PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI

SITOTOKSISITAS FRAKSI PROTEIN DAUN MIMBA (Azadirachta indica A. Juss) FP10, FP20, FP30, DAN FP40 TERHADAP KULTUR SEL HeLa

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh: Lestarining Wahyu Ndadari NIM: 038114029

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2007

i


SITOTOKSISITAS FRAKSI PROTEIN DAUN MIMBA (Azadirachta indica A. Juss) FP10, FP20, FP30, DAN FP40 TERHADAP KULTUR SEL HeLa

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh: Lestarining Wahyu Ndadari NIM: 038114029

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2007

ii




HALAMAN PERSEMBAHAN

Ia membuat segala sesuatu indah pada waktunya, bahkan Ia memberi kekekalan dalam hati mereka. Tetapi manusia tidak dapat menyelami pekerjaan yang dilakukan Allah dari awal sampai akhir. Pengkhotbah 3 : 11

Ku persembahkan karyaku ini kepada: Tuhan Yesus Kristus atas Kasih dan KaryaNya yang luar biasa dalam hidupku Bapak dan Ibu yang menyayangiku dengan seluruh dukungan, restu dan doa yang selalu menyertaiku Semua teman-teman dan Almamaterku

v


PRAKATA

Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas karunia dan anugerahNya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP10, FP20, FP30, dan FP40 terhadap Kultur Sel HeLa” sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar sarjana pada Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Penulisan skripsi ini tidak mungkin terwujud tanpa adanya bimbingan, bantuan dan dukungan dari berbagai pihak yang senantiasa meluangkan waktu dan pikirannya. Oleh karena itu, pada kesempatan ini penulis ingin mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada: 1. Rita Suhadi, M.Si., Apt., selaku dosen dan dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang bersedia berbagi ilmu dan pengalaman klinis. 2. Drs. A. Yuswanto, Ph.D., S.U., Apt., yang telah memberikan bimbingan, pengarahan, dan semangat selama penelitian dan penyusunan skripsi. 3. Drs. Mulyono, Apt., yang bersedia berdiskusi dan memberikan saran sebagai dosen penguji skripsi. yang bersedia meluangkan waktu dan memberikan masukan dalam menyelesaikan permasalahan. 4. dr. Luciana Kuswibawati, M. Kes., yang memberikan saran sebagai dosen penguji skripsi. 5. Ign. Y. Kristio Budiasmoro, M.Si. yang membantu dalam pengolahan statistik dan determinasi tanaman.

vi


6. Dosen dan karyawan Fakultas Farmasi yang telah banyak memberikan sumbangan ilmu dan tenaga. 7. Kedua orang tua, Bapak Wahjudi dan Ibu J. Endang Lestari serta keluarga besar atas doa, cinta, nasehat, semangat dan perhatian kepada penulis. 8. Bapak Rajiman, Mbak Yuli, Mbak Istini, Heni, Mas Dwi, segenap karyawan dan staf Laboratorium Ilmu Hayati UGM yang telah banyak membantu dan membimbing selama penelitian skripsi ini. 9. Nike, yang telah menjadi teman dan sahabat yang berharga yang Tuhan Yesus anugerahkan bagi penulis dalam suka, duka, tangis dan tawa ceria. 10. Teman-teman PMK Apostolos yang menjadi keluarga untuk berbagi suka dan keluh kesah, kekuatan yang menopang dan menarik kembali saat jauh dariNya, dan semangat dalam pelayanan, dalam mereka kelembutan kasih Tuhan terpancar. 11. Teman-teman Komunitas Tari Genta Rakyat atas kebersamaan yang indah dalam perjalanan yang mengagumkan untuk menemukan jati diri. Dance with our Soul. 12. Leea, Vita, Sari, Lucy, Melon, Ana, Jenny (kelompok Mimba) dan Mila, Wati, Ratih, Agnes (kelompok Teki) untuk diskusi, kerjasama, dan sebagai teman seperjuangan suka maupun duka dalam menyelesaikan penyusunan skripsi ini. 13. Seluruh angkatan 2003 Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma khususnya kelas A kelompok B atas kebersamaan kita dalam setiap belajar di kelas maupun di luar kelas dan praktikum yang penuh dengan tantangan, ketegangan dan keceriaan.

