat szétválasztottuk, a szerves fázist vízzel (240 ml) kétszer mostuk. A szerves fázist ezután 900 ml¹re bepároltuk (víztartalom 105 mg/ml) és közvetlenül használtuk a kapcsolási reakciókban. A HPLC ellenõrzés 99,96%¹os karbamil-kloriddá való konverziót mutatott. 1E. reakcióvázlat 2-({[terc-Butil-(dimetil)-szilil]-oxi}-metil)-4¹(2,5difluor-fenil)-2-fenil-2,5-dihidro-1H-pirrol (1–8) 1. lépés: 6¹(2,5-Difluor-fenil)-7a-fenil-5,7a-dihidro1H-pirrolo[1,2¹c][1,3]oxazol-3¹on (1–7) 231 g (1,06 mol) 1–6 képletû vegyület 11 l THF-fel készült szuszpenzióját egy 20 l¹es dupla falú reaktorban 1 óra hosszat felsõ keverõvel élénken kevertük, majd –70 °C¹ra lehûtöttük. A szuszpenzióhoz cseppenként hozzáadtuk NaHMDS 1 M THF¹es oldatának 1,28 literét (1,28 mol). Miután 3 óra hosszat kevertük, hozzáadtunk 478,9 g (1,28 mol) szilárd N¹fenil-bisz(trifluor-metánszulfonimid)¹et, majd további másfél óra

5

10

15

20

25

30

35

2

hosszat kevertük, ezután a reakciót 2 l telített vizes ammónium-klorid-oldat adagolásával leállítottuk. Miután az oldat szobahõmérsékletre hûlt, 2 l vizet és 2 l etilacetátot adtunk hozzá, a fázisokat szétválasztottuk, és a vizes fázist 2 l etil-acetáttal extraháltuk. Az egyesített szerves fázisokat konyhasóoldattal mostuk, nátriumszulfáton szárítottuk, és filmbepárlóban bepároltuk. A maradékot egy 20 l¹es dupla falú, felsõ keverõvel ellátott reaktorban, feloldottuk 6 l DME-ben és 1,2 l vízben, és az oldatot nitrogén erõteljes átáramoltatásával 1 óra hosszat gázmentesítettük. Ezután a reaktorba 201,6 g (1,28 mol) 2,5-difluor-fenil-bórsavat, 134 g (3,19 mol) lítium-kloridot, 338 g (3,19 mol) nátrium-karbonátot és 24,6 g (21 mmol) tetrakisz(trifenil-foszfin)palládium(0)¹t adagoltunk, és az elegyet 2 óra hosszat 90 °C¹on hevítettük. Ezután kb. 4,5 l DME¹t desztilláltunk le, a maradék oldatot szobahõmérsékletre lehûtöttük, és 6 l víz és 8 l diklór-metán elegyébe öntöttük. A fázisokat szétválasztottuk, a vizes fázist 2 l diklórmetánnal extraháltuk, a szerves fázisokat egyesítettük, 4 l vízzel mostuk, nátrium-szulfáton szárítottuk, és filmbepárlóban bepároltuk, így sötétvörös szilárd masszát kaptunk. Ezt a maradékot 500 1 kloroformmal kezeltük, és leszûrtük, így sárgásbarna szilárd anyagot kaptunk. A szûrletet 300 ml¹re bepároltuk, és a szilárd anyag egy második részletét gyûjtöttük össze, amelyet egyesítettünk az elsõ adaggal, és az egyesített anyagokat egy éjszakán át 500 ml etil-acetáttal kezeltük. Ezt a szuszpenziót leszûrtük, így piszkosfehér szilárd anyagot kaptunk, a szûrletet bepároltuk 250 ml¹re, és így egy második adag terméket kaptunk, amelyet az elsõ adaggal egyesítettünk. Az egyesített anyagokat (205 g) 1,6 l etil-acetátból átkristályosítottuk, így az 1–7 képletû anyagot kaptuk fehér szilárd anyag formájában. Az 1–7 képletû vegyület adatai: 1H–NMR (500 MHz, CDCl3) d 7,5–7,3 (m, 5H), 7,1–6,9 (m, 3H), 6,8 (s, 1H), 4,9 (d, 1H), 4,75 (d, 1H), 4,5 (d, 1H), 4,25 (d, 1H) ppm. HRMS (ES) M+H a C18H13F2NO2: 314,0987 összegképlet alapján számított. Talált: 314,0993.

40

45

50

55

60 33

2. lépés: 2¹({[terc-Butil-(dimetil)-szilil]-oxi}-metil)4¹(2,5-difluor-fenil)-2-fenil-2,5-dihidro-1H-pirrol (1–8) 109,4 g (349 mmol) 1–7 képletû vegyület 2,2 1 etanollal és 105 ml (1,05 mol) 10 M nátrium-hidroxiddal készült szuszpenzióját egy 10 l¹es gömbölyû fenekû edényben 4 óra hosszat 60 °C¹on hevítettük, majd szobahõmérsékletre lehûtöttük, és egy éjszakán át reagáltattuk. Ehhez az elegyhez hozzáadtunk 90,2 ml (1,08 mol) koncentrált sósavat, és az oldószert filmbepárlóban eltávolítottuk. A maradékot 2 l acetonitrilben szuszpendáltuk, majd filmbepárlóban újra szárazra pároltuk. A szilárd anyagot 3,8 1 diklór-metánban és 200 ml DMF-ben szuszpendáltuk, és hozzáadtunk 118,7 g (1,75 mol) imidazolt, majd 110,5 (733 mmol) TBSCl¹t. Miután az elegyet 15 óra hosszat enyhe nitrogénáramban kevertük, a reakcióelegyet 4 l víz és 2 l diklór-metán elegyébe öntöttük, a fázisokat szétválasztottuk, a vizes fázist 2 l diklór-metánnal extraháltuk. Az egyesített szerves extraktumokat 4×4 l vízzel mostuk,

1

HU 005 812 T2

nátrium-szulfáton szárítottuk, és filmbepárlóban bepároltuk. A maradékot 500 ml metanolban és 500 ml 2 M metanolos metil-aminban oldottuk, 4 óra hosszat kevertük, majd filmbepárlóban bepároltuk. A maradékot nagyvákuum alá helyeztük, amíg állandó tömeget nem értünk el, majd az anyagot mozsárban összetörtük, és

5

2

így az 1–8 képletû vegyületet kaptuk bézs színû szilárd anyag formájában. Az 1–8 képletû vegyület adatai: 1H–NMR (500 MHz, CDCl ) d 7,6–7,3 (m, 5H), 7,1–6,9 3 (m, 3H), 6,75 (s, 1H), 4,25 (d, 1H), 4,1 (d, 1H), 3,95 (d, 1H), 3,75 (d, 1H), 0,9 (s, 9H), 0,1 (s, 3H), 0,05 (s, 3H) ppm.

2. reakcióvázlat

2–1

2–2

2–2a

2–4 2–3

2–5

1. lépés: Benzil-3-fluor-4-oxo-piperidin-1-karboxilát (2–2) 10,0 g (43 mmol) benzil-4-oxo-1-piperidin-karboxilát 25 ml DMF-fel készült oldatához hozzáadtunk 14,3 ml (103 mmol) trietil-amint, majd 6,53 ml (52 mmol) TMSCl¹ot. A reakcióelegyet egy éjszakán át 80 °C¹on hevítettük, majd szobahõmérsékletre lehûtöttük, és egy választótölcsérbe hexánokba öntöttük. Az elegyet telített vizes nátrium-hidrogén-karbonáttal megosztottuk, elválasztottuk, konyhasóoldattal mostuk, magnézium-szulfáton szárítottuk, és filmlepárlóban bepároltuk. A maradékot feloldottuk 500 ml metilcianidban, és 16,7 g (47 mmol) Selectfluorral kezeltük. 90 perc múlva a reakcióelegyet kb. az eredeti térfogat kb. felére bepároltuk, etil-acetát és konyhasóoldat között megosztottuk, elválasztottuk, magnézium-szulfáton szárítottuk, szûrtük és filmbepárlóban bepároltuk. A maradékot szilikagél oszlopra töltöttük, és etil-acetát és hexánok elegyével eluáltuk, így a 2–2 képletû vegyületet színtelen olaj formájában kaptuk. 2. lépés: Benzil-3-fluor-4-(metil-amino)-piperidin-1karboxilát (2–2a) 9,4 g (37,5 mmol) 2–2 képletû vegyület 150 ml 1,2diklór-etánnal készült oldatához hozzáadtunk 37,5 ml

40

45

50

55

60

34

(74,9 mmol) 2 M THF¹es metil-amin-oldatot, valamint 11,9 g (56,2 mmol) Na(OAc) 3 BH¹t. Miután 2 óra hosszat kevertük a reakcióelegyet, a reakciót telített vizes kálium-karbonáttal leállítottuk, az elegyet etilacetáttal megosztottuk, elválasztottuk, és a vizes fázist háromszor etil-acetáttal extraháltuk. Az egyesített extraktumokat konyhasóoldattal mostuk, magnéziumszulfáton szárítottuk, szûrtük és filmbepárlóban bepároltuk. A maradékot szilikagél oszlopra töltöttük, és kloroform, etil-acetát és etanol 80:10:10 arányú elegyével eluáltuk, így a 2–2a képletû vegyület cisz- és transz-izomerjeit kaptuk színtelen olaj formájában. A 2–2a képletû vegyület elõször eluálódó transz-izomerjének adatai (NOE-elemzéssel ellenõrizve): 1H–NMR (600 MHz, CD Cl ) d 7,4–7,3 (m, 5H), 5,1 2 2 (m, 2H), 4,4–4,1 (m, 2H), 3,9 (m, 1H), 3,15–3,05 (m, 2H), 2,75 (m, 1H), 2,4 (s, 3H), 2,0 (m, 1H), 1,25 (m, 1H) ppm. A 2–2a képletû vegyület másodikként eluálódó cisz-izomerének adatai (NOE-elemzéssel ellenõrizve): 1H–NMR (600 MHz, CD2Cl2) d 7,4–7,2 (m, 5H), 5,1 (m, 2H), 4,9–4,7 (m 1H), 4,4 (m, 1H), 4,15 (m, 1H), 3,1–2,9 (m, 2H), 2,6 (m, 1H), 2,4 (s, 3H), 1,8 (m, 1H), 1,6 (m, 1H) ppm. HRMS (ES) M+H a C14H19F1N2O2: 267,1504 összegképlet alapján számított: 267,1504. Talált: 267,1500.

1

HU 005 812 T2

3. lépés: Benzil-(3R,4S)-4-[(terc-butoxi-karbonil)(metil)-amino]-3-fluor-piperidin-1-karboxilát (2–3) 7,67 g (28,8 mmol) 2–2a képletû vegyület cisz-izomerjének 150 ml diklór-metánnak készült oldatához hozzáadtunk 12,1 ml (86,5 mmol) trietil-amint és 9,44 g (43,3 mmol) di¹terc-butil-dikarbonátot. Miután 1 óra hosszat kevertük, a reakcióelegyet diklór-metán és víz között megosztottuk, a szerves fázist konyhasóoldattal mostuk, magnézium-szulfáton szárítottuk, szûrtük és filmbepárlóban bepároltuk. A maradékot szilikagél oszlopra töltöttük, és etil-acetát és hexánok elegyével eluáltuk, így racém 2–3 képletû vegyület cisz-izomerjét kaptuk fehér szilárd anyag formájában. Az enantiomerek rezolválását kromatográfiásan végeztük, Chiralpak AD© 10×50 cm¹es oszlop alkalmazásával, 20% hexános izopropanollal (0,1% dietil-aminnal) 150 ml/perc átfolyási sebességgel. Az eluens analitikai HPLC elemzését 4×250 mm¹es Chiralpak AD® oszlopon végeztük, 20%¹os hexános izopropanollal (0,1% dietil-aminnal) 1 ml/perc átfolyási sebességgel, ami azt mutatta, hogy az elsõként eluálódó 2–3 képletû enantiomer Rt értéke 5,90 perc, míg a másodikként eluálódó enantiomer Rt értéke 6,74 perc. A 2–3 képletû vegyület adatai: HRMS (ES) M+Na a C19H27F1N2O4 összegképlet alapján számított: 389,1847. Talált: 389,1852. 4. lépés: terc-Butil-[(3R,4S)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-metil-karbamát (2–4) 4,6 g (12,6 mmol) a 2–3 képletû vegyület másodikként eluálódó enantiomerjének 150 ml etanollal készült oldatához hozzáadtunk 29,7 ml (314 mmol) 1,4-ciklohexadiént és katalitikus mennyiségû 10%¹os szénhordozós palládiumot. Miután egy éjszakán át kevertük, a reakcióelegyet celiten leszûrtük, és filmbepárlóban lepároltuk. A maradékot feloldottuk 75 ml metanolban, és hozzáadtunk 2 ml ecetsavat és 3,1 ml (38 mmol) 37%¹os vizes formaldehidet, és az elegyet 1 óra hosszat kevertük. Ekkor hozzáadtunk 1,58 g (25,1 mmol) nátrium-ciano-bór-hidridet 10 ml metanolban, és a reakcióelegyet további 2 óra hosszat kevertük, majd telített vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldatba öntöttük. Az elegyet háromszor extraháltuk diklór-metánnal, a szerves fázist vízzel mostuk, magnézium-szulfáton szárítottuk, szûrtük és filmbepárlóban bepároltuk, így a 2–4 képletû vegyületet színtelen olaj formájában kaptuk. A 2–4 képletû vegyület adatai: HRMS (ES) M+H a C12H23FN2O2 összegképlet alapján számított: 247,1817. Talált: 247,1810. 5. lépés: (3R,4S)-3-Fluor-N-1-dimetil-piperidin-4amin (2–5) 3,0 g (12,2 mmol) 2–4 képletû vegyület 100 ml etilacetáttal készült oldatán sósavgázt buborékoltattunk át, míg az oldat érintése melegnek nem tûnt. A lombikot ezután lezártuk, és 4 óra hosszat kevertük. Az illékony komponenseket filmbepárlóban eltávolítottuk, és a maradékot dietil-éterrel trituráltuk, nagyvákuum alá helyeztük, és így fehér szilárd anyagot kaptunk. Ezt az anyagot összekevertük 25 ml 10%¹os vizes nátriumkarbonát-oldattal és kloroform és etanol 2:1 arányú ele-

2

gyével (5×50 ml) extraháltuk. A szerves fázisokat filmbepárlóban nagyon enyhe melegítés közben bepároltuk, a maradékot feloldottuk 200 ml kloroformban, nátrium-szulfáton szárítottuk és bepároltuk, így a 2–5 kép5 letû vegyületet kaptuk színtelen olaj formájában. A 2–5 képletû vegyület adatai: 1H–NMR (500 MHz), CDCl3 d 4,8 (m, 1H), 3,15 (m, 1H), 2,85 (m, 1H), 2,5 (s, 3H), 2,45 (m, 1H), 2,3 (s, 3H), 2,2–2,0 (m, 2H), 1,9–1,7 (m, 2H) ppm. HRMS (ES) M+H a C7H15FN2 összegképlet 10 alapján számított: 147,1292. Talált: 147,1300.

