Tartalomjegyzék FOCUS MEDICINAE

2009. XI. évfolyam 1. szám

FOCUS MEDICINAE Felelõs szerkesztõ: Dr. Szolnoky Miklós Fõszerkesztõ: Dr. Karabélyos Csaba Szerkesztõbizottság: Dr. Bencsik Krisztina Prof. Czirják László Dr. Futó Judit Prof. Horváth Örs Péter Dr. Kalmár Ágnes Dr. Mátrai Zoltán Dr. Nemes László Dr. Paál Mária Dr. Pál Katalin Prof. Zeher Margit Szerkesztõbizottság tanácsadó testülete: Prof. Fekete György Prof. Kiss Attila Dr. Kiss István Prof. Komoly Sámuel Prof. Lipták József Prof. Mándi Yvette Prof. Maródi László Prof. Medgyesi György Dr. Mészner Zsófia Dr. M. Tóth Antal Dr. Nagy Kálmán Prof. Pálóczi Katalin Prof. Perner Ferenc Prof. Pénzes István Prof. Péter Ferenc Prof. Romics Imre Prof. Rozgonyi Ferenc Prof. Sas Géza Prof. Schuler Dezsõ Dr. Siklós Pál Prof. Szegedi Gyula Dr. Szita János Prof. Tekeres Miklós Prof. Tímár László Dr. Trestyánszky Zoltán Prof. Tulassay Tivadar

Focus Medicinae

Tartalomjegyzék Genetika, genomika, posztgenomika: múlt, jelen, jövõ /Genetics, genomics, postgenomics: past, present, future/ Dr. Németh Krisztina, Prof. Fekete György

2

Hogyan mûködnek a természetes killersejtek? (Az NK sejtek genomikája) /How does the natural killer cells work? (Genomics of the NK cells)/ Dr. Benczúr Miklós

8

Autoimmunitás: alapmechanizmusok és azok szerepe endokrin betegségekben /Autoimmunity: basic mechanisms and their role in the endocrine diseases/ Dr. Kalmár Ágnes, Dr. Szolnoky Miklós

17

A vércsoportszerológia elmúlt 10 éve /The recent 10 years of the red serology/ Dr. Hoffer Izabella

23

Biomarkerek – a procalcitonin szerepe a diagnosztikában /Biomarkers – the role of procalcitonin in the diagnostics/ Prof. Molnár Zsolt

27

Alapító: Biotest Hungaria Kft. Kiadja és a nyomdai munkáért felelõs: Dursusz Bt. Szerkesztõség és levelezési cím: 2045 Törökbálint, Torbágy u. 15/A ISSN: 1419-0478 Megjelenik: évente négyszer Elõfizetési díj: 2009. évre 2009,- Ft + 5% áfa 1


Genetika, genomika, posztgenomika: múlt, jelen, jövõ

Genetika, genomika, posztgenomika: múlt, jelen, jövõ Dr. Németh Krisztina, Prof. Fekete György Semmelweis Egyetem, II. sz. Gyermekgyógyászati Klinika, Budapest Összefoglalás: A Human Genom Program mérföldkõ volt a genetika történetében. Lehetõséget adott arra, hogy kilépjünk a klasszikus genetika korszakából és beléphessünk a genomika világába. A genomika, amely a szervezet teljes genomjának szerkezetét vizsgálja, egy egész sor új tudományterület kialakulását tette lehetõvé. Ehhez természetesen szükség volt a laboratóriumi technikák valamint a számítástechnika, illetve a bioinformatika ugrásszerû fejlõdésére is. A farmakogenomika célja a személyre szabott gyógyszeres kezelés kifejlesztése. A komparatív genomika a homológia felhasználásával igyekszik a gének funkcióját meghatározni. A strukturális- és funkcionális genomika a genomban kódolt fehérjemolekulák térszerkezetét vizsgálja, majd a térszerkezethez igyekszik párosítani a funkciót. A populációgenomika feladata az egyes populációk genetikai összetételének, illetve a genetikai összetételt megváltoztató mechanizmusoknak a vizsgálata. A genetikai betegségek gyógyítási módja a jövõben reményeink szerint a hatékony génterápia lesz, amelynek kifejlesztése napjaink nagy kihívása. Miközben még tart a genomika korszaka, már kibontakozóban van a posztgenomika is, amely teljesen új értelmezést ad a genetikai eredetû betegségek kialakulásáról alkotott eddigi elképzeléseinknek.

Summary: The Human Genome Project was a milestone in the history of genetics. It presented the opportunity for crossing over the era of classical genetics into the world of genomics. Genomics as a science of analysing the whole human genome has been promoting a great number of new scientific disciplines. The significant leap of laboratory techniques, as well as computer science and bioinformatics was necessary for this development. The aim of pharmacogenomics lies in the individually tailored pharmaceutical therapy. Comparative genomics has the intention to identify gene functions by using homology studies. Structural and functional genomics are analysing the three-dimensional structures of coded protein molecules, combining construction and action. Treatment of genetic diseases will be the successful gene therapy in the future, and the processing of the necessary methods seems to be an important challenge of our time. Since genomics being still going on, post genomics has been also developing, providing a completely new explanation of the aetiology of hereditary diseases.

Kulcsszavak: Human Genom Program, microarray, bioinformatika, genomika, génterápia, posztgenomika

Key words: Human Genome Project, microarray, bioinformatics, genomics, gene therapy, post-genomics

Genomika: Az új korszak kezdete

tották, hogy 99,9%-os az egyezés a nukleotid bázisokban az összes emberben, és, hogy a korábbi becslésekkel ellentétben – amelyek 80–140 ezer emberi gént feltételeztek – mindössze 24-25 ezer gén található a humán genomban. Megtudták, hogy a gének több mint 50%ának nem ismert a funkciója valamint, hogy a genom kevesebb, mint 2%-a kódol fehérjéket. Felismerték, hogy a gének a genomnak mindössze 1,3%-át teszik ki, a genom legalább 50%-a pedig ismétlõdõ, fehérjét nem kódoló szekvenciákból áll. Az alternatív splicing (kivágódás) segítségével pedig egy génrõl több különbözõ fehérjetermék képzõdhet. A Human Genom Program mérföldkõ volt a genetika történetében. Lehetõséget adott arra, hogy kilépjünk a klasszikus genetika korszakából, és beléphessünk a genomika világába. Mi a különbség a kettõ között? Míg a genetika egyes tulajdonságok öröklésével, egyes gének szerkezetével és mûködésével foglalkozik, addig a genomika tárgya az élõ szervezet DNS-ének egésze. A genomika tehát a szervezet teljes genomjának szerkezetét vizsgálja, beleértve a gének számát, méretét és eloszlását, de vizsgálatának tárgya a gének közötti DNS-szakaszok szerkezete, elhelyezkedése és biológiai szerepe is. Ezeken túlmenõen foglalkozik a különbözõ szervezetek genomjainak összehasonlításával is. Míg a geneti-

Az 1990-ben kezdõdött Human Genom Program elsõ – közvetlen célokat tartalmazó – szakasza 1993-tól 1998-ig tartott. Minden kitûzött célját sikerrel elérte, kifejlesztette azokat a technikai lehetõségeket, amelyek az eredetileg 1998-2003 évekre tervezett következõ szakaszban lehetõvé tették a teljes humán genom DNS szekveciájának meghatározását (4). Ezt a feladatot, a 3,2 milliárd nukleotid sorrendjének meghatározását azonban jóval korábban, már 2000 júniusára megoldották. Hat ország tizenhat nagy kutatólaboratóriumának több, mint ezeregyszáz biológusa és informatikusa foglalkozott ezzel a páratlanul nagyszabású feladattal. Az eredményekrõl 2001. február 15-én a Nature, a következõ napon pedig a Science számolt be – mindkettõ különkiadásban. Azóta tehát ismerjük az emberi genom kémiai szerkezeti képletét. Ezzel a munka korántsem fejezõdött be, sõt az igazi, érdemi része csak ezután következett, nevezetesen a DNS-ben kódolt gének azonosítása, mûködésük meghatározása, a gének bekapcsolási sorrendjének, a kapcsolatok rendszerének feltárása, valamint az, hogy megértsük a nem kódoló szakaszok funkcióját. A végül 2003-ban lezárult vizsgálatok a következõ eredményekkel gazdagították a tudományt. Megállapí2


ka azt vizsgálja, hogy ismert funkciókat és tulajdonságokat milyen genetikai háttér kódol, addig a genomika fordított sorrendben, elõbb a DNS-szerkezetet határozza meg és már annak ismeretében keresi a DNS-szakaszokhoz tartozó funkciót, tulajdonságot.

Microarray (chip) technológia A genetikából a genomika korszakába való átlépéshez azonban a genomprogramok befejezésén kívül más fontos tudományos eredmények megjelenése is szükséges volt. Az egyik technikai jellegû áttörés, amely nagymértékben elõsegítette a genomika alkalmazását, a microarray (chip) technika kidolgozása. Ennek segítségével nemcsak nagyságrendekkel nõtt meg a párhuzamosan vizsgálható gének száma, hanem azok nukleotid-sorrendjének meghatározása mellett funkcionális információkhoz (génkifejezõdés, expresszió) is juttatta a kutatót. A DNS-chipek felhasználásával mutációk jelenléte vagy hiánya vizsgálható. Ez a módszer veleszületett, öröklõdõ betegségek genetikai hátterének kimutatására használható, de betegséget önmagában nem okozó, úgynevezett „single nucleotide polymorphism” (SNP) vizsgálatára is alkalmas. Génexpressziós microarray segítségével expressziós vizsgálatok végezhetõk egy adott sejt- vagy szövettípus géntermékeinek (hírvivõ RNS-ek vagy fehérjék) jelenlétének, mennyiségének, valamint jelenlétük idõtartamának meghatározása céljából. A génexpressziós mintázat segítségével információ kapható a vizsgált sejt vagy szövet aktuális állapotáról, illetve funkciójáról. Egészséges és beteg személyek meghatározott szövetébõl készült expressziós összehasonlító vizsgálatokkal kiszûrhetõk azok a gének, illetve géncsoportok, amelyek expressziója vagy éppen „elcsendesedése” az adott beteg sejtre vagy szövetre jellemzõ, míg egy egészséges sejtre vagy szövetre nem.

Bioinformatika A másik tudományterület, amely elengedhetetlen a genomika által szolgáltatott hatalmas adattömeg kezelésére, a bioinformatika. A bioinformatika az a tudományág, amely a biológiai tudományok területén keletkezett információkat, adatokat korszerû informatikai, matematikai és számításechnikai eszközökkel tárolja, összesíti és feldolgozza. Ezek az információk a genomok analízise eredményeképpen kapott nukleinsav és aminosav szekvenciák, valamint az azokhoz tartozó, már megfejtett szerkezeti, funkcionális és egyéb információk. A chipek által szolgáltatott adathalmaz bioinformatikai elemzése során a számítógép clusterekbe, csoportokba rendezi a kapott információkat.

Single nucleotide polymorphism (SNP) A DNS-chipek segítségével mutációk jelenléte vagy hiánya mutatható ki. Ennek a technikának a segítségével rövid idõ alatt akár több gén egyidejû vizsgálatával veleszületett génhibák deríthetõk fel, de az úgynevezett „single nucleotide polymorphism” (SNP) vizsgálatára


is használható. A SNP olyan pontmutáció – vagyis egyetlen nukleotid kicserélõdése egy másik nukleotidra – amely legalább egy populációban 1%-nál nagyobb gyakorisággal fordul elõ. Az egyes személyek DNS állományában a nukleotidbázisok körülbelül minden ezredik ponton különböznek – vagyis a teljes haploid genomban mintegy hárommillió SNP van – de természetesen eloszlásuk nem egyenletes. Független genetikai allélként öröklõdnek, tehát több SNP együttes vizsgálatával az adott egyénre jellemzõ genetikai jellegeket tudjuk követni. (10 SNP együttes mintázata egymillió, míg 20 SNP már egymilliárd ember között tud különbséget tenni). Mivel már több ezer SNP-t azonosítottak, a lehetõségeink szinte korlátlanok. Az SNP-könyvtárak használata nagyon sok segítséget nyújthat például az igazságügyi orvostanban (apasági tesztek, kriminalisztikai vizsgálatok), de nagy remények fûzõdnek a személyre szabott gyógykezelés kialakításához a gyógyszermellékhatások prediktív feltárása segítségével (farmakogenomika). Az SNP-profilok vizsgálata az evolúciós genetikában is sok új információhoz vezethet el. Mivel az SNP-k mindössze körülbelül 1%-a található a gének exonjaiban vagy szabályozó régióiban, õk maguk közvetlenül betegséget nem okozó, csak jelzõ funkcióval rendelkezõ markerek. A humán genetikai variációkat összefoglaló adatbázisok (pl. Hap-Map) sok hasznos adattal látják el a humángenetikai kutatásokat. A bioinformatikai módszereket felhasználva diagnosztikai és prognosztikai következtetéseket egyaránt levonhatunk. Ezenkívül lehetõvé válik olyan géncsoportok azonosítása, amelyek alkalmasak valamely betegség, szövõdmény vagy mellékhatás bekövetkezésének elõre jelzésére. Napjainkig több mint 100 olyan régiót azonosítottak, amelyek SNP variánsai elõsegíthetik egyes gyakran elõforduló megbetegedések (például cukorbetegség, koszorúér-betegség, prosztataés emlõrák, rheumás ízületi gyulladás, gyulladásos bélbetegség, idõskori maculadegeneráció) kialakulását.

Farmakogenomika Régi tapasztalat, hogy az egyes betegek nem egyformán reagálnak a gyógyszeres beavatkozásra. A nagyszámú emberen bevált gyógyszerek egyeseknél kevésbé, másoknál fokozottan hatékonyak. Még az is elõfordulhat, hogy ugyanabban a betegségben szenvedõk között egyeseknél kifejezetten ártalmas lehet az a gyógyszeres kezelés, amely másoknál elõnyösen alkalmazható. A farmakogenomika célja éppen az, hogy elõre jelezni tudjuk egy betegnek az adott gyógyszerre való érzékenységét, illetve a gyógyszer által a betegben kiváltott mellékhatást. E feladat megoldásának a kulcsa a genomprogram termékeként felfedezett SNP-k vizsgálata, illetve a vizsgálati eredményeknek bioinformatikai módszerrel történõ analízise (6). Az SNP-k vizsgálata különösen nagy jelentõséggel bír akkor, amikor a különbözõ betegek ugyanazon gyógyszeres kezelésre adott eltérõ válaszait tanulmányozzák. Hogyan is történik ez a gyakorlatban? A vizsgálat során egy adott betegségben szenvedõ egyének közül kiválasztanak egy olyan betegcsoportot, amely egy adott gyógyszerre mellékha3


tást mutat és egy másik csoportot, amelyik nem. Ezután az SNP-chipek használatával szerzett eredményeket bioinformatikai módszerekkel elemezve olyan SNP-mintázatot keresnek, amely az egyik, vagy a másik csoportra jellemzõ. Ha sikerül különbséget találni a két csoport között – természetesen számítógépes programokkal, bioinformatikai eljárással –, akkor a következõ betegben már csak az SNP-profil meghatározása a feladat és ebbõl jó eséllyel megjósolható az, hogy ajánlott vagy nem javasolt számára az adott gyógyszer szedése. Mindenképpen említésre érdemes, hogy a bioinformatikai módszerek és a rendelkezésre álló hatalmas nemzetközi adatbázisok lehetõvé tették számunkra az „in silico” megközelítést, vagyis segítségükkel laboratóriumi háttér nélkül is korszerû, alkotó jellegû genomikai kutatás végezhetõ. Természetesen a számítógépen végzett kutatások, elõrejelzések nem helyettesítik az in vitro vagy in vivo kísérleti munkát, de nagy segítséget jelenthetnek az azt követõ manuális laboratóriumi munka megtervezésében.

Komparatív (összehasonlító) genomika A genomika természetesen nemcsak az egyes genomokat tanulmányozza. A nagy hatékonyságú vizsgálati módszerek és nemzetközi adatbázisok segítségével kialakulhatott a komparatív (összehasonlító) genomika, amelynek feladata a homológia felhasználásával a humán gének funkciójának tisztázása. Ismeretes, hogy a különbözõ szervezetekben az azonos funkciót ellátó és közös evolúciós eredetû fehérjéket homológoknak, az ugyanazon információt kódoló génszekvenciákat pedig homológ szekvenciáknak nevezik. Ha különbözõ fajok homológ szekvenciáit egymás mellé helyezzük, azonosítani tudjuk azokat a konzervált domén-szerkezeteket, amelyek egy adott fehérjetermék mûködésére utalnak. Az elmúlt években sok hasznos, új információ született a közelebbi és távolabbi rokonságban álló szervezetek teljes genomjainak szerkezeti összehasonlításával. A múltban a fehérjék funkciójának meghatározása volt az elsõ lépés és ezt követte az azonosított fehérjemolekula szerkezetének megismerése. Ez idõigényes, röntgensugárzást és mágneses magrezonanciát alkalmazó vizsgálat volt. Ezzel ellentétben a strukturális genomika elõször a fehérjemolekula szerkezetét határozza meg és csak ezután vizsgálja azt, hogy milyen funkciót lát el. Ennek meghatározása pedig már egy újabb tudományterület, a funkcionális genomika feladata (7).

Strukturális (szerkezeti) genomika A strukturális genomika feladata tehát a genomban kódolt összes fehérje térszerkezetének meghatározása. Tudjuk, hogy az élõvilág fehérjéi mindössze néhány ezer alaptípusba sorolható fehérje-doménbõl épülnek fel, és az egy rokonsági körbe tartozó, homológ fehérje-domének térszerkezete nagymértékben hasonló. Vagyis egy fehérjecsalád új tagjának térszerkezetét a homológia alapján modellezni lehet. A kísérleti szerkezeti genomika célja éppen az, hogy a genomból kiválassza azokat a célfehérjéket, amelyek térszerkezetét kísérleti úton 4


(pl. röntgenkrisztallográfia) meghatározva az összes többi fehérje homológia-modellezési távolságon belül lesz. (Ez azt jelenti, hogy a szekvenciák kb. 20%-ban azonosak). Ilyen módon minden fehérje térszerkezete homológiamodellezéssel megjósolható lesz. Az így megszerzett információk azután felhasználhatók a genomika más területein, például a funkcionális genomikában.

Funkcionális genomika A genomikai korszak egy másik új tudományága a funkcionális genomika. E tudományterület feladata többlépcsõs. Elsõként a genomszekvenciákban rejlõ gének azonosítása szükséges, majd ezután következhet az azonosított génekrõl képzõdött fehérjetermékek funkciójának meghatározása. Segítségével megtudhatjuk, hogy az adott fehérjének milyen biokémiai reakcióban van katalizáló szerepe, esetleg milyen molekula megkötésére képes, illetve, hogy a sejt egészének funkciós rendszerében hol foglal helyet. A bioinformatikai módszerek egyre érzékenyebbé és megbízhatóbbá válásával mind hatékonyabbá válik a genomszekvenciában a gének azonosítása. Meghatározható a gének által kódolt mRNS-ek nukleotid- és a róluk termelõdõ fehérjék aminosav szekvenciája és térszerkezete. Ennek ismeretében pedig összehasonlító vizsgálattal valószínûsíteni lehet azok biológiai funkcióját, mûködési mechanizmusukat. A fehérje funkciójának azonosítása történhet a térszerkezet ismeretében „fold” (gomboly) alapján, illetve az aktív hely geometriája szerint. Az elsõ módszer azonban csak akkor alkalmazható, ha az adott funkció és gomboly között egyértelmû kapcsolat áll fenn. Ez nem minden esetben igaz, gyakran ugyanazt a funkciót többféle gomboly is elláthatja, de ugyanaz a gomboly többféle funkciót is megvalósíthat.

Populációgenomika Az evolúciós biológia egyik lényeges feladata az ökológiai szempontból fontos jellegeket meghatározó gének azonosítása, illetve a gének ismeretében ezután ezen lókuszok természetben elõforduló genetikai variációinak vizsgálata. A cél annak meghatározása, hogy az egyes genetikai variációk milyen fenotípusos következményekkel járnak. Ezen feladat megoldására több új megközelítési módot alkalmaztak, köztük a populációgenomikát. A populáció-genomikai elemzés során különbözõ környezeti körülmények között élõ egyénekben egyidejûleg több molekuláris markert vizsgálnak. A cél az, hogy olyan markermintázatokat találjanak, amelyek az eltérõ környezeti feltételek között élõ egyénekben különböznek. Így szûrhetõk ki azok a gének, amelyek – változékonyságuk miatt – a természetes szelekció mûködésére utalhatnak. Ez a fajta megközelítési mód igen kényelmes, mert egyszerre nagyon sok genetikai markert vizsgálhatunk, nincs feltétlenül szükség a fenotípus és a vizsgált személyek családi vonatkozásainak ismeretére sem. A genetikai változatok felfedezése azonban a munkának csak a kezdete, hiszen ezzel kapcsolatban egy egész sor kérdésre kell a választ megta-


lálni. Vajon a hasonló környezeti körülményekhez való alkalmazkodásért egy fajon belül vagy fajok között is ugyanazon gének vagy mutációk felelõsek? Az alkalmazkodásért felelõs allélek meglévõ genetikai variációk, vagy újonnan keletkezett mutációk? Hogyan változtatja meg a szelekció a genetikai állományt? Hogyan befolyásolják a demográfiai tényezõk és a véletlenszerû események a szervezet alkalmazkodóképességét a megváltozott környezeti körülményekhez? A populációgenomika ezekre a kérdésekre keresi a választ (9).