vii


14. Semua pihak yang telah memberikan dukungan baik moral maupun material yang tidak dapat disebutkan satu persatu. Penulis menyadari masih banyak kekurangan baik dalam isi, bahasa maupun penulisan skripsi ini. Untuk itu, penulis mengharapkan koreksi dan saran dari seluruh pembaca untuk lebih menyempurnakan tulisan ini. Penulis berharap semoga skripsi ini bermanfaat dan memberikan sumbangan bagi ilmu pengetahuan.

Penulis

viii



INTISARI Terapi alternatif yang mulai digunakan untuk penyakit kanker adalah dengan daun mimba (Azadirachta indica A. Juss). Hasil penelitian sebelumnya fraksi protein daun mimba hasil pengendapan dengan amonium sulfat 30% dan 60% memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel HeLa. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30 dan FP40 terhadap kultur sel HeLa dan sel Vero. Penelitian ini adalah penelitian eksperimental murni rancangan acak lengkap pola satu arah. Fraksi protein diendapkan menggunakan amonium sulfat dalam berbagai tingkat kejenuhan dan konsentrasi. Uji sitotoksisitas dilakukan terhadap sel HeLa dan sel Vero secara in vitro menggunakan metode MTT (3(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-dipheniltetrazolium bromide). Hasil uji berupa prosentase kematian sel. Analisis statistik dengan analisis probit dilakukan untuk mengetahui nilai LC50 dan uji t-independent sample untuk membandingkan sitotoksisitas fraksi protein daun mimba terhadap sel HeLa dan sel Vero. Hasil uji sitotoksisitas menunjukkan bahwa FP10, FP20, FP30 dan FP40 sitotoksik terhadap sel HeLa dan sel Vero. Nilai LC50 FP10, FP20, FP30 dan FP40 terhadap sel HeLa berturut-turut sebesar 1,5.107 µg/ml; 6.10-3 µg/ml; 3,7.10-13 µg/ml dan 1,8.10-2 µg/ml; sedangkan terhadap sel Vero berturut-turut sebesar 1,2.10-3 µg/ml; 1,2.104 µg/ml; 1,2.10-2 µg/ml dan 2,3.1011 µg/ml. Uji tindependent sample menunjukkan bahwa seluruh fraksi protein daun mimba memiliki perbedaan sitotoksisitas yang tidak signifikan antara sel HeLa dan sel Vero. FP10, FP20, FP30 dan FP40 daun mimba tidak berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker. Kata kunci : daun mimba, sitotoksisitas, fraksi protein, LC50, sel HeLa, sel Vero

x


ABSTRACT Neem leaves (Azadirachta indica A. Juss) is now being used as alternative therapy for cancer. Previous research showed that protein fraction of neem leaves which were precipitated using ammonium sulphate in concentration of 30% and 60% had cytotoxic activity against HeLa cells. This research aim to investigate the cytotoxicity of protein fraction of neem leaves PF10, PF20, PF30, and PF40 against HeLa and Vero cells (normal cells). This research was pure experimental research with the complete random and one way design. Protein fractions were precipitated with ammonium sulphate in various saturation grades. The cytotoxicity test was determined against HeLa cells and Vero cells in vitro using MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyl tetrazolium bromide) method. Data collected was cell death percentage. Data were statistically analysis by probit analysis to determined the LC50 values and independent samples t-test was used to identify whether the protein fractions have selectivity to HeLa cells. The result indicated that PF10, PF20, PF30, and PF40 of neem leaves show cytotoxic activity to HeLa and Vero cells. LC50 of PF20, PF30, and PF40 against HeLa cells are 1,5.107 µg/ml; 6.10-3 µg/ml; 3,7.10-13 µg/ml and 1,8.10-2 µg/ml respectively; whereas LC50 of PF10, PF20, PF30 and PF40 against Vero cells are 1,2.10-3 µg/ml; 1,2.104 µg/ml; 1,2.10-2 µg/ml and 2,3.1011 µg/ml. The results of independent samples t-test showed that all protein fraction of neem leaves have no significant difference of cytotoxicity between HeLa and Vero cells. In conclusion, PF10, PF20, PF30, and PF40 of neem leaves were not recommended to be developed as anticancer. Keywords: neem leaves, cytotoxicity, protein fraction, LC50, HeLa cells, Vero cells

