Woord vooraf. Sharon, juni Onderzoek van cervicale intra-epitheliale neoplasie aan de hand van HPV, p16 en Ki67 1

Woord vooraf Als laatstejaarstudente in de biomedische laboratoriumtechnologie kreeg ik de opdracht een eindwerk te maken. Ik heb mijn stage gevolgd in AZ Onze-LieveVrouw Ter Linden (Knokke) op de dienst anatomo-pathologie. Als onderwerp voor mijn eindwerk kreeg ik HPV. Graag zou ik Dr. Thierri Speelman willen bedanken, omdat ik op zijn laboratorium mijn eindwerk heb mogen uitvoeren. Bedankt voor de goede begeleiding, raad, uitleg en informatie doorheen het proces. Verder wil ik ook Sonja en Viviane bedanken voor hun handige weetjes en hulp tijdens de stage. De sfeer in het laboratorium was optimaal en ik kwam elke dag graag naar het labo. Jullie hebben me heel wat bijgeleerd en ik heb ontdekt dat het heel leuk is om te werken op de dienst anatomo-pathologie. Ik dank het volledige team van de Hogeschool West-Vlaanderen departement Simon Stevin voor de begeleiding en voor de kansen die ze me geboden hebben in de voorbije 3 jaar. In het bijzonder bedank ik Mevr. Kaat Van Oostveldt omdat ze mij tijdens het eindwerk met raad en daad bijgestaan heeft. Ook wil ik een dankwoord uiten naar de firma Hologic en in het bijzonder Joost Van Toren die me de nodige informatie en uitleg heeft gegeven. Als laatste kan ik u nog vertellen dat ik zeer blij was met het onderwerp dat ik heb gekregen. Het onderwerp boeide me vanaf het begin, waardoor het maken van een eindwerk zeer vlot verlopen is.

Sharon, juni 2009

Onderzoek van cervicale intra-epitheliale neoplasie aan de hand van HPV, p16 en Ki67

1

Samenvatting De 23 subtypen van het humane papillomavirus veroorzaken aandoeningen in het genitale gebied. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen hoog risico HPV en laag risico HPV. HR-HPV kan lijden tot baarmoederhalskanker, bij LR-HPV krijgt de patiënt voornamelijk last van genitale wratten. Aan de hand van screening zorgt men voor vroegtijdige opsporing. Het onderwerp bestaat uit volgende twee delen. Het eerste deel van deze scriptie gaat over het screenen op afwijkingen in uitstrijkjes. Meer bepaald screening op ASCUS/AGUS, LSIL en HSIL. Deze screening gebeurt aan de hand van ThinPrep 2000 en de ThinPrep PapStain® kleuring. Uit deze screening worden er 27 afwijkende en 10 normale uitstrijkjes verder onderzocht. Er wordt bovendien een oplossing gezocht voor bloederige stalen. Dit probleem wordt via een protocol van ThinPrep opgelost. Het uitvoeren van het protocol en het beoordelen van de resultaten worden in dit eindwerk behandeld. Het tweede deel van deze scriptie gaat over het uittesten van de antilichamen HPV, p16 en Ki67 op de 27 abnormale en 10 normale stalen. Hierbij worden er per staal 3 ThinPrep preparaten gemaakt voor de 3 verschillende antilichamen. Het is de bedoeling om aan de hand van de bekomen resultaten een prognose te kunnen stellen van cervicale intra-epitheliale letsels. Hierbij moet men toezien dat de 3 verschillende antilichamen evenveel tot dit doel bijdragen. Hiermee wordt bedoeld dat er geen onnodige testen mogen gebeuren voor het stellen van de prognose. De plaatjes worden immunohistochemisch gekleurd met de Benchmark (Ventana). Hierbij is de ABC methode toegepast als immunohistochemische kleuring. ABC staat voor Avidine-biotine complex verbonden met het enzym peroxidase. Deze methode maakt gebruik van de affiniteit van het eiwit avidine voor de vitamine biotine. Het protocol bestaat uit de volgende stappen: fixatie van de cellen, maken van ThinPrep preparaat, ABC-methode, dehydrateren en monteren, aflezen van de preparaten. Elk antilichaam wordt zowel onderzocht op gevoeligheid als op specificiteit. Onder gevoeligheid verstaat men de sterkte van de kleuring. Het aantal gekleurde kernen wordt eveneens onderzocht, dit wordt uitgedrukt met de term specificiteit. Aangezien er grote hoeveelheden stalen gelijktijdig worden gescreend is het maken van controles niet noodzakelijk. Er gebeurt immers een interne controle. Na het aflezen van de resultaten wordt er een vergelijkende studie gemaakt tussen HPV, p16 en Ki67. Het is de bedoeling om aan de hand van deze studie te bepalen in welke mate deze 3 antilichamen van nut zijn bij een bepaalde graad van dysplasie. Er wordt eveneens nog een vergelijkende studie gemaakt tussen Onderzoek van cervicale intra-epitheliale neoplasie aan de hand van HPV, p16 en Ki67

2

HPV en Ki67/ p16. Het doel van beide studies is om te weten in welke mate beide antilichamen gemeenschappelijk voorkomen. Uit deze studies kan men echter besluiten dat de 3 gebruikte antilichamen weldegelijk nodig zijn bij het stellen van de prognose van cervicale intra-epitheliale letsels. Zowel HPV, p16 als Ki67 zullen echter alleen worden gebruikt, indien dit specifiek door de gynaecoloog wordt aangevraagd. Deze testen zijn immers niet terugbetaald en moeten dus volledig door de patiënt worden betaald. Daarom zullen deze antilichamen dan ook meestal enkel in het geval van een HSIL worden aangevraagd.


3

Lijst met afkortingen en symbolen A

adenine

ABC-methode

Avidine biotine complex methode

ASC

Atypische squameuze cellen

ASCUS

“Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance“, atypische plaveiselepitheelcellen waarvan de betekenis niet duidelijk is.

BMHK

baarmoederhalskanker

C

cytosine

CIN

Cervicale intra-epitheliale neoplasie

CIS

Carcinoma in situ

DAB

3,3-diamino-benzidine

DNA

Desoxyribonucleïnezuur.

ds.

dubbelstrengig

es.

enkelstrengig

G

guanine

GIN

glandulaire intra-epitheliale neoplasie

HPV

Humaan papillomavirus

HR-HPV

Hoog-risico humaan papillomavirus

HSIL

Hooggradig squameus intra-epitheliaal letsel

H2O2

waterstofperoxide

ISH

In situ hybridisatie

K/C

Verhouding kern / cytoplasma

LSIL

Laaggradig squameus intra-epitheliaal letsel

PCR

“polymerase chain reaction”

pH

“Pondus hydrogenii” Maat voor de activiteit van waterstofionen.

p16

Proteïne 16

RNA

ribonucleïnezuur

SA-HRP

“Streptavidine-horse radish peroxidase”

SCC

Squameus cel carcinoma


4

SOA

Seksueel overdraagbare aandoening

T

thymine

TP

ThinPrep

VLP

“Virus Like Particles”


5

Verklarende woordenlijst adjuvans

Stof die zonder zelf werkzaam te zijn de werking van een geneesmiddel ondersteunt.

amfofilie

2-kleurige epitheelcellen

atypie

Onregelmatig, afwijkend van het type of de norm

capsomeren

Het nucleïnezuur van een virus wordt omgeven door een eiwitmantel het capside. Elk capside bestaat uit subeenheden nl. de capsomeren.

chromatine kleuring

Aankleuren van DNA en eiwitten in de celkern.

chromogeen

Stoffen waaruit gemakkelijk kleurstoffen kunnen ontstaan. kleurvormend

chromosoom

Is een drager van een deel van het erfelijke materiaal (DNA). Het is een met kleurstoffen goed zichtbaar te maken eiwitstructuur in de celkern.

colposcopie

Onderzoek waarbij de gynaecoloog de baarmoederhals nauwkeurig bekijkt. Meestal wordt er ook weefsel (biopt) van de baarmoederhals weggenomen voor onderzoek.

conisatie

Kleine operatie aan de baarmoedermond

cutaan

Via of met betrekking tot de huid.

cyanofiel

Cellen waarvan de wanden blauw of violet kleuren onder invloed van het reagens katoenblauw.

cytoplasma

Alles waar een cel uit bestaat behalve de kern.

dehydratatie

Het onttrekken van water.

densiteitsanalyse

dichtheid van het staal meten

differentiatie

Toeneming van gecompliceerdheid en organisatie, het ontstaan van verschillende structuren.

DNA polymerase

Is een enzymcomplex betrokken bij de DNA replicatie. Het verdubbelt het DNA door aan elke base de complementerende base te plakken.

DNA probe

Sequentie van DNA die specifiek is voor het te onderzoeken sequentie (die zogenaamde target DNA sequentie) op het humane chromosoom.

dysplasie

Abnormale ontwikkeling

epitheliaal weefsel

Een-of meerlagig dekweefsel dat een beschermende functie heeft voor onderliggend weefsel.


6

epitopen

Deel van een antigen waarop een antilichaam aangrijpt.

genoom

Het geheel van alle genen van een individu, die gezamenlijk alle erfelijke informatie bevatten.

gevoeligheid

De gevoeligheid geeft de sterkte van de kleuring weer.

hybridisatie

Versmelting van twee (complementaire) enkele strengen DNA met elkaar of van es. DNA met RNA op plaatsen waar de sequenties in beide strengen complementair en homoloog zijn.

hyperchromasie

Te sterke opname van de kleurstof in de kern waarmee de uitstrijkjes gekleurd worden.

hysterectomie

Verwijdering van de baarmoeder

hysteroscopie

Onderzoek waarbij de gynaecoloog met een dun buisje in de baarmoeder kijkt en eventueel kleine ingrepen doet.

immunoenzymatische reactie

Dient om enzyme te lokaliseren in de coupe door gebruik te maken van diens enzymatische activiteit.

induceren

Opwekking van een beweging of een proces door een uitwendige prikkel.

interfase

Fase in de mitose. Dit is de periode tussen twee celdelingen in. Het is eigenlijk een gewone cel. Je kan de chromosomen niet zien omdat ze niet gecontraheerd zijn. De DNA-replicatie vindt hierin plaats. Zo zijn er genoeg chromosomen om straks onder de twee nieuwe cellen te verdelen. [33]

Intramusculaire injec- Injectie in de spier. tie In vitro

Biologische technieken die buiten het lichaam van het organisme worden toegepast.