15

20

25

30

35

40

2A. reakcióvázlat 1. lépés: Benzil-3-fluor-4-oxo-piperidin-1-karboxilát (2–2) Egy mechanikus keverõvel felszerelt 22 l¹es gömbölyû fenekû lombikba 2–1 képletû Cbz-ketont (2,5 k g, 10,7 mol), 5,0 l dimetil-acetamidot, trietil-amint (3,0 l, 21,5 mol) töltöttünk. Hozzáadtunk 2,0 l (15,7 mol) trimetil-szilil-kloridot. Az elegyet 60 °C¹ra melegítettük és 4 óra hosszat reagáltattuk. Miután 10 °C¹ra lehûtöttük, az elegyet 10 l 5%¹os nátrium-hidrogén-karbonátoldattal és 10 1 n¹heptánnal hígítottuk, miközben a belsõ hõmérsékletet 20 °C alatt tartottuk. A szerves fázist 2×10 l 2,5%¹os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal mostuk. A végsõ szerves fázist nátrium-szulfáton szárítottuk, szûrtük és csökkentett nyomáson bepároltuk, és az oldószert 10 l metil-cianidra váltottuk. Egy 50 l¹es dupla falú edénybe bemértünk 7,5 l metil-cianidot és 4,0 kg (11,5 mol) Selectfluort. A kapott szuszpenziót lehûtöttük 10 °C¹ra, és hozzáadtunk 0,37 kg (2,68 mol) kálium-karbonátot. Ehhez részletekben hozzáadtuk a metil-cianidos szilil-éter-oldatot, miközben a belsõ hõmérsékletet 10–15 °C¹on tartottuk. A végsõ szuszpenziót 2 óra hosszat 10–15 °C¹on reagáltattuk. Ezután a reakcióelegyet egy 100 l¹es, 20 l 2 N sósavat és 30 l etil-acetátot tartalmazó extraktorba öntöttük. A szerves fázist 20 l 2 N sósavval, 10 l 20 tömeg%¹os nátrium-klorid-oldattal mostuk, nátrium-szulfáton szárítottuk és szûrtük. A szûrletet bepároltuk, és csökkentett nyomáson etil-acetáttal KF=16 000 mg/ml értékig elárasztottuk, majd az oldószert csökkentett nyomáson kb. 10 l THF¹re váltottuk.

2. lépés: Benzil-3-fluor-4-(metil-amino)-piperidin-1karboxilát (2–2a) Egy gömbölyû fenekû lombikban feloldottunk 10,3 mol Cbz fluor-ketont 30 l tetrahidrofuránban. Hozzáadtunk 10,3 l 2 M tetrahidrofurános metil-amint (2,00 ekv.; 20,6 mol; 10,3 l), és az elegyet szobahõ50 mérsékleten 30 percig kevertük. Ezután az elegyet 0 °C¹ra lehûtöttük, és hozzáadtunk 1,236 kg (1,17 l; 20,6 mól; 10,3 l) ecetsavat, majd 0 °C¹on további 30 percig kevertük. Ezután részletekben 15 perc alatt hozzáadtunk 2,62 kg nátrium-triacetoxi-bór-hidridet, és 55 a reakcióelegyet 0 °C¹on reagáltattuk, amíg a HPLC elemzés alapján a reakció teljesnek nem tûnt. A reakcióelegyet lassan egy 100 l¹es hengeres extraktorba vezettük, amely 2,75 l 12 M vizes sósavat (30,9 mol, 2,575 l), 30 l vizet és 140 mol (15 l) toluolt 60 tartalmazott. Miután 15 percig élénken kevertük, a fázi45

35

1

HU 005 812 T2

sokat elválasztottuk, a toluolos fázist 10 l vízzel tovább mostuk. Az egyesített vizes fázisokat visszavezettük az extraktorba. Hozzáadtunk 8,24 l (82,4 mol) 10 M vizes nátrium-hidroxidot, és az elegyet 30 l izopropil-acetáttal egyszer extraháltuk. A szerves fázist 3 kg nátrium-szulfáttal szárítottuk és bepároltuk. A maradékot feloldottuk etanol és víz 8:2 térfogatarányú elegyében (23 kg etanol 7,2 kg vízzel keverve) és az oldathoz hozzáadtunk 667 ml (9,83 mol; 950 g, 667 ml) 85%¹os foszforsavat, és kristálymagokat. Az elegyet szobahõmérsékleten egy éjszakán át kevertük. A kivált kristályos szilárd anyagot szûréssel összegyûjtöttük. A szilárd anyagot etanol és víz 8:2 arányú elegyével mostuk, vákuumkemencében szárítottuk, így 2,1 kg szilárd anyagot kaptunk. A szilárd anyagot 35 l etanol és 4 l víz elegyében szuszpendáltuk, és 70–80 °C¹on hevítettük, amíg a szilárd komponens fel nem oldódott. Ezután a hõforrást eltávolítottuk, a tiszta oldatot 2–2a képletû vegyület cisz-izomer elegyével beoltottuk. Miután szobahõmérsékleten egy éjszakán át kevertük, kristályos szilárd anyag csapódott ki, amelyet szûréssel összegyûjtöttünk. A terméket vákuumkemencében szárítottuk, így fehér szilárd anyagot kaptunk.

Boc-diamint tartalmaz. Ehhez az oldathoz formaldehidet (37%¹os vizes oldat, 430 ml, 5,3 mol) adtunk, és az elegyet 5% szénhordozós palládiumon (183 g) 4 óra hosszat hidrogénnyomás alatt tartottuk. Ezután a reak5 cióelegyet leszûrtük a katalizátor eltávolítására, és a 8 l etil-acetát és 8 l 0,5 M nátrium-hidrogén-karbonát-oldat között megosztottuk. A szerves fázist 8 l 0,5 M nátriumhidrogén-karbonát-oldattal mostuk. Az egyesített vizes fázisokat 8 l etil-acetáttal visszaextraháltuk. Az egyesí10 tett szerves fázisokat nátrium-szulfáton szárítottuk és leszûrtük. A szûrletet a következõ lépésben közvetlenül felhasználtuk.

15

20

25 3. lépés: Benzil-(3R,4S)-4-[(terc-butoxi-karbonil)(metil)-amino]-3-fluor-piperidin-1-karboxilát 2–3 Egy 50 l¹es extraktorba bemértünk 20 l vizet és 1,06 kg nátrium-karbonátot, és az elegyet addig kevertük, míg az összes szilárd anyag fel nem oldódott. Ezután hozzáadtunk 20 l izopropil-acetátot, és 1,85 kg (5,3 mol) CBZ-amin-karboxilátot. Keverés után a fázisokat szétválasztottuk. A vizes fázist további 5 l izopropanol-acetáttal extraháltuk. Az egyesített szerves fázisokat nátrium-szulfáton szárítottuk. Miután a szárítószert leszûrtük, a tételt egy 72 l¹es gömbölyû fenekû lombikba töltöttük, és hozzáadtunk 4,8 l 1,0 M Boc2-oldatot. A 45 perc múlva végzett HPLC elemzés 98%¹os konverziót mutatott. Egy további Boc2O-oldatot (50 ml) adtunk hozzá. Miután a tételt további 15 óra hosszat reagáltattuk, vákuumban minimális térfogatra bepároltuk, 10–15 l metanollal elárasztottuk. Ezután a tételt metanollal kb. 14,3 kg teljes tömegre hígítottuk. A HPLC elemzés kb. 1,9 kg kívánt terméket mutatott ki. A fluor-piperidint kromatográfiás elválasztással rezolváltuk 20 mm¹es Chiralpak AD (Diacel Chemical Industries, Ltd.) királis stacioner fázisú oszlopon (átmérõ 30×25 cm). Injektálásonként 54 g racemátot eluáltunk metanollal. A legkisebb retenciós idejû enantiomert gyûjtöttük össze, így 45 g (85%¹os visszanyerés) kívánt (3R, 4S) enantiomert kaptunk 98% ee tisztasággal. Ezt az elválasztási eljárást ismételtük és a különbözõ injektálások kívánt frakcióit egyesítettük és bepároltuk. 4. lépés: terc-Butil-[(3R,4S)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-metil-karbamát (2–4) Úgy találtuk, hogy a királis elválasztási lépés koncentrált oldata (4 l) 489,5 g (1,3 mol) 2–3 képletû Cbz-

2

30

35

40

45

50

55

60 36

6. lépés: (3R,4S)-3-Fluor-N-1-dimetil-piperidin-4amin (2–5) Az etil-acetátos, Boc-védett 2–4 képletû diamint (327 g a HPLC elemzés szerint) tartalmazó oldatot egy 12 l¹es lombikba töltöttük, miközben 28 °C¹on koncentráltuk. Amikor a tétel összes térfogata 1,5 l¹t érte el, az oldószert 8 l etanol betöltésével etanolra váltottuk, miközben állandó térfogaton tartva desztilláltuk. Egy másik 12 l¹es gömbölyû fenekû lombikba bemértünk 1,5 l etanolt (200 szeszfok). Ezután az etanolhoz hozzáadtunk 436 ml acetil-kloridot, miközben a hõmérsékletet 35 °C alatt tartottuk egy vízfürdõ segítségével. Az oldatot 1 óra hosszat kevertük. Ezután a 302 g Boc-védett 2–4 képletû diamint tartalmazó etanolos oldatot lassan hozzáadtuk a sósavhoz, miközben a hõmérsékletet 30 °C alatt tartottuk. Amikor az adagolás 3/4¹énél tartottunk, az oldatból szilárd termék kezdett kristályosodni. A reakciót gázkromatográfiásan ellenõriztük, és a szuszpenziót egy éjszakán át kevertük. Ezután a szilárd komponenst szûréssel elválasztottuk, a szûrõpogácsát 2 l 85%¹os etanollal és 15%¹os etil-acetáttal mostuk. Ezután a szûrõpogácsát vákuumban szárítottuk nitrogénáram segítségével egy éjszakán át, így 243 g kívánt 2–5 képletû terméket kaptunk bisz-dihidrokloridsó formájában. A gázkromatográfiás elemzés azt mutatta, hogy a tétel 99,3% ee tisztaságú. Kb. 200 mg 2–5 képletû vegyületet (fluor-piperidin-dihidroklorid) bemértünk egy fiolába, és metanolban (<500 ml) szuszpendáltuk. A mintát egy hevítõpisztollyal oldódásig hevítettük. 2 óra múlva nagy háromdimenziós kristályokat figyeltünk meg. A kristályokat a maradék oldószer eltávolításával izoláltuk. Egy kristályt kiválasztottunk az egykristály röntgensugáradatok felvételéhez Bruke Smart Apex rendszerben. A kristály egy színtelen, 0,24 mm×0,22 mm×0,14 mm méretû lemez volt. Az egységcellát 5 másodperces beolvasási sebességgel vettük fel és az autoindexálás azt mutatta, hogy a cella monoklin. A szerkezetet oldottuk a monoklin P 21 tércsoportban, miután gradiensadatokat gyûjtöttünk 5 másodperc beolvasási sebességgel. Az oldott szerkezet végsõ jellemzõit tartalmazó információkat az 1–5. táblázatban foglaltuk össze. A 2–5 képletû vegyület számítógépes rajzát az 1. ábrán mutatjuk be.

HU 005 812 T2

1. táblázat A 2–5 képletû vegyület kristályadatai és szerkezetfinomítása Empirikus képlet

C8H21C12FN2O

Molekulatömeg

251,17

Hõmérséklet

298(2) °K

Hullámhossz

0,71073 Angström

Kristályrendszer tércsoport

monoklin, P2(1)

Egységcella-dimeziók

a=7,286(2) A alpha=90 fok. b=7,637(2) Å béta=105,295(5) fok. c=12,378(4) Å gamma=90 fok.