xi


DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL .........................................................................

ii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................

iii

HALAMAN PENGESAHAN ...........................................................

iv

HALAMAN PERSEMBAHAN ........................................................

v

PRAKATA .........................................................................................

vi

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ............................................

ix

INTISARI ..........................................................................................

x

ABSTRACT .........................................................................................

xi

DAFTAR ISI ......................................................................................

xii

DAFTAR TABEL ..............................................................................

xvi

DAFTAR GAMBAR .........................................................................

xviii

DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................

xix

ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH ASING ..................................

xx

BAB I PENGANTAR ........................................................................

1

A. Latar Belakang .......................................................................

1

1. Permasalahan ...................................................................

3

2. Keaslian penelitian ...........................................................

3

3. Manfaat penelitian ...........................................................

4

B. Tujuan Penelitian ...................................................................

4

Tujuan umum .........................................................................

4

Tujuan khusus ........................................................................

4

xii


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ................................................

5

A. Tanaman Mimba (Azadirachta indica A. Juss.) ....................

5

1. Nama daerah ....................................................................

5

2. Deskripsi tanaman ............................................................

5

3. Kandungan kimia .............................................................

6

4. Penelitian terhadap tanaman mimba ................................

6

B. Protein ....................................................................................

7

1. Pengertian protein ............................................................

7

2. Jenis protein berdasarkan kelarutan .................................

8

3. Pemurnian protein ............................................................

9

4. Pengukuran konsentrasi protein .......................................

11

C. Kanker ....................................................................................

11

1. Definisi .............................................................................

11

2. Proses terjadinya kanker ..................................................

13

3. Kanker leher rahim ..........................................................

18

D. Kultur Sel ...............................................................................

19

1. Sel HeLa ...........................................................................

20

2. Sel Vero ...........................................................................

21

E. Uji Sitotoksisitas In vitro .......................................................

21

F. Landasan Teori .......................................................................

23

G. Hipotesis ................................................................................

24

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ..........................................

25

A. Jenis dan Rancangan Penelitian .............................................

25

xiii


B. Variabel-variabel Penelitian ...................................................

25

C. Definisi Operasional ..............................................................

26

D. Bahan atau Materi Penelitian .................................................

26

E. Alat-alat Penelitian .................................................................

27

F. Tatacara Penelitian .................................................................

28

1. Determinasi tanaman .......................................................

28

2. Pengumpulan daun mimba ...............................................

28

3. Sterilisasi alat dan bahan ..................................................

28

4. Pembuatan fraksi protein dari daun mimba .....................

28

5. Pengukuran konsentrasi protein total ...............................

31

6. Propagasi dan panen sel HeLa .........................................

31

a. Propagasi sel HeLa ....................................................

31

b. Panen sel HeLa ..........................................................

32

7. Propagasi dan panen sel Vero ..........................................

32

a. Propagasi sel Vero .....................................................

32

b. Panen sel Vero ...........................................................

33

8. Uji sitotoksisitas terhadap sel HeLa dan sel Vero ...........

33

a. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT terhadap sel HeLa ..........................................................................