Invasieve groei

Groei waarbij de tumoren in gezonde weefsels binnendringen

keratine

Onoplosbaar eiwit dat voorkomt op de epidermis (buitenlaag) van de huid.

koilocyt

Deze cel is het voornaamste kenmerk van HPV besmetting.

laesies

Letsels, verwondingen


7

metafase

Fase in de mitose. De chromosomen zijn maximaal verkort en verdikt. Ze liggen nu gerangschikt in het equatoriaalvlak (midden van de cel). De spoeldraden verbinden de centromeren met de polen. De kernmembraan is inmiddels verdwenen. [30]

mitose monoclonaal chaam

Normale celdeling, waarbij het aantal chromosomen na de deling gelijk gebleven is. antili- Afkomstig van 1 kloon van lymfocyten en gericht tegen 1 epitoop.

neoplasie

Dit woord betekent nieuwvorming. Het omvat zowel goedals kwaadaardige gezwellen voor zover die ontstaan door celvermeerdering.

nucleases

Enzymen die het DNA afbreken

nucleïnezuur

DNA en RNA zijn natuurlijke nucleïnezuren.

nucleotide

Bouwstenen voor DNA en RNA. Is een molecuul bestaande uit 3 componenten: een fosfaatgroep, een suiker met 5 C-atomen en een purine (A en G) of pyrimidine (T of C)

oxidatie

Elk proces waarbij een stof valentie-elektronen afstaat

parabasale cellen

Nagenoeg de enige celpopulatie in het uitstrijkje tijdens de prepuberteit en postmenopauze. Een infectie die enige tijd blijft duren.

persisterende infectie polychrome kleuring polyclonaal chaam primer progressie

tegen- Er worden meerdere kleuren gebruikt als tegenkleuring antili- Mengsel van antilichamen, gemaakt door verschillende klonen van lymfocyten en gericht tegen verschillende epitopen van het antigeen (opgewekt in konijn, varken…) Klein stukje DNA of RNA dat gebruikt wordt als startpunt van de PCR. Geleidelijke voortgang

proliferatie

Snelle vermenigvuldiging

proteïne

eiwit

proteolyse

eiwitsplitsing

Recurrente Respira- zeer ernstige, maar zeldzame aandoening, gekenmerkt toire Papillomatose door recurrente wratten of papillomen ter hoogte van de bovenste luchtwegen, vooral de larynx. replicatiecyclus Cyclus waarin de verdubbeling van DNA tijdens een celdeling gebeurt. specificiteit De specificiteit betekent het aantal gekleurde cellen Onderzoek van cervicale intra-epitheliale neoplasie aan de hand van HPV, p16 en Ki67

8

syncitiaal

Het virus zorgt ervoor dat cellen gaan samensmelten.

tumorsuppressorgen

Een tumorsuppressorgen is een gen dat onbeperkte deling van de cel voorkomt. Hierbij verhindert het ontstaan van een tumor. Synoniem: virus Bevat een hoeveelheid erfelijk materiaal (RNA of DNA), gewoonlijk ingesloten in een omhulsel van eiwit.

virionen


9

Lijst van figuren Figuur 2.1:

Structuur HPV [2]

Figuur 2.2:

Cumulatieve proportionele bijdrage van 8 HPV-types van BMHK bij vrouwen van 15 jaar of ouder uit Europa en N-Amerika. [3]

Figuur 2.3:

Mogelijk beloop van een infectie van de cervix met een HR-HPV [3]

Figuur 2.4:

CIN1/LSIL [8]

Figuur 2.5:

CIN 2/HSIL [8]

Figuur 2.6:

CIN 3/HSIL [8]

Figuur 2.7:

PCR-proces [13]

Figuur 2.8:

In situ hybridisatie [29]

Figuur 2.9:

Transformatiezone [8]

Figuur 2.10: Werkwijze conventioneel uitstrijkje [16] Figuur 2.11: Werkwijze ThinPrep® preparaat [16] Figuur 2.12: Werkwijze dunnelaag preparaat [24] Figuur 3.1:

Principe ThinPrep® 2000 [32]

Figuur 3.2:

ThinPrep® 2000 [eigen foto]

Figuur 3.3:

Benchmark (Ventana) [eigen foto]

Figuur 3.4:

ABC-methode [36]

Figuur 4.1:

A) HPV negatief B) HPV positief: de donkerbruin e bijna zwarte stippen zijn positieve kernen [eigen foto: vergroting 100X]

Figuur 4.2:

A) p16 negatief B) p16 positief: de donkerbruine bijna zwarte stippen zijn positieve kernen [eigen foto: vergroting 100X]

Figuur 4.3:

A) Ki67 negatief B) Ki67 positief: de donkerbruine bijna zwarte stippen zijn positieve kernen [eigen foto: vergroting 100X]

Figuur 4.4:

Normale stalen in functie van de positieve graad

Figuur 4.5:

Stalen met een ASCUS/AGUS in functie van de positieve graad

Figuur 4.6:

Stalen met een LSIL in functie van de positieve graad

Figuur 4.7:

Stalen met een HSIL in functie van de positieve graad

Figuur 4.8:

Voor de behandeling van het bloederige staal (staal 1105)

Figuur 4.9:

Na de behandeling van het bloederige staal (staal 1105)]


10

Lijst van tabellen Tabel 2.1:

Types HPV

Tabel 3.1:

Protocol ThinPrep PapStain® kleuring [38]

Tabel 4.1:

Berekeningen positieve en negatieve stalen

Tabel 4.2:

Resultaten normale cytologie

Tabel 4.3:

Resultaten ASCUS/AGUS

Tabel 4.4:

Resultaten LSIL

Tabel 4.5:

Resultaten HSIL

Tabel 4.6:

Vergelijkende studie (HPV vs. p16 vs. Ki67)

Tabel 4.7:

Vergelijkende studie HPV vs. Ki67

Tabel 4.8:

Vergelijkende studie HPV vs. p16


11

Inhoudsopgave Woord vooraf ........................................................................................................ 1 Samenvatting ........................................................................................................ 2 Lijst met afkortingen en symbolen ..................................................................... 4 Verklarende woordenlijst ..................................................................................... 6 Lijst van figuren.................................................................................................. 10 Lijst van tabellen ................................................................................................ 11 Inhoudsopgave ................................................................................................... 12 1 2 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3

Inleiding, situatieschets en probleemstelling ..................................... 15 Literatuurstudie ..................................................................................... 17 HPV ......................................................................................................... 17 Types ....................................................................................................... 17 Van infectie met HPV tot baarmoederhalskanker .................................... 19 Abnormale squameuze cellen ................................................................. 20 2.1.3.1 ASCUS ........................................................................................ 20 2.1.3.2

CIN 1/LSIL ................................................................................... 21

2.1.3.3

CIN 2-3/HSIL ............................................................................... 22

2.1.4

Abnormale Glandulaire cellen .................................................................. 24 2.1.4.1 AGUS .......................................................................................... 24

2.2 2.2.1

Opsporingsmethodes............................................................................... 25 Immunocytochemie.................................................................................. 25 2.2.1.1 p16 .............................................................................................. 25 2.2.1.2

Ki67 ............................................................................................. 25

2.2.1.3

HPV ............................................................................................. 25

2.2.2

PCR ......................................................................................................... 26 2.2.2.1 Het principe van PCR .................................................................. 26

2.2.3 2.2.4

In situ hybridisatie .................................................................................... 27 Screeningsuitstrijkje ................................................................................. 28 2.2.4.1 Conventionele methode .............................................................. 29 2.2.4.2

2.3 2.3.1 2.3.2 3 3.1

Dunnelaag methode .................................................................... 30

Preventiemaatregelen.............................................................................. 32 SOA-preventie ......................................................................................... 32 Vaccinatie ................................................................................................ 32 2.3.2.1 Toediening................................................................................... 33 Materiaal en methode ............................................................................ 34 Materiaal .................................................................................................. 34


12

3.1.1

ThinPrep .................................................................................................. 34 3.1.1.1 Benodigdheden ........................................................................... 34 3.1.1.2

3.1.2

3.2 3.2.1

PapStain® kleuring...................................................................... 34

Benchmark (Ventana) .............................................................................. 35 3.1.2.1 Detectie ....................................................................................... 35 3.1.2.2

Reagentia .................................................................................... 35

3.1.2.3

Bereiden van Reagentia .............................................................. 35

3.1.2.4

Antilichamen ................................................................................ 35

3.1.2.5

Bereiden van antilichamen .......................................................... 35

Methode ................................................................................................... 36 ThinPrep® 2000 ...................................................................................... 36 3.2.1.1 Principe ThinPrep® 2000 ............................................................ 36 3.2.1.2

Werkwijze ThinPrep® 2000 ......................................................... 37

3.2.1.3 Werkwijze om ThinPrep preparaten te “herprocessen” bij bloederige stalen............................................................................................... 38 3.2.2

De Papanicolaoukleuring ......................................................................... 39 3.2.2.1 Protocol ThinPrep PapStain® kleuring ........................................ 39 3.2.2.2

3.2.3

4 4.1 4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.2 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.2.4 4.3 4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.4

Verversen van de kleurbaden...................................................... 40

Benchmark (Ventana) .............................................................................. 41 3.2.3.1 Principe Benchmark (Ventana).................................................... 41 3.2.3.2

Werkwijze Benchmark (Ventana) ................................................ 41

3.2.3.3

Automatische kleuring ................................................................. 42

3.2.3.4

Principe immunohistochemische kleuring ................................... 43

Resultaten .............................................................................................. 46 Aflezen van resultaten ............................................................................. 46 HPV ......................................................................................................... 46 p16........................................................................................................... 46 Ki67 ......................................................................................................... 47 Verwerken van resultaten ........................................................................ 48 Normale cytologie .................................................................................... 48 ASCUS/AGUS ......................................................................................... 50 LSIL ......................................................................................................... 51 HSIL......................................................................................................... 52 Vergelijkende studie ................................................................................ 53 HPV vs. p16 vs. Ki67 ............................................................................... 53 HPV vs. Ki67 ........................................................................................... 54 HPV vs. p16 ............................................................................................. 55 Herprocessen van bloederige preparaten................................................ 56


13

4.4.1 4.4.2 4.5

Voor de behandeling................................................................................ 56 Na de behandeling................................................................................... 57 Rapportering van de resultaten ............................................................... 57

5

Discussie ................................................................................................ 58

6

Conclusie ............................................................................................... 60

7

Literatuurlijst .......................................................................................... 61

8

Bijlagen ................................................................................................... 64

Colofon ................................................................................................................ 65 Voor akkoord verklaring .................................................................................... 66


14

1

Inleiding, situatieschets en probleemstelling

De 23 subtypen van het humane papillomavirus veroorzaken aandoeningen in het genitale gebied. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen hoog risico HPV en laag risico HPV. HR-HPV kan lijden tot baarmoederhalskanker, bij LR-HPV krijgt de patiënt voornamelijk last van genitale wratten. Aan de hand van screening zorgt men voor vroegtijdige opsporing. Het eerste deel van deze scriptie gaat over het screenen op afwijkingen in uitstrijkjes. Meer bepaald screening op ASCUS/AGUS, LSIL en HSIL. Deze screening gebeurt aan de hand van ThinPrep 2000 en de ThinPrep PapStain® kleuring. Uit deze screening worden er 27 abnormale en 10 normale uitstrijkjes verder onderzocht. Er wordt bovendien een oplossing gezocht voor bloederige stalen. Dit probleem wordt via een protocol van ThinPrep opgelost. Het uitvoeren van het protocol en het beoordelen van de resultaten worden in dit eindwerk behandeld. Het tweede deel van deze scriptie gaat over het uittesten van de antilichamen HPV, p16 en Ki67 op de 27 afwijkende en 10 normale stalen. Hierbij worden er per staal 3 uitstrijkjes gemaakt voor de 3 verschillende antilichamen. Deze preparaten worden immunohistochemisch gekleurd met de Benchmark (Ventana). Deze kleuringen gebeuren op ThinPrep preparaten wat in het verleden hier nog nooit eerder is gebeurt. De cytologische bepalingen gebeurden vooreerst enkel met HPV en p16. In dit onderzoek wordt er eveneens gebruik gemaakt van Ki67. Ki67 heeft als doel de graad van proliferatie weer te geven. Het is de bedoeling om aan de hand van de bekomen resultaten een prognose te kunnen stellen van cervicale intra-epitheliale letsels. Hierbij moet men toezien dat de 3 verschillende antilichamen evenveel tot dit doel bijdragen. Hiermee wordt bedoeld dat er geen onnodige testen mogen gebeuren voor het stellen van de prognose. Er wordt een vergelijkende studie gemaakt tussen de 3 verschillende antilichamen. Hierbij wordt er rekening gehouden met het aantal positieve stalen en de graad van besmetting/proliferatie. Het is de bedoeling om aan de hand van deze studie te bepalen in welke mate deze 3 antilichamen van nut zijn bij een bepaalde graad van dysplasie. HPV en Ki67 worden met elkaar vergeleken. Hierbij wordt er rekening gehouden met het aantal positieve stalen. Het doel van deze vergelijking zit hem in het feit dat men wil weten in welke mate HPV en Ki67 gemeenschappelijk voorkomen.