Térfogat

664,3(4) Å3

Z, számított sûrûség

2, 1,256 Mg/m3

Abszorpciós koefficiens

0,477 mm–1

F(000)

268

Kristályméret

0,24×0,22×0,14 mm

Teta-tartomány az adatgyûjtéshez

1,71–26,35 fok.

Korlátozó indexek

–9<=h<=9, –9<=k<=9, –15<=1<=15

Gyûjtött reflexiók/egyedi

5309/2674 [R(int)=0,0227]

Teljesség a teta=26,35 nézve

99,7%

Abszorpciós korrekció

nincs

Finomítási módszer

teljes mátrix legkisebb négyzet F2¹re nézve

Adatok/korlátozások/paraméterek

2674/1/135

Illesztési jóság

F2-höz

1,055

Végsõ R indexek [I>2 szigma(I)]

R1=0,0383, wR2=0,0939

R indexek (összes adat)

R1=0,0409, wR2=0,0959

Abszolút szerkezeti paraméter

0,02(6)

Legnagyobb diff. csúcs és lyuk

0,310 és –0,135 e.Å3

2. táblázat Atomkoordináták (×104) és ekvivalens izotróp kiszorítási paraméterek (Å2×103) a 2–5 képletû vegyület esetén U(eq) az ortogonalizált Uij tenzor nyomának egyharmada x

y

z

U(eq)

C(1)

10 896(3)

4999(4)

3165(2)

45(1)

C(2)

10 015(3)

6778(3)

2967(2)

40(1)

C(3)

7 954(3)

6708(3)

2311(2)

36(1)

C(4)

7 708(3)

5658(3)

1234(2)

43(1)

C(5)

8 554(3)

3861(3)

1506(2)

44(1)

C(6)

11 521(4)

2227(3)

2315(2)

53(1)

C(7)

5 074(3)

8626(4)

1808(3)

62(1)

C(11)

6 300(5)

5224(6)

4909(3)

85(1)

Cl(1)

2 362(1)

4966(1)

194(1)

53(1)

Cl(2)

8 214(1)

1057(1)

4028(1)

55(1)

F(1)

10 991(2)

7785(2)

2346(1)

55(1)

N(1)

10 618(3)

3989(2)

2104(2)

39(1)

N(2)

7 187(3)

8513(2)

2056(2)

39(1)

O(11)

5 695(3)

4422(3)

3856(2)

68(1)

37

HU 005 812 T2

3. táblázat Kötések hossza [Å] és szögek [fok] a 2–5 képletû vegyületnél C(1)–N(1)

1,491(3)

C(2)–C(1)–H(1A)

109,2

C(1)–C(2)

1,495(3)

N(1)–C(1)–H(1B)

109,2

C(1)–H(1A)

0,9700

C(2)–C(1)–H(1B)

109,2

C(1)–H(1B)

0,9700

H(1A)–C(1)–H(1B)

107,9

C(2)–F(1)

1,406(3)

F(1)–C(2)–C(1)

109,28(19)

C(2)–C(3)

1,508(3)

F(1)–C(2)–C(3)

107,49(17)

C(2)–H(2)

0,9800

C(1)–C(2)–C(3)

112,33(18)

C(3)–N(2)

1,489(3)

F(1)–C(2)–H(2)

109,2

C(3)–C(4)

1,525(3)

C(1)–C(2)–H(2)

109,2

C(3)–H(3)

0,9800

C(3)–C(2)–H(2)

109,2

C(4)–C(5)

1,505(3)

N(2)–C(3)–C(2)

110,26(17)

C(4)–H(4A)

0,9700

N(2)–C(3)–C(4)

110,51(17)

C(4)–H(4B)

0,9700

C(2)–C(3)–C(4)

111,07(18)

1,494(3)

N(2)–C(3)–H(3)

108,3

C(5)–H(5A)

C(5)–N(1)

0,9700

C(2)–C(3)–H(3)

108,3

C(5)–H(5B)

0,9700

C(4)–C(3)–H(3)

108,3

1,490(3)

C(5)–C(4)–C(3)

109,71(19)

C(6)–N(1) C(6)–H(6A)

0,9600

C(5)–C(4)–H(4A)

109,7

C(6)–H(6B)

0,9600

C(3)–C(4)–H(4A)

109,7

C(6)–H(6C)

0,9600

C(5)–C(4)–H(4B)

109,7

C(3)–C(4)–H(4B)

109,7

H(4A)–C(4)–H(4B)

108,2

C(7)–N(2)

1,491(3)

C(7)–H(7A)

0,9600

C(7)–H(7B)

0,9600

N(1)–C(5)–C(4)

C(7)–H(7C)

0,9600

N(1)–C(5)–H(5A)

109,6

C(11)–O(11)

110,49(18)

1,402(4)

C(4)–C(5)–H(5A)

109,6

C(11)–H(11A)

0,9600

N(1)–C(5)–H(5B)

109,6

C(11)–H(11B)

0,9600

C(4)–C(5)–H(5B)

109,6

C(11)–H(11C)

0,9600

H(5A)–C(5)–H(5B)

108,1

N(1)–H(1)

0,77(2)

N(1)–C(6)–H(6A)

109,5

N(2)–H(2A)

0,9000

N(1)–C(6)–H(6B)

109,5

N(2)–H(2B)

0,9000

H(6A)–C(6)–H(6B)

109,5

O(11)–H(11)

0,8200

N(1)–C(6)–H(6C)

109,5

N(1)–C(1)–C(2)

111,88(18)

H(6A)–C(6)–H(6C)

109,5

N(1)–C(1)–H(1A)

109,2

H(6B)–C(6)–H(6C)

109,5

N(2)–C(7)–H(7A)

109,5

C(1)–N(1)–C(5)

110,83(17)

N(2)–C(7)–H(7B)

109,5

C(6)–N(1)–C(5)

111,57(19)

H(7A)–C(7)–H(7B)

109,5

C(1)–N(1)–H(1)

107,9(17)

N(2)–C(7)–H(7C)

109,5

C(6)–N(1)–H(1)

110,0(17)

H(7A)–C(7)–H(7C)

109,5

C(5)–N(1)–H(1)

105,1(18)

H(7B)–C(7)–H(7C)

109,5

C(3)–N(2)–C(7)

113,99(19)

O(11)–C(11)–H(11A)

109,5

C(3)–N(2)–H(2A)

108,8

O(11)–C(11)–H(11B)

109,5

C(7)–N(2)–H(2A)

108,8

H(11A)–C(11)–H(11B)

109,5

C(3)–N(2)–H(2B)

108,8

O(11)–C(11)–H(11C)

109,5

C(7)–N(2)–H(2B)

108,8

H(11A)–C(11)–H(11C)

109,5

H(2A)–N(2)–H(2B)

107,6

109,5

C(11)–O(11)–H(11)

109,5

H(11B)–C(11)–H(11C) C(1)–N(1)–C(6)

111,2(2)

38

HU 005 812 T2

4. táblázat Anizotrop kiszorítási paraméterek (Å2×103) 2–5 képletû vegyület esetén. Az anizotrop kiszorítási faktor kitevõ a következõkbõl adódik: 2pi2[h2a*2U11+…+2hka*b*U12] U11

U22

U33

U23

U13

U12

C(1)

45(1)

49(1)

38(1)

0(1)

6(1)

3(1)

C(2)

41(1)

41(1)

37(1)

–6(1)

8(1)

–5(1)

C(3)

38(1)

39(1)

35(1)

–1(1)

13(1)

–3(1)

C(4)

43(1)

43(1)

40(1)

–9(1)

4(1)

0(1)

C(5)

44(1)

39(1)

46(1)

–9(1)

8(1)

–5(1)

C(6)

59(2)

40(1)

62(2)

7(1)

21(1)

12(1)

C(7)

37(1)

68(2)

78(2)

–12(2)

12(1)

8(1)

C(11)

69(2)

112(3)

77(2)

–25(2)

21(2)

7(2)

Cl(1)

70(1)

52(1)

43(1)

–3(1)

25(1)

–10(1)

Cl(2)

68(1)

58(1)

43(1)

–10(1)

21(1)

–3(1)

F(1)

41(1)

49(1)

75(1)

2(1)

18(1)

–9(1)

N(1)

47(1)

36(1)

40(1)

4(1)

18(1)

2(1)

N(2)

37(1)

43(1)

39(1)

–6(1)

15(1)

0(1)

O(11)

59(1)

80(2)

63(1)

0(1)

14(1)

5(1)

5. táblázat Hidrogénkoordináták (×104) és izotróp kiszorítási paraméterek (Å2×103) 2–5 képletû vegyületek esetén x

y

z

U(eq)

H(1A)

12 248

5118

3517

54

H(1B)

10 335

4358

3675

54

H(2)

10 113

7348

3689

48

H(3)

7 231

6126

2773

44

H(4A)

6 367

5558

853

52

H(4B)

8 336

6256

740

52

H(5A)

7 885

3246

1973

52

H(5B)

8 403

3198

820

52

H(6A)

12 857

2358

2661

79

H(6B)

11 341

1615

1617

79

H(6C)

10 945

1575

2802

79

H(7A)

4 507

7821

1218

92

H(7B)

4 671

9795

1577

92

H(7C)

4 683

8333

2468

92

H(11A)

7 656

5114

5184

128

H(11B)

5 699

4665

5421

128

H(11C)

5 960

6441

4843

128

H(2A)

7 550

8924

1463

46

H(2B)

7 704

9209

2644

46

H(11)

6 251

3486

3866

102

4510(30)

1710(20)

H(1)

11 060(30)

39

29(6)

1

HU 005 812 T2

2

3. reakcióvázlat

1–9 3–1

(2S)-4¹(2,5-Difluor-fenil)-N-[(3R,4S)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N-metil-2-fenil-2,5dihidro-1H-pirrol-1-karboxamid (3–1) 1,6 g (3,45 mmol) 1–9 képletû karbamoil-klorid 25 ml THF-fel készült oldatához hozzáadtunk 630 mg (4,31 mmol) 2–5 képletû amint, 1,44 ml (10,3 mmol) trietil-amint és katalitikus mennyiségû DMAP¹t. Miután 24 óra hosszat szobahõmérsékleten kevertük, a reakcióelegyet etil-acetát és telített vizes nátrium-hidrogénkarbonát-oldat között megosztottuk, a szerves fázist konyhasóoldattal mostuk, nátrium-szulfáton szárítottuk, és filmbepárlóban bepároltuk. A maradékot szilikagélen kromatográfiásan tisztítottuk, eluálószerként etilacetát és hexánok elegyét használtuk, így 1,7 g halványsárga karamellszerû anyagot kaptunk. Ezt feloldottuk 75 ml metil-cianidban, és hozzáadtunk 3 ml trietil-amin-trihidrofluoridot, és az elegyet 24 óra hosszat szobahõmérsékleten kevertük. Ezután hozzáadtunk további 3 ml trietil-amin-trihidrofluoridot, és a reakcióelegyet további 24 óra hosszat 37 °C¹on melegítettük. Ezután az elegyet telített vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldatba öntöttük, etil-acetáttal háromszor extraháltuk, konyhasóoldattal mostuk és nátrium-szulfáton szárítottuk, és filmbepárlóban bepároltuk. A maradékot szilikagélen kromatográfiásan tisztítottuk, eluálószerként etil-acetátot, majd etanol, ammónium-hidroxid és víz 20:1:1 arányú elegyét használtuk, így a 3–1 képletû vegyületet fehér szilárd anyag formájában kaptuk. A 3–1 képletû vegyület adatai: 1H–NMR (500 MHz, CDCl3) d 7,4–7,2 (m, 5H), 7,1–6,9 (m, 3H), 6,3 (s, 1H), 5,25 (m, 1H), 4,9 (d, 1H), 4,8 (d, 1H), 4,6 (d, 1H), 4,45 (m, 1H), 4,1–4,0 (m, 2H), 3,2–3,1 (m, 1H), 3,1 (s, 3H), 3,0 (m, 1H), 2,4–2,3 (m, 1H), 2,3 (s, 3H), 2,3–2,2 (m, 2H), 1,7 (m, 1H) ppm. HRMS (ES) M+H a C 25 H 28 F 3 N 3 O 2 összegképlet alapján számított: 460,2207. Talált: 460,2213. 3A. reakcióvázlat (2S)-4¹(2,5-Difluor-fenil)-N-[(3R,4S)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N-metil-2-fenil-2,5dihidro-1H-pirrol-1-karboxamid (3–1) Egy felsõ keverõvel, fûtéscsatlakozóval és nitrogén¹/vákuumbevezetõvel felszerelt lombikba bemértük