Génterápia A veleszületett öröklõdõ betegségek túlnyomó többsége ma még nem gyógyítható. Az egyetlen kezelési mód a klinikai tünetek enyhítése, de a betegség okának megszüntetése, a génterápia bevezetése még nagyrészt a jövõ feladata. Számos nemzetközi munkacsoport már évtizedek óta végez kutatásokat ebben az irányban. A feladat az, hogy a hibás gént hordozó sejtekbe az ép gént bejuttassuk, amely a sejtben átveszi a hibás gén feladatát. A legnagyobb probléma e feladat megoldása során a megfelelõ közvetítõ (vektor) kiválasztása. A vektor lehet természetes vagy mesterségesen elõállított cirkuláris DNS (plazmid), illetve mesterséges kromoszóma. A vektor sejtbe juttatása történhet fizikai úton (elektroporáció, mikroinjektálás), kémiai módszerrel (pl. pegilált-immunliposzóma), illetve biológiai úton vírusok segítségével. Az adenovírusokkal sejtbe juttatott gén nem, míg a retrovírusokkal bejuttatott gén beépül a genomba. 2000. április 28-án a Science folyóiratban számoltak be az elsõ sikeres génterápiás kezelésrõl (3). Két beteg, egy 11 és egy 8 hónapos, X-SCID ADA (autoszomális recesszív öröklõdésû severe combined immune adenosine-deaminase deficiency) betegségben szenvedõ gyermek elõzõleg eltávolított csontvelõ sejtjeibe retrovirális eredetû vektor segítségével juttatták be a betegségért felelõs hibás génszakaszt, majd a transzformálódott sejteket visszajuttatták a szervezetükbe. A kezelés sikeres volt, a gyermekek T-, B- és NK sejtjeiben az IL2Rγ expresszálódott, normális ellenanyagszintjük alakult ki a beavatkozás után, további terápiára nem volt szükségük. A kezelés következtében azonban 30, illetve 34 hónap elteltével mindkét betegnél akut limfoid leukémia alakult ki, amelyet kemoterápiával sikeresen meggyógyítottak. Egy másik betegcsoport, akiknél a génterápia kifejlesztésével az elmúlt 10 évben rengeteget foglalkoztak, a cisztás fibrosisban szenvedõ betegek. Mivel ebben a betegségben a tüdõ érintettsége a legsúlyosabb tünet, és általában a halál oka is, a cél aerosol formájában közvetlenül a tüdõ sejtjeibe juttatni az ép CFTR gént, illetve a róla szintetizált cDNS-t. Éppen a betegség következtében azonban a tüdõ felszínét sûrû váladék borítja, ami nehezíti a kezelés kivitelezését. Különbözõ munkacsoportok egy sor vírus – és nem vírus – eredetû vektort használtak. A legnagyobb problémát a vírus eredetû vektorok alkalmazása során a kialakuló immunválasz jelentette. Egyetlen kivételt találtak, a lentivírusok csoportját, amely lényegesen kisebb immunreakciót eredményezett. Nap-


jainkban is zajlanak azok a vizsgálatok, amelyek célja, hogy lentivírus eredetû közvetítõ segítségével kifejlesszék a leghatékonyabb légúti terápiát CF betegek számára. Az Egyesült Királyságban ugyanakkor egy másik munkacsoport olyan kísérleteket végez, amely nem virális, hanem liposzóma eredetû vektor alkalmazását célozza. Ezek a vektorok elõnyösebbek a vírus eredetû vektoroknál, mivel lényegesen kisebb immunreakciót váltanak ki, de hatékonyságuk elmarad azokétól. A jövõ azonban más lehetõségeket is rejt a CF-es betegek hatékony génterápiájának megoldásában. Bíztató in vitro kísérletek vannak siRNS (egyszálú, kis interferáló RNS) használatával a „génelcsendesítés” módszerével történõ génterápiás beavatkozás alkalmazására. Kimutatták, hogy az endoplazmás retikulum (ER) BAP31 proteinjének gátlásával a ΔF508 mutációt hordozó fehérjemolekulák képessé válnak arra, hogy eljussanak a sejtfelszínre. Ilyen módon már több különbözõ sejttípuson sikerült a normális klorid szekréció helyreállítása (5). A génterápia tehát nemcsak az ép gén sejtbe juttatását, illetve túlexpresszálását jelentheti, hanem ellenkezõleg, a hibás gén elcsendesítését is. Ebben a feladatban vehetik fel a harcot a betegséggel a siRNS molekulák, illetve az RNS interferencia nemrég felismert jelentõsége.

miRNS, siRNS, RNS interferencia A genomprogramnak köszönhetõen felismerték, hogy az emberi genom nem kódoló régióiban olyan mintázatok találhatók, amelyek fehérjekódoló gének szekvenciáinak komplementereit tartalmazzák, ráadásul ezek is átíródnak RNS-sé. Ezek az RNS-molekulák részben egyszálú, úgynevezett mikroRNS-ek, részben rövid duplaszálú RNS-ek. Ez utóbbiakból szintén egyszálú, kis interferáló RNS molekulák (siRNS) képzõdnek. 2006-ban orvosi-élettani Nobel-díjjal jutalmazták az RNS interferencia jelenségének felfedezését. Ez addig a génmûködés szabályozásának egy teljesen ismeretlen módja volt, amelynek során siRNS molekulák specifikusan gátolják egyes gének kifejezõdését oly módon, hogy a velük komplementer, hírvivõ RNS (mRNS) molekulákhoz kapcsolódva egy enzimkomplex mûködését indítják be, amely a mRNS lebontását eredményezi. Az RNS interferencia óriási lehetõséget ígér a jövõ kezelési eljárásaira vonatkozóan. A sejtekbe mesterségesen bejuttatott siRNS-ek „lehalkíthatnak” meghatározott, kiválasztott géneket. Már napjainkban is igen bíztató kísérleti eredményeket értek el az RNS interferencia hasznosításával a gyakorlatban. Például egerekben in vitro és in vivo egyaránt sikerült a vér koleszterinszintjét csökkenteni a megfelelõ gén gátlásával. A kísérlet során koleszterin molekulához kapcsolt, az ApoB génnel homológ siRNS molekulát juttattak be a szervezetbe. Ennek megfelelõen a siRNS csak koleszterinkötõ sejtfelszíni receptorokkal rendelkezõ sejtekbe volt képes bejutni. Ezek éppen azok a sejtek, amelyek a vér koleszterinszintjének változását érzékelik a májban és a vékonybélben. A vizsgálat során a kísérleti állatok vérében az LDL koleszterin-szint 44%-os csökkenése mel5


lett a HDL koleszterin-szint is 25%-kal csökkent. Mivel a siRNS molekula csak a megfelelõ sejtekbe jutott be, más gének mûködését nem befolyásolta, így a kezelésnek káros mellékhatásai nem voltak (8). Egy világszerte milliókat érintõ szembetegség, az idõskori macula degeneráció RNS-interferenciával való kezelése már a sikeresnek bizonyuló állatkísérletek után a klinikai kipróbálás fázisába jutott. A kezelés pozitív hatását a klinikai vizsgálatok is igazolták. A közvetlenül szembe injekciózott siRNS a vascularis endothelialis növekedési faktort kötõ receptor fehérjetermék (VEGFR-1) képzõdését akadályozza meg, így a betegek szemében csökken az új erek képzõdése. A tapasztalat szerint a kezelt betegek látásélessége is javult. A hatás tartóssága a gyógyszer adagjától függ. Káros mellékhatásokat nem tapasztaltak (1). Napjainkban számos munkacsoport foglalkozik az RNS-interferencián alapuló hatékony daganatterápia kifejlesztésén is (10). Az RNS-interferenciának a klinikumban való használatában – a génterápiánál említetthez hasonlóan – a megfelelõ hordozó kiválasztása, illetve a sejtbe való bejuttatás hatékony módszerének kifejlesztése a legnehezebb feladat. A duplaszálú, dsRNS molekulák sejtvonalakba történõ bevitelére már sikerült elõállítani olyan vektorokat, amelyek hosszú távú hatást biztosítanak, de a klinikai kipróbálások még csak most zajlanak (2). A miRNS molekulák mindössze 21-23 nukleotid hosszúságú egyszálú RNS szakaszok. Az emberi genomban több száz miRNS-t sikerült már azonosítani, amelyeknek mintegy 80 százaléka az emlõsök között evolúciósan konzervatív. Ma ismeretes funkciójuk szerint képesek hozzákapcsolódni a hírvivõ RNS-molekulákhoz, ezzel gátolva a fehérjeszintézis folyamatát. Kevésbé specifikusak, mint a siRNS molekulák, így egyegy miRNS molekula több különbözõ mRNS-hez tud kapcsolódni. Vagyis egyidejûleg nem csupán egyetlen, hanem sok gén mûködését képes befolyásolni. Bár a jelenségre magyarázatot még nem tudunk, de egyre több onkogén és tumor szuppresszor gén szabályozásának vizsgálata során fedezik fel, hogy miRNS-mintázatuk a normálistól eltérõ. E felismerésbõl adódik az a remény, hogy a jövõben a miRNS-eknek fontos szerepe lehet a daganatos betegségek elleni küzdelemben. Ha a feltételezések igazolódnak, akkor a tumorsejtekbe juttatott megfelelõ miRNS-ek segítségével esetleg egész onkogén géncsaládok mûködését lehetne egyidejûleg megakadályozni (11).

Posztgenomika – a jövõ A klasszikus genetika a genomot lineáris módon olvassa. A genomika – amely a legmodernebb informatikai módszerekkel az egész biológiát komplex tudományként új alapokra helyezte – ezen a talajon nõtt fel. Genomikai módszerekkel ugyanis egy sejtnek több (akár valamennyi) génjének mûködése párhuzamosan vizsgálható. Elemezhetõ a gének összes változata, illetve meghatározható a gének expressziós (kifejezõdési) min6


tázata. Az így nyert információk felhasználásával késõbb összehasonlító elemzések is végezhetõk. A genom legnagyobb része azonban még mindig ismeretlen a kutatók elõtt. Mint ismeretes, a genom 98,7%-a nem kódol fehérjét. Mivel errõl a hatalmas DNS mennyiségrõl szinte alig van információnk, azt ma is az eredeti „hulladék” DNS (junk DNA) néven tartják nyilván. Az elsõ elméletek szerint a junk DNS-nek mindössze mechanikai szerepe van a gének közötti távolságok biztosítására. A másik feltevés az volt, hogy ezek valamiféle tartalék szekvenciák. Késõbb azonban azt is felfedezték, hogy ez a tartomány olyan DNS szakaszokat is tartalmaz, amelyek egymástól távol álló fajok között is igen hasonlóak (konzervatív szekvenciák). Az információk értelmezésében a nagy áttörést a matematikai elemzés hozta meg. A genomszekvenciát fraktálgeometriai vizsgálatnak vetették alá, és igencsak meglepõ módon a nem kódoló DNS régiókban geometriai mintázatokat, fraktálokat fedeztek fel. A fraktálok olyan matematikai alakzatok, amelyeknek egy kis részletét fölnagyítva az egész alakzathoz hasonló szerkezetet kapunk. A junk DNS-ben a lineáris elemzések során elõ nem kerülõ ismétlõdõ szekvenciákat fedeztek fel. Ezek az értelmetlennek tûnõ ismétlõdések fraktálgeometriai módszerekkel elemezve azonban jelentõs információt hordozhatnak. Napjainkig már 24-25 millió olyan szakaszt azonosítottak, amelyek feltételezések szerint alapvetõ szerepet játszhatnak a génkifejezõdés szabályozásában. A posztgenomika fejlõdésében a következõ lépés a piknonok azonosítása volt. A humán genomban legalább 40-szer elõforduló, legalább 16 nukleotid hosszúságú DNS szakaszokat nevezzük piknonoknak. A genom nem kódoló részében már több millió piknont, illetve százezernél több piknonmintázatot azonosítottak. Ezeknek megfelelõ nukleotidszakaszok szinte minden ismert génben megtalálhatók. A génszabályozásban betöltött pontos szerepük meghatározása még a jövõ feladata, de már vannak olyan kórképek, amelyek egyértelmûen köthetõk nem kódoló DNS szakaszokhoz. A junk DNS-sel kapcsolatos betegségek listája szinte napról napra bõvül. A betegségekkel kapcsolatos információkat tartalmazó weblap bárki számára elérhetõ, és a legfrissebb eredmények tekintetében is pontos tájékoztatással szolgál (http://www.junkdna.com/junkdna diseases.html). Nagyon valószínû tehát, hogy a „hulladék” DNSbõl származó elemek, (miRNS-ek, siRNS-ek, az ismétlõdõ szatellit-DNS-ek és a génekben található intronok) a géneket mintegy a háttérbõl irányítva a genetikai betegségek kialakulásában legalább olyan fontos szerepet töltenek be, mint eddigi ismereteink szerint a gének kódoló, szabályozó régiói. Irodalomjegyzék

1. Buch P.K., Bainbridge J.W., Ali R.R.: AAV-mediated gene therapy for retinal disorders: from mouse to man. Gene Ther., 15(11), 849-857, 2008 2. Bumcrot D., Manohara, M., Koteliansky V. et al.: RNAi therapeutics: a potential new class of pharmaceutical drugs. Nat. Chem. Biol., 2, 711–719, 2006



3. Cavazzana-Calvo M., Hacein-Bey S., de Saint Basile G. et al.: Gene Therapy of Human Severe Combined Immunodeficiency (SCID)–X1 Disease. Science 288(28), 669-672, 2000 4. Collins F.S., Patrinos A., Jordan E.l. et al.: New Goals for the U.S. Human Genome Project: 1998-2003. Science, 282(5389), 682-689, 1998 5. Griesenbach U., Alton E.: Gene transfer to the lung: Lessons learned from more than 2 decades of CF gene therapy. Advanced Drug Delivery Reviews, 61, 128–139, 2009 6. Lengauer T. (ed.). Bioinformatics – from genomes to drugs. Weinheim: Wiley-VCH, Vols. I and II., 2002

7. Skolnick J., Fetrow J.S., Kolinski A.: Structural genomics and its importance for gene function analysis. Nat. Biotech., 18, 283-287, 2000 8. Soutschek J., Akinc A., Bramlage B.: Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature, 432, 173–178, 2004 9. Stinchcombe J.R., Hoekstra H.E.: Combining population genomics and quantitative genetics: finding the genes underlying ecologically important traits. Heredity, 100, 158–170, 2008 10. Takeshita F., Ochiya T.: Therapeutic potential of RNA interference against cancer. Cancer Sci., 97(8), 689696, 2006 11. Wang V., Wu W.: MicroRNA-Based Therapeutics for Cancer. Biodrugs, 23(1), 15-23, 2009

Megrendelõlap (Focus Medicinae) Alulírott, postai úton megrendelem a Focus Medicinae címû kiadványt 2009. évre, ............ példányban. A folyóirat éves elõfizetési díja: 2009,- Ft + 5% áfa.

Megrendelõ neve: ..................................................................................................................... Címe: ..........................................................................................................................................

Megrendelését az alábbi címre kérjük elküldeni: Dursusz Bt. 1106 Budapest, Juhász u. 47/A. Telefon/Fax: (1) 262-8688 Mobil: (06-30) 223-0629 E-mail: [email protected]

7


Hogyan mûködnek a természetes killersejtek?

Hogyan mûködnek a természetes killersejtek? (Az NK sejtek genomikája) Dr. Benczúr Miklós Országos Vérellátó Szolgálat Központ, Budapest Összefoglalás: A limfoid õssejtbõl származó, a sejtsorból kifejlõdõ természetes killersejtek (NK, natural killer) a veleszületett, (nem-adaptív) immunapparátus részei. A szervezetben hármas funkciót látnak el: a.) citotoxikus reakcióval pusztítják el a folyamatosan, a környezeti hatásokra véletlenszerûen képzõdõ (mutáns) tumorsejteket, a vírus-fertõzött sejteket és egyes sejten belüli élõsködõ kórokozókat (parazitákat), b.) aktivációt követõen számos szabályozó-üzenetközvetítõ molekulát (un. citokint) termelnek, szabályozva ezzel az immunválaszt, c.) végül sejtfelszíni receptoraik révén erõsítõ-kiegészítõ (co-stimulációs) jelet továbbítanak a T- és B-lymphocyták felé. Beigazolódott, hogy felismerõ receptor-családokkal bírnak, amelyeken keresztül gátló- vagy aktiváló hatású jelátvitel történik. Mind jobban ismertté váltak az NK sejtek receptorai és az általuk felismert MHC-I molekulák. E hármas funkció révén a szervezet integritásának megõrzése mellett a szervezet immunválaszát szabályozó mûködést végeznek. Az MHC génektõl eltérõ genetikai kódoltság folytán az NK receptorok a HLA-I ligandumoktól függetlenül öröklõdnek. Az immunglobulin-szerû KIR receptor család (killer cell immunglobulin-like receptor) a 19-es kromoszómán kiterjedt genetikai szervezõdést és szerkezeti változatosságot mutat, a lektin receptorok pedig ettõl eltérõen a 12-es kromoszómán kifejezetten konzervatív szerkezetet jelentenek. Az utóbbi években ismertté váltak azok a genetikai módszerek, amelyek segítségével az egyes NK sejtcsaládok közelebbi típusa meghatározható, a klinikumban pedig napvilágot láttak azok az eredmények, amelyek a rosszindulatú hematológiai betegségek gyógyítására alkalmazott õssejt átültetésekben az NK sejtek receptor-ligand kapcsolatának és kompatibilitásának szerepét igazolták.

lymphoid stem cells and developing from cell line are parts of congenital (non adaptive) immune apparatus. They have triple functions in the organism: a.) they destroy tumor cells continuously developing randomly (mutant) due to environmental effects, virus infected cells and some intracellular pathogens (parazytes) by cytotoxic reaction, b.) after activation they produce numerous regulating and messenger molecues (the so called cytokines), that way regulating the immune response, c.) finally through their cell-surface receptors they transmit a strengthening-complement (co-stimulating) sign towards Tand B- lymphocytes. It has been proven that they have recognition receptor families, through which there is a sign transmittion with either inhibitor or activator effect. The receptors of the NK cells have become more and more known and the MHC-I molecules recognised by them. Due to these triple functions while maintaining the integrity of the organism they function regulating the immune response of the organism. Because they are genetically not coded as MHC genes, NK receptors are inherited independently of HLA-I ligands. The immunoglobulin-like KIR (killer cell immunglobulin-like receptor) receptor family shows an expanded genetic organization and structural variety on chromosome 19, while lectin receptors on chromosome 12 have a distinctly conservative structure. Genetic methods have become well known in the past few years, which help to define a more precise type of NK cell families, in the field of clinics results have been published that in stem cell transplantations to cure malignant haematological diseases the role of the receptor-ligand connection and compatibility of NK cells was confirmed.

Kulcsszavak: NK sejtek, tumor, citokin, receptor, ligand, MHC

Key words: NK cells, tumor, cytokine, receptor, ligand, MHC

Summary: Natural killer cells (NK cells) originating from

Bevezetés Már több mint 3 évtizede ismerjük a vérben keringõ és a szövetekben fellelhetõ természetes ölõsejteket (NK, natural killer) amelyek legfontosabb tulajdonsága, hogy a szervezetben az „idegen” sejteket megölik minden korábbi immunizálódás nélkül. Az NK sejtek így a velünk született (természetes) immunrendszer részét képezik. Szoros rokonságban állnak a T-lymphocytákkal, mivel közös õssejtbõl származnak. Mûködésükhöz elengedhetetlen, hogy sejt-sejt kapcsolatokat hozhassanak létre, ezért számos kapcsolatot képzõ felismerõ molekulával (receptorokkal) bírnak, amelyek elsõsorban a minden magvas sejt felszínén megtalálható MHC-I (HLA) struktúrák felismerését szolgálják. Ez jelenti a „saját” megkülönböztetését az „idegen” sejtektõl. 8

Gátló receptoraik révén funkcionálisan is képesek megkülönböztetni a saját sejteket a potenciálisan veszélyes „idegen” sejtektõl, amelyek elvesztették, vagy nem kellõen fejezik ki MHC-I sejtfelszíni struktúrájukat. (ez az ún. „missing self” (elvesztett saját) hipotézis (15). Az NK sejtek elsõsorban a sejtfelszíni MHC-I struktúrát ismerik fel, amely egy tiltó jelet hoz létre, megakadályozva a saját sejtek megölését, ezért a saját MHC-I elvesztése/hiánya az NK sejtek citotoxikus mechanizmusát indítja be, amely az „idegen” sejtek megöléséhez vezet. Az NK sejtek épp úgy idegennek tekintik a megváltozott saját, pl. vírusok által megfertõzött sejteket, mint a testünkben állandóan képzõdõ (mutáns) sejteket, amelyek egy részébõl daganatok képzõdhetnek. A szervezetben folyamatosan képzõdõ, életképes mutációknak (daganatoknak) és vírust-hordozó sejteknek is az


MHC-I struktúrák „levedlése” az egyik túlélési módjuk, amely a T-sejtes (adaptív) immunválasz elkerülésére fejlõdött ki. Az MHC-I-et elvesztõ mutáns sejtek azonban az NK sejtek martalékai lesznek. A vérben és a szövetekben az NK sejtek állandóan készen állnak az „idegen” sejtek elpusztítására, szemben a T-sejtes adaptív celluláris immunválasszal, amelynek teljes-erejû kifejlõdéséhez 8-12 nap szükséges. A plazmasejtek által termelõdõ specifikus ellenanyagok (antitestek) közremûködésével az adaptív immunválasz részét is képezik, mivel az antitest-függõ celluláris citotoxicitás (ADCC) effektor sejtjeiként is szolgálnak, amelyben sejtölõ hatást fejtenek ki. Ölõ mûködésük mai tudásunk szerint azonos a T-lymphocyták közvetlen toxikus hatásával (citoplazmikus enzimeik, perforinok és más enzimek által kifejtett ozmotikus lízis és/vagy a természetes sejthalál (apoptosis) indukciójával (6). A biológia új integráló területe, a genomika, a gének és géntermékek gyors és könnyebb analízise útján elõsegítheti, jelentõsen felgyorsíthatja és részleteiben is módosíthatja az NK sejtek funkciójának mélyebb megértését. A természetes és a kórokozók (antigének) hatására kialakuló ún. adaptív immunválasz együttmûködésének lehetünk itt tanúi. Az NK sejtek számos területen mûködnek a szervezet egységét és szabályozását szolgálva. Klinikai megfigyelések összefüggést mutattak ki az NK sejtek és az átültetett õssejtekkel szembeni reakcióval (GVHD), különbözõ gyulladásos megbetegedések és az NK sejtek KIR receptorainak gátló/aktiváló tulajdonságaival. Különleges szubpopulációjuk a terhesség elsõ trimeszterében védi az embrió beágyazódását és fejlõdését a nem klasszikus HLA antigénekkel való együttmûködés révén. A KIR receptorok kiterjedt vizsgálata és a szervezet egészséges mûködésének megõrzésében még minden részletében nem tisztázott szerepük számos megbetegedésben bizonyára szükségessé teszik a KIR receptorok tipizálását. Különbözõ eredetû hiányuk vizsgálata pedig értékes adatokat nyújthat valódi fiziológiás mûködésük megismerésére.

A humán NK sejtek legfõbb tulajdonságai Az NK sejtek a T- és B-lymphocytáktól eltérõen „térlátásuk” révén ismerik fel a szervezetben képzõdõ malignus-, vagy fertõzött sejteket, észlelve a sejtfelszín mintázatának változásait. Ez a felismerés aktiváló és gátló struktúrák, az immunglobulin-szerû, ún. KIR receptorok útján történik (12). Újabb felismerés, hogy az aktiváló jelet kiváltó receptorok elsõsorban a természetes immunrendszer kórokozók elleni védekezõ funkciójának szolgálatában állnak és MHC-I (HLA) struktúrákat felismerõ képességük háttérbe szorul (23). Jellegzetes morfológiájuk is megkülönbözteti az NK sejteket a többi leukocytától; nagy lymphocyták, amelyeknek mérsékelten babalakú magvuk, kifejezett nucleolusuk van és a citoplazmájukban jól látható azurofil granuláció észlelhetõ egyszerû Giemsa festéssel, amelyek enzimei (perforin, szerin-eszterázok, ún. granzimek) a citotoxicitásban vesznek részt. E jellegze-


tesség alapján nagy granuláris lymphocytának (large granular lymphocyte LGL-sejtek) is nevezik e sejteket. A perifériás vérben 5-15%-ban fordulnak elõ (32).