Als laatste worden HPV en p16 met elkaar vergeleken. Hierbij wordt er rekening gehouden met het aantal positieve stalen. Deze vergelijking is uitgevoerd zodat Onderzoek van cervicale intra-epitheliale neoplasie aan de hand van HPV, p16 en Ki67

15

men kan bepalen in welke mate deze 2 antilichamen gemeenschappelijk kunnen voorkomen. Aan de hand van onze voorgaande vergelijking kan er geconcludeerd worden in welke mate de bepaling van Ki67 van belang is bij pathogene HPV besmette patiënten.


16

Literatuurstudie

2

Literatuurstudie

2.1

HPV

HPV of humane papillomavirussen zijn circulaire ds. DNA-virussen zonder enveloppe. Dit virus bevat een extern kapsel van 72 capsomeren en behoort tot de familie van de Papillomaviridae. [1] De vorm van het virus is afhankelijk van de rangschikking van de capsomeren. Het gevormde kapsel beschermt het nucleïnezuur tegen nucleases in biologische vloeistoffen en bevordert de aanhechting van het virus aan gevoelige gastheercellen. [1]

Figuur 2.1: Structuur HPV [2]

Het kapsel van HPV bestaat uit twee verschillende eiwitmoleculen, de zogeheten late eiwitten, aangeduid met L1 en L2. Het genoom van het virus codeert ook voor vroege eiwitten, aangeduid als E1, E2 en E4 t/m E7. De aanduiding ‘laat’ en ‘vroeg’ slaan op het tijdstip in de replicatiecyclus van het virus waarop deze eiwitten worden gemaakt. [2],[3] 2.1.1

Types

Er zijn meer dan 100 types HPV bekend. De meeste daarvan zijn betrekkelijk onschuldig, zoals de typen die wratten op handen en voeten veroorzaken. Huidwratten worden door cutane HPV-types veroorzaakt zoals HPV types 1, 2, 3, 10, 27, 5 en 8. Het merendeel van de infecties is van voorbijgaande aard en verloopt zonder symptomen.[2] 23 subtypen veroorzaken aandoeningen in het genitale gebied (zoals baarmoederhals, vagina en schaamlippen). Er wordt een onderscheid gemaakt tussen hoog risico en laag risico op kanker. (zie tabel 2.1).[2],[4]


17

Literatuurstudie

Tabel 2.1: Types HPV[2]

VIRUS TYPES

VIRUS TYPES

frequent

Minder frequent

Ziektes te wijten aan HPV types

Hoog HPV 16 & 18 risico op kanker

HPV 31, 33, 35, - HPV 16 & 18: 71,5% van de 39, 45, 51, 52, BMHKs 55, 56, 58, 59, 66 - (pre)cancereuse letsels van de baarmoederhals, vulva, vagina, anus, penis

Laag risi- HPV 6 & 11 co op kanker

HPV 42, 43, 44, - HPV 6 & 11: 90% genitale 55+ wratten - precancereuse letsels van de baarmoederhals - Recurrente Respiratoire Papillomatose (kind – volwassenen)

Zoals figuur 2.2 laat zien is HPV 16 wereldwijd het meest voorkomende type. Er zijn echter geografische verschillen gevonden in het voorkomen van HPV-types. Zo ligt het percentage van HPV 16&18 iets hoger in Europa en Noord-Amerika dan in de andere werelddelen.[3]

Figuur 2.2: Cumulatieve proportionele bijdrage van 8 HPV-types van BMHK bij vrouwen van 15 jaar of ouder uit Europa en N-Amerika. [3]


18

Literatuurstudie

2.1.2

Van infectie met HPV tot baarmoederhalskanker

Figuur 2.3: Mogelijk beloop van een infectie van de cervix met een HR-HPV [3]

HPV infecteert uitsluitend epitheliaal weefsel. Wanneer het cervixepitheel geïnfecteerd wordt door een HR-HPV, verloopt de infectie meestal asymptomatisch. Het virus is na verloop van tijd niet meer aantoonbaar. (zie figuur 2.3) Indien het virus niet wordt geklaard en er dus sprake is van een persisterende infectie, kunnen drie stadia doorlopen worden in de ontwikkeling tot BMHK: 1) persisterende infectie 2) progressie van infectie naar pre-cancereuze laesies 3) invasieve groei Als de HPV-infectie persisteert, kan het epitheel afwijkingen gaan vertonen in de vorm van atypie en milde dysplasie. De abnormale veranderingen van het epitheel beginnen in de transformatiezone, maar kunnen zich uitbreiden over het gehele exocervicale oppervlak en in het endocervicale kanaal (zie figuur 2.9). In ongeveer 10% van de gevallen komt in het endocervicale epitheel ook een atypie voor die glandulaire intra-epitheliale neoplasie (GIN) wordt genoemd.[5],[9],[10]


19

Literatuurstudie

2.1.3

Abnormale squameuze cellen

2.1.3.1 ASCUS ASCUS of ’Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance’. Atypische plaveiselepitheelcellen waarvan de betekenis niet duidelijk is. Het begrip staat voor onduidelijke veranderingen die we niet duidelijk kunnen definiëren. Cytologische criteria voor ASCUS: - de kern is twee tot driemaal zo groot als die van een intermediaire plaveiselcel; er ontstaat een kleine stijging van de kern/cytoplasma ratio; - de kernranden zijn meestal glad en regelmatig; - er kan een lichte hyperchromasie optreden; - er kan tweekernigheid voorkomen, de kerngrootte is wisselend. [7] ASCUS is volgens Bethesda 2001 vervangen door ASC, ’Atypische Squameus Cells’. (zie bijlage 8.1) Deze categorie is onderverdeeld in twee subklassen: 1) ASC-US: plaveiselcellen van het oppervlakkig of intermediair celtype met kernafwijkingen die kunnen wijzen op een LSIL of SIL. Er zijn echter onvoldoende argumenten voor een definitieve diagnose. 2) ASC-H: atypische cellen waarvan men vermoedt afkomstig te zijn van een hooggradig letsel maar waar door allerlei factoren het niet mogelijk is een definitieve diagnose te stellen. [7] In het labo wordt echter deze onderverdeling niet gemaakt. Men gebruikt immers nog steeds Bethesda 1991. Behandeling: zie bijlage 8.1


20

Literatuurstudie

2.1.3.2 CIN 1/LSIL Laaggradig squameus intra-epitheliaal letsel is een vroeg stadium van een intraepitheliaal (of pre-invasief) letsel van het plaveisel (of squameus) epitheel van de cervix. De afwijkingen blijven beperkt tot het onderste derde van het epitheel. Het bovenste tweederde deel vertoont een normale differentiatie en een normale rijping met afplatting van de cellen. [7],[9] CIN 1 is een lage graad van afwijking en kan zich echter verder ontwikkelen tot ernstigere afwijkingen van het epitheel in de vorm van dysplasie die zich over het onderste tweederde deel van het epitheel uitstrekt (CIN2). [5]

Koilocyten Dubbele nucleotide

hyperchromasie

Figuur 2.4: CIN1/LSIL [8]

Cytologische criteria voor LSIL: (zie figuur 2.4) - de kernmembraan is soms licht ontregelmatig; - het chromatinepatroon is fijn granulair, maar chromatine is wel regelmatig verdeeld; - de kern/cytoplasma ratio is min of meer normaal; - losliggende cellen of in groep; Onderzoek van cervicale intra-epitheliale neoplasie aan de hand van HPV, p16 en Ki67

21

Literatuurstudie

- kernafwijkingen komen voor in grote plaveiselcellen van het oppervlakkige en intermediaire type met één of soms twee kernen. - de koilocyten zijn gekenmerkt door een bleke halo rond de kern, amfofilie en zijn vaak meerkernig. [7],[8] Behandeling: zie bijlage 8.1 2.1.3.3 CIN 2-3/HSIL Hooggradig squameus intra-epitheliaal letsel omvat alle veranderingen, vroeger gekend als matige dysplasie (CIN 2) en ernstige dysplasie (CIN 3). [7]

Normale intermediaire cel

Matig afwijkende kern

Figuur 2.5: CIN 2/HSIL [8]

Atypische cellen komen voor in het onderste tweederde deel van het epitheel, maar er zijn tekenen van differentiatie en rijping met afplatting van de cellen in de bovenste helft. Parabasale cellen zijn gekenmerkt door sterk verschoven K/C. De kernen zijn atypisch met onregelmatige kernomtrekken. Kernafwijkingen kunnen in de gehele epitheellaag voorkomen, maar zijn het opvallendst in de onderste helft. In de onderste helft wordt immers een verhoogd aantal mitosen met enkele afwijkende vormen aangetroffen.[8],[9] Onderzoek van cervicale intra-epitheliale neoplasie aan de hand van HPV, p16 en Ki67

22

Literatuurstudie

Cytologische criteria voor CIN 2: (zie figuur 2.5) - de kern/cytoplasma ratio is verhoogd; - matige hyperchromasie en een granulair chromatine; - Losliggende cellen, in groep of in syncitiaal verband; - Een eosinofiel of cyanofiel gekleurd cytoplasma; - Matig vergrote kern men onregelmatige kernranden; - Kleine nucleolen of niet zichtbaar.[7] Behandeling: zie bijlage 8.1

Figuur 2.6: CIN 3/HSIL [8]

Histologisch vertoont het epitheel van CIN 3 een abnormale uitrijping en een sterk verstoorde cellulaire ordening. Basale cellen bevatten sterk atypische kernen. Mitosefiguren en afwijkende mitosen worden in alle lagen aangetroffen en de veranderingen kunnen zich uitbreiden langs de cervicale klierbuizen. De volledige breedte van het epitheel is dysplastisch. Onderscheid met carcinoma in situ is soms niet mogelijk. Daarom zegt men dat CIN 3 gelijk is aan een zware dysplasie of CIS. [7],[8],[9] Onderzoek van cervicale intra-epitheliale neoplasie aan de hand van HPV, p16 en Ki67

23

Literatuurstudie

Cytologische criteria voor CIN 3: (zie figuur 2.6) - de kern/cytoplasma ratio is opvallend verhoogd; - Soms aanwezigheid van nucleolen; - Soms vervormd cytoplasma, cyanofiel gekleurd; - Grof korrelig chromatinepatroon, regelmatig verdeeld; - Sterk vergrote en hyperchromatische kern met een onregelmatige vorm.[7] Behandeling: zie bijlage 8.1 2.1.4

Abnormale Glandulaire cellen

2.1.4.1 AGUS AGUS of ’Atypical Glandular Cells of Undetermined Significance’. Atypische klierepitheelcellen waarvan de betekenis niet duidelijk is. Men onderscheidt AGUS lichte atypie en AGUS sterke atypie. Beide kunnen voorkomen zowel bij cellen van endometriale als van endocervicale oorsprong. Behandeling: zie bijlage 8.1


24

Literatuurstudie

2.2

Opsporingsmethodes

2.2.1

Immunocytochemie

Immunocytochemische detectiemethode om specifieke virale eiwitten op te sporen. Er wordt gebruik gemaakt van antilichamen om structuren in cellen te markeren. Deze antilichamen worden verkregen door een lichaamsvreemd eiwit in een dier in te spuiten. Het immuunsysteem van het dier zal tegen dit eiwit dan antilichamen maken. Deze antilichamen worden dan geïsoleerd uit de bloedbaan van het dier. Deze techniek is tegenwoordig een belangrijk hulpmiddel bij de diagnose. [9],[22] 2.2.1.1 p16 Het bepalen van p16 op een uitstrijkje heeft als doel de sterk pathogene HPV types aan te kleuren. Een bruin-zwarte verkleuring met p16 van de celkern wijst op een positief uitstrijkje [11] 2.2.1.2 Ki67 Ki67 is een proliferatiemarker in normale exocervicale mucosa die beperkt is tot de basale cellenlaag. Bij HPV infectie ook in hogere cellagen aantoonbaar. Ki67 is afwezig in de rustfase van de celgroei. Deze eigenschap zorgt ervoor dat Ki67 een goede tumormerker is. Een bruin-zwarte verkleuring met Ki67 van de celkern wijst in principe op proliferatie van de cellen. [11],[12],[21] 2.2.1.3 HPV HPV is een monoklonaal muizenantilichaam tegen HPV geïnfecteerde epitheliale cellen. Een bruin-zwarte verkleuring van de celkern wijst in principe op een HPV infectie. [11],[23]