20

25

30

35

40

45

50

55

60 40

az 1–9 képletû karbamil-klorid 0,9 l izopropil-acetáttal készült oldatát. Ehhez az oldathoz hozzáadtunk 0,9 l DMF¹et, 111 g 2–5 képletû fluor-diamint és 540 ml diizopropil-etil-amint. Az oldatot 60 °C¹on 16 óra hosszat melegítettük, majd ellenõriztük a karbamil-klorid termékké alakulását. A reakciót végbementnek tekintettük, ha a karbamil-klorid termékké alakulása 98A%-nál nagyobbnak mutatkozott 200 nm¹nél HPLC útján mérve. A reakcióelegyet lehûtöttük 5 °C¹ra, és hozzáadtunk 450 ml 6 N sósavoldatot. Az oldatot addig reagáltattuk, míg a deszililezés végbe nem ment (>99A% 200 nm¹nél), ez kb. 2 órát vett igénybe. A reakcióelegyhez hozzáadtunk 3 l izopropil-acetátot, majd 2 l 8 tömeg%¹os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldatot, és hagytuk 15–20 °C¹ra melegedni. A fázisokat szétválasztottuk, a vizes fázist 3 l izopropil-acetáttal 1×extraháltuk. Az egyesített szerves fázisokat 1 l vízzel 2×mostuk. A mosott szerves oldatot 5 l¹re bepároltuk, és 30–40 °C¹on egy 1 mm¹es polipropilénszûrõn keresztül egy másik lombikba juttattuk. Ezután desztillációt végeztünk, amíg a térfogat 1 l¹t el nem ért, majd a reakcióelegyet szobahõmérsékleten tartottuk 2 óra hosszat. Ezután 2 óra alatt lassan hozzáadtunk 1 l heptánt. A kapott szuszpenziót szinterezett üvegszûrõn szûrtük, és a kristályos terméket háromszor 500 ml heptán és izopropil-acetát 2:1 térfogatarányú elegyével mostuk, amit kiszorításos mosásként végeztünk. A kapott szilárd 3–1 képletû vegyületet egy éjszakán át nitrogénáramban szárítottuk. Az 1H–NMR- és HRMSadatok megfeleltek a 3. reakcióvázlat szerinti termékének. Egy kristályt kiválasztottunk az egykristály röntgensugáradatok felvételéhez Bruke Smart Apex rendszerben. A kristály egy színtelen, 0,14 mm×0,13 mm×0,13 mm méretû poliéder volt. Az egységcellát 30 másodperces beolvasási sebességgel vettük fel és az autoindexálás azt mutatta, hogy a cella monoklin. A szerkezetet oldottuk az ortorombos P 212121 tércsoportban, miután gradiensadatokat gyûjtöttünk 30 másodperc beolvasási sebességgel. Az oldott szerkezet végsõ jellemzõit tartalmazó információkat az 1–5. táblázatban foglaltuk össze. A 3–1 képletû vegyület számítógépes rajzát a 2. ábrán mutatjuk be.

HU 005 812 T2

6. táblázat 3–1 képletû vegyületek kristály adatai és szerkezetfinomítása Empirikus képlet

C25H28F3N3O2

Molekulatömeg

459,50

Hõmérséklet

298(2) K

Hullámhossz

0,71073 Å

Kristályrendszer tércsoport

Ortorombos, P2(1)2(1)2(1) a=11,3916(14) Å alpha=90 fok.

Egységcella-dimeziók

b=11,4808(14) Å béta=90 fok. c=17,718(2) Å gamma=90 fok. Térfogat

2317,3(5) Å3

Z, számított sûrûség

4, 1,317 Mg/m3

Abszorpciós koefficiens

0,101 mm–1

F(000)

968

Kristályméret

0,14 mm×0,13 mm×0,13 mm

Teta-tartomány az adatgyûjtéshez

2,11–26,43 fok.

Korlátozó indexek

–14<=h<=14, –14<=k<=14, –22<=1<=22

Gyûjtött reflexiók/egyedi

22539/2698 [R(int)=0,0405]

Teljesség a theta¹ra nézve=

26,43 99,8%

Abszorpciós korrekció

nincs

Finomítási módszer

teljes mátrix legkisebb négyzet F2¹re nézve

Adatok/korlátozások/paraméterek

2698/0/301

Illesztési jóságF^2

1,157

Végsõ R indexek [I>2szigma(I)]

R1=0,0429, wR2=0,0993

R indexek (összes adat)

R1=0,0550, wR2=0,1047

Abszolút szerkezeti paraméter

0(10)

Legnagyobb diff. csúcs és lyuk

0,165 és –0,120 e.Å–3

7. táblázat Atomkoordináták (×104) és ekvivalens izotróp kiszorítási paraméterek (Å2×103) a 3–1 képletû vegyület esetén U(eq) az ortonogalizált Uij tenzor nyomának egyharmada x

y

z

U(eq)

C(5)

–2267(3)

6 218(3)

2092(2)

53(1)

C(25)

5273(3)

3 363(4)

2054(3)

93(1)

O(2)

24(2)

5 125(1)

1748(1)

50(1)

F(3)

4039(2)

6 650(2)

1452(1)

74(1)

F(1)

–3491(2)

9 889(2)

691(1)

73(1)

O(1)

–2142(2)

5 028(2)

2243(1)

63(1)

C(18)

313(2)

6 092(2)

1508(1)

39(1)

C(1)

–1779(2)

6 659(2)

1327(2)

41(1)

N(1)

–501(2)

6 935(2)

1354(1)

41(1)

C(12)

–1597(2)

9 968(2)

1225(1)

44(1)

C(20)

2315(2)

5 486(2)

1637(1)

40(1)

N(2)

1463(2)

6 357(2)

1377(1)

42(1)

F(2)

177(2)

12 521(2)

1590(1)

105(1)

C(4)

–303(2)

8 186(2)

1463(2)

50(1)

C(17)

–680(3)

10 679(2)

1453(2)

53(1)

C(2)

–2267(2)

7 865(2)

1205(1)

44(1)

41

HU 005 812 T2

7. táblázat (folytatás) x

y

z

U(eq)

C(11)

–3201(3)

5 372(2)

626(2)

53(1)

C(24)

2651(3)

4 586(2)

1056(2)

52(1)

C(3)

–1487(2)

8 695(2)

1296(1)

42(1)

N(3)

4491(2)

4 230(2)

1726(2)

60(1)

C(19)

1830(3)

7 139(3)

769(2)

58(1)

C(15)

–1705(4)

12 401(3)

1043(2)

78(1)

C(21)

3404(2)

6 016(2)

1983(2)

52(1)

C(16)

–754(3)

11 868(3)

1362(2)

68(1)

C(6)

–2088(2)

5 851(2)

671(1)

40(1)

C(13)

–2555(3)

10 532(3)

918(2)

55(1)

C(14)

–2613(4)

11 716(3)

818(2)

71(1)

C(7)

–1323(3)

5 615(3)

89(2)

57(1)

C(10)

–3518(3)

4 678(3)

26(2)

64(1)

C(9)

–2748(3)

4 452(3)

–544(2)

70(1)

C(22)

4183(3)

5 085(3)

2291(2)

64(1)

C(8)

–1644(3)

4 917(3)

-508(2)

73(1)

C(23)

3449(3)

3 691(2)

1414(2)

63(1)

8. táblázat Kötések hossza [Å] és szögek [fok] a 3–1 képletû vegyület esetén C(5)–O(1)

1,399(3)

N(2)–C(19)

1,464(3)

C(5)–C(1)

1,550(4)

F(2)–C(16)

1,360(4) 1,500(3)

C(5)–H(5A)

0,9700

C(4)–C(3)

C(5)–H(5B)

0,9700

C(4)–H(4A)

0,9700

C(25)–N(3)

1,457(4)

C(4)–H(4B)

0,9700

C(25)–H(25A)

0,9600

C(17)–C(16)

1,376(4)

C(25)–H(25B)

0,9600

C(17)–H(17)

0,9300

C(25)–H(25C)

0,9600

C(2)–C(3)

1,313(4) 0,9300

O(2)–C(18)

1,233(3)

C(2)–H(2)

F(3)–C(21)

1,393(3)

C(11)–C(10)

1,376(4)

F(1)–C(13)

1,358(4)

C(11)–C(6)

1,385(4)

O(1)–H(1)

0,8200

C(11)–H(11)

0,9300

C(18)–N(1)

1,368(3)

C(24)–C(23)

1,511(4)

C(18)–N(2)

1,364(3)

C(24)–H(24A)

0,9700

C(1)–N(1)

1,490(3)

C(24)–H(24B)

0,9700

C(1)–C(2)

1,508(3)

N(3)–C(22)

1,446(4)

C(1)–C(6)

1,528(4)

N(3)–C(23)

1,448(4)

N(1)–C(4)

1,466(3)

C(19)–H(19A)

0,9600

C(12)–C(13)

1,381(4)

C(19)–H(19B)

0,9600

C(12)–C(17)

1,386(4)

C(19)–H(19C)

0,9600

C(12)–C(3)

1,473(3)

C(15)–C(14)

1,360(5)

C(20)–N(2)

1,468(3)

C(15)–C(16)

1,367(5)

C(20)–C(24)

1,508(4)

C(15)–H(15)

0,9300

C(20)–C(21)

1,512(4)

C(21)–C(22)

1,492(4)

C(20)–H(20)

0,9800

C(21)–H(21)

0,9800

42

HU 005 812 T2

8. táblázat (folytatás) C(6)–C(7)

1,377(4)

C(18)–N(1)–C(4)

124,2(2)

C(13)–C(14)

1,372(4)

C(18)–N(1)–C(1)

121,18(19)

C(14)–H(14)

0,9300

C(4)–N(1)–C(1)

111,32(19)

C(7)–C(8)

1,377(4)

C(13)–C(12)–C(17)

115,7(2)

C(7)–H(7)

0,9300

C(13)–C(12)–C(3)

124,5(3)

C(10)–C(9)

1,362(4)

C(17)–C(12)–C(3)

119,7(2)

C(10)–H(10)

0,9300

N(2)–C(20)–C(24)

114,8(2)

C(9)–C(8)

1,368(5)

N(2)–C(20)–C(21)

113,3(2)

C(9)–H(9)

0,9300

C(24)–C(20)–C(21)

110,1(2)

C(22)–H(22A)

0,9700

N(2)–C(20)–H(20)

105,9

C(22)–H(22B)

0,9700

C(24)–C(20)–H(20)

105,9

C(8)–H(8)

0,9300

C(21)–C(20)–H(20)

105,9

C(23)–H(23A)

0,9700

C(18)–N(2)–C(19)

122,5(2)

0,9700

C(18)–N(2)–C(20)

115,44(19)

C(19)–N(2)–C(20)

117,40(19)

C(23)–H(23B) O(1)–C(5)–C(1)

116,7(2)

O(1)–C(5)–H(5A)

108,1

N(1)–C(4)–C(3)

102,5(2)

C(1)–C(5)–H(5A)

108,1

N(1)–C(4)–H(4A)

111,3

O(1)–C(5)–H(5B)

108,1

C(3)–C(4)–H(4A)

111,3

C(1)–C(5)–H(5B)

108,1

N(1)–C(4)–H(4B)

111,3

H(5A)–C(5)–H(5B)

107,3

C(3)–C(4)–H(4B)

111,3

N(3)–C(25)–H(25A)

109,5

H(4A)–C(4)–H(4B)

109,2

N(3)–C(25)–H(25B)

109,5

C(16)–C(17)–C(12)

120,3(3)

H(25A)–C(25)–H(25B)

109,5

C(16)–C(17)–H(17)

119,9

N(3)–C(25)–H(25C)

109,5

C(12)–C(17)–H(17)

119,9

H(25A)–C(25)–H(25C)

109,5

C(3)–C(2)–C(1)

113,6(2)

H(25B)–C(25)–H(25C)

109,5

C(3)–C(2)–H(2)

123,2

C(5)–O(1)–H(1)

109,5

C(1)–C(2)–H(2)

123,2

O(2)–C(18)–N(1)

121,6(2)

C(10)–C(11)–C(6)

121,0(3)

O(2)–C(18)–N(2)

121,0(2)

C(10)–C(11)–H(11)

119,5

N(1)–C(18)–N(2)

117,3(2)

C(6)–C(11)–H(11)

119,5

C(20)–C(24)–C(23)

109,4(2)

N(1)–C(1)–C(2)

99,73(19)

N(1)–C(1)–C(6)

112,2(2)

C(20)–C(24)–H(24A)

109,8

C(2)–C(1)–C(6)

111,3(2)

C(23)–C(24)–H(24A)

109,8

N(1)–C(1)–C(5)

113,1(2)

C(20)–C(24)–H(24B)

109,8

C(2)–C(1)–C(5)

107,1(2)

C(23)–C(24)–H(24B)

109,8

C(6)–C(1)–C(5)

112,6(2)

H(24A)–C(24)–H(24B)

C(2)–C(3)–C(12)

130,7(2)

C(9)–C(10)–C(11)

120,9(3)

108,2

C(2)–C(3)–C(4)

110,5(2)

C(9)–C(10)–H(10)

119,5 119,5

C(12)–C(3)–C(4)

118,7(2)

C(11)–C(10)–H(10)

C(22)–N(3)–C(23)

110,8(2)

C(10)–C(9)–C(8)

118,9(3)

C(22)–N(3)–C(25)

109,7(3)

C(10)–C(9)–H(9)

120,5

C(23)–N(3)–C(25)

111,2(3)

C(8)–C(9)–H(9)

120,5

N(2)–C(19)–H(19A)

109,5

N(3)–C(22)–C(21)

112,1(2)

N(2)–C(19)–H(19B)

109,5

N(3)–C(22)–H(22A)

109,2

H(19A)–C(19)–H(19B)

109,5

C(21)–C(22)–H(22A)

109,2

N(2)–C(19)–H(19C)

109,5

N(3)–C(22)–H(22B)

109,2

43

HU 005 812 T2

8. táblázat (folytatás) H(19A)–C(19)–H(19C)

109,5

C(21)–C(22)–H(22B)

109,2

H(19B)–C(19)–H(19C)

109,5

H(22A)–C(22)–H(22B)

107,9

C(14)–C(15)–C(16)

117,7(3)

C(9)–C(8)–C(7)

120,4(3)

C(14)–C(15)–H(15)