Az emberi NK sejtek érése, differenciálódása Felismerésük és az elsõ jellemzésük óta eltelt három évtized kiterjedt kutatásai és megfigyelései tisztázták, hogy ezek a sejtek a limfoid/lymphocyta rendszer õssejt vonalából (vérképzõ õssejtekbõl) több, ma már genetikai módszerekkel elkülöníthetõ szakaszból álló differenciálódási-érési folyamaton mennek át. A hematopoietikus õssejtben a korai NK fejlõdés során 15 specifikusan kifejezõdõ gént mutattak ki, míg az NK prekurzor sejtekben 30 ilyen gén fejezõdött ki (11). E bonyolult folyamat sikeréhez több növekedési és átíródási/transzkripciós faktor, citokin szabályozás és a környezet hatása is szükséges. A fejlõdési sor végén megjelenõ korai NK sejtek számos szabályozó citokint termelnek. A klinikai gyakorlatban a sejtek fejlõdési állapota a sejtek felszínén megjelenõ molekulákkal jellemezhetõ (ún. CD markerek), amelyek valójában a sejtfelszínen megjelenõ fontos funkcionális struktúrák. Az NK sejteket CD16+/ -CD56+++ markerrel jellemzik, noha a CD56 neurális adhéziós molekulának az NK sejteken gyakorolt funkciója bizonytalan (6). A legújabb kutatások szerint ettõl lényegesen jobb jellemzés is alkalmazható: az NK sejtek NKp46 pozitív, IL-15 citokin-függõ, IL-12-re válaszoló limfoid sejtek, amelyek az érés során az IFN-γ citokin korai forrásai, és jellemzõen erõs sejtölõ tulajdonsággal bírnak. Nem zárható ki, hogy ezeket a sejtfunkciókat a különbözõ NK sejtcsaládok megosztva végzik (35).

A korai NK sejtcsalád Ez a populáció nem, vagy csak kis sûrûségben hordozza a CD16-FcRIII-R(FcIII-receptor) struktúrát, citoplazmájában pedig kevés finom eloszlású azurofil testecske látható, amelyet a sejtölés szolgálatában álló enzim molekulák alkotnak (ún. granzimek, szerinészterázok). A nagy lymphocyta morfológiát mutató sejtek membránján megtalálhatók azok a jellegzetes, elsõsorban a MHC-I antigéneket felismerõ NK-receptorok, amelyek részletes tárgyalására késõbb térünk ki. A sejtcsalád jelentõs mennyiségben termel számos citokint (IFN-γ, TNF-α-β, GM-CSF, IL-10, IL13) és citokin receptorokkal is bír. Ez a perifériás vérben mintegy 1-5%-ot kitevõ korai sejtcsalád az immunrendszer szabályozásában vesz részt. A szöveti NK sejtek nagy részét is ezek a sejtek alkotják. A nagy-kötõerejû IL-2 citokin receptor (IL2-Rαβγ), csak ezen az NK sejtcsaládon kifejezett. Újabb vizsgálatok szerint a nyirokcsomók parafollicularis régiójában tízszer annyi korai NK sejt található, mint késõi. Feltételezik, hogy a T-és NK sejtek közötti információcserét a nagy aviditású IL-2R segíti elõ (18). Ebben a részleteiben még nem ismert folyamatban, az idegen fehérjét bemutató dendritikus sejtek is részt vesznek, amelyek végsõ érését az NK sejtek γ-IFN termelése segíti elõ. A sejtcsaládon belül további alpopulációk kü9


löníthetõk el, így pl. a γ-IFN termelést csak egy CD8 negatív alosztály végzi. A sejtek membránján a sejt-sejt kapcsolatot elõsegítõ molekulák; L-selectin és kisebb mennyiségben integrinek fejezõdnek ki (18).

A késõi NK sejtcsalád A késõi NK sejtek a keringõ vérben az NK sejtek 85-95%-át adják. A sejtek felszínén a sejt-sejt kapcsolatot elõsegítõ struktúrák találhatóak (LFA1, CD2, PSGL1/PEN5, CD44). A sejtcsalád az NK sejtek speciális gátló és aktiváló receptoraival bír. Más védekezõ rendszerekkel együttmûködésben a késõi sejtcsalád a szervezet immunológiai integritását felügyeli. A sejtek felszínén citokin receptorok fejezõdnek ki (IL-7R, IL-15R, IL-2R, IFN-γ-R, IL-21R), amelyek együttesen kontrollálják a saját sejtek stressz okozta változásait (vírus infekció, parazita infekció, malignus átalakulás, hõsokk). A funkcióból következik, hogy IL-2 aktiválódására erõteljes citotoxikus választ adnak. Minden elkülönítés ellenére, mind a mai napig vita folyik arról, hogy a két sejtcsalád a természetes fejlõdési sor egyes állomásait, vagy elkülönülten kifejlõdõ sejtcsaládok tagjait képviseli-e? (18). A nagy kötõerõvel bíró CD16/FcRIII receptor mellett a citoplazmában kifejezett azurofil granulumok láthatók. Sejtölõ (citotoxikus) mechanizmusuk azonosan mûködik, mint a T-lymphocytáké, vagyis citoplazmatikus enzimjeik, (perforinok és más enzimek) a sejtfalon lyukakat „fúrnak”, ami ozmotikus sejthalálhoz vezet. Ezentúl a sejtekben programozott természetes sejthalált (apoptosis) indítanak be a FAS-ligand, TNF vagy TRAIL ligand útján (6).

Az NK sejtek vándorlása Az NK sejtek, hasonlóan a T-lymphocytákhoz, kiléphetnek az érfalon keresztül a szövetekbe a sejt-sejt kapcsolatot elõsegítõ (adhéziós) molekulák, szelektinek, kemokinek segítségével (L-selectin, CCR7, CXCR3, CXCR4, CCR5). Az immár szöveti NK sejtek a korai NK sejtekhez hasonlóak (17). A szöveti NK sejtek elsõsorban a gyulladásos nyirokcsomók külsõ (paracorticalis) régiójába vándorolnak, ahol az NK sejtek által termelt IFN-γ stimulációja elõsegíti a dendritikus sejtek érését. Az NK sejtek citokin termelése ezen az úton befolyásolhatja a segítõ (CD4+ helper) T-sejteket (34).

Az NK sejtek felismerõ képessége, a receptorok Emberi daganatsejt-vonalakkal végzett kísérletek azt mutatták, hogy az NK sejtek receptoraik révén felismerõ képességgel bírnak. Korábbi saját kísérleteink azt igazolták, hogy idegen (ún. allogén) emberi lymphocytákat (legalább 7 különbözõ csoportot) is meg tudnak különböztetni, ami finom különbségek felismerésére képes receptorokat tételez fel (4). A receptorok és az általuk felismert molekulák, az ún. ligandumok, vagy ligandok tanulmányozása rámutatott, hogy az emberi NK sejtek az immunválasz sok10


oldalú együttmûködésében vesznek részt. A közelmúltban e folyóirat hasábjain megjelent munkánkban a receptorokkal részletesebben is foglalkoztunk (2). A korábbi közlemények az NK receptorokat szerkezeti alapon (KIR2DL1, KIR2DL2/3, KIR3DL1) csoportosították, aszerint, hogy a HLA-C α láncban a 80-as pozícióban aszparagin, vagy lizin-, illetve a 77-es pozícióban aszparagin vagy szerin csoportot hordozó I. osztályú HLA , illetve a HLA BW4 allélekkel, mint ligandumokkal tudtak kapcsolódni (25). Ezzel a felosztással is fontos klinikai összefüggéseket lehetett kimutatni (ld. késõbb). Az utóbbi idõben azonban számos olyan receptor-ligand komplexet ismertünk meg, amelyek elõsegítették az emberi NK sejtek felismerõ képességének és mûködésének jobb megértését (1,34). Táblázatba foglalva láthatóak az eddig megismert receptorok és ligandumok, amelyekre az NK felismerés irányul. Megjegyzendõ, hogy több esetben a ligandumok még nem ismertek (1. táblázat). 1. A KIR receptorok a szerkezeti hasonlóság alapján az immunglobulin szupergén családba sorolhatók a domén szerkezeti hasonlóság alapján. Csak az NK sejteken és a memória sejtek egy szubpopulációján fordulnak elõ ezek a sejtmembránba lehorgonyzott glikoprotein molekulák. A KIR receptorok a 19q13.4 leukociyta receptor gén komplexben kódoltak (1. ábra). Általánosságban a hosszú citoplazmikus farokkal bírók (hosszú, long L) gátolnak, míg a rövid (short, S) molekulák aktiváló hatást fejtenek ki, ez azonban nem szigorú törvényszerûség. Az aktiváló receptorok ún. adaptor proteinek (DAP10, DAP12) közvetítésével a tirozin kinázok (Syk és ZAP70) felé továbbítják a szabályozó jelet. A KIR receptorok az MHC-I (HLA-C,-B és -A) allélokat ismerik fel. Az észlelt specifikusság az MHC-I törzsfejlõdése során az õsi régiók felismerésére irányult (5,24). A gátló receptorok, amelyeken át az NK sejtek fõ funkciója érvényesül, hosszabb intracitoplazmikus láncuk révén, közvetlenül a foszfatázok (SHP-1, SHP-2) felé továbbítva fejtik ki szabályozó (gátló/aktiváló) mûködésüket, amely fõként citotoxikus jel továbbítását jelenti. 2. A lektin receptorok az egyik legõsibb gátló/aktiváló molekulák, amelyek az NK funkciót szabályozzák. Génjeik a 12p.13. kromoszómán találhatók (2. ábra). A két azonos láncú, a citoplazmába benyúló fehérjemolekula, az NKG2-A-F képezi a további NK receptorokat. A CD94 Ca-függõ lektinnel, kovalens kötésû heterodimer struktúrát alkotnak. Az MHC-I antigének felismerése kevésbé szigorú és a T-lymphocyták egy alosztályának (CD8+CD28-TCRαβ+, ún. memóriasejtek) felszínén is kimutathatók. Ligandjuk a „nem klasszikus” HLA-E molekula. Fontos feladatot látnak el az aktivált T-sejteken (CD8+) is a vírus infektált sejtek elölésében és az IFN termelés szabályozásában is (38). 3. Emberi NK sejtek toll receptorokkal (TLR) is bírnak, amelyek a patogének molekuláris mintázatát (PAMP) ismerik fel, így a természetes immunválasz korai fázisában, közvetlen módon képesek védeni a szervezetet. (Az NK sejteken csak az ILT-2 toll receptor fordul elõ).

2009. XI. évfolyam 1. szám NK RECEPTOR

LIGANDUM

Hogyan mûködnek a természetes killersejtek? FUNKCIÓ

EPITÓP

MEGJEGYZÉS 19q 13.42 kromoszómán

Immunglobulin szuperfamilia (IgSF) receptorok 2DS1

HLACw Lys80

aktiváló

N77 K80

P50.1 protein CD158h

2DS2

HLAC1 Asn80

aktiváló

S77 N80

P50.2 protein CD159j

2DS3

HLAC1

gátló?

P50 protein protektiv GVHD-re

2DS4

HLACw Lys80 ?

aktiváló

P50.3 protein CD158l

2DS5

?

aktiváló

P50 protein

2DL1

HLAC2 Lys80

gátló

N77 K80

P58.1, DAP12-„adaptor” molekulával CD158a

2DL2,3

HLAC1Asn80

gátló

S77 N80

P58, DAP12- CD158b1/b2

2DL3

?

gátló

S77 N80

P58

2DL4

HLA-G, HLA-A3, HLA-B46, HLA-B7

gátló/ aktiváló

2DL5

?

3DL1

HLA-Bw4 B27 B51

gátló

3DL2

HLA-A3,A11,

gátló

3DL3

?

3DS1

HLA-Bw4?

3DL2

HLA-A3,A11,

gátló

P140 CD158k minden NK/T sejten jelen van

3DL3

?

gátló

minden NK/T sejten jelen van

2DS6

P50 protein CD158c KIRX

P58 minden NK/T sejten jelen van, citokin termelést vált ki, nem citotoxicitást gátló/aktiváló

P58

77-83

P70, NKB1 P140 CD158k

gátló aktiváló?

2DP1

pseudogén

3DP1

pseudogén

C-típusú Lektin-receptorok 12. kromoszómán CD94/NKG2A

HLA-E

gátló

CD94-el kovalens kötés

CD94/NKG2C

HLA-E

aktiváló

CD94-el kovalens kötés

ILT

HLA-

gátló

immunglobulin szerû átirat

LIR

HLA-G

gátló

leukocita Ig-szerû receptor

NKG2D

MICA,MICB, ULPB

aktiváló

homodimer molekula, nem kapcsolódik CD94-el

NKp30

?

aktiváló

CD3?- malária falciparum

NKp44

?

aktiváló

vírus hemagglutinin ligandum?

NKp46

?

aktiváló

vírus hemagglutinin ligandum?

NKp80

?

aktiváló, citotoxicitás

Citotoxikus /Aktiváló Receptorok

2B4 (CD244)

CD48

aktiváló

koreceptor, citokin termelés

CD2

LFA-2

aktiváló

koreceptor koreceptor

LFA-1

ICAM-1

aktiváló

CD16

Fc?IIIR

aktiváló

TLR

PAMP

aktiváló

Citokin közös ?-lánc

IL2-,IL15- IL21

proliferáció, citotoxicitás

IFN?-R

IFN?

proliferáció citotoxicitás

c-kit

Toll receptorok

proliferáció

PEN5

CD62L

CD40L

CD40

-PSGL1apoptosis indukció

1. táblázat: Emberi természetes killersejtek (NK) sejtfelszíni receptorai. Az egyes receptoroknál látható az ismert ligandum és a receptorok fõ funkciója

11



1. ábra: KIR-receptorok emberi NK sejtek gátló és stimuláló receptor génjei a 19q kromoszómán. Ig-SF receptorok (Lanier Curr. Op. Immunol., 2003 nyomán)

4. Az NK sejtek számos aktiváló receptorral bírnak. Az NKp46, NKp30 és az NKp44 elsõdlegesen citolitikus/aktiváló reakciót kiváltó NK receptorok. Az NKp46 mivel csak az NK sejteken fordul elõ, az NK sejtek markerének használható, bár ligandumuk biztonsággal nem ismert (35). Kiemelt jelentõségû az NKG2D receptor, amely valamennyi nyugvó és aktivált NK sejten (és egyes Tsejteken is) jelen van. Aktiváló szabályozó mûködést és γ-IFN-termelést fokozó cascade-jelet ad (22).

Genetika Az immunglobulin szupercsalád (IgSF) receptor gének Az NK gének részben a 19q13.4 kromoszómán, az úgynevezett leukocyta receptor clusterben helyezkednek el (1. ábra). A centromer felé olyan fontos jeltovábbító molekulák génjei találhatók, amelyeket az NK receptorok is használnak mûködésük során (DAP10/KAP10, DAP12). A KIR receptorok specificitása az MHC-I molekulákra irányul, azonban azoktól függetlenül öröklõdnek. A receptorok 2 vagy 3 immunglobulin-szerû zárt lánccal (doménnel) bírnak, a sejt citoplazmájába benyú-

ló farok részen pedig gátló motívum (ún. ITIM) található. A gének öröklõdésébõl következik, hogy mindenki számos olyan HLA-struktúra ellen irányuló KIR receptorral bír, amelynek liganduma nem is fordul elõ a saját szervezetében, azonban minden NK sejtnek van a saját HLA antigénjére specifikus receptora. Ez azt jelenti, hogy õssejt átültetés esetén a KIR receptorokkal szembeni (NK) inkompatibilitás valószínûsége jelentõsen emelkedik. Egy emberben a KIR gének (izotípusos és allotípusos) variációjának megfelelõen legalább 15 különbözõ KIR haplotípus fordul elõ. Az emberek között tehát több száz örökölhetõ variáció fordul elõ. Ezt a magas fokú eltérést a gének-, a génpárok-, valamint a rekombinációs helyek magas száma okozza. Egy haplotípust mintegy 8-14 KIR gén határoz meg. A haplotípusok szerkezetét meghatározó (framework) gének minden NK sejten kimutathatók (14). Az egyes genotípusok eltérõ gyakorisággal (1-9%) fordulnak elõ, a gének száma 6 (9%) és 15 (3%) között változik. A leggyakrabban a 2DL1, 2DL3, 2DL4, 3DL1, 3DL2, és a 3DL3 receptor gének mutathatók ki (19). Egy NK sejt tulajdonságát az aktiváló és gátló receptorok egyensúlya fogja meghatározni, amely a képzõdõ tumorsejtekkel szembeni reakció irányát is befolyásolja. Figyelembe véve az NK sejtek-

2. ábra: lektin receptorok emberi NK sejtek gátló és stimuláló receptor génjei a 12-es kromoszómán (Lanier Curr. Op. Immunol., 2003 nyomán)

12


nek a HLA rendszertõl független szegregálódását és genetikai polimorfizmusát, a jövõben várható, hogy az õssejt átültetéseknél az NK sejtek genetikai tipizálása bevezetésre kerülhet. Az NK sejtek reziduális leukémia sejteket elpusztító hatása, amely különösen akut myeloid leukémiás esetekben, haplo-identikus átültetéseknél igazolt, szintén támogatja ezt a folyamatot (ld. késõbb). Az NK-receptorok(KIR) jelzése a korábbi standard elnevezés szerint történik (20): KIR elsõ 2 betûje a domének számát jelzi, pl. 2D, 3D. Gátló (ITIM) motívumot fõként a hosszú (L, long) citoplazmikus farokkal bíró receptorok hordoznak pl. 2DL, 3DL. Aktiváló hatást általában a rövid, (S short) citoplazmikus farokkal bíró receptorok fejtenek ki, pl. 2DS, 3DS. Az utolsó digit azt jelöli, hogy milyen fajta (1-5) intracitoplazmikus résszel kapcsolódott a receptor: pl. 3DL4.

C-típusú lektin gének Termékeik a kálcium függõ, a sejtfalon áthatoló fehérjék, amelyek a C-típusú, lektinkötõ külsõ doménnel bírnak. Az MHC komplexben kódolt, stressz indukált struktúrákat ismernek fel (MICA és MICB). Az NKG2 gének izoformjai (-A-H) számos glikoprotein receptort alkotnak a diszulfid híddal kapcsolódó CD94-el. Gátló, vagy aktiváló tulajdonságot hordoznak. Az emberi leukocyták lektin típusú receptorai a 12p12–p13 kromoszóma régióban kódoltak (2. ábra). A 28 génbõl álló komplex csak részben kódol NK receptorokat. Ezek egyrészt a nem klasszikus HLA –E molekula receptorai (NKG2A), másrészt a további HLA-F és – H molekulával (NKG2-C –E, -H) kapcsolódnak (5). Az NKG2A – NKG2F receptorok a CD94 molekulával kovalens kötéssel kapcsolódnak. Kivételt képez a kétláncú formában fontos aktiváló receptorként mûködõ NKG2D, amely nem kapcsolódik a CD94-el. A KIR család a 19-es, a lektin receptor család pedig a 12-es kromoszómán helyezkedik el kifejezetten konzervatív struktúrát jelentve. Így mind a receptorok mind a ligandumok egymástól függetlenül öröklõdnek. Az MHC (HLA) génektõl eltérõ öröklõdés (6-os kromoszóma) azt jelenti, hogy HLA-antigénekben egyezõ õssejt donorok az NK sejtek KIR receptoraiban még a nem egypetéjû ikrek esetében is eltérõek lehetnek (37).

NK-fenotípusok Az utóbbi években lehetõség nyílt az NK sejtek KIR receptor fenotípusának standard genetikai módszerekkel (PCR) történõ meghatározására, mivel a szükséges primerek rendelkezésre állnak (8,28). Ennek fontosságát az újabb klinikai adatok tükrében ítélhetjük meg. Érdekesek azok a micro-array vizsgálatok, amelyek arról számolnak be, hogy bizonyos NK gének csak a korai, mások a késõi NK sejtekben mutathatók ki és végül a gének egy része mindkét sejtcsaládban kimutatható. További kutatómunka szükséges ahhoz, hogy a gének és az NK sejtek mûködésének összefüggését megismerhessük (36).


Újabban az NK sejtek „átíródási aláírásáról” számolnak be a kutatók. Ezen számos DNS micro-array vizsgálat adatainak analízisébõl kialakított olyan átírt (fehérje) struktúrákat értenek, amelyek együttesen jellemzõek és megkülönböztetik az NK sejteket más sejttípusoktól, különösen a T-, B- és NK/T sejtektõl (79 ilyen gén jellemzõ kombinációjáról számolnak be) (35).

