6 mudah pada medium nutrien sederhana (Pelczar dan Chan 1988). Escherichia coli bersifat motil atau non-motil dengan kisaran suhu pertumbuhannya adalah 1040 oC, dengan suhu pertumbuhan optimum adalah 37 oC (Reapina 2007). Tempat yang paling sering terkena infeksi Escherichia coli adalah saluran kemih, saluran empedu, dan tempat-tempat lain di rongga perut. Bakteri ini juga menghasilkan enterotoksin yang tahan panas dapat menyebabkan diare yang ringan, sedangkan enterotoksin yang tidak tahan panas dapat menyebabkan sekresi air dan klorida ke dalam lumen usus, dan menghambat reabsorbsi natrium (Jawetz et al. 2005). Pseudomonas fluorescence Pseudomonas fluorescens merupakan bakteri aerob yang bersifat Gram negatif, berbentuk batang dengan ukuran 0,5 – 1 x 1,5 – 4 µm serta mampu membentuk siderofor (pigmen kuning kehijauan) pada media yang kekurangan ion Fe seperti King’s B. Koloni bakteri ini berbentuk bulat, rata dan fluidal. Tumbuh baik pada kisaran suhu 20 – 41 oC, dengan pH optimum pada kisaran 6 – 7 dan suhu optimum pada 30 oC. Bakteri P. fluorescens juga tidak bersifat patogen terhadap tumbuhan sehingga dapat digunakan sebagai pemacu pertumbuhan tanaman atau plant growth promoting rhizobacteria (PGPR) dan sebagai agen antagonis terhadap patogen tanaman (Arwiyanto et al. 2007). Bacillus cereus Bacillus cereus merupakan bakteri Gram positif berbentuk batang besar (>0,9 μm) dengan ukuran panjang sel 3 – 5 mikron dan lebarnya 1 mikron. Bakteri ini menghasilkan spora yang berbentuk elips dan terletak di tengah-tengah sel. Spora hanya terbentuk bila terdapat oksigen di lingkungan sekitar (aerob fakultatif). Bacillus cereus termasuk salah satu organisme mesofilik yaitu dapat tumbuh pada suhu optimal 30 – 35◦C (Blackburn dan McClure 2002). Klebsiella cloacae (Enterobacter cloacae) Enterobacter cloacae merupakan bakteri Gram negatif, tidak membentuk spora, anaerob fakultatif, dan motil dengan flagela peritrikus (Buchanan 2006). Enterobacter cloacae dapat diisolasi dari buah-buahan, usus hewan, tanah, dan perairan (Pelczar dan Chan 1999). Liu et al. (2009) menyatakan bahwa bakteri ini mampu menghasilkan β-galaktosidase dengan suhu optimum 35°C dan aktif pada kisaran pH 6.5 – 10.5. Enzim β-galaktosidase yang dihasilkan dari bakteri ini mampu mengkatalisis reaksi hidrolisis dan transglikosilasi.
MATERI DAN METODE Lokasi dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan pada bulan Januari sampai dengan Juli 2014 di Laboratorium Metabolisme Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi dan Laboratorium Riset Mikrobiologi, Bagian Mikrobiologi Medik, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner, Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor.