121,1

C(9)–C(8)–H(8)

119,8

C(16)–C(15)–H(15)

121,1

C(7)–C(8)–H(8)

119,8

F(3)–C(21)–C(22)

108,3(2)

N(3)–C(23)–C(24)

F(3)–C(21)–C(20)

111,3(2)

N(3)–C(23)–H(23A)

C(22)–C(21)–C(20)

111,3(2) 109,4

110,4(2)

C(24)–C(23)–H(23A)

109,4

F(3)–C(21)–H(21)

109,0

N(3)–C(23)–H(23B)

109,4

C(22)–C(21)–H(21)

109,0

C(24)–C(23)–H(23B)

109,4

109,0

H(23A)–C(23)–H(23B)

108,0

C(20)–C(21)–H(21) F(2)–C(16)–C(15)

119,6(3)

F(2)–C(16)–C(17)

117,7(3)

C(15)–C(16)–C(17)

122,8(3)

C(7)–C(6)–C(11)

117,3(3)

C(7)–C(6)–C(1)

122,9(2)

C(11)–C(6)–C(1)

119,7(2)

F(1)–C(13)–C(14)

117,6(3)

F(1)–C(13)–C(12)

118,8(3)

C(14)–C(13)–C(12)

123,6(3)

C(15)–C(14)–C(13)

119,9(3)

C(15)–C(14)–H(14)

120,0

C(13)–C(14)–H(14)

120,0

C(6)–C(7)–C(8)

121,5(3)

C(6)–C(7)–H(7)

119,3

C(8)–C(7)–H(7)

119,3

9. táblázat Anizotrop kiszorítási paraméterek (Å2×103) a 3–1 képletû vegyület esetén. Az anizotrop kiszorítási faktor kitevõ a következõkbõl adódik: –2pi2 [h2a*2U11+…+2hka*b*U12]

C(5)

U11

U22

U33

52(2)

57(2)

50(2)

U23

2(1)

U13

U12

4(1)

–5(1)

C(25)

53(2)

89(3)

136(3)

38(3)

3(2)

21(2)

O(2)

43(1)

33(1)

75(1)

13(1)

–4(1)

0(1)

F(3)

58(1)

57(1)

109(1)

18(1)

–2(1)

–15(1)

F(1)

65(1)

68(1)

86(1)

5(1)

–14(1)

19(1)

O(1)

63(1)

58(1)

69(1)

21(1)

9(1)

–6(1)

C(18)

42(1)

32(1)

42(1)

1(1)

–2(1)

2(1)

C(1)

35(1)

38(1)

50(1)

4(1)

2(1)

1(1)

N(1)

39(1)

28(1)

55(1)

4(1)

–2(1)

3(1)

C(12)

60(2)

35(1)

36(1)

2(1)

6(1)

12(1)

C(20)

41(1)

36(1)

43(1)

8(1)

2(1)

4(1)

N(2)

41(1)

35(1)

50(1)

9(1)

4(1)

4(1)

F(2)

144(2)

40(1)

131(2)

–4(1)

–27(2)

–12(1)

C(4)

45(1)

30(1)

74(2)

6(1)

–6(1)

3(1)

C(17)

69(2)

37(1)

53(2)

2(1)

3(2)

9(1)

44

HU 005 812 T2

9. táblázat (folytatás) U11

U22

U33

U23

U13

U12

C(2)

41(1)

41(1)

50(1)

–2(1)

–1(1)

9(1)

C(11)

49(2)

51(2)

58(2)

5(1)

–6(1)

0(1)

C(24)

55(2)

44(1)

58(2)

–3(1)

–2(1)

5(1)

C(3)

49(1)

39(1)

38(1)

2(1)

5(1)

9(1)

N(3)

40(1)

58(1)

82(2)

20(1)

9(1)

13(1)

C(19)

53(2)

49(2)

73(2)

24(1)

10(2)

7(1)

C(15)

127(3)

38(2)

68(2)

1(2)

–3(2)

25(2)

C(21)

46(1)

51(2)

58(2)

–6(1)

–1(1)

–1(1)

C(16)

105(3)

35(1)

65(2)

–2(1)

–5(2)

3(2)

C(6)

40(1)

33(1)

48(1)

7(1)

–2(1)

6(1)

C(13)

67(2)

53(2)

47(2)

0(1)

4(1)

19(2)

C(14)

99(3)

53(2)

62(2)

4(2)

–6(2)

35(2)

C(7)

51(2)

66(2)

56(2)

–8(2)

1(1)

5(2)

C(10)

61(2)

55(2)

75(2)

0(2)

–21(2)

–6(2)

C(9)

82(2)

61(2)

67(2)

–18(2)

–23(2)

14(2)

C(22)

43(2)

81(2)

67(2)

12(2)

–6(1)

–3(2)

C(8)

75(2)

83(2)

63(2)

–19(2)

0(2)

21(2)

C(23)

65(2)

42(1)

83(2)

3(2)

8(2)

12(2)

10. táblázat Hidrogénkoordináták (×104) és izotrop kiszorítási paraméterek (Å2×103) a 3–1 képletû vegyület esetén x

y

H(5A)

–1881

6 648

z

U(eq)

2493

64

H(5B)

–3096

6 408

2114

64

H(25A)

4878

2 968

2458

139

H(25B)

5963

3 742

2246

139

H(25C)

5495

2 810

1674

139

H(1)

–1483

4 815

2120

95

H(20)

1926

5 057

2045

48

H(4A)

287

8 479

1116

60

H(4B)

–61

8 355

1977

60

H(17)

–13

10 353

1669

64

H(2)

–3046

8 007

1077

53

H(11)

–3743

5 520

1006

63

H(24A)

3051

4 959

637

62

H(24B)

1951

4 208

863

62

H(19A)

1181

7 275

435

88

H(19B)

2463

6 789

492

88

H(19C)

2087

7 865

980

88

H(15)

–1730

13 206

983

93

H(21)

3171

6 536

2395

62

H(14)

–3273

12 049

597

85

H(7)

–572

5 933

100

69

H(10)

–4268

4 360

9

76

H(9)

–2970

3 989

–950

84

45

1

HU 005 812 T2

2

10. táblázat (folytatás) x

y

z

U(eq)

H(22A)

4894

5 438

2487

77

H(22B)

3787

4 700

2707

77

H(8)

–1106

4 760

–890

88

H(23A)

3028

3 288

1812

76

H(23B)

3677

3 120

1038

76

4. reakcióvázlat

4–1

2–3 enantiomerje

1–9

4–2

(2S)-4¹(2,5-Difluor-fenil)-N-[(3S,4R)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N-metil-2-fenil-2,5dihidro-1H-pirrol-1-karboxamid (4–2) Ezt a vegyületet a 3–1 képletû vegyület szerinti módon állítottuk elõ azzal az eltéréssel, hogy a királis oszlopról elõször eluálódó 2–3 képletû enantiomer alkalmazását, amint ez a 2. reakcióvázlat 3. lépésében történik,

kihagytuk. A 4–2 képletû vegyület adatai: 1H–NMR 40 (500 MHz, CDCl3) d 7,4–7,2 (m, 5H), 7,1–6,9 (m, 3H), 6,3 (s, 1H), 5,4 (bs, 1H), 5,2 (d, 1H), 4,9 (m, 1H), 4,6 (m, 1H), 4,4 (m, 1H), 4,0 (m, 1H), 3,8 (m, 1H), 3,2 (s, 3H), 3,0 (m, 1H), 2,5–2,2 (m, 3H), 2,4 (s, 3H), 1,8–1,6 (m, 2H) ppm HRMS (ES) M+H a C25H28F3N3O2 összeg45 képlet alapján számított: 460,2207. Talált: 460,2229.

5. reakcióvázlat

2–2a transz-izomerjeinek keveréke

46

5–1

5–2

1

HU 005 812 T2

2

5–1

1–9

5–3

5–4

1–9

(2S)-4¹(2,5-Difluor-fenil)-N-[(3R,4R)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N-metil-2-fenil-2,5dihidro-1H-pirrol-1-karboxamid (5–3) Ezt a vegyületet a 3–1 képletû vegyület elõállításánál ismertetett módon állítottuk elõ, azzal az eltéréssel, hogy ebben a szintézisben a 2–2a képletû vegyület transz-izomerjét alkalmaztuk. A 2–3 képletû transz-izomer enantiomerjeinek rezolválását kromatográfiásan végeztük Chiralpak AD © 10×50 cm¹es oszlopon 15%¹os hexános etanollal (0,1% dietil-aminnal) 150 ml/perc átfolyási sebességgel. A 4×250 mm Chiralpak AD® oszlopról 15%¹os hexános etanollal (0,1% dietil-aminnal) 1 ml/perc sebességgel kapott eluens analitikai HPLC elemzése azt mutatta, hogy az elsõként eluálódó enantiomer Rt értéke 7,30 perc, és a másodikként eluálódó enantiomeré Rt=11,59 perc. Az elsõként eluálódott enantiomert (amelynek abszolút sztereokémiai szerkezetét nem ismerjük) tovább feldolgoztuk, így az 5–1 képletû transz-amint kaptuk, amelyet az 5–3 képletû vegyület szintézisében alkalmaztunk, a 2. reakcióvázlatnál ismertetett reakcióúttal azonos módon. Az 5–3 képletû vegyület adatai: 1H–NMR (500 MHz, CDCl ) d 7,4–7,2 (m, 5H), 7,1–6,9 3 (m, 3H), 6,3 (s, 1H), 5,0–4,7 (m, 4H), 4,5 (m, 1H), 4,0

(m, 1H), 3,8 (m, 1H), 3,3 (m, 1H), 2,9 (s, 3H), 2,85 (m, 1H), 2,35 (s, 3H), 2,2–1,9 (m, 3H), 1,7 (m, 1H) ppm. HRMS (ES) M+H a C25H28F3N3O2 összegképlet alap40 ján számított: 460,2207. Talált: 460,2231. Az 5–3 és 5–4 képletû vegyületek piperidinrészének abszolút sztereokémiai szerkezetét nem határoztuk meg, a jelzett sztereokémiai szerkezetet kísérletképpen rendeltük hozzá: 45 (2S)-4¹(2,5-Difluor-fenil)-N-[(3S,4S)3-fluor-1-metil-piperidin4¹il]-2-(hidroxi-metil)-Nmetil-2-fenil-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-karboxamid (5–4) 50 Ezt a vegyületet az 5–3 képletû vegyülettel azonos módon állítottuk elõ, azzal az eltéréssel, hogy a királis oszlopról származó másodikként eluálódott transz2–3 vegyület izomerjét alkalmaztuk. Az 5–4 képletû vegyület adatai: 1H–NMR (500 MHz, CDCl3) d 7,4–7,2 55 (m, 5H), 7,1–6,9 (m, 3H), 6,3 (s, 1H), 5,4 (m, 1H), 4,9–4,6 (m, 3H), 4,4 (m, 1H), 4,0 (m, 1H), 3,85 (m, 1H), 3,25 (m, 1H), 3,0 (s, 3H), 2,85 (m, 1H), 2,35 (s, 3H), 2,2–1,9 (m, 4H) ppm. HRMS (ES) M+H a C 25 H 28 F 3 N 3 O 2 összegképlet alapján számított: 60 460,2207. Talált: 460,2229. 47

1

HU 005 812 T2

2

6. reakcióvázlat

6–1

6–2

6–4

6–3

6–5

6–6 1. lépés: (2S,4S)-terc-Butil-4-hidroxi-2-fenilpirrolidin-1-karboxilát (6–2) Egy lánggal szárított, keverõvel felszerelt lombikba bemértünk terc-butil-(2S,4S)-4-{[terc-butil-(dimetil)-szilil]-oxi}-2-fenil-pirrolidin-1-karboxilátot [6–1 képletû vegyület, (5)¹(–)-4-klór-3-hidroxi-butironitrilbõl elõállítva a következõ irodalmi helyen ismertetett módon: Maeda, et al Synlett 2001, 1808–1810, 7,8 g, 20,7 mmol] és vízmentes acetonitrilt (20,0 ml). A kapott oldatot keverés közben nitrogénatmoszférában trietail-amin-trihidrofluoriddal kezeltük (10,1 ml, 62,0 mmol). A reakcióelegyet 12 óra hosszat 40 °C¹on kevertük. Ezután az elegyet 100 ml etil-acetáttal hígítottuk, és 5%¹os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldatba öntöttük. A gázképzõdés megszûnése után a szerves fázist további 3×5%¹os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal mostuk. A szerves fázist magnézium-szulfáton szárítottuk, szûrtük és bepároltuk, így a nyersterméket kaptuk. Átkristályosítást végeztünk etil-acetát és hexánok elegyébõl, így a 6–2 képletû (2S,4S)-terc-butil-4-hidroxi-2fenil-pirrolidin-1-karboxilátot fehér kristályos szilárd anyag formájában kaptuk. 1H–NMR (300 MHz, CDCl3) rotamerek d 7,38–7,18 (m, 5H), 4,90 (m, 1H), 4,42 (m, 1H), 3,88 (m, 1H), 3,56 (dd, J=11,5, 4,0 Hz, 1H), 2,60 (m, 1H), 2,03 (m, 1H), 1,50 és 1,20 (széles s, 9H); MS 208,0 talált 208,1 [M–C(CH3)3] required. 2. lépés: (2S)-terc-Butil-4-oxo-2-fenil-pirrolidin-1karboxilát (6–3) Egy lánggal szárított és keverõrúddal ellátott lombikba bemértünk 150 ml vízmentes diklór-metánt, és –78 °C¹ra lehûtöttük. Ezután egymás után hozzáadtunk 3,8 ml (44 mmol) oxanil-kloridot és 4,8 ml (60 mmol) DMSO¹t és az elegyet 10 percig kevertük.