Klinikai megfigyelések Elöljáróban megemlítendõ, hogy az eddigi klinikai megfigyelések azt bizonyítják, hogy az õssejt donor és a befogadó szervezet (recipiens) közötti NK kompatibilitás szintje egyértelmûen befolyásolhatja a beültetett sejteknek a gazda szervezet ellen meginduló immunreakcióját, amely az életet veszélyeztetõ ún. graft versus host (GVH) betegség formájában nyilvánul meg. További megfigyelések kellenek azonban ahhoz, hogy ennek a viszonynak a részleteit is megismerhessük. Ésszerû tehát, hogy az NK sejtek receptorainak genetikai módszerekkel történõ meghatározása tért nyerjen és az eddigi eredményekbõl bevezetésre kerüljenek azok az eljárások, amelyek a betegek javát szolgálhatják. Ismeretes, hogy a fehérvérûségek (leukémiák) gyógyításának elõkészítésénél (kondicionálás) a lehetséges maximális sejtölõ kezelés (besugárzás + kémiai szerek) szinte teljesen elpusztítja a befogadó szervezet saját immunkompetens- és vérképzõ sejtjeit, azonban a leukémia sejtekbõl rezisztens sejtpopulációk maradnak a szervezetben, amelyekbõl a malignus folyamat kiújulhat. Az õssejt átültetéseket (csontvelõ transzplantáció) követõ regenerációban a periférián megjelenõ elsõ sejtcsaládot az NK sejtek alkotják, amelyek donor NK sejtek jellemzõit hordozzák. Fontos kiemelnünk, hogy az utóbbi években az NK sejtek felszíni receptorainak részletes analízisére egyszerû genetikai módszerek (PCR) állnak rendelkezésünkre, amellyel a sejtek allo-specificitása vizsgálható (8,28). Az õssejt átültetések jelentõs részében nem található optimális családi donor, ezért a 90-es évek elején, az állatkísérletekbõl szerzett kutatási eredmények alapján megindultak a családon belüli haplo-identikus õssejt átültetések, amelyek a teljes kompatibilitású rokon donor hiányát és a HLA kompatibilis nem rokon donor-keresés idõt veszítõ és költséges voltát kívánták áthidalni. Ezzel a folyamattal együtt járt a T-sejt-mentesítés eljárásainak és mértékének, valamint a kondicionáló kezelések módszerének fejlõdése is, amely szükséges a nagyon érzékeny egyensúlyi állapot elérésére és fenntartására a maradék leukémia sejtek elölése és a GVH reakció minimalizálása céljából (33). Az átültetett NK õssejtekben ugyanis hiányoznak a beteg HLA antigénjeire specifikus gátló receptorok, amelyek – a gátlás hiányában – elpusztítják a maradék leukémia sejteket. Az NK sejtek nagy affinitással bírnak a csontvelõi sejtek irányában. Ez lehet a további magyarázata annak, hogy a maradék repopulálódó leukémia sejteket elpusztítják, meggátolva a betegség kiújulását. In vitro és egér kísérletek arra utalnak, hogy a limfoid leukémia sejtek ellen13


állók az NK-killinggel szemben a myeloid sejtekhez képest (25). Az allo-reaktív NK sejtek felismerik és szintén eliminálják a recipiens antigén-prezentáló dendritikus sejtjeit (APC), amely a hematopoietikus affinitáson túl tovább magyarázza, hogy az allo-reaktív NK sejtek nem váltanak ki GVH reakciót (13). Érdekes megfigyelés, hogy leukémiák heterogén csoportjában a HLA-BW6 csoport gyakoribb leregulálását észlelték, mint a HLABW4-csoportba tartozó ligandumokét. Ismeretes ugyanis, hogy a BW6 csoportot az NK sejtek „nem látják”, így leregulálásuk, és a BW4 csoport megtartása (amit az NK sejtek „látnak”), a leukémia sejteket mind az NK-, mind a T-sejtes citotoxikus immunmechanizmus elõl megmenekíti (33). A közleményekben megjelenõ klinikai megfigyelések és a különbözõ analízisek összehasonlítása nehézségekbe ütközik, mivel eltérõ diagnózisokat, betegségcsoportokat alkotnak, amelyet a kondicionáló kezelés, az életkor, az összehasonlításra alkalmazott paraméterek eltérései és még számos más faktor tovább bonyolítanak, megnehezítve, hogy statisztikai módszerekkel összevethetõ eredményekhez jussunk. Korábbi vizsgálatok a HLA azonos õssejt átültetésekben azt mutatták, hogy ha a befogadó szervezet KIR genotípusában megtalálható volt a nem rokon (idegen) donor KIR genotípusa, akkor 100%-ban fejlõdött ki GVH betegség, amíg rokon donor esetében, ha a recipiens genotípusa benne elõfordult, nem fejlõdött ki GVHD. Az összes további kombinációban 60% volt a GVH-betegség elõfordulása (8). A nehézségek ellenére nagyobb betegcsoport folyamatos analízisével tisztázódni látszanak azok az immunológiai folyamatok, amelyek az õssejt átültetéseknél jelentõs szerepet játszanak. Korábbi, 112 magas kockázatú akut leukémiás beteg kezelésébõl nyert eredmények egyértelmûen bizonyították az allogén reaktív NK sejtek szerepét a betegek túlélésében. A reaktív immungenetikai viszonyban végzett átültetések után nem következett be az átültetett õssejtek kilökõdése és a legalább II. fokozatú GVHD sem alakult ki (0% vs.13,7%). Ugyanakkor már ez a tanulmány is rámutatott arra, hogy a kedvezõ hatás elsõsorban AML kezelésében tapasztalható. Az 5 éves túlélés során relapsust sem észleltek (0% vs. 75%) AML-ben (27). Más közleményükben, 85 progresszív stádiumú AML beteg (1993-2003 között transzplantált) esetében jelentõsen csökkent a relapsusok száma az allo-reaktív NK csoportban (17% vs. 79%) és a betegek 52%-a esemény mentesen élt túl a nem-reaktív csoporttal szemben (7%) (25). A recipiens MHC-I ligandjaival reagáló donor NK sejtek transzplantációját követõen több, mint 100 magas kockázatú, felnõtt AML beteg analízisével bizonyították, hogy mind a transzplantáció veszélyét jelentõ GVH-betegség kockázata, mind az alapbetegség kiújulásának veszélye egyértelmûen csökkent. Az alloreaktív NK- (un.reagáló) donor az egyik független prognosztikai tényezõnek tekinthetõ a betegek túlélésében is. A családi alloreaktív donorok alkalmazásának határa van, 14


ugyanis immungenetikai okok miatt a családtagok egyharmada nem reaktív (26). AML-ben és MDS-ben azt észlelték, hogy azok a betegek, akikben hiányzott a donor KIR genotípusnak megfelelõ HLA ligandum, szignifikánsan hosszabb betegség-mentes és átlagos túlélési idõt mutattak (10). Hasonlóképpen ugyanez volt megfigyelhetõ 372 korai stádiumú myeloid leukémiás betegnél (CML) is akiknek egyik KIR ligandjuk (MHC-I) hiányzott (21). A KIR-receptorok jelentõségét újabb fontos eredmények húzzák alá. 202 HLA azonos testvér közötti õssejt-transzplantált beteg klinikai adatainak elemzésével bizonyították, hogy a transzplantáció eredményessége függ a donor- és recipiens KIR genotípusától. Aktiváló típusú KIR receptor jelenléte a donor sejteken emelte az immun-reaktivitást, ugyanakkor a befogadó szervezet gátló KIR receptorai az elfogadást segítették elõ. Az alapbetegség kiújulása nélküli túlélés különösen AML-ben bizonyult kifejezetten hosszabbnak. A legutóbbi és korábban megjelent klinikai közlemények (29) rávilágítanak a HLA egyezõség vizsgálata mellett a gátló- és aktiváló KIR receptorokkal bíró NK sejtcsaládok szerepére az átültetett õssejtek megtapadásában, valamint a GVH betegség kiváltásában. További kiterjedt vizsgálatok és klinikai megfigyelések szükségesek a fenti ígéretes eredmények megerõsítésére és az aktiváló/gátló KIR receptorok immungenetikai tesztelésére, amelyek jelentõsen megváltoztathatják az õssejt transzplantációs terápiás eljárásban eddig követett kiválasztási stratégiánkat (13). Az NK sejteknek az õssejt transzplantációkban betöltött szerepével a közelmúltban megjelent munkánkban részletesen is foglalkoztunk (2). Azt is észlelték, hogy nem rokon õssejt átültetést követõ GVHD erõsségét növelte, ha a leukémiás betegek több gátló KIR receptorral bírtak, mint a donorok és/vagy a donoroknak több aktiváló receptora volt, mint a betegeknek. Végül csökkent a betegség kiújulása, ha a donoroknak KIR2DS1 és – 2DS2 receptoruk volt (29). Japán szerzõk 379 vastagbél-daganatos beteg vizsgálatával megállapították, hogy a magas NK aktivitásvédõhatású ebben a daganattípusban (7). A klinikai megfigyelések közül még megemlítenénk azt a gyakorlati szempontból is fontos adatot, hogy átültetett máj transzplantátumok sikeres befogadására lehet következtetni, ha a KIR2DL1/S1 (CD158a), illetve a KIR2DL2/3/S2 (CD158b) pozitív NK és memória Tsejtek száma az átültetés elõtt az egészséges kontrollokéhoz hasonló, illetve a mûtét után jól regenerálódik (16). Ez utóbbi közlemények azt az egyébként logikus következtetést támasztják alá, hogy az NK sejtek mind a hematopoietikus, mind a szervátültetésben fontos immunológiai funkciót töltenek be.

A magzat védelme Az elsõ trimeszterben a méhben egy különleges NK sejtcsalád alkotja a limfoid sejtek mintegy 70-90%-át. Ezek az uterus NK sejteknek (uNK) nevezetett sejtek aktivált populációnak tekinthetõk, amelyek a méh átalakult nyálkahártyájában hormonális szabályozás alatt


állnak, eltérõ sejtfelszíni markereik pedig a korai NK sejtekre emlékeztetnek. A méhbe beágyazódó petesejt genetikai okok miatt immunológiailag „félig idegen” (szemi-allogén). Az embrió burkokon a HLA-C mellett, a nem klasszikus HLA-G és HLA-E fejezõdik ki. A G-molekula, LIR-1 receptorain keresztül gátolja, hogy az uNK sejtek felismerjék a szemi-allogén trophoblast sejteket, amely elõsegíti a foetus beágyazódását és fejlõdését (24). További, és újabb vizsgálatok szerint elõtérben álló gátló mechanizmus a HLA-E molekula és a CD94-NKG2 (-A és -C) lektin receptor kapcsolat, amely fiziológiás terhesség esetén gátló hatást fejt ki. Mindeddig az a logikus munkahipotézis, hogy az uNK sejtek a szemi-allogén foetust ismerik fel és végsõ soron az elsõ trimeszterben a terhesség fennmaradásában, illetve a „spontán” vetélésekben a legfontosabb immunológiai tényezõt jelentik (12), kellõképpen még nem bizonyított. Korábbi munkánkban ezzel a kérdéssel részletesebben is foglalkoztunk. A hormonális szabályozás és progeszteron indukálta blokkoló faktor kapcsolatában magyar kutatók értek el figyelemre méltó eredményeket (PIBF)(9, 30,31). Jól ismert tény, hogy a kísérletes vizsgálatok eredményei csak igen lassan és kellõ kritikai vizsgálatok után szûrõdnek át a klinikumba. Örömmel látjuk az újabb közleményeket, amelyek azt jelzik, hogy az évtizedek kísérletes eredményei, különösen a genomikai vizsgálatok révén a klinikumban hasznosulnak. Irodalomjegyzék

1. Arnon T., Markel G., Mandelboim O.: Tumor and viral recognition by natural killer cells receptor. Semin. Cancer Biol., 16, 348-358, 2006 2. Benczúr M.: Emberi NK sejtek allogén felismerõ képessége és funkciója az õssejtek transzplantációjában. Hemat. Transzf., 39, 5-9, 2006 3. Benczúr M.: Emberi természetes ölõsejtek (NK) genomikája és mûködése. Magyar Tudomány, 4, 396399, 2009 4. Benczúr M., Petrányi G Gy., Pálffy Gy.et al.: Dysfunction of natural killer cells in multiple sclerosis: a possible pathogenetic factor. Clin. Exp.Immunol., 39, 657-662,1980 5. Borrego F., Kabat J., Dae-Ki K. et al.: Structure and function of major histocompatibility complex (MHC) class I specific receptors expressed on human natural killer (NK) cells. Mol. Immunol., 38, 637-660, 2002 6. Cooper M., Fehniger M.A., Caligiuri M.A.: The biology of human natural killer-cell subsets. Trends Immunol., 22, 633-640, 2001 7. Furue H., Matsuo K., Kumimoto H. et al.: Decreased risk of colorectal cancer with the high natural killer activity NKG2D genotype in Japan. Carcinogenesis, 29(2), 316-320, 2008 8. Gagne K.G., Brizard B., Gueglio N. et al.: Human Relevance of KIR gene polymorphisms in bone marrow transplantation outcome. Immunology, 63, 271-280, 2002


9. Hammer C.A., Polgár M., Hartmann R. et al.: Human trophoblast cells express the immunomodulator progesterone-induced blocking factor. J. Reprod. Immunol., 79, 26-36, 2008 10. Hsu K.C., Keever-Taylor C.A., Wilton A. et al.: Improved outcome in HLA-identical sibling hematopoietic stem-cell transplantation for acute myelogenous leukemia predicted by KIR and HLA genotypes. Blood, 105, 4878-4884, 2005 11. Hyung-Sik K., Kimb E-M., Sanggyu L.: Stage-dependent gene expression profiles during natural killer cell development. Genomics, 86, 551-565, 2005 12. Lanier L.L: NK receptors. Ann. Rev. Immunol., 16, 359–393, 1998 13. Leung W.R., Iyengar V., Turner P. et al.: Determinants of antileukemia effects of allogeneic NK cells. J. Immunol., 172, 644–650, 2004 14. Li Hao: Evolution of natural killer cell receptor genes. PhD értekezés. Pennsylvania State Univ., 2006 15. Ljunggren H.G., Kärre K.: In search of the missing self: MHC molecules and NK cell recognition. Immunol. Today, 11, 237–244, 1990 16. Lopez-Álvarez M. et al.: Analysis of KIR2D receptors on peripheral blood lymphocytes from liver graft recipients. Transplant. Immunol., 17, 51-54, 2006 17. Loza M.J., Perussia B.: The IL-12 signature: NK cell terminal CD56+ high stage and effector functions. J. Immunol., 172, 88–96, 2004 18. Maghazachi A.A.: Compartmentalization of human natural killer cells. Mol. Immunol., 42, 523-529, 2005 19. Malmberg K-J. Schaffer M., Ringdén O.: KIR-ligand mismatch in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Mol. Immunol., 42, 4531-4534, 2005 20. Marsh S.G., Parham B., Dupont D.E. et al.: Killer-cell immunoglobulin-like receptor (KIR), nomenclature report, 2002. Tissue Ant., 62, 79-86, 2003 21. Miller J.S., Cooley,S., Parham P. et al.: Missing KIR ligands are associated less relapse and increased graft-versus host disease (GVHD) following unrelated donor HCT. Blood, 109, 5058-5061, 2007 22. Moretta L., Bottino C., Pende D. et al.: Human natural killer cells: Molecular mechanisms controlling NK cell activation and tumor cell lysis. Immunol. Letters, 100, 7-13, 2005 23. Moretta A., Bottino M., Pende D.: Surface NK receptors and their ligand on tumor cells. Semin. Immunol., 18, 151-158 2006 24. O’Connor G.M., Hart O.M., Gardiner C.M.: Putting the natural killer cell in its place. Immunology, 117, 1-10, 2006 25. Ruggeri L., Capanni M., Mancusi A. et al.: Natural killer cells as a therapeutic tool in mismached transplantation. Best Practice &Res. Clin. Haematol., 17, 427438, 2004 26. Ruggeri L., Capanni M., Urbani et al.: Effectiveness of donor natural killer cell alloreactivity in mismached hematopoietic transplants. Science, 295, 2097-2100, 2002 27. Ruggeri L., Mancusi A., Burchielli E. et al.: Natural Killer cell recognition of missing self and haploiden15


28.

29.

30.

31.


32. Trinchieri G.: Biology of disease of human NK cells: Biological and pathological aspects. Lab. Invest., 50, 489-513, 1984 33. Verheyden S., Demanet C.: NK cell receptors and their ligand in leukemia. Leukemia, 22, 249-257, 2008 34. Vivier E.: What is natural in natural killer cells? Immunol. Letters, 107, 1–7, 2006 35. Walzer T., Jaeger S., Chaix J. et al.: Natural killer cells: from CD3-NKp46+ to post-genomics meta-analyses Curr. Op. Immunol., 19, 365-372, 2007 36. Wilk E., Kalippke K., Buyny S. et al.: New aspects of NK cell subset identification and inference of NK cells’ regulatory capacity by assessing functional and genomic profiles. Immunobiol., 213, 271-283, 2008 37. Wilson M.J., Torkar M.A., Haude T. et al.: Plasticity in the organization and sequences of human KIR/ILT gene families. PNAS USA, 97, 4778–4784, 1997 38. Zhang C., Zhang J., Wei H.: Imbalance of NKG2D and its inhibitory counterparts: How does tumor escape from innate immunity? Internat. Immunopharmacol., 5, 1099–1111, 2005

tical hematopoietic transplantation. Sem. Cancer Biol., 16, 404-411, 2006 Steffens U., Vyas Y., Dupont B. et al.: Nucleotide and amino acid sequence alignment for human killer cell inhibitory receptors (KIR). Tissue Ant., 51(4), 398413, 1998 Sun J.Y., Gaidulis L., Dagis A. et al.: Killer Ig-like receptor (KIR) compatibility plays a role in the prevalence of acute GVHD in unrelated hematopoietic cell transplants for AML. Bone Marrow Transpl., 36, 525530, 2005 Szekes-Bartho J., Faust Zs., Varga L. et al.: The immunological pregnancy protective effect of progesterone is manifested via controlling cytokine production.; Am.J. Reprod. Immunol., 35, 348-351,1996 Szekeres-Bartho J., Kilar F., Falkay G. et al.: The mechanism of the inhibitory effect of progesterone on lymphocyte cytotoxicity I. Progesterone-treated lymphocytes release a substance inhibiting cytotoxicity and prostaglandin synthesis. Am. J. Reprod. Immunol. Microbiol., 9, 15–18, 1985

Megrendelõlap (Focus Medicinae) Alulírott, postai úton megrendelem a Focus Medicinae címû kiadvány .............................................. számát, ............ példányban 650,- Ft + 5% áfa/pld. áron. Megrendelõ neve: ..................................................................................................................... Címe: .......................................................................................................................................... Megrendelését az alábbi címre kérjük elküldeni:

Dursusz Bt. 1106 Budapest, Juhász u. 47/A. Telefon/Fax: 262-8688 E-mail: [email protected]

16


Autoimmunitás: alapmechanizmusok és azok szerepe endokrin betegségekben

Autoimmunitás: alapmechanizmusok és azok szerepe endokrin betegségekben Dr. Kalmár Ágnes, Dr. Szolnoky Miklós Fõvárosi Önkormányzat Szent János Kórháza és Észak-budai Egyesített Kórházai, Budapest Összefoglalás: A saját antigénekkel szembeni immunválasz szabályozása magába foglalja az autotolerancia fenntartását is. Ha a tolerancia sérül, az immunrendszer a sajátot idegenként ismeri fel, és celluláris valamint humorális immunreakciót hoz létre ellene, ami autoimmun betegség kialakulásához vezet. A tolerancia megváltozásában genetikai és környezeti tényezõk egyaránt közrejátszanak. A tolerancia aktív folyamat, centrális és perifériás része is van, mindkettõben részt vesznek a T- és Blymphocyták. A tolerancia elvesztése elméletileg számos módon megtörténhet. Ezek közül a legkézenfekvõbb a perifériás tolerancia károsodása azokban az autoimmun betegségekben, amelyek igen szelektív módon csak egyes szerveket érintenek. Mivel egyes endokrin betegségekhez gyakrabban társulnak egyéb autoimmun endokrin és nem endokrin kórképek, az ilyen betegségek fennállása esetén rendszeres szûrõvizsgálatokkal keresni kell a társult kórképet. Továbbá szisztémás autoimmun betegségekhez gyakran társulhatnak autoimmun endokrin kórképek, így lehetséges az is, hogy a felfedezett endokrin megbetegedés esetleg egy szisztémás autoimmun betegség részjelensége. Ezért is fontos a pontos diagnózis felállítása és a lehetséges endokrinológiai kapcsolatok tisztázása.

Summary: The regulation of immune-response against the own antigens includes the maintenance of autotolerance. If the tolerance is destroyed, the immune system detects the own as foreign, thus forces cellular and humoral immune reaction against them, which causes the formation of an autoimmune disease. Some genetic and ambient factors play role in the modification of tolerance as well. The tolerance is an active process, it has central and periferal parts, the T- and B-lymphocytes take part in both of them. The lost of tolerance can happen on more ways theoretically. The most plausible the impairment of the peripheral tolerance in such autoimmune diseases, which are selective to certain organs. While some other autoimmune endocrine and non-endocrine diseases can be joined to certain endocrine illnesses, in the persistance of these cases more frequently the associated disease must be looked for by frequent screenings. Furthermore some autoimmune endocrine diseases can be joined to systemic autoimmune illnesses frequently, therefore a detected endocrine disease might be a partsymptom of a systemic autoimmune illness. Because of it the exact diagnosis and clarifying of the possible endocrine contacts are important.

Kulcsszavak: antigén bemutatás, autoantigén, autoantitest, autoreaktív lymphocyta, kostimulációs molekulák, MHC, regulátoros T-sejtek, tolerancia, CTLA-4, PTPN22, CD40, Aire gén, FoxP3, HLA régiók, MHC, monoklonális antitest terápia

Key words: antigen presentation, autoantigen, autoantibody, autoreactive lymphocyte, costimulations molecules, MHC, regulatory T-cells, tolerance, CTLA-4, PTPN22, CD40, Aire gene, FoxP3, HLA regions, MHC, monoclonal antibody therapy

Rövidítések jegyzéke:

Bevezetés

MHC = major histocompatibility complex TCR = T-sejt receptor T1D = 1-es típusú diabetes mellitus Treg = regulátoros T-sejtek Th = helper T-sejtek HLA = human leukocyta antigén Aire = autoimmun regulátor TGF-β = transforming growth factor IL = interleukin CTLA-4 = citotoxikus T-lymphocyta asszociált faktor 4 AITD = autoimmun pajzsmirigy betegség SLE = szisztémás lupus erythematodes SNP = single nucleotide polymorphism PTPN22 = protein tirozin foszfatáz GAD = glutaminsav dekarboxiláz enzim NOD = non-obese diabetic IA-2 = inzulinoma-asszociált-2 ICA = „islet cell antigén” - szigetsejt antigén APECED = autoimmune polyendocrinopathy, candidiasis, ectodermal dystrophy IPEX = immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked IVIG = nagydózisú intravénás immunglobulin

A saját antigénekkel szembeni immunválasz szabályozása komplex folyamat, amely magába foglalja az autotolerancia fenntartását a hatékony immunválasz kifejtésének megõrzésével egyidejûleg. Ha a tolerancia sérül, az immunrendszer a sajátot idegenként ismeri fel, és sejtes valamint humorális immunreakciót hoz létre ellene, ami autoimmun betegség kialakulásához vezet. A tolerancia megváltozásában genetikai és környezeti tényezõk egyaránt közrejátszanak. Az autoimmun betegségek létrejöttében különbözõ gének polimorfizmusának szerepét vetették fel, ezt bizonyos esetekben már igazolták is. A környezeti ágensek közül is több, de mindeddig nem kellõen bizonyított tényezõ hatása is felmerült: infekciók, stressz, dohányzás. A különbözõ faktorok egyénenként változó jelentõséggel bírnak, ezért az autoimmunitás kialakulása tekintetében nincs egyértelmû genotípus-fenotípus kapcsolat (2,3).