25

Literatuurstudie

2.2.2

PCR

2.2.2.1 Het principe van PCR In de eerste fase wordt het dubbelstrengs DNA gesplitst in twee ketens enkelstrengs DNA (denaturatie). Dit gebeurt door het opwarmen van het mengsel tot ongeveer 95°C gedurende een aantal minuten. De waterstofbruggen tussen beide ketens worden verbroken, terwijl de covalente bindingen onaangetast blijven. Deze twee enkelstrengige DNA-ketens dienen voor de aanmaak van twee complementaire DNA-ketens. Het enzyme dat hiervoor verantwoordelijk is, is het DNApolymerase. Dit enzyme is slechts werkzaam wanneer het een startpunt vindt in de vorm van een stukje ds. DNA. In de PCR wordt gebruik gemaakt van zogenaamde primers. Primers zijn kleine stukjes es. DNA, meestal ongeveer 20 tot 40 basen lang, die precies complementair zijn aan de uiteinden van het stuk DNA waarin we geïnteresseerd zijn. (zie figuur 2.7: P1 en P2) Figuur 2.7: PCR-proces [13]

Vervolgens wordt de temperatuur verlaagd om de primers op de complementaire plaatsen te laten binden (annealing). Het DNA-polymerase kan vervolgens beginnen met de aanmaak van een complementaire DNA-streng. Als startpunt kiest men voor het kleine stukje ds. DNA ter hoogte van de primer (extension). Het enzyme plaatst één voor één de complementaire nucleotiden aan elkaar. De nieuwgevormde DNA-streng is volledig complementair aan zijn mal. Vanaf de primer ontstaan zo twee nieuwe ds. DNA-ketens, volledig identiek aan de oorspronkelijke moedermolecule. (zie figuur 2.7: annealing en extension) Onderzoek van cervicale intra-epitheliale neoplasie aan de hand van HPV, p16 en Ki67

26

Literatuurstudie

De cyclus (denaturatie, annealing en extension) wordt een aantal keren herhaald. De nieuwgevormde DNA-strengen fungeren in de volgende cyclus als mal voor de productie van nieuwe strengen. Bij elke cyclus verdubbelt de hoeveelheid DNA. Er is dus een exponentiële vermenigvuldiging van het op te sporen stukje DNA. De exponentiële toename van het target-DNA gaat echter niet onbeperkt door. Na een bepaalde tijd neemt de efficiëntie van de reactie af. Het rendement verlaagt na ongeveer 25 cycli. [13],[14],[15] 2.2.3

In situ hybridisatie

ISH is een krachtig hulpmiddel waarmee directe veranderingen in de chromosomen zichtbaar gemaakt kunnen worden in de cel. De detectie van specifieke bekende DNA- of RNA- sequenties in histo/cytologische preparaten gebeurt zonder morfologisch verlies. Het basisprincipe bestaat uit een in vitro gelabeld nucleïnezuur (probe) te laten hybridiseren met complementair target-DNA of RNA (aanwezig in paraffine-/ vriescoupe) tot een ds. hybride molecuul. Die hybriden kunnen ontstaan tussen twee complementaire strengen DNA, tussen DNA-RNA en RNA-RNA combinaties, maar er kunnen ook hybriden ontstaan tussen natuurlijke en kunstmatige strengen van nucleïnezuren. De verschillende probes zijn in vitro gelabelde nucleotidenstrengen, waarvan de basenvolgorde complementair zijn met die van de targets.[27],[29]

3

5

6

Figuur 2.8: In situ hybridisatie [29]


27

Literatuurstudie

1) Cellen in metafase of interfase worden gefixeerd op een objectglas. 2) Proteolyse wordt toegevoegd waarna bestanddelen van de celkern en van het cytoplasma worden verwijderd, hierdoor kan de probe beter bij het DNA komen. 3) Door verhitting tot 75°C zal het patiënten DNA denatureren en ook de DNA probe zal door denaturatie “openvouwen“. (zie figuur 2.8) 4) De DNA probe wordt opgebracht. 5) Hybridisatie vindt overnacht plaats bij 37°C. Het patiënten DNA zal met de DNA probe een reactie aangaan, daar waar de stukken complementair zijn. (zie figuur 2.8) 6) Het teveel aan DNA probe wordt dan door spoelstappen verwijderd. De specifiek gebonden probefragmenten zijn zichtbaar te maken m.b.v. fluorescentie microscopie. (zie figuur 2.8) [29] 2.2.4

Screeningsuitstrijkje

De arts brengt een speculum (eendenbek) in de schede (vagina) in. Hierna wordt het speculum geopend. Zo wordt de baarmoederhals zichtbaar. De arts neemt met een houten spatel of borsteltje cellen t.h.v. de transformatiezone af. De transformatiezone is de plaats van permanente ombouw met reparatie en mitose. (zie figuur 2.9) [6],[8]

endocervix exocervix

transformatiezone Figuur 2.9: Transformatiezone [8]


28

Literatuurstudie

2.2.4.1 Conventionele methode Deze methode wordt zo goed als niet meer gebruikt, dit komt door de moeilijk te interpreteren resultaten. In het laboratorium worden de preparaten gekleurd met de papanicolaoukleuring. (zie 3.2.2)[16] Werkwijze conventioneel uitstrijkje:

Figuur 2.10: Werkwijze conventioneel uitstrijkje [16]


29

Literatuurstudie

2.2.4.2 Dunnelaag methode De huisarts maakt gebruik van een reagens op methanolbasis, dat wordt gebruikt voor transport en conservering van gynaecologische monsters. De cervix-brush wordt niet meer uitgestreken op een dekglaasje, maar wordt tot 10 keer toe op de bodem van het potje gedrukt (zie figuur 2.11), zodat alle cellen loskomen van het borsteltje. Bij de tweede dunnelaag methode wordt het borsteltje in het potje achtergelaten (zie figuur 2.12). Deze methoden hebben als voordeel dat er meerdere testen kunnen gebeuren op eenzelfde staal, zonder dat de patiënt moet teruggeroepen worden. In het laboratorium worden de preparaten gekleurd met de papanicolaoukleuring. (zie 3.2.2) [17],[18],[25] 1) nieuwe methode sinds januari 2009:

Figuur 2.11: Werkwijze ThinPrep® preparaat [16]


30

Literatuurstudie

2) oudere methode:

1

2

3

4

1) Afname brush en potje met fixator. 2)Densiteitsanalyse van het staal. 3) Centrifugeren 4) Resultaat en aflezing van het staal met dunnelaag techniek.

Afname door huisarts of gynaecoloog

1

2

Afname brush en potje met fixator

3

Afname

4

Schudden van het potje voor een homogene fixatie

Wordt opgestuurd naar labo anatome pathologie

Techniek en diagnose van het labo

5

6

De celconcentratie wordt bepaald met het Turbitec apparaat.

7

Staal afname volgens de Turbitec indicatie, naar de cytologische kamer.

Centrifugatie

8

Screening van het staal.

Figuur 2.12: Werkwijze dunnelaag preparaat [24]


31

Literatuurstudie

2.3

Preventiemaatregelen

Jonge vrouwen kunnen ongemerkt besmet zijn met een ziekte die 20 of 30 jaar later kan ontaarden in kanker. Dat gebeurt omdat HPV een van de meeste voorkomende seksueel overdraagbare aandoeningen is. De besmetting kan al plaatsvinden tijdens de ontmaagding. HPV geeft vaak geen klachten en daarom weten veel mensen niet dat ze ermee besmet zijn, vandaar dat een preventieve aanpak noodzakelijk is. De vroegtijdige vaccinatie is dan ook een aanbevolen maatregel. (zie hoofdstuk 2.3.2).[27] 2.3.1

SOA-preventie

De enige afdoende maatregel om niet besmet te worden is afzien van elk contact met de aangedane lichaamsdelen. Een aantal studies toont aan dat de transmissie van HPV niet met zekerheid voorkomen kan worden door het gebruik van een condoom. Onderzoek heeft echter wel uitgewezen dat de transmissie van HPV significant kan verminderen en dat de dysplasie van de cervix voorkomen kan worden door altijd condooms te gebruiken bij seksueel contact. [3] 2.3.2

Vaccinatie

Zoals eerder vermeld (hoofdstuk 2.1), bestaat het kapsel van HPV uit twee eiwitten (L1 en L2) die het genoom omgeven. Voor de ontwikkeling van HPVvaccins werd uitgegaan van de vaststelling dat serum neutraliserende antilichamen gericht zijn tegen epitopen op het L1-kapseleiwit. Begin de jaren negentig van de vorige eeuw ontdekte men de zogenaamde Virus Like Particles (VLP). VLP’s konden ontwikkeld worden door expressie van het L1 kapseleiwit in ondermeer gistcellen of cellijnen afkomstig van insecten. Een VLP is qua structuur morfologisch gelijk aan de ronde kapsels van de virionen, maar bevat geen viraal DNA. Een VLP is in staat om antilichamen te induceren zonder zich te vermenigvuldigen. Dit is de reden dat er geen risico is op infectie en bij uitbreiding evenmin op de ontwikkeling van kanker door HPV-vaccins. De bescherming die de HPV-vaccins bieden is in principe typespecifiek, maar ook kruisbescherming tegen onder andere HPV31 en 45 is gerapporteerd.[3],[5] Er zijn op dit moment twee verschillende preventieve vaccins tegen HPV op de markt. Het eerste vaccin tegen HPV was Gardasil®, dit is een quadrivalent vaccin van Sanofi Pasteur MSD gericht tegen de typen HPV 6,11, 16 en 18. In het geval van Gardasil® wordt voor het produceren van het L1-VLP gebruik gemaakt van een gist. Cervarix® werd als tweede vaccin op de markt gebracht en is een bivalent vaccin. Dit vaccin van GlaxoSmithKline is gericht tegen HPV 16 en 18. Voor de productie van Cervarix® wordt er gebruik gemaakt van een cellijn afkomstig van insecten. De beide HPV-vaccins bevatten VLP’s van de types HPV16 en HPV18. Gardasil® echter bevat eveneens VLP’s voor de types HPV6 en 11.[3],[5]


32

Literatuurstudie

De beide vaccins verschillen wat betreft het gebruikte adjuvans. Cervarix® bevat een nieuw adjuvans, met name ASO4. Dit is een combinatie van aluminiumhydroxide en een gezuiverd lipide-derivaat verkregen uit Salmonella Minnesota. Gardasil® bevat als adjuvans aluminiumhydroxyfosfaat sulfaat.[3],[5] 2.3.2.1 Toediening De primaire vaccinatiereeks bij het gebruik van Gardasil® bestaat uit 3 intramusculaire injecties met een dosis van 0,5ml, het is aangeraden 2 en 6 maanden na de eerste vaccinatie opnieuw het vaccin toe te dienen. Bij Cervarix® is het aanbevolen om de 3 inentingen van elk 0,5ml volgens een 0, 1, 6 maanden schema te volgen. [3],[19] Vaccinatie is het meest zinvol als vrouwen of meisjes nog niet seksueel actief zijn. Hoewel een HPV-infectie al na eenmalig seksueel contact kan zijn opgelopen, kan vaccinatie toch zin hebben als er nog maar heel weinig seksueel contact is geweest. Er is immers kans dat een meisje nog geen infectie heeft opgelopen met één van de HPV-typen waartegen de vaccins beschermen. Hoe meer seksuele partners een vrouw heeft gehad, hoe groter de kans dat ze al geïnfecteerd is (geweest) met HPV. Bij vrouwen die al seksueel actief zijn kan vaccinatie dus ook nuttig zijn.[20]