Ezután cseppenként hozzáadtuk 2,28 g (8,73 mmol) 6–2 képletû (2S,4S)-terc-butil-4-hidroxi-2-fenil-pirrolidin-1-karboxilát 10 ml vízmentes diklór-metánnal ké30 szült oldatát, és az elegyet –78 °C¹on 1 óra hosszat kevertük. Ezután hozzáadtunk 12 ml (87 mmol) trietilamint, és a reakciót 1 óra alatt 0 °C¹ra melegítettük. Miután a reakció végbement, az elegyet 5%¹os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és konyhasóoldattal 35 mostuk, majd magnézium-szulfáton szárítottuk. A szerves fázist bepároltuk, így a nyers 6–3 képletû (2S)-tercbutil-4-oxo-2-fenil-pirrolidin-1-karboxilátot kaptuk. Átkristályosítást végeztünk etil-acetát és hexánok elegyébõl. 1H–NMR (300 MHz, CDCl3) d 7,35 (m, 3H), 7,17 40 (m, 2H), 5,38 (m, 1H), 4,08 (d, J=19,5 Hz, 1H), 3,90 (d, J=19,3 Hz, 1H), 3,13 (dd, J=18,8, 9,8 Hz, 1H), 2,58 (dd, J=18,6, 2,4 Hz, 1H), 1,40 (széles s, 9H); MS 206,0 kapott, 206,1 [M–C(CH3)3] számított. 45

3. lépés: (2S)-terc-Butil-2-fenil-4-{[(trifluor-metil)szulfonil]-oxi}-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-karboxilát (6–4) Egy lánggal szárított és keverõrúddal ellátott lombikba bemérünk 0,16 g (0,62 mmol) 6–3 képletû (2S)50 terc-butil-4-oxo-2-fenil-pirrolidin-1-karboxilátot és 2 ml vízmentes THF¹et. A kapott oldatot –78 °C¹ra lehûtöttük, és cseppenként hozzáadtunk 0,68 ml (0,68 mmol) 1 M THF¹es lítium-hexametil-diszilil-amidot (LHMDS). A reakcióelegyet 1 óra hosszat –78 °C¹on kevertük, 55 majd egyetlen részletben tisztán hozzáadtunk 0,27 g (0,68 mmol) N¹(5¹klór-piridin-2¹il)-1,1,1-trifluor-N-[(trifluor-metil)-szulfonil]-metánszulfonamidot. A reakcióelegyet hagytuk 0 °C¹ra melegedni, és összesen 4 óra hosszat kevertük. Ezután az elegyet 10 ml dietil-éterrel 60 hígítottuk, és egymás után 10 ml vízzel és 10 ml kony48

1

HU 005 812 T2

hasóoldattal mostuk. A szerves fázist magnézium-szulfáton szárítottuk, szûrtük és bepároltuk. A kapott nyers maradékot gyors oszlopkromatográfiával tisztítottuk (eluálószer 0–20% etil-acetát/hexánok gradiens, 15 perc), így a 6–4 képletû (2S)-terc-butil-2-fenil-4{[(trifluor-metil)-szulfonil]-oxi}-2,5-dihidro-1H-pirrol-1karboxilátot kaptuk. 1H–NMR (300 MHz, CDCl3) nagyobb rotamer: d 7,30 (m, 5H), 5,72 (m, 1H), 5,48 (m, 1H), 4,42 (m, 2H), 1,18 (s, 9H); MS 379,0 talált 379,1 (M–CH3) számított. 4. lépés: (2S)-4¹(2,5-Difluor-fenil)-2-fenil¹N,Ndimetil-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-karboxamid (6–5) Egy lánggal szárított és keverõrúddal ellátott lombikba bemértünk 0,250 g (0,636 mmol) 6–4 képletû (2S)-terc-butil-2-fenil-4-{[(trifluor-metil)-szulfonil]-oxi}2,5-dihidro-1H-pirrol-1-karboxilátot, 0,251 g (1,59 mmol 2,5-difluor-fenil-bórsavat, 0,202 g (1,91 mmol) nátriumkarbonátot és 0,80 g (1,91 mmol) lítium-kloridot. A szilárd anyagokat DME és víz 4:1 arányú elegyének 20 ml¹ével feloldottuk és nitrogénnel gázmentesítettük. Hozzáadtunk 0,037 g (0,032 mmol) Pd(PPh3)4¹t, és a reakcióelegyet nitrogénnel lezártuk, és 2 óra hosszat 90 °C¹on hevítettük. Miután a reakció végbement, a reakcióelegyet 5%¹os vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldat és etil-acetát (3×50 ml) között megosztottuk, az egyesített szerves fázisokat magnézium-szulfáton szárítottuk. Szûrés után a szerves fázist bepároltuk, és gyors oszlopkromatográfiával tisztítottuk (SiO2, 0–20% etil-acetát/hexánok gradiens), így a 6–5 képletû (2S)-

2

terc-butil 4¹(2,5-difluor-fenil)-2-fenil-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-karboxilátot kaptuk.

5

10

15

20

25

30

5. lépés: 1¹{[(2S)-4¹(2,5-Difluor-fenil)-2-fenil-2,5dihidro-1H-pirrol-1¹il]-karbonil}-3-metil-1H-imidazol3-ium (6–6) Egy lánggal szárított és keverõrúddal ellátott lombikba nitrogénatmoszférában bemértünk 0,63 g (1,75 mmol) 6–5 képletû vegyületet és 10 ml vízmentes diklór-metánt. A kapott oldatot 5 ml trifluor-ecetsavval kezeltük, és 1,5 óra hosszat 25 °C¹on kevertük. Miután a reakció végbement, az elegyet bepároltuk, 50 ml diklór-metánnal felvettük, és 50 ml 5%¹os nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal mostuk. A szerves fázist magnézium-szulfáton szárítottuk, szûrtük és csökkentett nyomáson bepároltuk. A kapott szabad amint 10 ml vízmentes THF-ben feloldottuk, és 0,31 g (1,93 mmol) karbonil-diimidazollal kezeltük. A kapott oldatot 4 óra hosszat visszafolyató hûtõ alatt forraltuk, amíg a reakció végbe nem ment. Ezután a reakcióelegyet bepároltuk, 50 ml etil-acetáttal felvettük, és vízzel, majd konyhasóoldattal mostuk. Az egyesített szerves fázisokat magnézium-szulfáton szárítottuk és bepároltuk. A nyers acil-imidazolt vízmentes metil-cianidban feloldottuk, és 2,2 ml (36 mmol) metil-jodiddal kezeltük. A kapott oldatot egy éjszakán át 25 °C¹on kevertük. Miután a reakció végbement, a reakcióelegyet bepároltuk, így a 6¹6 képletû vegyületet narancsszínû szilárd anyag formájában kaptuk. LRMS m/z (M+H) 365,9 kapott, 366,1 számított.

7. reakcióvázlat

2–5

6–6

(2S)-4¹(2,5-Difluor-fenil)-N-[(3R,4S)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-N-metil-2-fenil-2,5-dihidro-1H-pirrol-1karboxamid (7–1) 75 mg (0,15 mmol) 6–6 képletû vegyület 1 ml THFfel készült oldatához hozzáadtunk 40 mg (0,18 mmol) 2–5 képletû amin bisz-hidrokloridsóját és 106 ml (0,76 mmol) trietil-amint. Miután a reakcióelegyet 72 óra hosszat szobahõmérsékleten kevertük, diklórmetán és telített vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldat

7–1

között megosztottuk, a szerves fázist konyhasóoldattal mostuk, magnézium-szulfáton szárítottuk, és filmbepárlóban bepároltuk. A kapott maradékot szilikagélen 55 kromatográfiásan tisztítottuk, eluálószerként kloroform, etil-acetát és metanol 80:10:10 térfogatarányú elegyét használtuk, így a 7–1 képletû vegyületet kaptuk fehér szilárd anyag formájában. A 7–1 képletû vegyület adatai: HRMS (ES) M+H a C24H26F3N3O összegképlet 60 alapján számított: 430,2101. Talált: 430,2116. 49

1

HU 005 812 T2

2

5 (7–3)

(7–2)

10

(2S)-4¹(2,5-Difluor-fenil)-N-[(3S,4R)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-N-metil-2-fenil-2,5-dihidro-1H-pirrol-1karboxamid (7–2) Ezt a vegyületet a 7–1 képletû vegyület elõállításával analóg módon állítottuk elõ, kiindulási anyagként a 4–1 képletû vegyületet használtuk. A 7–2 képletû vegyület adatai: HRMS (ES) M+H a C 24 H 26 F 3 N 3 O összegképlet alapján számított: 430,2101. Talált: 430,2119.

R1

(2S)-4¹(2,5-Difluor-fenil)-N-[(3R,4R)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-N-metil-2-fenil-2,5-dihidro-1H-pirrol-1karboxamid (7–3) Ezt a vegyületet a 7–1 képletû vegyület elõállításával 15 analóg módon állítottuk elõ, kiindulási anyagként az 5–1 képletû vegyületet használtuk. A 7–3 képletû vegyület adatai: HRMS (ES) M+H a C24H26F3N3O összegképlet alapján számított: 430,2101. Talált: 430,2115. 20 A 7–3 képletû vegyület piperidinrészletének abszolút sztereokémiai szerkezetét nem határoztuk meg, a jelzett sztereokémiai szerkezetet kísérlet jelleggel jelöltük. A következõ vegyületeket az 1–7. és G–N. reakcióvázlatokon bemutatott eljárások egyszerû módosításával 25 állítottuk elõ, a megfelelõ szubsztituált reagensek alkalmazásával a reakcióvázlatokon bemutatottak helyett.

R2

R3

R4

R5

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

50

HU 005 812 T2

Táblázat (folytatás) R1

Me

R2

R3

R4

R5

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

Me

Me

F

H

51

HU 005 812 T2

Táblázat (folytatás) R1

R2

R3

R4

R5

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

52

HU 005 812 T2

Táblázat (folytatás) R1

R2

R3

R4

R5

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

53

HU 005 812 T2

Táblázat (folytatás) R1

R2

Me

R3

R4

R5

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

Me

Cl

H

Me

CH2OH

Me

Br

H

Me

CH2OH

Me

CN

H

Me

CH2OH

Me

Me

H

Me

CH2OH

Me

CF3

H

Me

CH2OH

Me

NO2

H

Me

CH2OH

Me

F

OH

Me

CH2OH

Me

F

NH2

Me

CH2OH

Me

F

F

Me

CH2OH

Me

F

SH

8. reakcióvázlat

8–1

8–2

8–4

8–3

8–5

8–4 8–6a 54

8–6b

1

HU 005 812 T2

Benzil-4-[(terc-butoxi-karbonil)-(metil)-amino]-2(hidroxi-metil)-piperidin-1-karboxilát (8–2) 2,0 g (6,8 mmol) 8–1 képletû vegyület (amelyet a következõ irodalmi helyen ismertettek: S. J. Hayes, T. C. Malone, G. Johnson J. Org. Chem. 1991, 56,4084–4086) 100 ml diklór-metánnal készült oldatához hozzáadtunk 3,33 ml (23,9 mmol) trietil-amint, majd cseppenként 2,44 g (15,4 mmol) SO3-piridin 50 ml DMSO-val készült oldatát. Miután 5 óra hosszat szobahõmérsékleten kevertük, a reakcióelegyet diklórmetán és víz között megosztottuk, a fázisokat elválasztottuk, 2×1 M sósavval, telített vizes nátrium-hidrogénkarbonát-oldattal, konyhasóoldattal mostuk, magnézium-szulfáton szárítottuk és bepároltuk, így a ketont kaptuk. 2,1 g (7,2 mmol) ilyen keton 35 ml metanollal készült oldatához hozzáadtunk 1 ml ecetsavat és 14,4 ml (28,9 mmol) 2 M metanolos metil-amin-oldatot. Miután 1 óra hosszat kevertük, 910 mg (14,4 mmol) nátrium-ciano-bór-hidrid 5 ml metanollal készült oldatát adtuk hozzák és egy éjszakán át kevertük. Ezután az elegyet telített vizes ammónium-kloriddal vegyítettük, diklór-metánnal extraháltuk, nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, vízzel és konyhasóoldattal mostuk, magnézium-szulfáton szárítottuk és bepároltuk, így 2,0 g (7,2 mmol) amint kaptunk. Ezt az anyagot feloldottuk 25 ml diklór-metánban, hozzáadtunk 1,78 g (8,2 mmol) di¹terc-butil-dikarbonátot és 1,8 ml (12,9 mmol) trietilamint, és a kapott elegyet 72 óra hosszat kevertük. Ezután a reakcióelegyet diklór-metán és telített vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldat között megosztottuk, elválasztottuk, vízzel és konyhasóoldattal mostuk, magnézium-szulfáton szárítottuk és bepároltuk. A maradékot szilikagél oszlopon kromatográfiásan tisztítottuk, eluálószerként etil-acetát és hexánok elegyét használtuk, így 1,85 g (4,6 mmol) diasztereomerelegyet kaptunk. Ezt feloldottuk 20 ml THF és 1 ml metanol elegyében, 0 °C¹ra lehûtöttük és hozzáadtunk 496 mg (22,8 mmol) lítium-bór-hidridet. Miután szobahõmérsékletre felmelegítettük és egy éjszakán át kevertük, a reakcióelegyet telített vizes ammónium-klorid-oldattal hígítottuk, etil-acetáttal extraháltuk, vízzel és konyhasóoldattal mostuk, magnézium-szulfáton szárítottuk és bepároltuk, így a 8–2 képletû vegyületet kaptuk színtelen gumiszerû anyag formájában. A 8–2 képletû vegyület adatai: LRMS (ES) M+H a C20H30N2O5 összegképlet alapján számított: 379. Talált: 379. terc-Butil-[2¹(hidroxi-metil-1-metil-piperidin-4¹il]metil-karbamát (8–3) 1,08 g (2,9 mmol) 8–2 képletû vegyület 30 ml etanollal készült oldatához hozzáadtunk 7 ml (74 mmol) 1,4-ciklohexadiént és katalitikus mennyiségû 10%¹os szénhordozós palládiumot. Miután egy éjszakán át kevertük, a reakcióelegyet celiten leszûrtük, filmbepárlóban bepároltuk, és 25 ml metanolban oldottuk. Ehhez hozzáadtunk 2 ml ecetsavat és 700 ml (8,6 mmol) 37%¹os vizes formaldehidet. Miután egy éjszakán át kevertük, hozzáadtuk 540 mg (8,6 mmol) nátrium-ciano-bór-hidrid 5 ml metanollal készült oldatát, és a reakcióelegyet további 1 óra hosszat kevertük. Ezután az