Autotolerancia Az autoimmun reakció során patogén autoantitestek és a saját ellen fellépõ sejtes immunválasz egyaránt 17



létrejönnek. Ezt a folyamatot általában az immunológiai tolerancia szorítja határok közé. A tolerancia aktív folyamat, centrális és perifériás része is van, mindkettõben részt vesznek a T- és B-lymphocyták is. A centrális T-sejt tolerancia a thymusban a T-sejtek érése folyamán alakul ki. Azok az érõ T-sejtek, melyek nagy kötõerõvel (aviditással) ismerik fel a saját MHC (major histocompatibility complex) – saját peptid komplexeket klonális deléción esnek át és elpusztulnak. Ugyanakkor az érõ B-sejtek is átesnek tolerizáción: az IgM pozitív, éretlen, naív B-sejtek antigénnel való találkozáskor vagy anergiássá válnak, vagy elpusztulnak. A T-sejt ontogenezis során nem minden antigén kerül be a thymusba, ezért szükséges a perifériás T-sejt tolerancia fennállása is. A T-sejt aktiváció kezdetéhez két szignál szükséges. Az egyik antigén-specifikus, és az MHC-T-sejt receptor (TCR) komplexen keresztül jut érvényre, míg a második nem specifikus, pl. a T-sejteken levõ CD28 kostimulációs molekula és az antigén bemutató sejteken levõ B7 kölcsönhatásából származik. Perifériás tolerancia akkor alakul ki, ha a második jel hiányzik, ez a klonális anergia. Ennek az elvesztése az 1-es típusú diabetes mellitus (T1D) kialakulásának egyik alapmechanizmusa. A perifériás tolerancia további formái: autoreaktív T-sejtek deléciója, ignorancia, aktív szuppresszió regulátoros T-sejtek (Treg) által (4). A perifériás B-sejtes tolerancia a T-sejtes tolerancián keresztül alakul ki, ehhez is két szignál szükséges. Az elsõ a B-sejt receptor (felszíni antitest) és az antigén kölcsönhatásából származik, a második helper T-sejtektõl (Th). Ha ez utóbbi hiányzik (mert a T-sejtek toleránsak), a B-sejtek nem aktiválódnak, nem proliferálnak és nem történik meg az immunglobulin osztályváltás, így a B-sejtek nem termelnek IgG típusú autoantitesteket nagyobb mennyiségben.

Autoimmun betegségek kialakulása: a tolerancia elvesztése A tolerancia elvesztése elméletileg számos módon megtörténhet. Ezek közül a legkézenfekvõbb a perifériás tolerancia károsodása azokban az autoimmun betegségekben, amelyek igen szelektív módon csak egyes szerveket érintenek. További elméletek a tolerancia elvesztésére: a klonális deléció elmaradása, antigén szekvesztráció, saját antigének megváltozása, károsodott MHC-II expresszió, szuperantigén elmélet és poliklonális B-sejt stimuláció. A folyamatok genetikusan programozottak, specifikus immunválasz géneken keresztül jutnak érvényre.

Antigén bemutatás Az aktív immunválasz vagy tolerancia kialakulásának elsõ lépése az antigén felismerése. Az antigén bemutatásban az MHC-I és MHC-II molekuláknak döntõ jelentõsége van, hiszen a T-sejtek az ezekkel kötõdött antigéneket ismerik fel az antigén bemutató sejteken. Az MHC molekulák átírását kódoló HLA (human leuko-

18

cyta antigén) régió a 6-os kromoszómán helyezkedik el, amely számos immunválasz gént is tartalmaz. Ide sorolható az Aire (autoimmun regulátor) gén, amely számos autoantigén, pl. az inzulin transzkripcióját elõsegíti, és szerepel az autoreaktív thymocyták negatív szelekciójában. Hiányában tehát az autoreaktív T-sejtek nem pusztulnak el a thymusban, és ez alapot teremt több endokrin szervben az autoimmun betegség létrejöttéhez (ld. APS1). A legfontosabb antigén bemutató sejtek a dendritikus sejtek. Az indukált dendritikus sejtek autoantigént mutatnak be a T-sejtek számára, és ezáltal biztosítják nyugalmi állapotban a perifériás toleranciát. Bizonyos körülmények között azonban tolerancia helyett (pl. antiCD40-el való kezelés) T-sejt aktiváció lép fel. 1-es típusú diabetes mellitusban B-sejtek is közremûködnek az antigén bemutatásban és ezáltal autoreaktív T-sejtek indukálásában. Így pl. B-sejt hiányos egerekben késõbb alakul ki insulitis, nem jön létre a fõ autoantigénekkel, GAD65-el és HSP60-al szemben autoreaktív T-sejt válasz sem. Ezért terápiásan kiaknázható lehet a B-sejt depletáló monoklonális antitestek alkalmazása.

Regulátoros T-sejtek A CD4+CD25+Foxp3+ Treg sejtek az immunrendszer fõ szabályozói. Normális állapotban fenntartják a sajáttal szembeni toleranciát, túlmûködésük azonban gyengíti a tumorsejtek és paraziták feletti immunfelügyeletet. A természetes Treg sejtek biztosítják nyugalmi helyzetben a kontrollt, míg az indukált Treg sejtek gyulladásos körülmények között, amikor citokin termelés is szükséges a gátló folyamatok erõsítéséhez. A regulátoros T-sejtek feladata az effektor T-sejt válaszok gátlása, mely az autoreaktív T- sejteket is érinti. A természetes Treg sejtek Foxp3 pozitívak, amely a CD4+CD25+ regulátoros T-sejtek funkciójáért felelõs transzkripciós faktor. Ezen kívül egyéb markereket is hordoznak: GITR, CTLA-4, LAG-3, FR4 (folát receptor), kemokin receptorok, homing molekulák. Utóbbiak révén alakul ki a szervspecificitás, mely terápiásan is kihasználható lehet ezen molekulák indukciójával, mint az alább látható. A Foxp3 mutációja a Treg sejtek képzésének zavarához vezet. IPEX szindrómában (immun disregulatio, polyendocrinopathia, enteropathia, X-linked) a Foxp3 gén defektusa áll fenn. Ezek a betegek fatális kimenetelû autoimmun betegségben szenvednek, ideértve a pajzsmirigy betegségeit is. Állatkísérletben a betegség kialakulása CD4+CD25+ sejtek átvitelével megelõzhetõ. Az indukált regulátoros T-sejtek a perifériás limfoid szervekben alakulnak ki saját antigén expozíció hatására, amikor TGF-β (transforming growth factor) termelõ Th3 (helper) sejtek képzõdnek. Ezek a sejtek „bystander” szuppresszióra is képesek, ami azt jelenti, hogy nemcsak a kiváltó antigénnel szemben érvényesül a szabályozás. Ismételt antigén behatásra Tr1 (regulátoros) sejtek fejlõdnek ki, melyek interleukin 10-t (IL-10) termel-



nek. Újabban CD8+ regulátoros T-sejteket is izoláltak, melyek Foxp3-t, CTLA-4-t, GITR-t expresszálnak (9,10). A hormonok fontos szerepet töltenek be a Treg sejtek kifejlõdésében és fenntartásában. Az ösztrogén kezelés in vivo is emeli a Treg sejtek, sõt az IL-10 termelõ Tr1 sejtek számát is. A zsírszövet is számos hormont termel. Ezek közül a leptin immunregulátoros sajátságokkal is rendelkezik, gátolja a Treg sejtek expanzióját (mivel azok leptin receptort hordoznak). Ebbõl kifolyólag leptin receptor ellenes antitestekkel a Treg sejtek proliferációja elõsegíthetõ. Mindez aláhúzza az endokrin és immunrendszer kölcsönhatásának jelentõségét.

Infekciók szerepe az autoimmunitás kialakulásában A fertõzõ ágensek hatékony stimulust jelentenek az immunrendszer számára, és arra érzékeny egyénekben autoreaktív T-sejtek szelekciójához is vezethetnek. Több infekció és autoimmun betegség között fedeztek fel kapcsolatot (T1D), de a patogenetikai összefüggés a mai napig nem tisztázott. Az egyik magyarázat a molekuláris mimikri, amely akkor lép fel, ha egy saját antigén és egy idegen antigén között keresztreakció áll fenn, aminek következtében a sajátot idegenként ismeri fel az immunrendszer. A keresztreaktivitást a T-sejt epitópok korlátozott felismerõ-képessége is okozhatja, mivel egy T-sejt receptor több hasonló szerkezetû antigént is felismerhet, intrinsic keresztreaktivitást eredményezve. A peptidek MHC-hez való kötõdési erõssége is döntõ: az instabil komplexek nem érnek el negatív szelekciót a thymusban, de a periférián T-sejt proliferációt képesek elindítani. Másik lehetõség a keresztreaktivitás kialakulására, ha egy T-sejten két TCR van, különbözõ specificitással. Ha az egyik patogén specifikus, pozitívan szelektálódik, ezáltal lehetõséget teremtve, hogy a másik autoreaktív TCR kikerülje a negatív szelekciót és elérje a perifériát (példa rá: inzulin specifikus TCR-t hordozó T-sejtek). Mindettõl függetlenül a keresztreaktivitás nem elegendõ az autoimmun betegség kialakításához, más tényezõk is hozzá kell, hogy adódjanak. Az ún. „bystander” aktiváció nem-specifikus mechanizmus, aminek a folyamatában különbözõ kemokinek és citokinek termelõdnek, amelyek „bystander” sejteken is hatnak és azokat aktiválhatják. Coxsackie vírusfertõzésben láthatunk ilyet, amikor állatkísérletes adatok szerint az immunválasz során kialakult gyulladás elindíthatja diabetes kifejlõdését autoreaktív T-sejtek kialakulását erõsítve. Az „epitop spreading” egy másik alternatív mechanizmus, amellyel az autoimmunitás kezdetét magyarázzák. Ennek értelmében, ha a sejt valamilyen okból károsodik, saját antigének kerülhetnek bemutatásra, és kihívást jelentenek az immunrendszer számára.

Környezeti hatások A higiéne hipotézissel magyarázzák, hogy emelkedik az autoimmun betegségek száma a kevesebb infekció, a védõoltások eredményeképpen. A szocio-öko-

nomikus körülményekben és az infekciók számában fennálló különbségek hatását példázza az a vizsgálat, amely finn és orosz gyerekeket hasonlít össze, azzal az eredménnyel, hogy a finnekben gyakoribb az anti-TPO és anti-TG elõfordulása.

Gén polimorfizmusok jelentõsége Molekuláris genetikai vizsgálatokkal számos olyan gént, gén polimorfizmust találtak, melyek részben közös autoimmun hajlamosító gént jelentenek, részben olyanokat, amelyek az egyes szervek autoimmun betegségének létrejöttét segítik elõ. A közös, autoimmun regulációban részt vevõ gének közül néhánynak a jelentõségét részletezzük. A CD40 gén az egyetlen gén, amely a B-sejt regulációban vesz részt. A CD40 B-sejt aktivációs molekula, ligandja a CD154 a helper T-sejteken. A stimulált B-sejt második aktivációs jel hiányában rövid életû lesz, és csak kevés, mérsékelt affinitású antitestet fog termelni, melyek IgM izotípusúak. Ezt bizonyítja, hogy a CD154 elleni monoklonális antitestek meggátolják mind a primer, mind a szekunder antitestválasz kialakulását, és a kísérleti autoimmun betegségek (Graves betegség) fellépését is. A CD40 C allél (Kozak polimorfizmus) a T-allélhez képest fokozza a CD40 mRNS transzkripcióját, és ily módon a CD40 B-sejteken való expresszióját, ezáltal a B-sejtek könnyebben aktiválhatóvá válnak és autoimmun betegség a legkisebb behatásra elindulhat. A Bsejtek CD40 úton való aktivációja fokozódó IL-10 képzéshez és ezen keresztül a Th1/Th2 egyensúly Th2 felé való eltolódásához vezet, ami humorális autoimmun betegségek, pl. Graves betegség szempontjából kockázati tényezõt jelent. A CD40 megjelenik a thymocytákon, amelyek ezen kívül MHC-II expresszióra is képesek és ily módon antigén bemutató sejtként szerepelhetnek. Ugyanakkor Th1 dominanciájú autoimmun betegségekben (Hashimoto) a CD40 Kozak polimorfizmus nem játszik szerepet. A CTLA-4 molekula (citotoxikus T-lymphocyta asszociált faktor 4) a T-sejt aktivitás legfõbb negatív mediátora. A CTLA-4 monoklonális ellenanyaggal való blokkolása T-sejt aktivációhoz és IL-2 termelõdéshez vezet. Több polimorfizmust találtak, amely autoimmun betegségekkel összefügg, amelyek a CTLA-4 expresszióját vagy mûködõképességét befolyásolják, így a T-sejtek aktivációja fokozódik, minek folytán autoimmun folyamat elindulhat. A CTLA-4 polimorfizmusa számos autoimmun betegséggel összefügg, T1D, Addison kór, autoimmun pajzsmirigy betegség (AITD) minden formája, szisztémás lupus erythematodes (SLE): általános autoimmun génlokusznak tekinthetõ. Az, hogy mely szervben indul el az autoimmun folyamat, függ a környezeti tényezõktõl és a szervekre specifikus genetikai meghatározottságtól (pl. inzulin gén polimorfizmus) vagy egyéb genetikai hajlamosító génlokuszok polimorfizmusától (MHC) (7). A G allél esetében emelkedett a thyreoglobulin és TPO ellenes autoantitestek szintje, AITD relatív kockázatát 2,0-nek találták. A 3’UTR mikroszatellita jelenléte 19



a Graves betegség relatív kockázatát 2,1-rõl 2,8-ra emeli. A GG polimorfizmus a Graves betegség súlyosságával is összefüggést mutat, az ezt hordozó betegek között kevesebben kerülnek 5 év alatt remisszióba. Két Graves betegséggel kapcsolt polimorfizmust találtak, a CTLA-4(AT)n mikroszatellita és a CTLA4(49)A/G single nucleotide polymorphism (SNP). Ezek az allélek befolyásolhatják a thyreotoxicosis súlyosságát, az ophthalmopathia kialakulását és társuló autoimmun betegség fellépését is (T1D). Ezek az allélek a genetikai fogékonyság csaknem harmadát reprezentálják. Részt vesznek az autoimmun hypothyreosis kialakításában és a pajzsmirigy autoantitestek képzésében is. A protein tirozin foszfatáz (PTPN22) gén által kódolt fehérje szintén a T-sejt aktiváció hatékony inhibitora. A R620W SNP, amely funkcionális eltérést eredményez a limfoid kinázban, befolyásolja a jelátvitel szabályozását. A PTPN22 polimorfizmusa általában összefüggésben van az autoimmun betegségek kialakulásával, kiemelten szerepel T1D és Graves betegség patomechanizmusában.

Thyreoglobulin: pajzsmirigy specifikus hajlamosító gén A teljes genom vizsgálatok az AITD fogékonysági génjét a 8q24 kromoszóma régióra lokalizálták: ez a thyreoglobulin gén. A kóros thyreoglobulin és ennek kötõdése MHC-II-höz az antigén bemutatás folyamatában döntõ, ebben a HLA szerepe kiemelkedik: a DrβArg74 képes a kóros thyreoglobulin optimális bemutatására. Egerekben thyreoglobulin immunizáció autoimmun thyreoiditist válthat ki, melyben CD4+ T-sejtek játszanak meghatározó szerepet (5).

A TSH receptor gén A Graves betegség jellemzõje a stimuláló hatású TSHR elleni autoantitestek termelõdése. A TSHR vonatkozásában 3 fontos single nucleotide polymorphism ismeretes: kettõ a TSHR extracelluláris (D36H és P52T), egy az intracelluláris részén (D727E) helyezkedik el (6,7).

Autoimmun betegségek immunintervenciós kezelése Az autoimmun folyamatok részletes megismerése lehetõséget teremt olyan kezelési stratégiák bevezetésére, amelyek ezen folyamat valamelyik szakaszán beavatkozva akadályozzák meg a betegségek kifejlõdését. Az alábbiakban ezt példázzuk néhány újabb terápiás próbálkozás bemutatásával (a terjedelem korlátai miatt a teljesség igénye nélkül). Monoklonális antitestekkel aktivációs molekulákat lehet gátolni, sejtek mûködését kiiktatni, citokinek hatását befolyásolni. Számos ilyen antitestet fejlesztettek ki és próbáltak állatkísérletekben vagy humán vizsgálatokban autoimmun betegségek kezelésében. A B-sejtek jelentõs szerepet töltenek be, mint antigén bemutató sejtek. Elméleti síkon az autoantitest20

mediálta kórképekben az önmagukat stimuláló autoreaktív B-sejtek által generált circulus vitiosus megszakítása a B-sejtek átmeneti kiiktatásával terápiás hatékonyságú lehet. Ezért próbálkoznak B-sejt deplécióval anti-CD20 monoklonális antitesttel, T1D-ben valamint más autoimmun betegségben, pl. Graves betegségben is, helye lehet többek között súlyos ophthalmopathia megelõzésében. A sejt depléciót nem okozó anti-CD3 monoklonális antitesttel való kezelés is hatékony lehet. Egerekben, sõt emberben is lassítja T1D-ben a β-sejtek funkcióvesztésének folyamatát, a hatás azonban emberben nem tartós. Egérkísérletekben szolubilis CTLA-4 és IgG1 Fc régió fúziós proteinnel diabetes létrejöttét meg lehet elõzni (rheumatoid arthritis kezelésre már emberben is elfogadott). Az autoimmun folyamatok kontrollálásában a regulátoros T-sejtek töltik be a karmester szerepét. Ezért fordult újabban a figyelem ismét feléjük, hatékony kezelési módszerek kidolgozása érdekében. A Treg sejtek indukciójával erõsíthetõ a tolerancia, egérkísérletekben ez elérhetõ autoantigének mucosalis bejuttatásával (inzulin, GAD). Per os adott inzulin TGF-β termelõ Th3 sejteket, nazális úton bejuttatott IL-10 képzõ sejteket indukál, amelyek szupprimálják a CD8+ T-sejteket. A módszert pajzsmirigy betegségek megelõzésére is sikerrel alkalmazták, kifejlõdött autoimmun betegség kezelésére azonban nem alkalmas. T1D megelõzésében és kezelésében értek már el jó eredményeket in vitro expandált antigén (szigetsejt) specifikus Treg sejtekkel. Ezek a sejtek TGFβ-t és IL-10-et termelnek és gátolják a CD4+ effektor sejteket. Ha NOD (non-obese diabetic) egérbe a Treg sejteket diabetogén T-effektor sejtekkel együtt juttatják be, akkor is képes hatékonyan megakadályozni a kezelés a diabetes kialakulását. Az õssejt terápia magasan differenciált sejtek, pl. inzulin-termelõ pancreas β-sejtek alkalmazása kimeríthetetlen õssejt forrásból. Felnõtt pancreas ductus képletek is tartalmaznak õssejteket, de transzdifferenciálódás elérhetõ enteroendocrin, mesenchymális õssejteken vagy perifériás vér monocytákon is, intestinalis K sejtek is képesek lehetnek hormontermelésre bizonyos elõkezelés hatására. Olyan autoimmun betegségekben, ahol nem ismert a kiváltó autoantigén, a sejtek aktivációjához szükséges második jel kiiktatásával, a különbözõ kostimulációs utak gátlásával (pl. CD28-CD80/86) érhetõ el tolerancia autoimmun betegségekben. Az alapkoncepció az, hogy kostimulatorikus jelek döntik el azt, hogy immunválasz vagy tolerancia alakul-e ki az aktivációs jel átvitele folyamatában (8). A nagydózisú intravénás immunglobulin (IVIG) hatása az immunpatogenezisû kórképekben igen összetett. A kóros B-sejt klónra, az idiotípus-antiidiotípus hálózatra, a citokinek termelésére, a makrofágok Fc receptoraira, a komplement rendszerre stb. hatva többek között csökkenti az autoantitest termelést és a keringõ autoantitestek és immunkomplexek mennyiségét, továbbá az aktivált sejtek és komplementrendszer down-re-



gulációját idézi elõ. Az endokrin kórképek közül a legnagyobb tapasztalat az endokrin ophthalmopathiában történt alkalmazásáról van.

Autoimmun endocrinopathiak immundiagnosztikája A természetes autoantitestek (elsõsorban a CD5+ B1 B sejtek, más néven B1a B sejtek termelik) ún. alacsony affinitású, keresztreakciókat adó, polispecifikus, általában IgM-molekulák. Mennyiségük a szérumban ng/ml koncentráció alatti. A természetes ellenanyagok mennyisége csecsemõ- és idõskorban fiziológiásan alacsonyabb. Ez az idiotípus-antiidiotípus ún. Jerne féle hálózat egy önkorlátozó, egymással kölcsönhatásban lévõ B- és Thsejtek komplex hálózata, melynek jelentõs szerepe van az immunválasz szabályozásában. Az idiotípus-hálózat létére bizonyíték, hogy az anti-TSH elleni anti-idiotípus antitest (anti-anti-TSH antitest) TSH-szerûen viselkedik és kötõdik a TSH-receptorhoz (TSH-receptor elleni antitest). A patológiás autoantitestek IgG, IgA vagy IgM izotípusúak, nagy affinitásúak, szérumkoncentrációjuk 6 nagyságrenddel nagyobb, azaz mg/ml koncentrációban detektálhatók. Fõként sejtfelszíni struktúrák, receptorok, citoplazma-fehérjék vagy nukleoproteinek ellen termelõdnek. Egy betegségben akár többféle autoantitest is megjelenhet. Számos esetben az autoantitestek koncentrációja jól jelzi a betegség aktivitását, és a terápia hatékonyságának nyomon követésében is hasznos támpont lehet. Bizonyos esetekben csak az endokrin kórkép kezdeti szakában mutathatók ki a kóros autoantitestek (T1D, hyperthyreosis, Hashimoto-thyreoiditis). Máskor a betegség lefolyása során ellenanyag-pozitív és ellenanyag-negatív periódusok váltogatják egymást, ezért mindig javasolt az autoantitestek ismételt meghatározása. Az autoantitestek kimutathatósága sokszor megelõzi az autoimmun betegség megjelenését (antiGAD, szigetsejtek elleni antitestek stb.), melynek nemcsak az a jelentõsége, hogy ezeket a betegeket rendszeresen ellenõrizve a betegségét igen korai fázisban ismerhetjük fel, és idõben kezdhetjük meg a megfelelõ terápiát, hanem már a közeljövõben is várható, hogy megelõzõ, immunmoduláló kezeléssel megakadályozhatóvá válik egyes autoimmun betegségek klinikai manifesztálódása. Diabeteses betegek családtagjainál, akik szérumában kimutatható mindhárom az inzulin, GAD65 és IA-2 autoantitest 75% a rizikója, hogy 5 éven belül diabetes manifesztálódik, míg azon családtagoknál, ahol csak egy autoantitest expresszálódik a rizikó 25%. Az idõ elõrehaladtával a rizikó nem csökken. Tekintettel arra, hogy egyes endokrin betegségekhez gyakrabban társulnak egyéb autoimmun endokrin és nem endokrin kórképek, az ilyen betegségek fennállása esetén rendszeres szûrõvizsgálatokkal keresni kell a társult kórképeket. Az alábbi betegségek esetén és gyakorisággal ajánlott szûréseket végezni: T1D-hez 15-30%-ban társulhat autoimmun pajzsmirigy-betegség (elsõsorban hypothyreosis), 4-9%-ban coeliakia, 0,5%-ban Addison kór. APS1ben kb. 20%-ban fordul elõ T1D. Az Amerikai Diabetes