33

Materiaal en methode

3


3.1

Materiaal

3.1.1

ThinPrep

3.1.1.1 Benodigdheden - ThinPrep methode: o The ThinPrep PAP Test (PreservCyt® Solution: 20ml) o DOW CORNING® (high vacuum grease) o The ThinPrep PAP Test Microscope Slides o The ThinPrep PAP Test filters o Cytolyt ThinPrep 3.1.1.2 PapStain® kleuring - Alcohol 100% (Labonord) - Alcohol 95% - Alcohol 70% - Alcohol 50% - Aq.dest. - Kleurstoffen: o ThinPrep® Nuclear stain o ThinPrep® Rinse solution o ThinPrep® Bluing solution o ThinPrep® Orange G solution o ThinPrep® EA solution


34


3.1.2

Benchmark (Ventana)

3.1.2.1 Detectie - iviewTM DAB Detection kit (Ventana): o 25mL iviewTM Copper-Cu4SO4 (5g/L) o 25mL iviewTM DAB – DAB (0,2%) o 25mL iviewTM Biotinylated Ig (<200µg/mL) o 25mL iviewTM H2O2 – H2O2 (<0,08%) o 25mL iviewTM SA-HRP (<300µg/mL) o 25mL iviewTM inhibitor – H202 (3%) - Hematoxylin (Ventana): kleurstof - Bluing Reagent (Ventana): kleurstof 3.1.2.2 Reagentia - LCS (Pre-diluted) - Reaction Buffer (concentratie: 10X) - EZ PrepTM (concentratie: 10X) - CC1 (Pre-diluted) - CC2 (Pre-diluted) - Antibody diluent 3.1.2.3 Bereiden van Reagentia - Reaction Buffer/ EZ PrepTM 200ml Reaction Buffer/ EZ PrepTM en 1800mL aq.dest. 3.1.2.4 Antilichamen - Ki67 (Dakocytomation) - NCL-HPV-4C4 (Novocastra) - p16 (Dakocytomation) 3.1.2.5 Bereiden van antilichamen - Ki67 (verdunning: 1/150): 80µl Ki67 en 11920µl antibody diluent - NCL-HPV-4C4 (verdunning 1/10): 1200µl NCL-HPV-4C4 en 10800µl antibody diluent - p16 (verdunning: 1/40): 300µl p16 en 11700µl antibody diluent


35


3.2

Methode

3.2.1

ThinPrep® 2000

3.2.1.1 Principe ThinPrep® 2000 1) Spreiding van de cellen: De ThinPrep filter draait in het staal en veroorzaakt stromingen in de vloeistof die sterk genoeg zijn om onzuiverheden en slijm te scheiden van de cellen. Er is geen ongunstig effect op de cellen. 2) Verzamelen van de cellen: De ThinPrep filter wordt vacuüm gezogen, waardoor de cellen op het membraan komen. De opgezogen vloeistof wordt in een afvalvat gebracht. 3) Transmissie van de cellen: Nadat de cellen op het filtermembraan zijn verzameld, wordt de ThinPrep filter rustig op een ThinPrep glaasje gebracht. Er komt een luchtstroom doorheen de filter, waardoor de cellen zich verplaatsen van de filter naar het objectglaasje. Ook de positieve lading van het objectglaasje heeft een invloed op de transmissie. Er ontstaat een egale verspreiding van de cellen op het objectglaasje. [32]

1

2

3

Figuur 3.1: Principe ThinPrep® 2000 [32]


36


2

10

9

11

8 6

Figuur 3.2: ThinPrep® 2000 [eigen foto]

3.2.1.2 Werkwijze ThinPrep® 2000 1) Zet de ThinPrep® 2000 aan met de knop achteraan. 2) Zorg ervoor dat het potje met alcohol dagelijks wordt ververst. 3) Aanvraag en staal nummeren. 4) Zelfde nummer van het staal overbrengen op een ThinPrep glaasje. 5) Filterhouder om de twee dagen insmeren met DOW CORNING® High vacuum grease. 6) Plaats de filter op filterhouder, zorg ervoor dat de filter voldoende is aangedrukt. 7) Maak het ThinPrep potje open en kijk of er voldoende staal in het potje aanwezig is. Dit controleer je door te kijken naar de maatstreep op het potje. Indien het staal onder de streep ligt mag men vloeistof uit een ongebruikt ThinPrep potje overgieten. PAS OP dat men niet teveel vloeistof toevoegt, eenmaal over de maatstreep is er een teveel en zal het toestel dit staal niet aanvaarden. 8) Plaats het ThinPrep potje in het toestel. Onderzoek van cervicale intra-epitheliale neoplasie aan de hand van HPV, p16 en Ki67

37


9) Plaats de filter en filterhouder in het toestel + controleer of de filterhouder kan ronddraaien. 10) Plaats het ThinPrep glaasje in het toestel met het etiket naar de rechterzijde + controleer of het glaasje goed vastzit. 11) Druk op nummer 4 op het toestel. 12) Wacht tot het toestel klaar is. 13) Open het toestel en haal het potje met alcohol en ThinPrep glaasje uit het toestel. - Indien er een PapStain® kleuring moet gebeuren: ÆPlaats het ThinPrep glaasje in 95% alcohol. - Indien er een immunologische kleuring (Benchmark) moet gebeuren: ÆLaat het ThinPrep glaasje drogen op een absorberend oppervlak. 14) Haal het ThinPrep potje voorzichtig uit het toestel en draai het terug dicht. Bewaar het potje gedurende een 3-tal weken. 3.2.1.3 Werkwijze om ThinPrep preparaten te “herprocessen” bij bloederige stalen Wanneer? 1) Maak eerst een routine ThinPrep 2) Bij onbeoordeelbaarheid door extreem veel bloed kan men herprocessen. 3) Vaak zijn de potjes macroscopisch extreem bloederig Methode 1) Breng het materiaal uit het preservcyt potje in een centrifuge buis. 2) Centrifugeer 10 min. bij 2000 RPM 3) Decanteer 4) Voeg 30 ml cytolyt/ijsazijn oplossing toe (in de verhouding 9:1) (27ml cytolyt/ 3ml ijsazijn). Laat dit 10 min. staan. 5) Vortex 6) Centrifugeer 10 min. bij 2000 RPM. 7) Decanteer 8) Voeg de celpellet toe in een nieuw preservcyt potje. 9) Maak ThinPrep m.b.v de TP 2000.


38


3.2.2

De Papanicolaoukleuring

De PAP-kleuring is een polychrome tegenkleuring gebaseerd op kleurstof competitie in het cytoplasma gecombineerd met een kernkleuring. De PAP-kleuring gebeurt op praktisch elk cytologisch preparaat. Het is de meest voorkomende kleuring aan de werkpost van de cytologie. De kleuring wordt uitgevoerd met behulp van het kleurtoestel ‘Tribune stainer HCS 33‘ van de firma Labonord. De kleurstoffen die gebruikt worden zijn: ThinPrep® Nuclear stain: Dit is een hematoxyline kleuring. Hematoxyline zelf kleurt niet , maar moet eerst een oxidatie ondergaan met Hematine. Ook hematine kleurt niet. Pas als deze hematine zich bindt aan een metaal-zout oplossing wordt de kern aangekleurd. De kleurstof kleurt de kern in eerste instantie hard roze aan. ThinPrep® Rinse solution: Verwijderen van overmatige aankleuring van het cytoplasma. ThinPrep® Bluing solution: Deze oplossing werkt als een Lithium Carbonaat oplossing en kleurt door de hoge pH de kernen van hard roze naar donker paars. De chromatine kleuring wordt vastgehouden en men kan verder gaan met de tegenkleuring. ThinPrep® Orange G solution: Kleurt het keratine aan en zorgt voor helderheid binnen celgroepen. De alcohol zorgt ervoor dat de tegenkleuring daadwerkelijk in de cellen terecht komt of eruit gaat. ThinPrep® EA solution: Deze oplossing is een mix van Eosine Y en Fast Red. Deze kleurstof zorgt voor de aankleuring van het cytoplasma. Hierna volgt het wegwassen van overmaat aan Orange G en EA solution en van al het water. PAS OP! Een langere tijd in de alcohol kan ook invloed hebben op de aankleuring. Dit kan immers verlies aan kleuring opleveren. [34],[38]

3.2.2.1 Protocol ThinPrep PapStain® kleuring Tabel 3.1: Protocol ThinPrep PapStain® kleuring [38] Onderzoek van cervicale intra-epitheliale neoplasie aan de hand van HPV, p16 en Ki67

39


Product

Werking

Tijdsduur (min.)

Alcohol 95%

Hydratatie

1:00

Alcohol 70%

Hydratatie

1:00

Alchol 50%

Hydratatie

1:00

Aq. destilaat

spoelen

1:00

ThinPrep® Nuclear stain

Kleurt de kernen hard roze

5:00

Aq. destilaat

Spoelen

00:10

ThinPrep® Rinse solution

Overmatige aankleuring van cytoplasma verwijderen

1:00

Aq. destilaat

Spoelen

00:30

ThrinPrep® Bluing solution

Kleurt de kernen donker paars

00:30

Aq. destilaat

Spoelen

00:30

Alcohol 50%

Ontwateren (dehydratatie)

00:30

Alcohol 95%


00:30

ThinPrep® Orange G solution

Kleurt het keratine aan en 2:00 zorgt voor helderheid binnen de celgroepen

Alcohol 95%


00:15

Alcohol 95%


00:15

ThinPrep® EA solution

Kleurt het cytoplasma

4:00

Alcohol 95%


1:00

Alcohol 100% (Labonord)


1:00

Totale tijdsduur van een cytologische PAP kleuring is 21 minuten en 10 seconden.[38]

3.2.2.2 Verversen van de kleurbaden Kleurstoffen en alcoholen: Onderzoek van cervicale intra-epitheliale neoplasie aan de hand van HPV, p16 en Ki67

40


1 mL verbruik per glaasje. Bij een inhoud van 450 mL kunnen er 450 glaasjes worden gekleurd. Aqua dest: Dit dient vervangen te worden na 160 glaasjes.[38] 3.2.3

Benchmark (Ventana)

3.2.3.1 Principe Benchmark (Ventana) De methode voor het uitvoeren van immunohistochemische kleuring, is gebaseerd op een immunoenzymatische reactie, gebruikmakend van mono-en polyclonale antilichamen om cel of weefsel antigenen te detecteren.

Figuur 3.3: Benchmark (Ventana) [eigen foto]

3.2.3.2 Werkwijze Benchmark (Ventana) 1) Labelen van de ThinPrep glaasjes. Onderzoek van cervicale intra-epitheliale neoplasie aan de hand van HPV, p16 en Ki67

41


2) Maak de ThinPrep glaasjes en laat deze drogen op een absorberend oppervlak gedurende minimum 1 uur. (zie 3.2.1.2) 3) Breng het barcode-etiket dat overeenkomt met het uit te voeren antibodyprotocol aan op het glaasje. 4) Plaats de primaire-antibodydispenser, de juiste detection kit dispensers en de benodigde bijbehorende reagentia op het reagensplateau en plaats dit op de automated slide stainer. Controleer de vloeistof- en afvalstoffenreservoirs. 5) Open het glaasjescarrousel van de Benchmark en leg er de gedroogde voorwerpglaasjes in. 6) Breng een laagje aq.dest. op de glaasjes. 7) Tel het aantal glaasjes en breng dit in het computerprogramma in. 8) Druk op “start run” om de kleuring te starten.(zie 3.2.3.3) 9) Op het einde van de run geeft de Benchmark een signaal. Klik op het gele OK icoon. 10) Open het glaasjescarrousel van de Benchmark en haal er de gekleurde voorwerpglaasjes uit. 11) Start de schoonmaakcyclus. 12) Was de voorwerpglaasjes in een bakje met warm water waarin er zeep zit. Laat dit ongeveer een 5 min. staan. 13) Spoel de zeepoplossing weg en plaats de glaasjes in zuivere alcohol. Doorloop een 3-tal baden met zuivere alcohol, zodat al het water wordt weggespoeld. 14) Breng een dekglaasje op het preparaat aan met permanente mounting. 15) Breng de coupes naar de respectievelijke patholoog. 16) Plaats de afsluitdopjes op de reagensdispensers en plaats ze terug in de frigo.