5

2

oldószereket filmbepárlóban eltávolítottuk, a maradékot etil-acetát és vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldat között megosztottuk, a szerves fázist konyhasóoldattal mostuk, nátrium-szulfáton szárítottuk és bepároltuk. A maradékot diklór-metánnal felvettük, szûrtük és bepároltuk, így a 8–3 képletû vegyületet kaptuk színtelen olaj formájában. A 8–3 képletû vegyület adatai: LRMS (ES) M+H a C13H26N2O3 összegképlet alapján számított: 259. Talált: 259.

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60 55

terc-Butil-[2¹(fluor-metil)-1-metil-piperidin-4¹il]-metilkarbamát (8–4) és terc-butil-(6¹fluor-1-metilazepan-4¹il)-metil-karbamát (8–5) 350 ml (2,6 mmol) (dietil-amino)-kén-trifluorid (DAST) 15 ml diklór-metánnal készült oldatához –78 °C¹on hozzáadtuk 520 mg (2,0 mmol) 8–3 képletû vegyület 5 ml diklór-metánnal készült oldatát. A reakcióelegyet hagytuk lassan szobahõmérsékletre melegedni, miközben egy éjszakán át kevertük, és ezután jeges vízzel hígítottuk. Az elegyet további diklór-metánnal és kis mennyiségû 3 N kálium-hidroxiddal megosztottuk, a szerves fázist vízzel mostuk, nátrium-szulfáton szárítottuk és bepároltuk. A maradékot szilikagél oszlopra töltöttük, és etil-acetáttal, majd etanol, ammónium-hidroxid és víz 20:1:1 térfogatarányú elegyével eluáltuk. Az elsõként eluálódó termék a 8–5 gyûrûnagyobbított termék volt színtelen olaj formájában, a másodikként eluálódó termék pedig a 8–4 képletû vegyület színtelen olaj formájában. Mind a 8–5 mind a 8–4 képletû vegyületet a transz-diasztereomerek enantiomer elegye formájában izoláltuk. A szerkezeteket extenzív 1D és 2D NMR-spektroszkópiával ellenõriztük. A 8–5 képletû vegyület adatai: 1 H–NMR (600 MHz, CD2Cl2) d 4,75 (m, 1H), 4,1–3,9 (m, 1H), 2,9–2,7 (m, 3H), 2,75 (s, 3H), 2,4 (s, 3H), 2,35 (m, 1H), 2,1–1,7 (m, 4H), 1,4 (s, 9H) ppm. A 8–4 képletû vegyület adatai: 1 H–NMR (500 MHz, CD 2 Cl 2 ) d 4,8–4,5 (m, 2H), 4,1–4,0 (m, 1H), 3,2 (m, 1H), 2,75 (m, 2H), 2,7 (s, 3H), 2,45 (s, 3H), 1,9–1,5 (m, 4H), 1,45 (s, 9H) ppm. (2S)-4¹(2,5-Difluor-fenil)-N-[(2R,4R)-2-(fluor-metil)1-metil-piperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N-metil-2fenil-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-karboxamid (8–6a) és (2S)¹(2,5-difluor-fenil)-N-(2S,4S)-2-(fluor-metil)-1metil-piperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N-metil-2-fenil2,5-dihidro-1H-pirrol-1-karboxamid (8–6b) 80 mg (0,31 mmol) 8–4 képletû vegyület 30 ml etilacetáttal készült oldatát sósavgázzal telítettük, és 1 óra hosszat szobahõmérsékleten kevertük. Ezután a reakcióelegyet filmbepárlóban bepároltuk, és a kapott fehér szilárd anyagot 1 ml THF-ben szuszpendáltuk. Ehhez hozzáadtunk 156 mg (0,34 mmol) 1–9 képletû vegyületet, 268 ml (1,54 mmol) diizopropil-etil-amint és katalitikus mennyiségû DMAP¹t. Miután egy éjszakán át 50 °C¹on melegítettük, hozzáadtunk 500 ml trifluorecetsavat, és a keverést további 1 óra hosszat folytattuk szobahõmérsékleten, majd telített vizes nátriumhidrogén-karbonát-oldattal hígítottuk. Az elegyet diklór-metánnal megosztottuk, a szerves fázist konyha-

1

HU 005 812 T2

sóoldattal mostuk, magnézium-szulfáton szárítottuk és bepároltuk. A maradékot szilikagél oszlopra töltöttük, és kloroformmal, majd kloroform, etil-acetát és metanol 80:10:10 arányú elegyével eluáltuk, így a 8–6a és 8–6b képletû vegyületek el nem választható keverékét kaptuk színtelen gumiszerû anyag formájában. A 8–6a/8–6b képletû vegyületek adatai: HRMS (ES)

R1

5

2

M+H a C26H30F3N3O2 összegképlet alapján számított: 474,2363. Talált: 474,2374. A következõ vegyületeket az 1–8 és G–N. reakcióvázlatokon bemutatott eljárások egyszerû módosításai útján állítottuk elõ, azonban a reakcióvázlatokon bemutatott reagenseket a megfelelõ szubsztituált reagensekkel helyettesítettük.

R2

R3

R4

R5

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

56

HU 005 812 T2

Táblázat (folytatás) R1

R2

R3

R4

R5

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

57

HU 005 812 T2

Táblázat (folytatás) R1

R2

R3

R4

R5

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

58

HU 005 812 T2

Táblázat (folytatás) R1

R2

R3

R4

R5

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

Me

Cl

H

Me

CH2OH

Me

Br

H

Me

CH2OH

Me

CN

H

Me

CH2OH

Me

Me

H

Me

CH2OH

Me

CF3

H

Me

CH2OH

Me

NO2

H

Me

CH2OH

Me

F

OH

Me

CH2OH

Me

F

NH2

59

1

HU 005 812 T2

2

Táblázat (folytatás) R1

R2

R3

R4

R5

Me

CH2OH

Me

F

F

Me

CH2OH

Me

F

SH

9. reakcióvázlat

3–1

9–1

(2S)-4¹(2,5-Difluor-fenil)-N-[(3R,4S)-3-fluor-1-metil1-oxi-dopiperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N-metil-2fenil-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-karboxamid (9–1) 20 mg (0,044 mmol) 3–1 képletû vegyület 1 ml diklór-metánnal készült oldatához 0 °C¹on hozzáadtunk 11 mg (0,048 mmol) mCPBA¹t. A jeges fürdõt eltávolítottuk, és a reakcióelegyet 30 percig kevertük. Azután az elegyet etanol és telített vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldat között megosztottuk, elválasztottuk, vízzel és konyhasóoldattal mostuk, nátrium-szulfáton szárítottuk és filmbepárlóban bepároltuk. A maradékot szili-

kagél oszlopra töltöttük, és etil-acetáttal, majd metanol, ammónium-hidroxid és víz 20:1:1 térfogatarányú elegyével eluáltuk, így a 9–1 képletû vegyületet kaptuk fehér hab formájában. A 9–1 képletû vegyület adatai: 25 1H–NMR (500 MHz, CDCl3) d 7,4–7,2 (m, 5H), 7,1–6,9 (m, 3H), 6,25 (s, 1H), 5,0–4,9 (m, 2H), 4,7 (m, 1H), 4,5 (m, 1H). 4,3–4,2 (m, 1H), 4,0 (m, 2H), 3,7 (m, 1H), 3,4–3,3 (m, 2H), 3,3 (s, 3H), 3,2 (s, 3H), 2,5–1,9 (bs, 2H), 1,8 (m, 1H) ppm. HRMS (ES) M+H a 30 C 25 H 28 F 3 N 3 O 3 összegképlet alapján számított: 476,2156. Talált: 476,2165.

10. reakcióvázlat

10–1

2–3

1–9

10–2

60

1

HU 005 812 T2

1. lépés: Benzil-(3R,4S)-4-[{[(2S)-4¹(2,5-difluorfenil)-2-(hidroxi-metil)-2-fenil-2,5-dihidro-1H-pirrol1¹il]-karbonil}-(metil)-amino]-3-fluor-piperidin-1karboxilát (10–1) 885 mg (2,4 mmol) 2–3 képletû vegyület (a kromatográfiában elsõként eluálódó izomer) 12 ml etil-acetáttal készült oldatához 0 °C¹on hozzáadtunk 12 ml (48 mmol) 4 M dioxános sósavoldatot. A jeges fürdõt eltávolítottuk, és a keverést 2 óra hosszat folytattuk, majd az illékony komponenseket filmbepárlóban eltávolítottuk. A maradékot etil-acetát és 5 ml 1 M nátrium-hidroxidot tartalmazó telített vizes nátrium-karbonát között megosztottuk, a vizes fázist etil-acetáttal kétszer extraháltuk. Az egyesített szerves extraktumokat nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal és konyhasóoldattal újra mostuk, nátrium-szulfáton szárítottuk és bepároltuk, így 590 mg (2,2 mmol) amint kaptunk. 215 mg (0,81 mmol) ilyen anyag 5 ml THF-fel készült oldatához hozzáadtunk 340 mg was added 340 mg (0,73 mmol) 1–9 képletû vegyületet, 306 ml (2,2 mmol) trietil-amint és katalitikus mennyiségû DMAP¹t. Miután egy éjszakán át kevertük, a LC/MS elemzéssel úgy találtuk, hogy a reakció csak 40%-ban ment végbe, ezért további DMAP¹t adagoltunk, és a keverést egy éjszakán át tovább folytattuk. Ezután a reakcióelegyet etil-acetát és telített vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldat között megosztottuk, a szerves fázist nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, vízzel és konyhasóoldattal mostuk, nátrium-szulfáton szárítottuk és bepároltuk. A maradékot szilikagélen kromatográfiásan tisztítottuk, eluálószerként etil-acetát és hexánok elegyét használtuk, így a 10–1 képletû vegyületet kaptuk színtelen olaj formájában. A 10–1 képletû vegyület adatai: MS (ES) M+H a C38H46F3N3O4Si összegképlet alapján számított: 694,4. Talált: 694,3.

5

10

15

20

25

30

2

2. lépés: (2S)-4¹(2,5-Difluor-fenil)N-[(3R,4S)-3-fluor-piperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-Nmetil-2-fenil-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-karboxamid (10–2) 405 mg (0,58 mmol) 10–1 képletû vegyület 4 ml etanollal készült oldatához hozzáadtunk 1,38 ml (14,6 mmol) 1,4-ciklohexadiént, 100 mg 10%¹os szénhordozós palládiumot, és az elegyet egy éjszakán át kevertük. Ezután celiten leszûrtük, bepároltuk, és a maradékot 3 ml diklór-metánban feloldottuk. Ehhez hozzáadtunk 3 ml trifluor-ecetsavat, 1 óra hosszat kevertük, majd az elegyet etil-acetát és telített vizes nátrium-hidrogén-karbonátoldat+25 ml 5%¹os vizes nátrium-karbonát-oldat között megosztottuk, a szerves fázist nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, vízzel és konyhasóoldattal mostuk, nátrium-szulfáton szárítottuk, és filmbepárlóban bepároltuk. A maradékot szilikagél oszlopra töltöttük, és etil-acetáttal, majd etanol, ammónium-hidroxid és víz 20:1:1 térfogatarányú elegyében eluáltuk, így a 10–2 képletû vegyületet kaptuk fehér szilárd anyag formájában. Az 5% szennyezést késõbb reverz fázisú kromatográfiával víz és metil-cianid 95:5–5:95 térfogatarányú (mindkettõ 0,1% TFA¹t tartalmazott) elegyével eluálva eltávolítottuk. A frakciókat nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal meglúgosítottuk, így a tiszta B–2 képletû vegyületet kaptuk fehér szilárd anyag formájában. A 10–2 képletû vegyület adatai: 1H–NMR (500 MHz, CDCl ) d 7,4–7,2 (m, 5H), 7,1–6,9 3 (m, 3H), 6,3 (s, 1H), 5,2 (bs, 1H), 4,9 (m, 1H), 4,8–4,6 (m, 2H), 4,45 (m, 1H), 4,2–4,1 (m, 1H), 4,0 (m, 1H), 3,3–3,2 (m, 2H), 3,1 (s, 3H), 2,85–2,7 (m, 2H), 2,1 (m, 1H), 1,7 (m, 2H) ppm. HRMS (ES) M+H a C 24 H 26 F 3 N 3 O 2 összegképlet alapján számított: 446,2050. Talált: 446,2059.