Társaság (ADA) és a vonatkozó szakirodalom jelenlegi ajánlása szerint a T1D-ben coeliakia irányába a diagnózis felállításakor, majd kétévente ajánlott szûrni (IgA izotípusú endomysium és szöveti transzglutamináz elleni autoantitestek, szeletív IgA-hiányban szenvedõknél IgG izotípus vizsgálata szükséges), pajzsmirigybetegségre évente (TSH és anti-TPO), Addison kórra (21hidroxiláz elleni autoantitest) kétévente. Kezeletlen coeliakiában a hypothyreosis elõfordulását háromszor találták gyakoribbnak (kb. 13%), mint a normál populációban, de a hyperthyreosisét nem. Mások viszont Graves-Basedow-kórban közel ötször gyakoribbnak (4,5%) találták a coeliakia elõfordulását a normál populációhoz (0,9-1,0%) képest. Az autoimmun pajzsmirigybetegségben gyermekkorban kétszer gyakoribbnak találták a coeliakia társulását, mint felnõttkorban. Coeliakiás betegek 5,4%-ában igazoltak T1D fennállását. Jelenleg még nem ismert, hogy a gluténmentes diéta vajon az autoimmun betegségek manifesztálódásának a valószínûségét is csökkenti-e, de arra már vannak adatok, hogy a diéta mellett esetleg csökken a diabetes és pajzsmirigy-betegség asszociált autoantitestek százalékos aránya. Mások ezt nem erõsítették meg. A 21hidroxiláz elleni autoantitest pozitív, nem diabeteses betegek esetében az Addison kór kialakulásának valószínûsége 10 és 50% közötti. Az autoimmun polyendocrinopathia szindróma különbözõ társulásait a vonatkozó fejezet tárgyalja. Általánosságban elmondható, hogy a társult autoimmun betegségekre évente, kétévente ajánlott az autoantitestek szûrõvizsgálatként történõ elvégzése klinikai tünetek hiánya esetén is. Fontos azt is figyelembe venni, hogy a vizsgált autoantitestek hiánya nem jelenti feltétlenül azt, hogy az adott betegség nem áll fenn vagy nem fog hamarosan manifesztálódni, tehát az autoantitest meghatározása nem feltétlenül informatív. Jó példa erre a T1D-ben az újabban felfedezett ZnT8 (szigetsejt specifikus cink transzporter) autoantigén elleni autoantitest kimutatása, mely különösen az inzulin, GAD65 és IA-2 elleni autoantitest negatív esetekben nyújthat jelentõs diagnosztikus segítséget. Minden esetben a klinikai képpel szoros összefüggésben kell értékelni az autoantitest meghatározás eredményét. Az újszülöttek, csecsemõk átmeneti autoimmun betegségeinek hátterében a placentán átjutó anyai autoantitestek állnak, ilyen estekben a gyermek és az anya szérummintáit egyaránt vizsgálni kell. Az autoantitestek laboratóriumi vizsgálata mellett az immun-szerológiai módszerek között ajánlott a szérumfehérje kép általános vizsgálata (ELFO), valamint az immunglobulinok, az akutfázis-fehérjék, a komplement-fehérjék és az immunkomplexek meghatározása is. A celluláris immunitás vizsgálatának alappillére a lymphocyták sejtfelszíni immun-fenotípusának meghatározása. További lehetõséget jelent az aktivált lymphocyták és monocyták által termelt szolubilis faktorok és citokinek kimutatása. Az autoimmun endocrinopathiak az úgynevezett szerv-specifikus autoimmun betegségek csoportjába tartoznak. A cél-antigén szerint megkülönböztetünk az endokrin szervek szöveti antigénjei/epitópjai, a hor21


Autoimmunitás: alapmechanizmusok és azok szerepe endokrin betegségekben Irodalomjegyzék

mon-receptorok illetve a keringõ hormonok ellen képzõdött autoantitestek kiváltotta kórképeket.

1. Anderson M.S.: Update in endocrine autoimmunity. J. Clin. Endocrinol. Metab.,. 93, 3663-3670, 2008 2. Ballotti S., Chiarelli F., de Martino M.: Autoimmunity: basic mechanisms and implications in endocrine diseases. Part I. Horm. Res., 66, 132-141, 2006 3. Ballotti S., Chiarelli F., de Martino M.: Autoimmunity: basic mechanisms and implications in endocrine diseases. Part II. Horm. Res., 66, 142-152, 2006 4. Barker J.M.: Clinical review: Type I diabetesassociated autoimmunity: natural history, genetic associations and screening. J. Clin. Endocrinol. Metab.,. 91, 1210-1217, 2006 5. Ch’ng C.L., Jones M.K., Kingham J.G.: Celiac disease and autoimmune thyroid disease. CM&R, 3, 184-192, 2007 6. El Fassi D., Nielsen C.H., Hasselbalch H.C. et al.: The rationale for B lymphocyte depletion in Graves’ disease: monoclonal anti-CD20 antibody therapy as novel treatment option. Eur. J. Endocrinol., 154, 623632, 2006 7. Jacobson E.M., Tomer Y.: The CD40, CTLA-4, Thyreoglobulin, TSH receptor and PTPN22 gene quintet and its contribution to thyroid autoimmunity: back to the future. J. Autoimmun., 28, 85-98, 2007 8. Papewalis C., Jacobs B., Wuttke M. et al.: Cellular therapies in endocrine diseases. Exp. Clin. Endocrinol. Diabet., 116(S1), S33-39, 2008 9. Vandenbark A.A., Offner H.: Critical evaluation of regulatory T cells in autoimmunity: are the most potent regulatory specificities being ignored? Immunol., 125, 1-13, 2008 10. Wong S., Dayan C.M.: Regulatory T cells in autoimmune endocrine diseases. Trends Endocrinol. Metab., 19, 292-299, 2008

Az immunrendszert érintõ betegségek endokrin vonatkozásai E publikáció kereteit meghaladja, de fontos megjegyezni, hogy a nem szerv-specifikus, azaz a szisztémás autoimmun betegségekhez is gyakrabban társulhatnak autoimmun endokrin kórképek. Leggyakrabban az SLE kapcsán találkozhatunk társult endokrin betegséggel, melyek között legtöbbször a pajzsmirigy érintett. Gondolni kell annak a lehetõségére is, hogy a felfedezett endokrin megbetegedés esetleg egy szisztémás autoimmun betegség részjelensége. A primer immundeficienciákhoz gyakrabban társulnak autoimmun betegségek is, különösen szelektív IgA hiányban és variábilis immundeficienciában (CVID) gyakoribbak az autoimmun kórképek, többek között a thyreoiditis, a T1D és az Addison-kór. Az APECED és az IPEX polyendocrinopathiával társul. A HIV-fertõzéshez társuló endokrin kórképek lehetnek magának a vírusnak, a társuló opportunista fertõzéseknek és tumoroknak, illetve az alkalmazott gyógyszerek mellékhatásainak a következményei. A hypothalamus-hypophysis tengely, a mellékvesék, a pajzsmirigy, a gonádok, a szigetsejtek és a mellékpajzsmirigyek is érintettek lehetnek (1). Az autoimmun betegségek immunszuppresszív kezelése kapcsán gyakran találkozhatunk a krónikus szteroid adagolás ismert mellékhatásaival, mely iatrogén endokrin kórkép. Jelen publikáció könyvfejezetként megtalálható a következõben: Péter F (szerk.): Gyermekendokrinológia. Semmelweis Kiadó, Budapest. 2009. (nyomás alatt)

22


A vércsoport-szerológia elmúlt 10 éve

A vércsoport-szerológia elmúlt 10 éve Dr. Hoffer Izabella Budapest Összefoglalás: A vércsoport-szerológiát a klinikai transzfuziológia alapjának tekintve a nemzetközi irodalomban immunhematológiaként idézik. A vércsoport-szerológiai módszerek ugyan nem változtak az utóbbi idõben, de a különbözõ mikrotechnikák (folyékony, szilárd fázisú) a mikroplate-tõl a különbözõ gélkártyákig, széles körben elterjedtek. Az automatizálásra való törekvés minden technikában megjelenik, különbözõ mértékben valósul meg, a részleges, egy-egy, vagy a teljes munkafolyamat automatizálásával, egyre biztonságosabbá téve az egyes technikák használatát, hogy ezáltal is minél inkább eleget tegyen a vércsoport-szerológiában is megkövetelt minõségi elõírásoknak. A vércsoport antigének öröklõdésének gén-szintû tisztázása, molekuláris biológiai vizsgálati módszerek alkalmazása az antigének meghatározásában, a chip technika kidolgozásához vezetett. Az áramlási citometria is létjogosultságot nyert az immunhematológia területén. A monoklonális reagensek elõállítása kiváltotta a humán eredetû reagensek nagy részét, új lehetõséget teremtve a hagyományos antigén diagnosztikában. Újra és újra elõtérbe került a vércsoport rendszerek egységes terminológiájának megteremtése.

Summary: The clinical transfusiology is based on the blood group serology alias immunohaematology. The blood group serological methods have not been changed in the last decade but different microtechnologies spreaded in wide-ranging from the microplate to gelcards. The automatisation appears in each technique. All the steps in the testing process can be automatised, including the generation of reports. The blood group serological methods became more safe by the automatisation and fulfill the requirements of quality. The genetical inheritance of blood surface antigens was made clear and molecular biological methods led to the developing of bloodchip technology. The flow cytometric method is used in immunhematology. The monoclonal antibodies are produced in vitro – contrary to the human polyclonal reagents – and this innovation opened a new period in the classical antigen-diagnostics. In the last decade the ISBT terminology became well-known.

Kulcsszavak: immunhematológia, vércsoport antigének, antitestek, vércsoport-szerológiai technikák, monoklonális reagens, terminológia, elektronikus keresztpróba, kompatibilitás, újszülöttkori hemolitikus betegség (ÚHB).

Keywords: immunohaematology, blood group antigens, antibodies, blood group serological technics, monoclonal reagents, terminology, electronic crossmatching, compatibility, haemolytic diseases of newborn (HDN).

Bevezetés

forgalmát, vizsgálati számát, beteg típusokat, a problémás esetek számát, kell-e 24 órában szolgáltatást nyújtani, milyen a sürgõs esetek aránya. Míg az antigén vizsgálat során minden erre alkalmas technikában általában megbízhatunk, addig az ellenanyag vizsgálatban egy technikára sem lehet azt mondani, hogy százszázalékos eredményt ad. Ez nem csak az illetõ technikától függ, hanem az alkalmazott segédanyagoktól, alacsony-ionerõsségû oldattól, mosófolyadéktól, az alkalmazott szûrõ-, panelsejttõl, antihumán-globulintól és nem utolsó sorban a betegtõl, hiszen a vérminta, mint biológiai anyag, adott körülmények között különbözõ módon viselkedhet. Ha egy technika mellett dönt a felhasználó, akkor azt a használati utasítás szerint, a lehetõ legprecízebb módon kell alkalmazni, és az eredményt el kell fogadni. Amennyiben egy problémás esetet kell tisztázni, nem elég egy módszert alkalmazni, és esetleg célszerû további vizsgálatra a mintát erre alkalmas laboratóriumba küldeni. Szinte minden agglutináción alapuló módszernek a maga helyén, ma is van létjogosultsága. A lemezes technika az AB0 vércsoport meghatározásban, az egyedi, sürgõs esetekben, a gyors probléma tisztázásban – a világnak azon a részén, ahol ez alap módszer volt – megõrizte szerepét. A csöves technika a legtöbb szakmai útmutatóban (guide) az autoimmun hemolitikus anémiák kivizsgá-

Az elmúlt 10 év a vércsoport-szerológiában a minél biztonságosabb adatkezelésre, mintakezelésre, a minél kevesebb kézimunkát igénylõ technikák alkalmazására való törekvés jegyében telt. Az emberi tényezõkbõl adódó hibák kiküszöbölése érdekében az automatizált technikák lehetõ legszélesebb körben való alkalmazására az utóbbi idõben Magyarországon is megteremtõdött a lehetõség. Szerencsére szinte minden vércsoport-szerológiai vizsgálatot végzõ laboratórium részt vesz körkontrollban. A minél precízebb antigén vizsgálatok, a monoklonális reagensek, a molekuláris biológiai módszerek elérhetõsége, az egyre megbízhatóbb ellenanyag vizsgálatok, mind-mind a hemolitikus transzfúziós szövõdmények és az újszülöttkori hemolitikus betegség (ÚHB) megelõzését szolgálják.

Különbözõ technikák alkalmazása a vércsoport-szerológiában A gyártó és forgalmazó cégek garmadáját lehetne felsorolni, akik szereplõi a különbözõ technikákat kínáló piacnak. A felhasználónak számtalan kritériumot kell mérlegelnie ahhoz, hogy választani tudjon. Az anyagi lehetõségén túl, a munkaerõ ellátottságot, a laboratórium beteg

23


lásában az elsõ helyen áll, annál is inkább, mivel azokban az országokban, ahol nem rutin az enzimes közegû vizsgálatok alkalmazása, ebben a körben az alapvizsgálatok közé tartozik, hiszen köztudott, hogy a meleg típusú autoantitestek is gyakran, elõször enzimes közegben mutatkozhatnak. Egyébként, az enzimes közegû vizsgálatok csöves technikára kerültek kidolgozásra, összehasonlító vizsgálatok is bizonyítják, hogy a legtöbb enzimes antitestet a csöves technikával lehetett kimutatni, emellett költséghatékony is. A 90-es években megjelent a magyar piacon az automatizált változat, az indirektCoombs módszer mosási folyamatát ugyan nem küszöböli ki, de szemimikro-módszernek számít, a rázásból, leolvasásból adódó értékelési eltérések kiküszöbölõdnek. Ma már a teljesen automata változat is létezik. A leolvasás automatizálása sokkal nagyobb mértékben növelte a csöves technika érzékenységét, mint más mikrotechnikák automatizált leolvasási lehetõsége, mivel a kézzel történõ rázás, szemmel történõ értékelés erõsen személyfüggõ. Ez utóbbi a magyarázat arra, hogy a kézi csöves technika széles körben kiszorult a napi rutinból. A vírusszerológiában már régóta alkalmazott mikroplate technika volt az elsõ olyan mikro-módszer, amely nagy tömegû minta vizsgálatára is alkalmas volt, akár „U”, akár lépcsõs kiképzésû, 96 lyukú plate-et alkalmazott. Így nemcsak a betegek, hanem a donorok kivizsgálására is, fõként az automata változatok világszerte elterjedtek. Az AB0, Rh antigének vizsgálatára különösen közkedvelt technika az elmúlt évtizedben beszárított reagenssel forgalmazott változat, kifejezetten felhasználóbarát. Speciális típusa (solidscreen®) ellenanyag vizsgálatra is alkalmas. A kétfajta plate kombinációja egy automatán belül csíkokra (strip) szedhetõ plate-kkel, egy modern, minden, a betegeknél kötelezõ pretranszfúziós vizsgálatra alkalmas rendszerként, az elmúlt 10 évben került be a vércsoport-szerológiai eszköztárba. A mikroplate rendszer számos automatában, kifejezetten az ellenanyag vizsgálat céljából gélkártyarendszerrel kombinálva kerül forgalomba, beteg- és terhes-vérminták vizsgálatára. Az elmúlt évtizedben terjedtek el világszerte az ún. kártyás mikrotechnikák, üveggyöngy, transzparens gél töltéssel készülnek, reagens tartalommal vagy anélkül. A kártyák gyártótól függõen 6 vagy 8 vizsgálati kamrával (oszloppal) rendelkeznek. Szedimentációs, illetve szétválasztásos kromatográfiás technológiát alkalmaznak. A kártyákhoz szükséges eszköz/rendszer gyártóspecifikus. Míg az üveggyöngyös kártya folyékony közegûnek minõsül, mint az eddig ismertetett technikák, addig a gélkártyák szilárd fázisúak. Ez a rendszer költségessége ellenére a beteg, a terhes és különösen az újszülöttek kivizsgálására széles körben elterjedt. A kevés vérminta igény, a Coombs módszer mosás nélküli elvégezhetõsége, jól és könnyen értékelhetõ kevert mezõs reakciók, a transzfúziós szövõdmények kivizsgálására is jól használhatóvá tette ezt a rendszert. Különbözõ mértékben automatizált készülékek vannak forgalomban, mikroplate-tel kombinált változatuk nagyon felhasználóbarát (1). 24


Áramlási citometria: a 90-es évek végén került az immunhematológia látókörébe. Elõször a magzati vörösvérsejteknek az anyai keringésben történõ mennyiségi kimutatására próbálták ki, amely az anti-D IgG profilaxis során útmutatóul szolgál, a korrekt adagolást illetõen (11). Ugyanezen a területen, az anyai anti-D kvantitatív meghatározás volt az a módszer, amelynek az eredményébõl a magzati károsodás várható mértékére lehet következtetni (8) (1. táblázat). Az elmúlt években egyre tökélesedett a módszer, ennek ellenére még ma is csak egyes centrumok tudják végezni Magyarországon, mivel csak korlátozottan hozzáférhetõ. Különbözõ antigén vizsgálatokra is alkalmazható a módszer (10), különösen a thrombocyta (HPA) saját antigénjeinek meghatározására terjedt el, erre nálunk is alkalmazzák. Anti-D szint ÚHB < 4 IU

ÚHB nem valószínû

4–15 IU

ÚHB kockázata fennáll

> 15 IU

ÚHB magas rizikójú (hydrops foetus universalis)

1. táblázat: Az anti-D antitest kvantitatív értéke és az ÚHB összefüggése

A molekuláris biológiai (DNS) vizsgálatok - PCR (allélspecifikus polimeráz láncreakció) vagy RFLP (PCRrestriction fragment length polymorphism) assay: 1995ben jelent meg a Human Blood Group címû könyv elsõ kiadása Geoff Daniels tollából, amelyben egybe gyûjtve olvasható a vércsoport antigének, rendszerek genetikája, ezeknek a vörösvérsejt mûködésében betöltött funkciója, szerepe. A legutóbbi, második kiadás 2007-ben jelent meg, amely már az egyes vércsoport rendszerek teljes genetikai tisztázását tárja elénk (6). Míg 1997-ben még azt sem tudtuk pontosan, hogy az Rh rendszert 2 vagy 3 gén határozza-e meg (15), addig ebben a században egyre több antigén rendszert sikerült genetikailag, funkcionálisan tisztázni, például az 1955-ben felfedezett Diego rendszerrõl 2002-ben közölték, hogy PCR-SSP (sequence-specific primer) módszerrel sikerült feltárni genetikai hátterét, génszekvenciáját (17). A PCR vizsgálatok bevezetése a vércsoport-szerológiai gyakorlatba elõször is lehetõvé tette anyai vérmintából a magzati DNS szeparálását, és így magzati invazív beavatkozás nélkül meghatározhatóvá vált a magzati, illetve újszülöttkori hemolitikus betegség (ÚHB) cél antigénjének meghatározása (3). 2003-ban egy workshop keretében mutatták be a PCR automatizált változatát, amely holland, angol, spanyol együttmûködés keretében az ún. bloodchip megalkotásához vezetett (4). Ez a rendszer már tömeges vörösvérsejt antigén vizsgálatot tesz lehetõvé, és a hagyományos szerológiai vizsgálati eredmények ismeretében, egy biztonságosabb, a vérkészítmény címkéjén is feltüntethetõ, donor vér antigén tulajdonság meghatározásra alkalmas. A PCR vizsgálatok utat nyitottak az RhD gyenge variánsokon kívül más Rh rendszerbeli és egyéb vércsoport rendszereken belüli gyenge variánsok kimutatására, megtalálására. A Bloodchip technológia kifejlesztésének koncepciója az oligonukleotid microarray (DNS-chip) alapú hibridizációs analízis,


amelynek révén közvetlenül a vércsoport molekuláris szintjéhez lehet eljutni. Elõször is létre kellett hozni az SNPs (single-nucleotide polymorphism(s)) listát, elõször 94 ilyen polimorfizmust sikerült izolálni, majd ez 106-ra bõvült (14). A chip technológia az immunhematológia/vércsoport-szerológia területén nemcsak a tömeges donor, de a beteg diagnosztikában is nagy lehetõségeket kínál. Az immunhematológiai kompatibilitás ma már nemcsak a klasszikus vércsoport-szerológiai módszerekkel ellenõrizhetõ, hanem DNS szintû vizsgálatokkal is (5).

A monoklonális reagensek helye a vércsoportszerológiában A monoklonális reagensek megjelenésével, nagyüzemi módszerekkel, vörösvérsejt antigén meghatározásra alkalmas antitestek kerültek a piacra. Elõnyük, hogy nem szükséges donorokat immunizálni, nagy tömegben állíthatók elõ, ezért olcsóbban elérhetõek, mint az emberi eredetû, poliklonális reagensek. Mivel az egyes klónok leginkább epitóp specifikusak, ezért gyakran keverékeket alkalmaznak. Sok olyan meghatározási problémát kiküszöbölnek a klasszikus vércsoport meghatározás során, mint a poliagglutinábilitás, szerzett B tulajdonság kimutatása, amely a poliklonális reagenseknek sajátja volt. Ugyanakkor ez hátrányuk is, mert egyrészt ezek a jelenségek rejtve maradnak, holott segíthetnének a klinikai diagnózis felállításában, másrészt pedig az egyes antigén variánsok, esetleg negatív reakciót mutatva, rejtve maradhatnak (1).