7 Materi Hewan yang digunakan pada penelitian ini adalah imago betina ulat sutera liar A. atlas sebanyak empat ekor yang berasal dari perkebunan teh PTPN VIII Purwakarta, Jawa Barat. Alat-alat yang digunakan pinset, gunting bedah, tabung sampel steril, mikroskop cahaya, ose, gelas objek, tabung reaksi, cawan Petri, pipet, rak tabung reaksi, pembakar Bunsen, spidol, label nama, inkubator, lemari es, dan camera digital. Bahan-bahan yang digunakan adalah sampel penggantung telur A. atlas, aquades steril sebagai bahan pengencer sampel, media untuk mengisolasi seperti agar darah, MacConkey Agar (MCA), dan trypticasein soy agar (TSA), media untuk mengidentifikasi bakteri seperti Triple Sugar Iron Agar (TSIA), Indol, Simmon’s citrate agar, urea, kaldu gula-gula (glukosa, sukrosa, laktosa, manitol, dan maltosa), zat warna Gram (kristal violet, lugol, aseton alkohol, safranin), alkohol 70%, reagent Erhlich, H2O2 3% dan KOH 3%. Prosedur Penelitian Pengambilan dan Pemeliharaan Kokon Kokon ulat sutera A. atlas diambil dari perkebunan teh PTPN VIII Purwakarta, Jawa Barat. Kokon selanjutnya dipelihara dalam kandang kasa berukuran 50 cm x 50 cm x 50 cm. Kokon dipisahkan antara kokon betina dan jantan dengan sedikit menggunting kulit kokon untuk melihat bakal imago betina dan jantan ulat sutera A. atlas. Pupa dengan antena kecil akan menjadi imago betina, pupa dengan antena besar akan menjadi imago jantan. Pengambilan Sampel Imago betina A. atlas terlebih dahulu dimatikan dengan cara memasukkan hewan ke dalam freezer selama 1 jam. Pengambilan sampel dilakukan pada empat ekor imago betina ulat sutera liar A. atlas dengan melakukan pembedahan bagian medial abdomen menggunakan pinset dan gunting bedah steril. Sampel saluran telur kemudian dimasukkan ke dalam tabung sampel steril dan ditambahkan aquades sebagai pengencer sebanyak 2-3 ml. Sampel ditanam pada media agar darah dan MCA, lalu diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam. Isolasi Bakteri Sampel dibiakkan ke dalam agar darah dan MCA dengan teknik goresan T, lalu diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator dengan suhu 37 oC. Setelah 24 jam, koloni bakteri terpisah yang tumbuh pada agar darah dan MCA dicatat ciri koloninya. Koloni yang berbeda kemudian dipindahkan ke dalam agar miring TSA dan dilakukan pelabelan sistematis untuk masing-masing koloni. Identifikasi Bakteri Koloni yang tumbuh pada media TSA diwarnai dengan pewarnaan Gram untuk dilihat morfologi, sifat Gram, dan kemurniannya. Menurut Lay (1994), cara melakukan pewarnaan Gram diawali dengan pembuatan preparat ulas, kemudian difiksasi di atas pembakar Bunsen. Preparat ulas ditetesi larutan kristal violet ke seluruh bagian ulasan bakteri dan didiamkan selama satu menit lalu dicuci dengan aquades. Selanjutnya, preparat diberi larutan lugol dan didiamkan selama satu menit lalu dicuci dengan aquades hingga bersih. Berikutnya, preparat diberi
8 larutan pemucat (aseton alkohol) kurang lebih 10 detik dan dicuci kembali dengan aquades hingga bersih. Terakhir, preparat ditetesi larutan safranin selama 15-20 detik lalu dicuci dengan aquades hingga bersih kemudian dikeringkan dengan kertas saring. Lalu diamati di bawah mikroskop menggunakan perbesaran objektif 100x dengan bantuan minyak emersi. Hasil pewarnaan Gram, bakteri Gram positif berwarna ungu sedangkan bakteri Gram negatif berwarna merah. Apabila terdapat koloni bakteri yang belum murni, maka dilakukan kembali iisolasi pada agar darah maupun MCA dengan teknik goresan T. Apabila hasil dari pewarnaan Gram kurang meyakinkan, maka dilakukan uji KOH 3% untuk menentukan sifat Gram bakteri. Bakteri Gram negatif akan memberikan hasil adanya masa gelatin yang membentuk benang-benang halus saat diangkat menggunakan ose. Analisis Data Analisis data disajikan secara deskriptif. Secara ringkas alur identifikasi bakteri Gram positif dan negatif dapat dilihat pada Gambar 2 dan 3. Identifikasi akhir mengacu pada Jang et al. (1976), Barrow dan Feltham (1993), dan Bergey dan Breed (1994).
9
Bacillus
Gambar 2 Diagram alir identifikasi bakteri Gram positif (Bergey dan Breed 1994; Lay 1994)
10
Gambar 3 Diagram alir identifikasi bakteri Gram negatif (Bergey dan Breed 1994; Lay 1994)