3.2.3.3 Automatische kleuring De immunohistochemische kleuring wordt uitgevoerd met het toestel “Benchmark”. Er wordt reaction buffer en olie op het draagglaasje gebracht. Vervolgens wordt Onderzoek van cervicale intra-epitheliale neoplasie aan de hand van HPV, p16 en Ki67

42


het glaasjes opgewarmd tot 37°C. Alle reacties die verder worden besproken gebeuren bij 37°C: 1) iview inhibitor wordt toegevoegd met een incubatietijd gedurende 4 minuten. Dit om endogene peroxidase tegen te gaan. Endogene peroxidase veroorzaakt achtergrondkleuring. 2) 100µl van het antilichaam (HPV, p16 of Ki67) wordt aangebracht met een incubatietijd gedurende 32 minuten. Het monoklonale primaire antilichaam bindt met het antigeen in het preparaat. 3) 1 druppel iview Biotinylated Ig wordt toegevoegd met een incubatietijd van 8 minuten. Dit secundaire gebiotynileerd antilichaam bindt met het primair antilichaam. 4) 1 druppel iview SA-HRP wordt toegevoegd met een incubatietijd van 8 minuten. Hierbij bindt het avidine met het biotine. 5) 1 druppel iview DAB en 1 druppel Iview H2O2 wordt toegevoegd met een incubatietijd van 8 minuten. Dit is de eigenlijke kleurreactie. 6) 1 druppel iview Copper wordt toegevoegd met een incubatietijd van 4 minuten. 7) 1 druppel Hematoxyline (tegenkleuring) wordt toegevoegd met een incubatietijd van 2 minuten. 8) 1 druppel Bluing Reagent (extra tegenkleuring) wordt toegevoegd met een incubatietijd van 2 minuten. 9) Tussen alle stappen wordt er gespoeld met Reaction buffer om de niet gebonden reagentia weg te spoelen.[37]

3.2.3.4 Principe immunohistochemische kleuring Als immunohistochemische methode gebruikt men ABC. ABC staat voor Avidine – biotine complex verbonden met een enzym peroxidase. Deze methode maakt gebruik van de affiniteit van het eiwit avidine voor de vitamine biotine. Onderzoek van cervicale intra-epitheliale neoplasie aan de hand van HPV, p16 en Ki67

43


Het principe van de ABC methode bestaat uit de volgende stappen (zie figuur 3.4): 1) Het ThinPrep preparaat bevat de antigenen. 2) Men voegt een peroxidase blok of H2O2 toe om endogene peroxidase tegen te gaan. De meeste cellen bevatten van nature endogene peroxidase. Dit endogene peroxydase moet worden onderdrukt voordat het conjugaat wordt toegevoegd. Het onderdrukken van het endogeen peroxydase kan door het preparaat te incuberen met H2O2. Het enzym kan het substraat H2O2 omzetten in H2O en O2, waarbij diamino benzidine (DAB) gaat polymeriseren waardoor een bruine neerslag ontstaat. Indien er niet geremd zou worden, dan wordt het gehele preparaat bruin van kleur na de DAB. [35], [39] 3) Men voegt een primair antilichaam toe. Dit primaire antilichaam (HPV, p16 of Ki67) bindt met de antigenen van het preparaat. De incubatieperiode bedraagt een 32 min. Vervolgens wast men het preparaat om niet gebonden primaire antilichamen te verwijderen. 4) Men voegt een secundair antilichaam toe dat bindt met het primair antilichaam. Het secundair antilichaam is gecomplexeerd met biotine. Men spreekt ook wel van een biotinylated antilichaam. Men wast na incubatie om het teveel aan secundaire antilichamen te verwijderen. 5) Men voegt een SA-HRP (“streptavidine – horse radish peroxidase enzym”) toe. Avidine is een proteïne dat afkomstig is van een eiwit. Het vertoont een grote affiniteit voor biotine en kan er dus mee complexeren. Een andere component van het complex dat men toevoegt is biotin gecomplexeerd met horseradish peroxidase enzym. Deze zal op zijn beurt gaan adderen op avidin. 6) Men incubeert het geheel. Tijdens incubatie vormt het toegevoegde avidine een complex met de secundaire antilichamen. Daarna bindt het biotin horseradish peroxidase op dit complex. Het avidine biotine immunoperoxidase complex is gevormd. Men voert een wasstap uit om weeral niet gebonden componenten te verwijderen. 7) Vervolgens incubeert men de cellen met een oplossing die 3,3diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB) bevat. Het diaminobenzidine zal door het peroxidase omgezet worden tot een chromogeen. Het chromogeen is een onoplosbaar donkerbruin neerslag dat gelokaliseerd is in dat deel van de cellen dat men wilt identificeren. [35]


44


Figuur 3.4: ABC-methode [36]


45

Resultaten

4

Resultaten

4.1

Aflezen van resultaten

4.1.1

HPV

Het bepalen van HPV op een uitstrijkje heeft als doel om infecties met HPV aan te tonen. Indien een persoon HPV positief is, is het van belang om de pathogeniteit van het HPV te bepalen. De pathogeniteit van het type HPV wordt bepaald via p16. (zie figuur 4.1) A

B

Figuur 4.1:A) HPV negatief B) HPV positief: de donkerbruine bijna zwarte stippen zijn positieve kernen [eigen foto: vergroting 100X]

4.1.2

p16

Het bepalen van p16 op een uitstrijkje heeft als doel de sterk pathogene HPV types aan te kleuren. Indien er een aankleuring gebeurt spreekt men van p16 positief. Hierbij is het belangrijk om te weten hoe snel de proliferatie plaatsvindt. De proliferatie van de cellen wordt bepaald met Ki67. (zie figuur 4.2) A

B

Figuur 4.2: A) p16 negatief B) p16 positief: de donkerbruine bijna zwarte stippen zijn positieve kernen [eigen foto: vergroting 100X] Onderzoek van cervicale intra-epitheliale neoplasie aan de hand van HPV, p16 en Ki67

46

Resultaten

4.1.3

Ki67

Het bepalen van Ki67 op een uitstrijkje heeft als doel de proliferatie van de cellen aan te tonen. Indien er reeds een positieve HPV en p16 is gedetecteerd is het bepalen van een Ki67 van groot belang. Zo kan men inschatten hoe snel de proliferatie gebeurt en hoe ernstig de situatie is. Dit zorgt voor een snellere behandeling van de patiënt. (zie figuur 4.3) A

B

Figuur 4.3: A) Ki67 negatief B) Ki67 positief: de donkerbruine bijna zwarte stippen zijn positieve kernen [eigen foto: vergroting 100X]


47

Resultaten

4.2

Verwerken van resultaten

Er worden 27 afwijkende en 10 normale stalen onderzocht met 3 verschillende antilichamen. Het gaat hier met name over HPV, p16 en Ki67. De immunohistochemische kleuring gebeurt met de Benchmark. De resultaten worden zorgvuldig beoordeeld volgens het aantal gekleurde kernen (specificiteit). Hieruit kan de graad van besmetting/proliferatie worden bepaald. De graad wordt uitgedrukt in niveaus: - niveau 1 wijst op een lichte besmetting/proliferatie; 1/3 of minder van de kernen zijn aangekleurd; - niveau 2 wijst op een matige besmetting/proliferatie; 1/3 tot 2/3 van de kernen zijn aangekleurd; - niveau 3 wijst op een ernstige besmetting/proliferatie; >2/3 van de kernen zijn aangekleurd. Bij het bepalen van HPV en p16 spreekt men van een besmetting, bij Ki67 spreekt men echter over een proliferatie. Er wordt ook rekening gehouden met de sterkte van de kleuring (gevoeligheid), hier spreekt men echter alleen van positief of negatief. Ofwel is er aankleuring of wel niet. 4.2.1

Normale cytologie

Er worden preparaten gekleurd met de ThinPrep PapStain® kleuring. Hieruit worden willekeurig 10 stalen gebruikt waar een normale cytologie te zien is. Deze stalen worden onderzocht via een immunohistochemische kleuring. Deze kleuring gebeurt op de Benchmark. In tabel 4.1 kunt u zien hoe de resultaten berekend worden. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen positieve en negatieve stalen dit wordt als volgt berekend: Tabel 4.1: Berekeningen positieve en negatieve stalen

Positieve stalen:

Voorbeeld HPV:

Aantal * niveau = x

2*1=2

Aantal * niveau = y

8*0=0

x + y = som

2+0=2

som : aantal stalen = z

2 : 10 = 0,2

max. 3 = 100%

3 Æ 100%

Regel van 3 wordt toegepast.

0,2 Æ 6,67%

: 15

Negatieve stalen: 100% - % positieve stalen = …%

100% - 6,67%= 93,33%


48

Resultaten

Tabel 4.2: Resultaten normale cytologie N°

graad

HPV

p16

Ki67

1

1115/normaal

0

0

0

2

1116/normaal

0

0

0

3

1118/normaal

1

1

1

4

1121/normaal

1

0

1

5

1123/normaal

0

0

0

6

1125/normaal

0

0

0

7

1126/normaal

0

0

0

8

1128/normaal

0

0

0

9

1129/normaal

0

0

0

10

1139/normaal

0

0

0

Positieve stalen

2:10 = 0,2

1:10 = 0,1

2:10=0,2

Æ6,67%

Æ3,33%

Æ6,67%

Æ 93,33%

Æ 96,67%

Æ 93,33%

Negatieve stalen

Normale cytologie

1 = licht 2 = matig

1,2

3= ernstig

1 0,8

HPV

positieve graad 0,6

p16 Ki67

0,4 0,2 0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

staalnummers

Figuur 4.4: Normale stalen in functie van de positieve graad


49

Resultaten

4.2.2

ASCUS/AGUS

Er worden preparaten gekleurd met de ThinPrep PapStain® kleuring. Hieruit worden willekeurig 10 stalen gebruikt waar een ASCUS/AGUS te zien is. Deze stalen worden onderzocht via een immunohistochemische kleuring. Deze kleuring gebeurt op de Benchmark. In tabel 4.1 kunt u zien hoe de resultaten berekend worden. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen positieve en negatieve stalen. Tabel 4.3: Resultaten ASCUS/AGUS HPV p16

N°

graad

1

922/AGUS

2

2

0

2

943/ASCUS

1

1

0

3

948/ASCUS

2

1

1

4

950/AGUS

1

1

1

5

954/ASCUS

0

0

0

6

975/ASCUS

0

0

0

7

987/ASCUS

1

0

0

8

996/ASCUS

0

0

0

9

1034/ASCUS

1

0

0

10

1008/AGUS

1

1

1

Positieve stalen

9:10=0,9

6:10=0,6

3:10=0,3

Æ 30,03%

Æ 20%

Æ 10%

Æ 69,97%

Æ 80%

Æ 90%

Negatieve stalen

Ki67

ASCUS/AGUS

1 = licht 2 = matig

2,5

3= ernstig 2 HPV

1,5 positieve graad

p16 1

Ki67

0,5 0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

staalnummers

Figuur 4.5: Stalen met een ASCUS/AGUS in functie van de positieve graad Onderzoek van cervicale intra-epitheliale neoplasie aan de hand van HPV, p16 en Ki67