11. reakcióvázlat

10–2 11–1

(2S)-4¹(2,5-Difluor-fenil)-N-[(3R,4S)-3-fluor-1izopropil-piperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N-metil-2fenil-2,5-dihidro-1H-pirrol-1-karboxamid (11–1) 38 mg (0,085 mmol) of 10–2 képletû vegyület 1 ml 1,2-diklór-etánnal készült oldatához hozzáadtunk 20 ml (0,34 mmol) ecetsavat, 25 ml (0,34 mmol) acetont és 27 mg (0,13 mmol) Na(OAc)3BH¹t. Miután egy éjszakán át kevertük, a reakcióelegyet etil-acetát és telített vizes nátrium-hidrogén-karbonát-oldat között megosztottuk, a szerves fázist nátrium-hidrogén-karbonát-oldattal, vízzel

és konyhasóoldattal mostuk, nátrium-szulfáton szárítottuk, és filmbepárlóban bepároltuk. A maradékot reverz fázisú kromatográfiával tisztítottuk, eluálószer víz és metil-cianid 95:5–5:95 térfogatarányú elegye (mindkettõ 55 0,1% TFA¹t tartalmazott). A frakciókat nátrium-hidrogénkarbonát-oldattal meglúgosítottuk, így a 11–1 képletû vegyületet színtelen film formájában kaptuk. A 11–1 képletû vegyület adatai: 1H–NMR (500 MHz, CDCl3) d 7,4–7,2 (m, 5H), 7,1–6,9 (m, 3H), 6,3 (s, 1H), 5,3 (m, 1H), 60 4,95–4,8 (m, 2H), 4,6 (m, 1H), 4,45 (m, 1H), 4,1–4,0 (m, 61

1

HU 005 812 T2

2H), 3,2 (m, 1H), 3,15 (s, 3H), 3,0 (m, 1H), 2,8 (m, 1H), 2,45–2,25 (m, 3H), 1,75 (m, 1H), 1,1–1,0 (m, 6H) ppm.

2

HRMS (ES) M+H a C27H32F3N3O2 összegképlet alapján számított: 488,2519. Talált: 488,2517.

12. reakcióvázlat

2–3 enantiomerje

12–1

12–2

12–3

(2S)-4¹(2,5-Difluor-fenil)-N-[(3S,4R)-3-fluorpiperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N-metil-2-fenil-2,5dihidro-1H-pirrol-1-karboxamid (12–1) Ezt a vegyületet a 10–2 képletû vegyület elõállítása szerinti módon állítottuk elõ azzal az eltéréssel, hogy kiindulási anyagként a 2–3 képletû enantiomert alkalmaztuk. A 12–1 képletû vegyület adatai: HRMS (ES) M+H a C24H26F3N3O2 összegképlet alapján számított: 446,2050. Talált: 446,2069. (2S)-4¹(2,5-Difluor-fenil)-N-[(3R,4R)-3-fluorpiperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N-metil-2-fenil-2,5dihidro-1H-pirrol-1-karboxamid (12–2) Ezt a vegyületet a 10–2 képletû vegyület elõállítása szerinti módon állítottuk elõ azzal az eltéréssel, hogy szintézisben a 2–2a képletû vegyület transz-izomerjét alkalmaztuk. A „transz-2–3” vegyület enantiomerjének rezolválását kromatográfiásan végeztük, Chiralpak

45

50

55

60

62

AD© 10×50 cm¹es oszlopon 15% etanolt tartalmazó hexánokban (0,1% dietil-aminnal) 150 ml/perc sebességgel. Az eluens analitikai HPLC elemzéssel 4×250 mm¹es Chiralpak AD® oszlopon 15% etanolt tartalmazó hexánokkal (0,1% dietil-aminnal) 1 ml/perc sebességgel eluálva azt mutatta, hogy az elsõként eluálódó enantiomer Rt=7,30 perc, míg a másodikként eluálódó enantiomer Rt=11,59 perc jellemzõt mutatott. Az elsõként eluálódó enantiomert (amelynek abszolút sztereokémiai szerkezetét nem ismertük) tovább feldolgoztuk, így a transz-amint kaptuk, amelyet a 12–2 képletû vegyület szintézisében alkalmaztunk, a 10. reakcióvázlaton bemutatottal azonos módon. A 12–2 képletû vegyület adatai: HRMS (ES) M+H a C24H26F3N3O2: 446,2050. Talált: 446,2069. A 12–1 és 12–3 képletû vegyületeken lévõ piperidincsoport abszolút sztereokémiai szerkezetét nem határoztuk meg, a sztereokémiai szerkezetet kísérleti jelleggel jelöltük.

1

HU 005 812 T2

(2S)-4¹(2,5-Difluor-fenil)-N-[(3S,4S)-3-fluorpiperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N-metil-2-fenil-2,5dihidro-1H-pirrol-1-karboxamid (12–3) Ezt a vegyületet a 10–2 képletû vegyület elõállítása szerinti módon állítottuk elõ azzal az eltéréssel, hogy a

5

2

„trans-2–3” képletû vegyület királis oszlopról másodikként eluálódó izomerjét alkalmaztuk. A 12–3 képletû vegyület adatai: HRMS (ES) M+H a C24H26F3N3O2 összegképlet alapján számított: 446,2050. Talált: 446,2068.

SZEKVENCIALISTA <110> Merck & Co., Inc. Coleman, Paul J. Cox, Christopher D. Garbaccio, Robert M. Hartman, George D. <120> MITOTIKUS KINEZIN INHIBITOROK <130> 21481Y <150> 60/495,637 <151> 2003–08–15 <150> 60/563,580 <151> 2004–04–19 <160> 2 <170> FastSEQ a Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 42 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220> <223> Teljesen szintetikus nukleotidszekvencia <400> 1

gcaacgatta atatggcgtc gcagccaaat tcgtctgcga ag

42

<210> 2 <211> 60 <212> DNS <213> Mesterséges szekvencia <220> <223> Teljesen szintetikus nukleotidszekvencia <400> 2

gcaacgctcg agtcagtgat gatggtggtg atgctgattc acttcaggct tattcaatat

63

60

1

HU 005 812 T2

SZABADALMI IGÉNYPONTOK 1. (I) általános képletû vegyület

(I)

vagy gyógyszerészetileg elfogadható sója vagy sztereoizomerje, ahol R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül: hidrogénatom vagy (C1–C6)-alkil-csoport. 2. (II) általános képletû vegyület

2

(2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3R,4R)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-N¹metil-2-fenil-2,5-dihidro-1H¹pirrol-1karboxamid, (2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(2R,4R)-2-(fluor-metil)5 1-metil-piperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil2,5-dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid, (2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(2S,4S)-2-(fluor-metil)1-metil-piperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil2,5-dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid, (2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3S,4R)-3-fluor-1-metil10 1-oxi-dopiperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil2,5-dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid, (2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3S,4R)-3-fluorpiperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil-2,515 dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid, (2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N-[(3S,4R)-3-fluor-1izopropil-piperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil2,5-dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid, (2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N-[(3S,4S)-3-fluor20 piperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil-2,5dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid, vagy ezek gyógyszerészetileg elfogadható sója. 4. Egy vegyület, amely 25

(II) 30

35

vagy gyógyszerészetileg elfogadható sója vagy sztereoizomerje, ahol R1 és R2 jelentése egymástól függetlenül: hidrogénatom vagy (C1–C6)-alkil-csoport. 3. Egy a következõk közül választott vegyület: (2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3S,4R)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil-2,5dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid, (2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3R,4S)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil-2,5dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid, (2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3R,4R)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil-2,5dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid, (2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3S,4S)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil-2,5dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid, (2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3S,4R)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-N¹metil-2-fenil-2,5-dihidro-1H¹pirrol-1karboxamid, (2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3R,4S)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-N¹metil-2-fenil-2,5-dihidro-1H¹pirrol-1karboxamid,

(2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N-[(3S,4S)-3-fluor-1-metil40 piperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil-2,5-dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid,

45

50

55

(2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3S,4R)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil-2,5-dihid60 ro-1H¹pirrol-1-karboxamid, 64

1

HU 005 812 T2

2

(2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N-[(2R,4R)-2-(fluor-metil)1-metil-piperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil2,5-dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid, 5

10 (2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3R,4S)-3-fluor-1-metilpiperidin-4¹il]-2-(hidroxi-metil)-N¹metil-2-fenil-2,5-dihidro-1H¹pirrol-1-karboxamid, 15

(2S)-4¹(2,5-difluor-fenil)-N¹[(3R,4S)-3-fluor-1-metil20 piperidin-4¹il]-N¹metil-2-fenil-2,5-dihidro-1H¹pirrol-1karboxamid, vagy ezek gyógyszerészetileg elfogadható sója. 5. Egy vegyület a következõk közül: 25

R1

R2

R3

R4

R5

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

65

HU 005 812 T2

Táblázat (folytatás) R1

R2

R3

R4

R5

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

66

HU 005 812 T2

Táblázat (folytatás) R1

R2

R3

R4

R5

Me

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

67

HU 005 812 T2

Táblázat (folytatás) R1

R2

R3

R4

R5

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

68

HU 005 812 T2

Táblázat (folytatás) R1

R2

Me

R3

R4

R5

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

Me

Cl

H

Me

CH2OH

Me

Br

H

Me

CH2OH

Me

CN

H

Me

CH2OH

Me

Me

H

Me

CH2OH

Me

CF3

H

Me

CH2OH

Me

NO2

H

F

OH

Me Me

CH2OH Me CH2OH

Me

F

NH2

Me

CH2OH

Me

F

F

Me

CH2OH

Me

F

SH

R1

R2

R3

R4

R5

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

69

HU 005 812 T2

Táblázat (folytatás) R1

Me

R2

R3

R4

R5

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

CH2OH

Me

F

H

Me

Me

F

H

70

HU 005 812 T2

Táblázat (folytatás) R1

R2

R3

R4

R5

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

71

HU 005 812 T2

Táblázat (folytatás) R1

R2

R3

R4

R5

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

Me

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

72

1

HU 005 812 T2

2

Táblázat (folytatás) R1

R2

Me

R3

R4

R5

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

F

H

Me

CH2OH

Me

Cl

H

Me

CH2OH

Me

Br

H

Me

CH2OH

Me

CN

H

Me

CH2OH

Me

Me

H

Me

CH2OH

Me

CF3

H

Me

CH2OH

Me

NO2

H

Me

CH2OH

Me

F

OH

Me

CH2OH

Me

F

NH2

Me

CH2OH

Me

F

F

Me

CH2OH

Me

F

SH

vagy ezek gyógyszerészetileg elfogadható sója vagy sztereoizomerje. 6. Gyógyszerkészítmény, amely egy az 1–5. igénypontok bármelyike szerinti vegyületet és gyógyszerészetileg elfogadható vivõanyagot tartalmaz. 7. A 6. igénypont szerinti készítmény, amely tartalmaz továbbá egy a következõk közül választott második vegyületet: 1) ösztrogénreceptor-modulátor, 2) androgénreceptor-modulátor, 3) retinoidreceptor-modulátor, 4) citotoxikus/citosztatikus ágens, 5) antiproliferatív ágens, 6) prenil-protein-transzferáz-inhibitor, 7) HMG-CoA reduktáz inhibitor, 8) HIV-proteáz-inhibitor, 9) reverz transzkriptáz inhibitor, 10) angiogenezisinhibitor, 11) PPAR¹g agonista, 12) PPAR¹d agonista, 13) sejtproliferáció és túlélési szignál inhibitor,

30

35

40

45

73

14) egy, a sejtciklus ellenõrzõ pontjával interferáló ágens és 15) apoptózist indukáló ágens. 8. A 7. igénypont szerinti készítmény, amely második vegyületként egy angiogenezisinhibitort tartalmaz a következõk közül: tirozin-kináz-inhibitor, epidermális eredetû növekedési faktor inhibitor, fibroblaszteredetû növekedési faktor inhibitor, vérlemezkeeredetû növekedési faktor inhibitor, MMP inhibitor, integrin blokkoló, interferon¹a, interleukin–12, pentozán-poliszulfát, ciklooxigenázinhibitor, karboxi-amido-triazol, konbretasztin-A–4, szkvalamin, 6¹O-(klór-acetil-karbonil)-fumagillol, talidomid, angiosztatin, troponin¹1 és VEGF elleni antitest. 9. A 6. igénypont szerinti készítmény, amely tartalmaz továbbá egy proteoszomainhibitort, aurora-kinázinhibitort, Raf-kináz-inhibitort, szerin/treonin kináz inhibitort vagy egy másik, KSP-tõl eltérõ mitotikus kinezininhibitort. 10. A 7. igénypont szerinti készítmény, amelyben a második vegyület egy tamoxifen vagy raloxifen közül választott ösztrogénreceptor-modulátor.

HU 005 812 T2 Int. Cl.: C07D 401/12

74

HU 005 812 T2 Int. Cl.: C07D 401/12

75

Kiadja a Magyar Szabadalmi Hivatal, Budapest Felelõs vezetõ: Törõcsik Zsuzsanna Windor Bt., Budapest