Terminológiai változások Az elmúlt évtizedben nagy változásnak vagyunk tanúi a vércsoport-rendszerek terminológájában tett változtatási törekvésekben (9). Az 1900-as évektõl felfedezett vércsoport rendszereket részben az ABC betûi, részben a felfedezés körülményeire utaló vagy családi nevek – ahol az új antigént leírták – rövidítései jelölték. 1980ban a Nemzetközi Transzfúziós Társaság (International Society of Blood Transfusion/ISBT) létrehozott egy Working Party-t, amely késõbb bizottsággá alakult, azzal a céllal, hogy létrehozza a numerikus nevezéktant minden olyan emberi vörösvérsejt felszíni antigénre vonatkoztatva, amelyet szerológiailag specifikus antitesttel azonosítottak. Ebben minden antigén, az öröklõdési jellegzetességeket is figyelembe véve, kap egy ISBT számot. Minden antigén kap a 4 karakterbõl egyet (az alacsony incidenciájú kb. 700 és a magas kb. 900) Alapfogalmakat tisztáztak, így például az antigén rendszert, amely egy gén locust vagy nagyon közeli homológ gén által meghatározott egy vagy több antigént jelent. Egy csoportot (collection) alkotnak azok az antigének, amelyek szerológiailag, biokémiailag vagy genetikailag hasonló módon viselkednek, de nem felelnek meg minden olyan kritériumnak, amely az egy rendszerbe való sorolásukat indokolhatná. 700 antigént soroltak a kis elõfordulásúak (<1%) közé szériaként titulálva, mivel sem a rendszer, sem a csoport besorolási


kritériumoknak nem feleltek meg. Ugyanez a helyzet a 901 szériát alkotó nagy gyakoriságú (>90%) antigénnel is. Minden egyes antigént, amely egy antigén rendszerhez tartozik, 6 jegyû számmal definiáltak, ebbõl az elsõ 3 reprezentálja magát a rendszert (pl. 006 – Kell) a második 3 az antigén specificitást (pl. 006003 – Kpa). Az antigén rendszer alternatív jelzéseként azonban fennmaradt a már ismert elnevezés a rendszer szám jelzésével kombinálva (pl. KEL003 vagy még gyakoribb KEL3). A fenotípus jelzésénél a rendszert betûvel, az egyes antigéneket számokkal, azok hiányát mínuszjellel szimbolizálják. (pl. KEL:-1,2,-3,4). A gének jelölése ugyanezt a szimbólum rendszert követi, csak a rendszer betûjelét csillag követi, azután az antigén számjele (pl. KEL*3). A genotípus szimbóluma pl. KEL*2,3/2,4. Ez a numerikus terminológia különösen praktikus a számítógépes nyilvántartás és a genetikai klasszifikáció szempontjából, azonban a napi gyakorlatban a régi nomenklatúra tovább él, mert megszoktuk, egyszerûbbnek tûnik. A vércsoportrendszerek összefoglalása megtalálható az ISBT honlapján (Table of blood group systems: http:// ibgrl.blood.co.uk/isbt pages/isbt terminology pages/ table of blood group systems.htm). Megalkották az új antigén felfedezésének kritériumait is. Talán az egyik legfontosabb szemléletbeli változás az 1946-ban Du-nak nevezett gyenge D variáns transzfúziós megítélése, és Dweak-ké történõ átnevezése, miután a DNS alapú vizsgálatok világossá tették, hogy nem egy egységes variánsról van szó, hanem legalább két típusról. Ha öröklötten vagy gén-interakció következtében gyengébb a D antigén kifejezõdése a vörösvérsejteken, transzfúzió és immunizáció szempontjából tekinthetõ RhD pozitívnak, mert RhD pozitív transzfúzió, illetve magzat sem vált ki anti-D antitest termelõdést. Az ún. epitóp hiányos, azaz manapság inkább parciális Dnek nevezett gyenge D esetében, az egyes epitópok részleges, teljes vagy kombinált hiányáról van szó. Elõször 9, majd legalább 30 epitópról beszéltek. Ha egy ilyen D tulajdonsággal rendelkezõ egyént egy teljes epitóp készlettel rendelkezõ vörösvérsejt stimulus éri, akkor a hiányzó epitóp ellen képes anti-D-t termelni. Ez az ismeret megváltoztatta a terhesek és szülõnõk anti-D IgG profilaxisának stratégiáját is, attól függõen, hogy az ún. gyenge D tulajdonság epitóp hiányra vezethetõ-e vissza vagy sem. Amennyiben igen, az RhD negatívoknál szokásos eljárás az irányadó. Ma már epitóp-specifikus, monoklonális kitekkel, illetve PCR módszerrel a gyenge D variáns típusa elég nagy biztonsággal tisztázható (13).

Immunhematológia / vércsoportszerológia a 21. században A mindennapi gyakorlatot az egyre nagyobb biztonságra való törekvés jellemzi az immunhematológia területén is. A vérminták vonalkódos jelölése, vonalkód leolvasók, a számítógépes beteg nyilvántartás terjedése a laboratóriumokban, az automatizálás egyre magasabb fokú bevezetése mellett, újabb és újabb biztonsági in25


tézkedések válnak szükségessé. Az immunizáció okozta hemolitikus transzfúziós szövõdmények elkerülése alapvetõ követelmény. Ez hívta életre az elektronikus keresztpróba módszerét sok országban, a betegágy mellett (2). Ez tulajdonképpen az AB0/Rh tévesztés elkerülésén túl azt is kontroll alatt tartja, hogy mikor történt ellenanyag-szûrés, a kiadott vörösvérsejt-készítmény a kompatibilitás érvényességi idõtartamába belefér-e. Ehhez azonban minden, a betegre vonatkozó adatot, a vérminták vételének idõpontját, a vércsoport-szerológiai vizsgálati eredményeket nyomon követhetõen dokumentálni kell. Magyarországon ez a módszer a jelenlegi kórházi informatikai adottságok között csak nagyon kevés helyen valósítható meg. Az antitest-szûrés és laboratóriumi keresztpróba optimális idõpontjának megválasztása nagy körültekintést igényel, mivel az antitest megjelenésének várható idõpontja is nagy változatosságot mutat az egyes betegek esetében. Ezért, ha a beteg 2 héten belül kapott transzfúziót – több országban 24 órán belüli vérmintából – 24 óráig érvényes az ellenanyag-szûrés, illetve a laboratóriumi keresztpróba. A 2008-ban megjelent Transzfúziós Szabályzat (16) is követi ezt az elvet, azonban a hazai gyakorlatra és lehetõségekre alapozva a 24 órát nem követeli meg, de felhívja a figyelmet a lehetõ legrövidebb idõintervallum betartására. Azt az elképzelést, hogy minden transzfúzió után 5-10 nap elteltével ellenanyag-szûrést végezzenek csak azért, hogy az esetleges antitest megjelenést diagnosztizálják, egy országban sem tudták megvalósítani – magas költség vonzata miatt (7). A rendszeresen transzfúzióra szoruló betegek esetében, sok helyen, legalább Rh fenotípus és a Kell antigén negativitás figyelembe vételével transzfundálnak, sõt a klinikailag fontosnak tartott vércsoport rendszerekben is a fenotípus-azonos vörösvérsejt-készítmény kiválasztására törekednek a lehetõ legszélesebb körben, megelõzve ezzel az immunizáció okozta alloantitestek megjelenését. Több országban van olyan gyakorlat, hogy a leánygyermekek és szülõképes korú nõk (46 vagy 50 éves korig), ha „C” homozigóták, nem kaphatnak „c” pozitív vért, ha Kell antigénre nézve negatívak, akkor csak azt kapnak, az Rh negatív, cde fenotípusúak pedig fenotípus azonosat. Hazánkban is ezt a szabályt követjük (12). Ahhoz, hogy a beteg antigén státuszát tisztázni tudjuk vagy még a transzfúziók elõtt, vagy hosszabb transzfúzió utáni idõszak esetén (a normál vörösvérsejt túlélés 120 nap, így az idegen, donor típusú vörösvérsejtek akár 3 hónapig is kimutathatók a beteg keringésében), erre is kínál megoldást a chip technológia, hiszen PCR módszerrel elkülöníthetõ a beteg és donor típusú DNS. Az igazi kompatibilitást az jelentené, ha minden olyan beteg, aki rendszeresen szorul transzfúzióra, a lehetõ legtöbb vércsoport antigénre nézve a sajátjával azonosat kapna. Ennek azonban annak ellenére, hogy a PCR technikákkal könnyen és egyszerûen megvalósítható lesz, az aktuálisan rendelkezésre álló, megfelelõ antigén tulajdonságú donorvér mennyisége szab határt. A donor állomány jelentõs növelésére nincs nagy esély. Mivel közismert, hogy még a rendszeresen transzfun26


dált betegeknek sem mindegyike immunizálódik, így a vércsoport-specifikus ellenanyagok megjelenésének követésétõl a meglévõ, hagyományos módszerekkel, még jó ideig nem tekinthetünk el. Arra kell törekedni, hogy lehetõleg minél kisebb hiba lehetõséggel, minél nagyobb technológiai fegyelemmel végezzük azokat, természetesen a tudomány legmodernebb eszközeinek alkalmazásával. Irodalomjegyzék

1. Armstrong B., Hardwick J., Raman L. et al.: Introduction to Blood Transfusion Technology. Vox Sang., Vol.3. No.2. ISBT Science Series; 06, 2008 2. Arslan Ö.: Electronic Crossmatching. Transf. Med. Rev., Vol.20. No.1. 75-79, 01, 2006 3. Avent N.D.: Antenatal Genotyping of the Blood Groups of the Fetus. Vox Sang., 74 (Suppl.2.), 365374, 1998 4. Avent N.D., Martinez A., Flegel W.A. et al.: The Bloodgen project: toward mass-scale comprehensive genotyping of blood donor sin the Europien Union and beyond Transfusion. Vol.47. supplement, 07, 2007 5. Blood- Matching Genetic. 03, 2008. Science, Vol. 319. by AAAS from www.sciencemag.org on March 14, 2008 6. Daniel G.: Human Blood Groups. 2nd ed. OxfordBlackwell, 2002 7. Garratty G.: Screening for RBC antibodies - what should we expect from antibody detection RBCs. Immunhemat., Vol.18. No.3., 71-77, 2002 8. Hildén J.O., Backteman K., Nilsson J.J., et al.: FlowCytometric Quantitation of Anti-D Antibodies. Vox Sang., 2, 172-176, 1997 9. International Society for Blood transfusion. Commitee on Terminology for Red Cell Surface Antigens; Terminology Home Page 2009 10. Leger R., Arndt P., O’Brien A. et al.: Clinical significance of an anti-Dib assessed by flow cytometry. Immunhemat., Vol.13. No.3, 1997 11. Nelson M., Popp H., Horky K., et al.: Development of a flow cytometric test for the detection of D-positive fetal cell after fetomaternal hemorrhage and a survey of the prevalence in D-negative women. Immunhemat., Vol.10. No.2, 1994 12. Poole J., Daniels G.: Blood Group antibodies and their Significance in Transfusion Medicine. Transf. Med. Rev., Vol.21. No.1. 01, 58-71, 2007 13. Reid M.E.: The Rh Antigen D: A Review for Clinicians. Blood Bulletin, Vol.10, No.1, 04, 2008 14. Reid M.E., Rois M.,Yazdanbakhsh K.: Application of Molecular Biology Techniques to Transfusion Medicine. Seminars in Hematology Vol.37. No.2, 166-177, 04, 2000 15. Sonneborn H.H., Voak D.: A review of 50 years of Rh blood group system, Biotest Bulletin, Vol.5, No.4, 1997 16. Transzfúziós Szabályzat, az OVSZ 4. módszertani levele, 2. kiadás. Sorozatszerkesztõ: Hoffer I., 2008 17. Wu Guo-G., Su Yu-Q., Yu Q., et al.: Development of a DNA-based genotyping method for the Diego blood group system; Transfusion, 42, 1553-1556, 2002


Biomarkerek – a procalcitonin szerepe a diagnosztikában

Biomarkerek – a procalcitonin szerepe a diagnosztikában Prof. Molnár Zsolt Pécsi Tudományegyetem, Aneszteziológiai és Intenzív Terápiás Intézet, Pécs Összefoglalás: A szisztémás gyulladásos válasz megkülönböztetése a szepszistõl, a laboratóriumi diagnosztika fejlõdése ellenére a mai napig komoly kihívás az intenzíves orvosok számára. Az ideális markert még keressük, de úgy tûnik, hogy mind szenzitivitását, mind specificitását tekintve a szérum procalcitonin (PCT) szint tûnik a legmegbízhatóbb szepszis markernek, mely nemcsak terápiás döntéseinket befolyásolhatja érdemben, de a PCT-szint napi mérése még akár költséghatékony is lehet. Diagnosztikus haszna mellett prediktív értékkel is bír. A jelen közlemény célja az elmúlt években megjelent szepszis markerkutatással kapcsolatos fontosabb vizsgálatok, elemzések eredményeinek összegzése.

Summary: Despite the development of biochemical diagnostics, differentiating the systemic inflammatory response syndrome from sepsis remains a major challenge for the intensive care phisician. The ideal marker is yet to be found, but as far as sensitivity and specificity is concerned, it seems that there is no competitor of the serum procalcitonin (PCT) test as a reliable sepsis marker. Beside its importance in therapeutic decision making, daily measurements might also be cost effective. In addition to its diagnostic performance it has some predictive value, as well. The aim of the recent article is to summarise the results of recently published studies and analyses in sepsis marker research.

Kulcsszavak: Szepszis, PCT, CRP, citokinek, kinetika

Key words: Sepsis, PCT, CRP, cytokine, kinetics

Bevezetés

késlekedése vagy elmaradása pedig nagy valószínûséggel halálhoz vezet (12). Azt az állapotot, amikor valamely szervre lokalizált gyulladás a szervezet immunrendszerének egészét aktivizálja, szisztémás gyulladásos válasznak („Systemic Inflammatory Response Syndrome”, SIRS) nevezzük (1). Bár a SIRS pontos patomechanizmusa még tisztázatlan, feltehetõen valamely inzultus hatására (mint pl.: infekció, trauma, steril gyulladás, vagy kiterjedt sebészeti beavatkozás) egy öngerjesztõ reakció következik be, melyben részt vesznek az immunrendszer legkülönfélébb elemei, és a betegség, látszólag függetlenül attól, hogy melyik szerv elsõdleges sérülésébõl indult a folyamat, az egész szervezet betegségévé válik (1. ábra). Amennyiben nem sikerül idejekorán megállítani, jobb esetben megfordítani ezt a kaszkádszerû reakciót, úgy egyre több szövet, szerv esik a folyamat áldozatául. Ez volt az oka annak, hogy az elmúlt évtizedek intenzív terápiás kutatásainak középpontjába került a szeptikus folyamat mediátorainak, markereinek megismerése, és a gyulladásos válasz modulációja.

A súlyos szepszis és szeptikus sokk, bár elsõsorban az intenzív terápia tárgykörébe tartozik, mára népegészségügyi problémává vált. A betegség incidenciája nõ, világszerte több millió esetet regisztrálnak, és négy betegbõl egyet általában el is veszítünk közülük (4,12). A szepszis diagnosztika nem egyszerû, mert nyilvánvaló lokális infekcióra utaló jelek nélkül kell felismernünk a szisztémás gyulladást, mely döntõen befolyásolja további terápiás lépéseinket. Az adekvát kezelés INZULTUS Endotoxin, Trauma, Steril gyulladás, Operáció stb. Humorális aktiválódás Interferon, Komplement Makofág aktiválódás TNF, IL-1,6,10, PAF

Fiziologiás reakció CRP, Láz, Metabolikus változások

Neutrofil aktiválódás FR, PAF, Kemotaxis

Endothelium NO, E-selectin, Permeabilitás növekedés

S. I. R. S.

MSOF

1. ábra: A gyulladásos reakció. TNF: tumor nekrózis fakor, PAF: thrombocyta aktiváló faktor, CRP: C-reaktiv protein, NO: nitrogén monoxid, SIRS: systemic inflammatory response syndrome

A szepszis definíciója A szepszis nem önálló betegség (mint pl. combnyaktörés, vagy gyomor-perforáció), ezért nehezen definiálható. Míg a lokális gyulladás jelei (rubor, dolor, calor, tumor, functio laesa) könnyen felismerhetõek, a szisztémás gyulladás diagnózisának felállítása sokkal nehezebb. Roger Bone és munkatársaiban vetõdött fel elõször az igény egy objektív szepszis kritérium létrehozására, egy multicentrikus vizsgálat tervezése kapcsán, melyben a metilprednizolon adjuváns kezelés hatását vizsgálták a súlyos szepszis és szeptikus sokk túlélésére (4). A szepszis-szindróma ún. „Bone-féle” definíciója szerint: a szepszis = az infekcióra adott SIRS. A di27


agnózis felállítása kettõs feltételt támaszt: egyrészt igazolni kell az infekció meglétét; valamint a szepszisre jellemzõ klinikai jeleket, melyek az egyes betegekben rendkívüli változatosságot és eltérõ hevességet mutathatnak. A szepszis-szindróma klinikai jeleirõl (láz, tachycardia, leukocytosis adott értékei) azonban fontos tudnunk, hogy nem valamilyen élettani vizsgálat, vagy prospektíven hitelesített („validált”) tanulmány eredményeibõl származnak, hanem egy maréknyi kutató konszenzusán alapulnak, melyet egy Las Vegas-i hotelszobában állítottak össze (19). Nem meglepõ tehát, hogy az így megfogalmazott szepszis-szindróma kritériumokat számos kritika érte, ami az 1991-es konszenzus konferenciához vezetett, ahol egy, a Las Vegas-inál jóval nagyobb plénum megegyezett a mind a mai napig érvényben lévõ definíciókban, mint: infekció, bakteriémia, szisztémás gyulladásos válasz, szepszis, súlyos szepszis, szeptikus sokk, többszervi elégtelenség (1). Az így pontosított nomenklatúrával számos vizsgálat indult világszerte, melynek jelentõs részét képezte a szepszis-marker kutatás is.

Markerek és mediátorok szepszisben Az alapvetõ kérdés tehát az, hogy van-e olyan jel (marker), melyet a szervezet akkor, és csak akkor ad, ha súlyos bakteriális infekció érte? Továbbá, milyen követelményeket támasszunk az ideális szepszis markerrel szemben? Az utóbbi kérdés megválaszolása a könnyebb: mindenekelõtt, csak bakteriális infekció okozta kritikus állapotban emelkedjen meg a szintje (tehát magas legyen a szenzitivitása, illetve specificitása), szövetsérülés, vagy egyéb sokk állapot ne befolyásolja. Néhány órával a szisztémás infekció felléptét követõen emelkedjen meg kiszámítható és reprodukálható mértékben a szintje, és kinetikája kövesse az állapot alakulását: rosszabbodás esetén növekedjék, javulás esetén (pl. adekvát antibiotikus terápia), csökkenjen. Végezetül, mérése egyszerû és olcsó legyen. A legtöbbet vizsgált markerek, és a szepszis kutatás történelmi szempontjából is nagy jelentõséggel bírnak a citokinek. Fontos szerepüket a szisztémás gyulladásos reakcióban három alapvetõ észlelés támasztotta alá: a) a klinikai állapot és a testfolyadékokban mért citokin-koncentráció között szoros kapcsolatot sikerült kimutatni (5); b) állatkísérletes modellben a beadott különbözõ exogén citokinek jól definiált kórképek tüneteit hozták létre (30); c) egyes citokinek specifikus eliminációja a betegség tüneteinek csökkenését/megszûnését eredményezte (29). Számos eredmény látott napvilágot az egyszerûen mérhetõ, a mindennapi rutinban is használható markerekrõl, a C-reaktív proteinrõl (CRP) és a procalcitoninról (PCT). Az elmúlt években újabb markereket is megismerhettünk, ilyen az endotoxaemiát kimutatni hivatott biológiai teszt, az ún. „endotoxin activity assay” (EAA), valamint a lipoprotein kötõ fehérje („lipoprotein binding protein”, LBP), és a natriuretikus peptid. 28


Citokinek A leggyakrabban vizsgált citokinek közül a TNFα, az IL-6, az IL-1 és újabban az IL-8 szérumszintjének monitorozása terjedt el. Mint szepszis markerek azonban távol állnak az ideálistól. Szintjük nemcsak bakteriális infekcióban, hanem egyéb szövetsérülések esetén is megemelkedik. Hátrányuk továbbá, hogy fél-életidejük rövid, néhány perctõl 2-3 óráig terjed, tehát az inzultus hatására bekövetkezett szintnövekedés túl gyorsan lecseng, a valós klinikai állapot monitorozása nem lehetséges. A méréshez szükséges felszerelés drága (37). A legreménytelibbnek tûnõ citokin, az IL-6. Az elmúlt évek vizsgálatai szerint azonban az IL-6 bár jó indikátora a gyulladásos válasz súlyosságának, de nem a szepszisnek (7,12,28). Számos vizsgálat igazolta hasznát újszülöttkori szepszisben, de úgy tûnik, hogy ebben az esetben is a PCT a megbízhatóbb diagnosztikai mutató (7).

C-reaktív protein A CRP az akut fázis proteinek csoportjába tartozó fehérje. Termelõdésének legfõbb ingere az akut fázis reakció során az aktivált sejtekbõl felszabaduló IL-6, IL-8 illetve TNF-α. A CRP-nek diagnosztikai jelentõsége van a bakteriális és vírusfertõzések elkülönítésében, a gyulladásos folyamatok nyomon követésében, illetve a kezelés eredményességének lemérésében. Az általánosan elfogadott referenciatartomány felnõttekben <10mg/l. Mivel nagyon érzékeny mutatója a gyulladásnak, az intenzív terápiás körülmények között használata újabban kérdésessé vált, mert a fertõzés és az egyéb eredetû gyulladás nehezen különíthetõ el vele, valamint szintjének szignifikáns emelkedése mutatkozik mûtétek után, traumát követõen, tumoros betegeknél éppúgy, mint autoimmun, vagy különféle fertõzéses megbetegedésekben szenvedõknél (24). Egy általunk végzett vizsgálatban azt találtuk, hogy a tumor miatti nyelõcsõmûtétek után csúcsértékét 48 óra múlva éri el, és nincs különbség a túlélõk, valamint a nem-túlélõk eredményei között (35). A CRP és PCT, mint szepszis markerek összehasonlításáról a következõkben lesz szó.

Procalcitonin A PCT-t a bakteriális szepszis legérzékenyebb markerének tartjuk immár 15 éve (2). Koncentrációjának normál tartománya <0,5 ng/ml, és az általánosan alkalmazott módszerekkel nem detektálható a vérben. A szervezetet ért, fõként fertõzéses stimulusra a szérum PCT szint ugrásszerûen megnõ. A válasz 3-4 órán belül jelentkezik és a maximális intenzitását a 24. órára éri el. A PCT stabil vegyület, féléletideje 25-30 óra, ami az egyik elõnye a gyakran nagyon instabil citokinekkel szemben. A kezdeti bíztató eredmények szerint a PCT szint jelentõs emelkedése a bakteriális szepszis specifikus markere lehet (22). További vizsgálatok azonban megkérdõjelezték ezt a feltevést, mert úgy tûnik, hogy bonyolult molekuláris és celluláris folyamatok révén nemcsak az endotoxinok, hanem a szöveti sérülés is okozhatja a PCT szint emelkedését (10,25,34).