33

b. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT terhadap sel Vero ............................................................................

34

G. Analisis Hasil .........................................................................

35

xiv


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ...........................................

36

A. Preparasi Fraksi Protein Daun Mimba ...................................

36

B. Penetapan Konsentrasi Fraksi Protein ...................................

38

C. Uji Sitotoksisitas Fraksi Protein ............................................

39

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ............................................

53

A. Kesimpulan ............................................................................

53

B. Saran ......................................................................................

53

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................

54

LAMPIRAN .......................................................................................

58

BIOGRAFI PENULIS .......................................................................

102

xv


DAFTAR TABEL

Halaman Tabel I.

Prosentase kematian dari uji sitotoksisitas fraksi protein terhadap sel HeLa ......................................................

Tabel II.

44

Prosentase kematian dari uji sitotoksisitas fraksi protein terhadap sel Vero .......................................................

46

Tabel III.

Volume larutan ekstrak gubal protein daun mimba ...

58

Tabel IV.

Absorbansi fraksi protein pada panjang gelombang 280 nm dan 260 nm ....................................................

Tabel V.

Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP10 terhadap kultur sel HeLa ............................................

Tabel VI.

62

Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP10 terhadap kultur sel Vero .............................................

Tabel X.

62


Tabel IX.

61


Tabel VIII.

61


Tabel VII.

60

63


xvi

63


Tabel XI.


Tabel XII.

64


xvii

64


DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1.

Reaksi reduksi MTT menjadi formazan ....................

22

Gambar 2.

Foto sel HeLa dan sel Vero tanpa perlakuan .............

41

Gambar 3.

Foto sel HeLa dan sel Vero setelah perlakuan ...........

42

Gambar 4.

Foto kristal formazan ungu ........................................

42

Gambar 5.

Grafik prosentase kematian sel HeLa ........................

44

Gambar 6.

Grafik prosentase kematian sel Vero .........................

47

Gambar 7.

Foto tanaman Azadirachta indica A. Juss ..................

98

Gambar 8.

Foto daun Azadirachta indica A. Juss .......................

98

Gambar 9.

Foto Hi-Mac Sentrifuge HITACHI SCP85 ................

99

Gambar 10.

Foto ELISA reader SLT 340ATC .............................

99

Gambar 11.

Foto Mikroskop (Olympus IMT-2) ............................

99

Gambar 12.

Foto perlakuan dengan sel HeLa dalam 96 well plate

100

Gambar 13.

Foto perlakuan dengan sel Vero dalam 96 well plate

100

xviii


DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1.

Jumlah penambahan amonium sulfat ........................

58

Lampiran 2.

Perhitungan konsentrasi protein .................................

60

Lampiran 3.

Absorbansi sel dengan metode MTT .........................

61

Lampiran 4.

Hasil analisis probit LC50 fraksi protein terhadap sel HeLa ...........................................................................

Lampiran 5.

66

Hasil analisis probit LC50 fraksi protein terhadap sel Vero ............................................................................

78

Lampiran 6.

Hasil distribusi data dengan Uji Kolmogorov-Smirnov

90

Lampiran 7.

Hasil analisis Uji t-independent sample .....................

94

Lampiran 8.

Foto tanaman dan daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) ......................................

Lampiran 9.

98

Foto Hi-Mac Sentrifuge HITACHI SCP85H, ELISA reader SLT 340ATC dan mikroskop (Olympus IMT-2) .......................................................

99

Lampiran 10. Foto hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP40 terhadap kultur sel HeLa dan sel Vero dalam 96 well plate ...............................................................

100

Lampiran 11. Surat determinasi tanaman .........................................