50

Resultaten

4.2.3

LSIL

Er worden preparaten gekleurd met de ThinPrep PapStain® kleuring. Hieruit worden willekeurig 10 stalen gebruikt waar een LSIL te zien is. Deze stalen worden onderzocht via een immunohistochemische kleuring. Deze kleuring gebeurt op de Benchmark. In tabel 4.1 kunt u zien hoe de resultaten berekend worden. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen positieve en negatieve stalen. Tabel 4.4: Resultaten LSIL HPV p16

N°

graad

1

965/LSIL

0

0

0

2

1105/LSIL

3

2

2

3

1053/LSIL Chlamydia

0

0

0

4

1061/LSIL

0

0

2

5

1078/LSIL

0

0

0

6

1080/LSIL

0

0

0

7

1091/LSIL

1

1

0

8

1108/LSIL

0

0

1

9

1143/LSIL

0

0

0

10

1152/LSIL

0

0

0

Positieve stalen

4:10=0,4

3:10= 0,3

5:10 = 0,5

Æ 13,33%

Æ 10%

Æ 16,67%

Æ 86,67%

Æ 90%

Æ 83,33%

Negatieve stalen

Ki67

LSIL

1 = licht 2 = matig

3,5

3= ernstig

3 2,5

HPV

2 positieve graad

p16

1,5

Ki67

1 0,5 0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

staalnummers

Figuur 4.6: Stalen met een LSIL in functie van de positieve graad Onderzoek van cervicale intra-epitheliale neoplasie aan de hand van HPV, p16 en Ki67

51

Resultaten

4.2.4

HSIL

Er worden preparaten gekleurd met de ThinPrep PapStain® kleuring. Hieruit worden slechts 7 stalen gebruikt waar een HSIL te zien is. Er worden niet meer stalen onderzocht omdat er niet meer stalen ter beschikking waren. Deze stalen worden onderzocht via een immunohistochemische kleuring. Deze kleuring gebeurt op de Benchmark. In tabel 4.1 kunt u zien hoe de resultaten berekend worden. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen positieve en negatieve stalen. Tabel 4.5: Resultaten HSIL HPV p16

N°

graad

1

1099/HSIL

0

0

0

2

1186/HSIL

1

1

1

3

1302/HSIL

0

0

0

4

1343/HSIL

0

0

0

5

236794/HSIL

0

0

0

6

090547/HSIL

3

3

3

7

173725/HSIL

0

0

0

Positieve stalen

4:7 = 0,57

4:7 = 0,57

4:7 = 0,57

Æ 19%

Æ 19%

Æ 19%

Æ 81%

Æ 81%

Æ 81%

Negatieve stalen

Ki67

HSIL

1 = licht 2 = matig

3,5

3= ernstig

3 2,5

HPV

2 positieve graad

p16

1,5

Ki67

1 0,5 0 1

2

3

4

5

6

7

staalnummers

Figuur 4.7: Stalen met een HSIL in functie van de positieve graad


52

Resultaten

4.3

Vergelijkende studie

4.3.1

HPV vs. p16 vs. Ki67

In de tabel hieronder vindt u het gemiddelde van de positieve stalen per graad van dysplasie. Het gemiddelde van de positieve stalen wordt berekend zoals in tabel 4.1 wordt weergegeven. Tabel 4.6: Vergelijkende studie (HPV vs. p16 vs. Ki67) Positieve stalen

Normale cytologie

ASCUS/AGUS

LSIL

HSIL

HPV

6,67%

30,03%

13,33%

19%

p16

3,33%

20%

10%

19%

Ki67

6,67%

10%

16,67%

19%

Niet pathogene HPV

6,67% - 3,33% = 3,34%

10,03%

3,33%

0%

Interpretatie: -

Ki67 blijft gestaag toenemen.

-

HPV en p16 lijken eerst af te nemen, maar zijn steeds aanwezig bij HSIL.

-

Blijkbaar is er aanvankelijk een soort van verweer maar geen echte afweer. Hiermee wordt verwezen naar HPV die eerst lijkt af te nemen. HPV is lokaal, vaginaal of cervicaal blijkbaar gedurende een bepaalde tijd in mindere mate aanwezig, maar is tijdens die periode in het bloed terug te vinden.

-

ASCUS/AGUS voornamelijk p16 (naast HPV)

-

LSIL en HSIL voornamelijk Ki67 (naast HPV)


53

Resultaten

4.3.2

HPV vs. Ki67

HPV en Ki67 worden met elkaar vergeleken. Hierbij wordt er rekening gehouden met het aantal positieve stalen. Het doel van deze vergelijking zit hem in het feit dat men wil weten in welke mate HPV en Ki67 gemeenschappelijk voorkomen. Tabel 4.7: Vergelijkende studie HPV vs. Ki67 Normale cytologie HPV:

Ki67:

2 * HPV positief

2 * Ki67 positief

Resultaat: 100% ASCUS/AGUS HPV:

Ki67:

7 * HPV positief

3 * Ki67 positief

- 2 * niveau 2

- 1 * bij niveau 2 HPV

- 5 * niveau 1


Resultaat: 42,92% LSIL HPV:

Ki67:

2 * HPV positief

3 * Ki67 positief

- 1 * niveau 3

- 1* bij niveau 3 HPV

- 1 * niveau 1

- 2 * zonder positieve HPV

Resultaat: 50% HSIL HPV:

Ki67:

2 * HPV positief

2 * Ki67 positief

- 1 * niveau 3


- 1 * niveau 1


Resultaat: 100% Gemiddelde: 73,23% is zowel positief voor HPV als voor Ki67

Interpretatie: - HPV en Ki67 komen in een groot percentage voor. - Ki67 is de belangrijkste maatstaaf voor de prognose van HPV besmette patiënten. - Bij de LSIL is het aantal positieve Ki67 groter dan het aantal positieve HPV Onderzoek van cervicale intra-epitheliale neoplasie aan de hand van HPV, p16 en Ki67

54

Resultaten

4.3.3

HPV vs. p16

HPV en p16 worden met elkaar vergeleken. Hierbij wordt er rekening gehouden met het aantal positieve stalen. Het doel van deze vergelijking zit hem in het feit dat men wil weten in welke mate HPV en p16 gemeenschappelijk voorkomen. Hieruit kan men dan concluderen in welke mate de bepaling van Ki67 van belang is bij pathogene HPV besmettingen. We weten immers al dat HPV en Ki67 veel gemeenschappelijk voorkomen (zie tabel 4.7) Tabel 4.8: Vergelijkende studie HPV vs. p16 Normale cytologie HPV:

p16:

2 * HPV positief

1 * p16 positief

Resultaat: 100% ASCUS/AGUS HPV:

p16;

7 * HPV positief

5 * p16 positief

- 2 * niveau 2


- 5 * niveau 1


Resultaat: 71,43% LSIL HPV:

p16:

2 * HPV positief

2 * p16 positief

- 1 * niveau 3


- 1 * niveau 1


Resultaat: 100% HSIL HPV:

p16:

2 * HPV positief

2 * p16 positief

- 1 * niveau 3


- 1 * niveau 1


Resultaat: 100% Gemiddelde: 92,86% is zowel positief voor HPV als voor p16


55

Resultaten

Interpretatie: -

HPV en p16 komen in een groot percentage samen voor.

- Ki67 is de belangrijkste maatstaaf voor de prognose van pathogene HPV besmette patiënten.

4.4

Herprocessen van bloederige preparaten

4.4.1

Voor de behandeling

A

B

Figuur 4.8: Voor de behandeling van het bloederige staal (staal 1105) A) vergroting 100X [eigen foto] B) macroscopisch uitzicht uitstrijkje [26]

Interpretatie: - De cellen liggen voornamelijk aan de rand van het gemaakte preparaat. De cel-

len zijn niet overduidelijk zichtbaar (zie figuur 4.8 B) - In het centrum van het preparaat is echter zo goed als niets te vinden qua cel-

len. (zie figuur 4.8 B) Dit alles is het gevolg van de grote hoeveelheden bloed die in het staal aanwezig zijn. Er kan slechts uit een kleine hoeveelheid cellen een diagnose worden gesteld. (zie figuur 4.8 A)


56

Resultaten

4.4.2

Na de behandeling

A

B

Figuur 4.9: Na de behandeling van het bloederige staal (staal 1105) A) vergroting 100X [eigen foto] B) macroscopisch uitzicht uitstrijkje [26]

Interpretatie: - Macroscopisch ziet het preparaat er normaal uit. (zie figuur 4.9 B) - De cellen zijn duidelijk zichtbaar. (zie figuur 4.9 A) De diagnose kan hier zoals bij een normaal uitstrijkje worden gesteld.

4.5

Rapportering van de resultaten

Voor de rapportering van de cervicale uitstrijkjes werd lange tijd de Papanicolaou classificatie (PAP-I t.e.m. PAP-V) gebruikt. Naarmate de diagnostische en vooral de therapeutische mogelijkheden bij (pre-)kankerletsels van de cervix evolueerde, werd duidelijk dat de PAP-classificatie niet langer als richtinggevende parameter kon gehanteerd worden. In 1991 werd een nieuwe classificatie voorgesteld, namelijk de Bethesda classificatie. Deze Bethesda classificatie werd in 2001 op een aantal punten verfijnd om te komen tot wat momenteel de “Bethesda 2001“ genoemd wordt. In het laboratorium van dr. Speelman maakt men zowel gebruik van de CIN classificatie als de Bethesda classificatie van 1991.(zie bijlage 8.1)[33]


57

Discussie

5

Discussie

Het doel van dit eindwerk berust op 3 immunohistochemische testen. Het gaat hier met name over HPV, p16 en Ki67. Deze kleuringen gebeurden op ThinPrep preparaten wat in het verleden hier nog nooit eerder is gebeurd. De cytologische bepalingen gebeurden vooreerst enkel met HPV en p16. In dit onderzoek wordt er eveneens gebruik gemaakt van Ki67. Ki67 heeft als doel de graad van proliferatie weer te geven. Het is de bedoeling om aan de hand van de bekomen resultaten een prognose te kunnen stellen van cervicale intra-epitheliale letsels. Hierbij moet men toezien dat de 3 verschillende antilichamen evenveel tot dit doel bijdragen. Hiermee wordt bedoeld dat er geen onnodige testen mogen gebeuren voor het stellen van de prognose. Er werden 27 afwijkende en 10 normale stalen onderzocht. De 27 afwijkende stalen kan men onderverdelen in 10 ASCUS/AGUS stalen, 10 LSIL en 7 HSIL stalen. Per staal worden er 3 preparaten gemaakt met de ThinPrep 2000. De immunohistochemische kleuring gebeurt met de Benchmark. De resultaten worden zorgvuldig beoordeeld volgens het aantal gekleurde kernen (specificiteit). Hieruit kan de graad van besmetting/proliferatie worden bepaald. De graad wordt uitgedrukt in niveaus: - niveau 1 wijst op een lichte besmetting/proliferatie; 1/3 of minder van de kernen zijn aangekleurd; - niveau 2 wijst op een matige besmetting/proliferatie; meer dan 1/3 tot 2/3 van de kernen zijn aangekleurd; - niveau 3 wijst op een ernstige besmetting/proliferatie; >2/3 van de kernen zijn aangekleurd. Bij het bepalen van HPV en p16 spreekt men van een besmetting, bij Ki67 spreekt men echter over een proliferatie. Er wordt ook rekening gehouden met de sterkte van de kleuring (gevoeligheid), hier spreekt men echter alleen van positief of negatief. Ofwel is er aankleuring of wel niet. Aangezien de testen in reeksen zijn uitgevoerd gebeurt er een interne controle. Het is dan ook de bedoeling om na te gaan of er per reeks zowel positieve als negatieve resultaten worden vastgesteld. Na het bekomen van alle resultaten werd er een vergelijkende studie opgestart. De 3 verschillende antilichamen werden vergeleken. Er werd rekening gehouden met het aantal positieve stalen en de graad van besmetting/ proliferatie. Het is de bedoeling om met behulp van deze studie te bepalen in welke mate deze 3 antilichamen van nut zijn bij een bepaalde graad van dysplasie. Uit de resultaten blijkt dat Ki67 gestaag blijft toenemen, naarmate de graad van dysplasie toeneemt. Ook kan men stellen dat HPV en p16 eerst lijken af te nemen, maar toch steeds aanwezig zijn bij HSIL. Naast HPV komt vooral p16 voor bij Onderzoek van cervicale intra-epitheliale neoplasie aan de hand van HPV, p16 en Ki67