A legújabb alapkutatási eredmények részben megmagyarázzák a fenti észleléseket. Valószínû, hogy a kitapadt monocyták termelik a PCT-t, míg a keringõ leukocyták a folyamatban nem vesznek részt. Tehát, a monocyták adhézióját befolyásoló helyi, vagy szisztémás gyulladás elengedhetetlenül fontos feltétele a PCT termelõdésnek (18,38). Ez lehet a magyarázata annak, hogy traumában és szepszisben miért látható, illetve, hogy vírus infekcióban és autoimmun betegségekben miért nem észlelhetõ a PCT szint emelkedése. A szöveti trauma eredetû sérülés, csakúgy mint a bakteriális infekció, elsõsorban monocyta aktiválódással jár, míg a vírus infekció, szervkilökõdés, és egyéb autoimmun állapotok lymphocyta és T-sejtes választ ingerelnek. Az elsõ, 2004-ben megjelent meta-analízis adatai szerint a PCT vs. CRP szenzitivitása az infekció diagnózisában 88% (95%-os konfidencia intervallum: 80-93%) vs. 75% (62-84%), p<0,05, specificitásuk 81% (67-90%) vs. 67% (56-67%), p<0,05 (33). Szemben a CRP-vel, a PCT nem csak az infekciónak megbízhatóbb mutatója, de szorosabb korrelációt mutat a szervdiszfunkció súlyosságával, és követi annak alakulását is (6). Ez egyben azt is jelenti, hogy bár az infekció a PCT termelõdés megindulásának fõ ingere, a szervezet gyulladásos válasza, mely szervdiszfunkcióhoz is vezet, fontos szerepet játszik a további PCT szintézisben. További elõnye a PCT-nek a CRP-vel szemben, hogy szintje 24 órával az adott inzultus után eléri csúcspontját, és szignifikáns különbség észlelhetõ túlélõk, és nem-túlélõk között (2. ábra) (35). Az általunk tapasztaltakat erõsítette meg egy dán kutatócsoport, akik egy heterogén, intenzív kezelésben részesülõ betegpopulációban prospektíven vizsgálták a PCT szint és a túlélés közötti különbséget (13). A tanulmányba 472 beteget vontak be. Két csoportra osztották õket aszerint, hogy a szérum PCT szint ≥1ng/ml, vagy növekvõ tendenciát („veszélyeztetett” csoport), vagy <1ng/ml és csökkenõ tendenciát („nem-veszélyeztetett” csoport) mutatott. Azt találták, hogy a 90 napos túlélés szignifikánsan jobb volt a „nemveszélyeztetett” csoportban (70% vs. 42%), valamint a


betegek túlélési esélyei szignifikánsan javultak, illetve romlottak, ha a csökkenõ vagy a növekvõ PCT tendencia 1, 2, vagy 3 napig is fennállt. A betegek halálozási esélyei 1 napi emelkedésnél 1,8-szoros (95% CI: 1,4-2,4), 2 napi emelkedésnél 2,2-szeres (95% CI: 1,6-3,0), és 3 nap után 2,8-szoros (95% CI: 2,0-3,8) emelkedést mutattak. Már ezek az eredmények is felvetik a naponta mért PCT szint jelentõségét kritikus állapotú betegekben. Fontos haszna lehet a PCT szint monitorozásának az antibiotikus terápia indikációjának eldöntésében. Tudjuk, hogy a láz mindössze 50%-os biztonsággal jelzi az infekció meglétét, amit hétköznapi nyelvre úgy fordíthatunk le, hogy nem jobb, mintha pénzfeldobással döntenénk el az infekció diagnózisát. Egy nemrégiben megjelent prospektív randomizált tanulmányban a légúti infekció gyanús betegekben az antibiotikus terápiát az egyik csoportban kóros PCT szint alapján (≥0.5ng/ ml), míg a kontroll csoportban hagyományos jelek alapján kezdeményezték. Hasonló klinikai kimenetel mellett, a PCT csoportban felére csökkent az antibiotikum használat (8). Fontos azonban megjegyezni, hogy ezek az adatok csak a vizsgált populációra alkalmazhatók. Posztoperatív állapotokban a PCT szint megemelkedik, medián: 2,12 ng/ml (interkvartilis tartomány 0,63-4,24 ng/ml) értékekre, ami a PCT infekció nélküli, „normális” kinetikájának tekinthetõ kiterjedt hasi sebészeti beavatkozások után (35). Tavaly jelent meg egy 79 szeptikus betegen végzett prospektív randomizált vizsgálat a PCT szint monitorozás és az antibiotikus terápia kapcsolatáról (27). A PCT csoportban a betegeknél leállították az antibiotikus kezelést, ha a PCT szint 90%-kal kezdeti érték alá csökkent, de nem korábban, mint 3 nappal az antibiotikum elindítása után, és akkor, ha a kezdeti PCT szint <1ng/ml; és nem korábban, mint az 5. nap, ha a kezdeti PCT szint ≥1ng/ml volt, és a klinikusok is egyet értettek a döntéssel. A kontroll csoportban, a hagyományos, empirikus jelek alapján döntöttek a klinikusok. A protokoll szerint kezelt betegek (n=68) analízise során a PCT csoport betegei szignifikánsan rövidebb ideig kaptak antibiotikumot az elsõ infekciójuk

2. ábra: A szérum CRP és PCT szint posztoperatív kinetikája túlélõkben (Survivors, n= 130) és nem túlélõkben (Non-survivors, n=23) Az adatokat, mint minimum, maximum, medián és interkvartilis tartomány tüntettük fel. Statisztikai analízis túlélõk és nem-túlélõk eredményei között: Mann-Whitney teszt, * p<0,05

29


alkalmával: medián=6 (min: 4 – max:16) vs. 10 (3-33), p=0,003. Az antibiotikum expozíciót illetõen a PCT csoport betegei szignifikánsan kevesebb napig kaptak antibiotikumot: 504 vs. 655, p=0,0002. Végezetül, az antibiotikum nélküli életben töltött napok száma is szignifikánsan több volt a PCT csoportban: 17,4±7,6 vs. 13,3±7,6, p=0,04. A közlemény felveti tehát, hogy a napi PCT szint kinetikán alapuló döntési algoritmus alkalmazása szignifikánsan megrövidíti az antibiotikus terápia idejét, anélkül, hogy érdemben rontaná a betegek túlélési esélyeit súlyos szepszisben és szeptikus sokkban. A közelmúltban több összefoglaló tanulmány és meta-analízis is megjelent a PCT-nek mint megbízható szepszis markernek a rutinszerû alkalmazásáról (3,15,36). Az egyik meta-analízisben arra a következtetésre jutottak, hogy a PCT diagnosztikus képessége arra, hogy a SIRS-t megkülönböztesse a szepszistõl, alacsony: a szenzitivitás és a specificitás egyaránt 71% (95% CI: 67-76), AUC („area under curve”) = 0,78 (36). Fontos azonban megjegyezni, hogy a vizsgálatba mindössze 18 közlemény került be, és a szeptikus sokkos betegeken végzett vizsgálatokat kihagyták az elemzésbõl, mondván, hogy ott nyilvánvaló klinikai jelei vannak a szepszisnek. A másik meta-analízisbe olyan közleményeket vontak be, melyek a PCT diagnosztikus pontosságát vizsgálták bakteriémiában, és a standard referencia pontnak a pozitív hemokultúrát tekintették (15). Ez esetben 17 tanulmány került górcsõ alá, és az elõzõ meta-analíziséhez hasonló eredményrõl számoltak be: 76 illetve 70%-os szenzitivitást és specificitást, AUC=0,84. A PCT diagnosztikus erejét moderáltnak véleményezték. Egy tavaly megjelent nagy összefoglaló tanulmány már árnyaltabban fogalmaz (3). Egyrészt kiemeli a PCT tagadhatatlan hasznát mint SIRS, infekció és szepszis marker, másrészt megjegyzi, hogy a témában megjelent eredmények ellentmondóak, a beteganyag nem homogén, az eredmények interpretációja, elsõsorban a mérési módszerek miatt, nem egyszerû. A legtöbb vizsgálatban ugyanis a PCT „gyorstesztet” (LUMItest, BRAHMS, Henningsdorf, Németország) használták. A sokkal érzékenyebb kryptát emisszión alapuló mûszer (Kryptor assay, BRAHMS) csak nemrégiben terjedt el, és remélhetõleg át fogja venni a jövõben a szerepet a kevésbé érzékeny LUMItest-tõl. Ez annál is meglepõbb, mert Magyarországon már hosszú évek óta elérhetõ, és több intézményben mûködik is ezen érzékenyebb PCT meghatározás. Mindezek alapján a PCT fontos és hasznos mutatója a bakteriális infekciónak, és segíthet az antibiotikus kezelés indikációjának eldöntésében. Kétségtelen, hogy szöveti sérülések is okozhatnak PCT szint-emelkedést. További vizsgálatokra van szükség annak eldöntésére, hogy különbözõ súlyosságú betegeknél milyen határértékeket válasszunk, vagy ami még érdekesebb, hogy milyen naponkénti változást tekintsünk kórosnak. Valószínûleg nagy elõrelépést fog jelenteni, amikor megjelennek a PASS-tanulmány (Procalcitonin And Survival Study) eredményei, melyben a hagyományos kezelésen 30


átesõ betegek túlélését hasonlítják a hagyományos kezelés+PCT irányított diagnosztikus és kezelési algoritmus szerint kezelt betegek kimeneteléhez (14). A szerzõk tavaly júniusban már a tervezett 1000 betegbõl 700 bevonásánál tartottak, és már túl voltak két idõközi elemzésen. Minden valószínûség szerint ez a vizsgálat hosszú idõre meghatározza majd a szakvélemény hozzáállását a PCT napi diagnosztikában és kezelésben betöltött szerepérõl.

Egyéb markerek Endotoxin. A Gram-negatív baktériumok felszabaduló lipoliszacharid szintjének mérése hosszú múltra tekint vissza, de nem vált a klinikai rutin részévé. Ennek oka, hogy az endotoxin plazma koncentrációja széles határok között változik, és nem mutat korrelációt a gyulladás súlyosságával. Egy új biológiai tesztrõl, az endotoxin aktivitási tesztrõl (EAA) azonban bíztató eredmények jelentek meg a közelmúltban. A vizsgálat a zymosan-antitest és anti-endotoxin-antitest reakció kiváltotta oxidatív választ („respiratory burst”) méri. Az elõzetes klinikai eredmények alapján a Gram-negatív infekció diagnózisában az intenzív osztályra kerüléskor mért EAA szenzitivitás 85,3%, specificitása 98,6% (95%os konfidencia intervallum 97,5-99,8%), ami elsõsorban a negatív prediktív értékét emeli ki a tesztnek (20,21). Bár alapvetõen bíztatóak a laboratóriumi eredmények, az önmagában történõ endotoxin mérés a klinikai gyakorlatban vitatható (31). Lipoprotein kötõ fehérje. Az endotoxin indukálta immunválasz egyik akut fázis fehérjéje a lipoprotein kötõ fehérje (LBP). Kevés adat áll rendelkezésünkre, az is egy neutropéniás, lázas, rákos betegeken végzett vizsgálatból származik. A szerzõk igen jó szenzitivitást és specificitást, és a CRP-hez hasonló, tehát viszonylag lassú kinetikát találtak (26). Az LBP esetében is vannak tehát érdekes eredmények, de jelenlegi ismereteink szerint diagnosztikai és prognosztikai haszna elmarad a PCT-étõl (23). VEGF. Az érendothel növekedési faktor („vascular endothelial growth factor, VEGF) szintje megemelkedik súlyos szepszisben, szeptikus sokkban, de az eddigi eredményekbõl, azon kívül, hogy van némi különbség a túlélõk és nem-túlélõk VEGF szintje között, nem lehet levonni semmilyen következtetést (16).

Szepszis, infekció vagy balszívfél elégtelenség? Az I-es típusú (hypoxiás) légzési elégtelenséggel sürgõsen felvett betegekben az akut állapotromlás okának differenciál-diagnózisa nem mindig egyértelmû, pedig a közvetlen életveszély elhárítását követõen alapvetõen meghatározza a további kezelést. Különösen idõsebb, krónikus szív-, illetve légzési elégtelenségben szenvedõ betegek esetében lehet nehéz a helyzetünk. Szerencsére, a legújabb biomarker kutatási eredmények alapján van esély arra, hogy mind a differenciál-diagnózist, mind a prognosztizálást illetõen jobb becsléseket tehessünk.


Natriuretikus peptidek. A natriuretikus peptidek elsõsorban a szívelégtelenség markerei, termelõdésük ingere a jobb pitvar feszülése. Legtöbbet vizsgált típusaik az N-terminális pro-brain-típusú natriuretikus peptid (proBNP), a „mid regional natriuretikus peptid” (proANP), és a „mid regional pro-adrenomedullin” (proADM). Több mint 10 éve ismert, hogy a proBNPnek fontos szerepe lehet az akut myocardialis infarktus (AMI) utáni halálozási rizikóbecslésben (32). Újabb vizsgálati eredmények szerint a calcitoninnal homológ génszerkezetet mutató proADM, mely a PCT-hez hasonlóan több szervben, szövetben is termelõdhet, AMI után aktiválódik, a proBNP-hez hasonló erejû prediktora a kedvezõtlen kimenetelnek: AUCproBNP=0,9, AUCproADM=0,7, és különösen erõs prediktív értéke van a kettõ együttes értékelésének: AUCproBNP+proANP=0,4 (17). Egy mostanában lezáruló multicentrikus klinikai tanulmány (Biomarkers in the Assessment of Congestive Heart Failure, BACH Study) elõzetes eredményei az elõbb említetteken kívül azt látszanak alátámasztani, hogy a proANP és PCT együttes értékelése komoly segítséget nyújthat az akut balkamra elégtelenség és a közösségben szerzett pneumonia differenciál-diagnózisában (9). Ez az ún. „multimarker” szemlélet új, és felettébb érdekes, és kíváncsian várjuk a vizsgálat lezárását, és az eredmények publikálását.

Összefoglalás A szepszis definíciójában a klinikai jelek mellett feltételként szereplõ láz és leukocytosis megbízhatatlan mutatói a bakteriális infekciónak. Bár a fent tárgyalt markerek egyike sem felel meg teljesen az „ideális szepszis marker” kívánalmainak, az elmúlt évek vizsgálatai alapján úgy tûnik, hogy a PCT áll legközelebb a „cím” elnyeréséhez. Nemcsak a diagnózis felállításában segít, hanem prediktív értékkel bír a kimenetelt illetõen, és mérésének fontos terápiás következményei lehetnek pl.: az antibiotikum terápiában, csökkentvén a fölösleges antibiotikum adást, és így a rezisztens baktériumok elszaporodását, és a kiadásokat. Ehhez azonban a PCT szint napi rendszerességgel történõ mérésére van szükség. Természetesen a PCT-t illetõen is több kérdés nyitott még, de ezek közül több is megválaszolásra kerülhet, ha megjelennek a közeljövõben várhatóan lezáruló PASS tanulmány eredményei. Az pedig, hogy nincsen olyan „egyetlen marker”, ami 100%-os szenzitivitással és specificitással bír, nem meglepõ, hiszen a SIRS vagy szepszis nem definitív betegség, hanem egy olyan állapot, mely számos inzultus hatására kialakulhat, és nem feltétlenül az inzultus ereje, sokkal inkább a szervezet válasza az, ami alapvetõen meghatározza egy infekció súlyosságát. Mind a mai napig a legtökéletesebb szepszis monitor ezért maga az emberi agy. Ez azt jelenti, hogy az egyre jobb és pontosabb diagnosztika mellett, valószínûleg mindig szükség lesz a jól felkészült, tapasztalattal bíró klinikusra, aki összegzi a klinikai képet, a laboratóriumi méréseket, és hozza meg a döntését a diagnózist és a terápiát illetõen.

Biomarkerek – a procalcitonin szerepe a diagnosztikában Irodalomjegyzék

1. American College of Chest Physicians – Society of Critical Care Medicine Consensus Conference: Definitions for sepsis and organ failure and guidelines for the use of innovative therapies in sepsis. Crit. Care Med., 20, 864-875, 1992 2. Assicot M., Gendrel D., Carsin H. et al.: High serum procalcitonin concentrations in patients with sepsis and infection. Lancet, 341, 515-518, 1993 3. Becker K.L., Snider R., Nylen E.S.: Procalcitonin assay in systemic inflammation, ifection, and sepsis: clinical utility and limitations. Crit. Care Med., 36, 941-952, 2008 4. Bone R.C., Fisher C.J., Clemmer T.P. et al.: A controlled clinical trial of high dose methylprednisolone in the treatment of severe sepsis and septic shock. N. Engl. J. Med., 317, 654-658, 1987 5. Cannon J.G., Tompkins R.G., Gelfand J.A. et al.: Circulating interleukin-1 and tumor necrosis factor in septic shock and experimental endotoxin fever. J. Infect. Dis., 161, 79-84, 1990 6. Castelli G.P., Pognani C., Meisner M. et al.: Procalcitonin and C-reactive protein during systemic inflammatory response syndrome, sepsis and organ dysfunction. Crit. Care, 8, R234-R240, 2004 7. Chiesa C., Pellegrini G., Pandero A. et al.: C-reactive protein, interlaukin-6, and procalcitonin int he immediate postnatal period: influence of illness severity, risk status, antenatal and perinatal complications, and infection. Clin. Chem., 49, 60-68, 2003 8. Christ-Crain M., Jaccard-Stolz D., Bingisser R. et al.: Effect of procalcitonin-guided treatment on antibiotic use and outcome in lower respiratory tract infections: cluster randomised, single blinded intervention trial. Lancet, 363, 600-607, 2004 9. Coletta A.P., Cullington D., Clark A.L. et al.: Clinical trials update from European Society of Cardiology meeting 2008: TIME-CHF, BACH, BEAUTIFUL, GISSI-HF, and HOME-HF. Eur. J. Heart Fail., 10, 1264-1267, 2008 10. de Werra I., Jaccard C., Corradin S.B. et al.: Cytokines, nitrite/nitrate, soluble tumor necrosis factor receptors, and procalcitonin concentrations: comparisons in patients with septic shock, cardiogenic shock, and bacterial pneumonia. Crit. Care Med., 25, 607-613, 1997 11. Dellinger R.P., Carlet J., Masur H. et al.: Surviving Sepsis Campaign guidelines for management of severe sepsis and septic shock. Crit. Care Med., 32, 858-872, 2004 12. Giannoudis P.V., Harwood P.J., Loughenbury P. et al.: Correlation between IL-6 levels and the systemic inflammatory response score: can an IL-6 cutoff predict a SIRS state? J. Trauma, 65, 646-652, 2008 13. Jensen J.U., Heslet L., Jensen T.H. et al.: Procalcitonin increase in early identification of critically ill patients at high risk of mortality. Crit. Care Med., 34, 25962602, 2006 31



14. Jensen J.U., Lundgren B., Hein L. et al.: The Procalcitonin And Survival Study (PASS). BMC Infect. Dis., 8, 91, 2008 15. Jones A.E., Fiechtl J.F., Brown M.D. et al.: Procalcitonin test int he diagnosis of bacteremia: a meta-analysis. Ann. Emerg. Med., 50, 34-41, 2007 16. Karlsson S., Pettilä V., Tenhunen J., et al.: Vascular endothelial growth factor in severe sepsis and septic shock. Anesth. Analg., 106, 1820-1826, 2008 17. Khan S.Q., O’Brien R.J., Struck J. et al.: Prognostic value of midregional pro-adrenomedullin in patients with acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol., 49, 1525-1532, 2007 18. Linscheid P., Seboek D., Schaer J.D. et al.: Expression and secretion of procalcitonin and calcitonin generelated peptide by adherent monocytes and macrophage-activated adipocytes. Crit. Care Med., 32, 1715-1721, 2004 19. Marshall J.C., Aarts M.A.: From Celsus to Galen to Bone: The illnesses, syndromes, and diseases of acute inflammation. In: Yearbook of intensive care and emergency medicine. Ed: Vincent J.L., pp: 3-12, 2001 20. Marshall J.C., Foster D., Vincent J.L. et al.: Diagnostic and prognostic implications of endotoxinemia in critical illness: Results of the MEDIC study. J. Infect. Dis., 190, 527-534, 2004 21. Marshall J.C., Walker P.M., Foster D. et al.: Measurement of endotoxin activity in critically ill patients using whole blood neutrophil dependent chemiluminescence. Crit. Care, 6, 342-348, 2002 22. Meisner M., Tschaikowsky K., Schnabel S. et al.: Procalcitonin–influence of temperature, storage, anticoagulation and arterial or venous asservation of blood samples on procalcitonin concentrations. Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem., 35, 597-601, 1997 23. Meisner M.: Biomarkers of sepsis: clinically useful? Curr. Opin. Crit. Care, 11, 473-480, 2005 24. Mimoz O., Benoist J.F., Edouard A.R. et al.: Procalcitonin and C-reactive protein during the early posttraumatic systemic inflammatory response syndrome. Int. Care Med., 24, 185-188, 1998 25. Molnár Z., Szakmány T., Kõszegi T. et al.: Microalbuminuria and serum procalcitonin levels following oesophagectomy. Eur. J. Anaesthesiol., 17, 464-465, 2000 26. Nijhuis C.S.M.O., Vellenga E., Daenen S.M.G.J. et al.: Lipopolisaccharide-binding protein a possible

27.

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34.

35.

36.

37.

38.

32

diagnostic marker for Gram-negative bacteremia in neutropenic cancer patients. Int. Care Med., 29, 21572161, 2003 Nobre V., Harbarth S., Graf J-D. et al.: Use of procalcitonin to shorten antibiotic treatment duration in septic patients. Am. J. Respir. Crit. Care Med., 177, 498-505, 2008 Oda S., Hirasawa H., Shiga H. et al.: Sequential measurement of IL-6 blood levels in patients with systemic inflammatory response syndrome (SIRS/sepsis). Cytokine, 29, 169-175, 2005 Ohlsson K., Bjork P., Bergenfeldt M. et al.: Interleukin1 receptor antagonist reduces mortality from endotoxin shock. Nature, 348, 550-552, 1990 Okusawa S., Gelfand J.A., Ikejima T. et al.: Interleukin 1 induces a shock-like state in rabbits. Synergism with tumor necrosis factor and the effect of cyclooxygenase inhibition. J. Clin. Invest., 81, 1162-1172, 1988 Opal S.M.: Endotoxin and cytokine detection systems as biomarkers for sepsis-induced renal injury. Contrib. Nephrol., 156, 220-226, 2007 Richards A.M., Nicholls M.G., Yandle T.G. et al.: Plasma N-terminal pro-brain natriuretic peptide and adrenomedullin: new neurohormonal predictors of left ventricular function and prognosis after myocardial infarction. Circulation, 97, 1921-1929, 1998 Simon L., Gauvin F., Amre D.K. et al.: Serum procalcitonin and C-reactive protein levels as markers of bacterial infection: a systematic review and metaanalysis. Clin. Infect. Dis., 39, 206-217, 2004 Suprin E., Camus C., Gacouin A. et al.: Procalcitonin: a valuable indicator of infection in a medical ICU? Int. Care Med., 26, 1232-1238, 2000 Szakmany T., Molnar Z.: Procalcitonin levels do not predict mortality following major abdominal surgery. Can. J. Anaesth., 50, 1082-1083, 2003 Tang B.M.P., Eslick G.D., Craig J.C. et al.: Accuracy of procalcitonin for sepsis diagnosis in critically ill patients: systemic review and meta-analysis. Lancet Infect. Dis., 7, 210-217, 2007 Thompson D., Milford-Ward A., Whicher J.T.: The value of acute phase protein measurements in clinical practice. Ann. Clin. Biochem., 29, 123-131, 1992 Wiedermann F.J., Kaneider N., Egger P. et al.: Migration of human monocytes in response to procalcitonin. Crit. Care Med., 30, 1112-1117, 2002

Tartalomjegyzék FOCUS MEDICINAE

Recommend Documents