58

Discussie

ASCUS/AGUS. Bij de LSIL en HSIL is het voornamelijk Ki67 die naast HPV voorkomt. HPV en Ki67 werden vergeleken. Hierbij werd er enkel rekening gehouden met het aantal positieve stalen. Het doel van deze vergelijking zit hem in het feit dat men wil weten in welke mate HPV en Ki67 gemeenschappelijk voorkomen. Uit de bekomen resultaten blijkt dat HPV en Ki67 in 73,23% van de gevallen samen voorkomt. Er werd eveneens opgemerkt dat het aantal positieve Ki67 groter is bij de LSIL dan het aantal positieve HPV. Dit kan wijzen op een oude besmetting met HPV. De proliferatie kan nog enkele tijd groter zijn dan normaal. Ook kan de oorzaak van de verhoogde proliferatie te wijten zijn aan andere factoren zoals bijvoorbeeld oestrogenen. Een verhoogde hoeveelheid oestrogenen kan immers leiden tot een verhoogde proliferatie van vaginale epitheliale cellen. Als laatste worden HPV en p16 met elkaar vergeleken. Hierbij wordt er rekening gehouden met het aantal positieve stalen. Deze vergelijking is uitgevoerd zodat men kan bepalen in welke mate deze 2 antilichamen gemeenschappelijk kunnen voorkomen. Aan de hand van onze voorgaande vergelijking kan er geconcludeerd worden in welke mate de bepaling van Ki67 van belang is bij pathogene HPV besmette patiënten. Uit de bekomen resultaten merkt men op dat HPV en p16 in 92,86% van de gevallen samen voorkomt. Aan de hand van deze vergelijkende studies zal men conclusies trekken over het gebruik van HPV, p16 en Ki67.


59

Conclusie

6

Conclusie

Uit de vergelijkende studie gemaakt tussen de 3 verschillende antilichamen, kan men concluderen dat p16 voornamelijk van belang is bij ASCUS/AGUS naast HPV weliswaar. Bij de laaggradige en hooggradige SIL is voornamelijk Ki67 van belang naast HPV. Bij de vergelijkende studie tussen HPV en Ki67 wordt er rekening gehouden met het aantal positieve stalen. Men kan uit de bekomen resultaten concluderen dat Ki67 de belangrijkste maatstaaf is voor de prognose van HPV besmette patiënten. Als laatste worden HPV en p16 met elkaar vergeleken. Hierbij wordt er rekening gehouden met het aantal positieve stalen. Men merkt op dat HPV en p16 in een percentage van 92,86% samen vookomen. Uit de voorgaande vergelijking weet men echter al dat HPV ook veel gemeenschappelijk voorkomt met Ki67. Men kan hieruit concluderen dat ook hier Ki67 de belangrijkste maatstaaf is voor de prognose van pathogene HPV besmette patiënten. Als eindbesluit kan men concluderen dat de 3 gebruikte antilichamen weldegelijk nodig zijn bij het stellen van de prognose van cervicale intra-epitheliale letsels. Het eventueel screenen van meer stalen zou zorgen voor een nog grotere juistheid van de resultaten. De 3 antilichamen om een prognose te stellen zullen echter alleen worden gebruikt, indien dit specifiek door de gynaecoloog wordt aangevraagd. Deze testen zijn immers niet terugbetaald en moeten dus volledig door de patiënt worden betaald. Daarom zullen deze antilichamen dan ook meestal enkel in het geval van een HSIL worden aangevraagd. Aangezien er zowel positieve als negatieve resultaten gediagnostiseerd zijn, kan men concluderen dat zowel de methode van werken, als het aflezen van de resultaten op een correcte en nauwkeurige manier is voltooid. Het is echter wel jammer dat een follow-up in dit onderzoek ontbreekt. Verder onderzoek is dus noodzakelijk.


60

Literatuurlijst

7 [1]

Literatuurlijst MLO Leeuwarden, Bouw van een virus [www], 2007 URL: http://www.microbiologie.info/bouw_van_een_virus.htm Gezien 12/03/2009

[2]

Dr. De Brauwer B.,Humaan Papillomavirus, 16/02/2009, PowerPoint

[3]

Hoge Gezondheidsraad, Vaccinatie tegen infecties veroorzaakt door het humaan papillomavirus, 05/12/2007

[4]

Dr Praet M., Cervical Cancer-role played by HPV, PowerPoint

[5]

Burgmeijer R., Hoppenbrouwers K., Bolscher N., Handboek vaccinaties, Van Gorcum

[6]

Wetenschappelijke Vereniging van Vlaamse Huisartsen vzw, Het uitstrijkje [www], 2004 URL: http://www2.domusmedica.be/files/uitstrijkje_pf.pdf Gezien 15/04/2009

[7]

Vanhulle M.,HPV detectie en interpretatie, eindwerk 2005-2006

[8]

Dr. Praet M., Vaginale & cervix cytologie, PowerPoint

[9]

Stevens A., Lowe J., Pathologie, Bohn Stafleu Van Loghum, 2003

[10] Saarloos E., Follow-up PAP 2 en de relatie met HPV, oktober 2007 [11] Dr. Speelman T, anatoom-patholoog [12] Dr. Vanstapel M-J.,Cytologische en histologische afwijkingen van de cervix door HPV infectie, PowerPoint [13] Meyer C., Paulay G.,CGDP-DNA Amplification [www], 1/10/2005 URL: http://www.flmnh.ufl.edu/cowries/amplify.html Gezien 08/04/2009 [14] Demeyere M.,BLT_13 Biotechnologie I, 2006-2007 [15] Virga Jesseziekenhuis, Het principe van PCR [www] URL:http://www.virgajesse.be/deelwebsites/Moleculaire_Diagnostiek/Welkom Gezien 9/04/2009 [16] The ThinPrep PAP test, protocol ThinPrep [www] URL: http://www.cma.be/Portals/0/disciplines/anapath/thinprep.pdf Gezien 09/04/2009


61

Literatuurlijst

[17] VU medisch centrum, informatie voor professionals [www], 2008 URL: http://www.hpvthuistest.nl/Professionals/Professionals.htm

Gezien 9/04/2009 [18] Leids Cytologisch en Pathologisch laboratorium, Jaarverslag 2003 [www], Coulomb Press Leyden 2004 URL: http://www.lcpl.nl/diversen/jaarverslagen/data/jv2003.pdf Gezien 9/04/2009 [19] LCI/CIb/RIVM richtlijnen, Humaan papillomavirus [www] URL: http://www.rivm.nl/ Gezien 11/04/2009 [20] RIVM, HPV vaccinatie [www], 19/11/2008 URL: http://www.rivm.nl/cib/themas/HPV-vaccinatie/#index_1 Gezien 11/04/2009 [21] Feng W.,Senescence and apoptosis in carcinogenesis of cervical squamous carcinoma [www], 26/11/2006 URL: http://www.nature.com/modpathol/journal/v20/n9/full/3800927a.html Gezien 13/04/2009 [22] Kellner N.,Immunohistochemie, 2008-2009 [23] Shepherd P S, Cason J., Patel D. Data Sheet Papillomavirus (types 6,11, 18) mouse monoclonal antibody NCL-HPV-4C4, 2003 [24] Labonord, Vroegtijdige opsporing van het cervixcarcinoma [25] ThinPrep, The ThinPrep® PAP Test PreservCyt®-oplossing gebruiksaanwijzingen [26] Am J Clin Pathol, The Unsatisfactory ThinPrep Pap Test [www], 2002 URL: http://www.medscape.com/viewarticle/430142_3 Gezien 15/04/2009 [27] Beans B., Carol L., Croft J., …, Medische doorbraken 2003, Reader’s Digest [28] Atrium medisch centrum parkstad, In situ hybridisatie [www] URL: http://www.atriummc.nl/In-situ-hybridisatie.13052.0.html Gezien 16/04/2009 [29] Annovum, FISH: Fluorescetie in-situ hybridisatie [www] URL: http://www.annovum.nl/Technieken/fish.html#Principe Gezien 16/04/2009 Onderzoek van cervicale intra-epitheliale neoplasie aan de hand van HPV, p16 en Ki67

62

Literatuurlijst

[30] ThinkQuest, Mitose [www] URL: http://library.thinkquest.org/17498/dutch/s14.htm Gezien 17/04/2009 [31] Van Toren J.,ThinPrep PapStain® protocol, 2009 [32] Cytyc, ThinPrep® 2000, handleiding [33] CMA/CLH, Cervix cytologie: Bethesda classificatie [www], 2007-03 URL: http://www.cma.be/Portals/0/Nieuws/NB-WS%20200703%20Bethesda.pdf Gezien 17/04/2009 [34] AZ Sint-Jan, De Papanicolaoukleuring, SOP Gezien: 11/05/2009 [35] Kellner N., Immunohistochemie, partim Immunohistochemie en radioprotectie, 2008-2009 [36] Vector Laboratories, The Biotin-Avidin System [www] URL: http://www.vectorlabs.com/ Gezien: 09/05/2009 [37] Ventana, iVIEWTM DAB Detection Kit, protocol gezien: 09/05/2009 [38] Thin Prep, ThinPrep PapStain® gezien: 11/05/2009 [39] de Jong S., De invloed van de anti-androgene stiffen ORG X en ORG Y op prostaattumorgroei in een muismodel [www], mei 2008 URL: http://hbo-kennisbank.uvt.nl/cgi/av/show.cgi?fid=3406 Gezien: 01/06/2009


63

Bijlagen

8

Bijlagen

Bijlage 8.1: Verschillende mogelijkheden van rapportering [33]


64

Colofon

Colofon Mijn eindwerk werd tot stand gebracht door middel van: - Laptop HP Pavilion - Besturingssysteem Windows XP - Tekstverwerkingsprogramma Microsoft Office Word 2003 o Kop 1: Arial, 14pt, vet, witte tekstkleur met zwarte achtergrond o Kop 2: Arial, 13pt, vet o Kop 3: Arial, 12pt, vet o Kop 4: Arial, 12pt, cursief o Normale tekst: Arial 12pt o Bijschrift: Arial, 10pt, vet, cursief o Kop- en voettekst: Arial, 10pt, vet Datum van voltooiing: 08/06/2009


65

Voor akkoord verklaring Dit eindwerk is een examen: eventuele fouten die worden vastgesteld tijdens de eindwerkverdediging of erna werden niet gecorrigeerd. Het gebruik als referentie in publicaties is toegelaten na goedkeuring van de stagebegeleider, vermeld op de titelbladzijde

Dr. Thierri Speelman stagementor

Kaat Van Oostveldt stagebegeleider


66

Woord vooraf. Sharon, juni Onderzoek van cervicale intra-epitheliale neoplasie aan de hand van HPV, p16 en Ki67 1

Recommend Documents