101

xix


ARTI SINGKATAN DAN ISTILAH ASING

continous cell lines : sel yang berasal dari sel primer yang ditumbuhkan terus menerus ELISA

: Enzyme Link Immunosorbent Assay

FP10 (PF10)

: fraksi protein (protein fraction) daun mimba hasil pengendapan dengan amonium sulfat 10% jenuh

FP20(PF20)


FP30(PF30)


FP40(PF40)


FBS

: Foetal Bovine Serum

MTT

: 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-dipheniltetrazolium bromide)

reagen stopper

: reagen yang terdiri dari larutan SDS 10% dalam HCl 0,01N

RPMI

: Rosswell Park Memorial Institute

SDS

: Sodium Dodesil Sulfat

tissue culture flask : tempat untuk menumbuhkan sel, berbentuk botol dengan leher bengkok 96 well plate

: sumuran mikro yang terdiri dari 96 lubang tempat menanam sel pada uji sitotoksisitas

xx


1

BAB I PENGANTAR

A. Latar Belakang Kanker memiliki reputasi sebagai penyakit yang mematikan (Anonim, 2005b). Dalam daftar Badan Kesehatan Dunia penyakit kanker masuk dalam urutan teratas dari kelompok penyakit. Di seluruh dunia penyakit kanker menempati urutan kedua setelah penyakit jantung, sedangkan di Indonesia masuk urutan

keenam sebagai

penyakit penyebab kematian. Penyakit kanker

diperkirakan diidap oleh 15 orang per 100.000 penduduk di dunia (Mulyadi, 1996). Sampai saat ini penyakit kanker masih menjadi ancaman, sementara obat spesifik untuk menghentikan perkembangan sel kanker belum juga ditemukan (Hartono, 1999). Upaya pencegahan terus diusahakan dengan berbagai terapi seperti pembedahan, radiasi dan sitostatika. Namun terapi-terapi tersebut membutuhkan biaya yang besar dan menimbulkan efek samping yang merugikan bagi penderita sehingga sebagian penderita lebih memilih terapi alternatif. Guna menakar besarnya manfaat dan risiko terapi alternatif, sangat diperlukan pemahaman tentang cara kerja terapi alternatif, termasuk penggunaan suplemen makanan (senyawa antioksidan serta vitamin mineral) dan preparat herbal yang dapat bekerja melawan kanker (Hartono, 1999). Pada umumnya antineoplastik menekan pertumbuhan atau proliferasi sel dan menimbulkan toksisitas. Suatu antikanker diharapkan memiliki toksisitas

1


2

selektif artinya menghancurkan sel kanker tanpa merusak sel jaringan normal (Ganiswarna, 1995). Oleh sebab itu, penelitian-penelitian menggunakan bahanbahan yang berasal dari alam misalnya tanaman, diharapkan dapat menjadi terapi antikanker alternatif yang bersifat selektif. Daun yang berasal dari tanaman mimba (Azadirachta indica A. Juss) telah lama diketahui memiliki banyak manfaat dalam dunia kesehatan antara lain, sebagai antiinflamasi, antirematik, antipiretik,

penurun

gula

darah,

antitukak

lambung,

hepatoprotektor,

imunopotensiasi, antifertilitas, antivirus, dan antikanker (Sukrasno, 2003). Penelitian tentang efek sitotoksik fraksi protein daun mimba terhadap kultur sel kanker telah dilakukan antara lain, fraksi total protein daun mimba terhadap kultur sel Raji (Ariyani, 2004), terhadap kultur sel SiHa (Lusia, 2004), terhadap kultur sel HeLa (Febriani, 2004), fraksi protein daun mimba hasil pengendapan dengan amonium sulfat 30%; 60% dan 100% jenuh terhadap kultur sel Myeloma (Hariadi, 2006), terhadap kultur sel SiHa (Candra, 2006), terhadap kultur sel Raji (Robbyono, 2006), dan terhadap kultur sel HeLa (Suwanto, 2006). Suatu senyawa dapat dinyatakan memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai antikanker apabila mempunyai nilai LC50 ≤ 20 µg/ml (Suffness and Pezzuto, 1991) dan bersifat toksik selektif (Ganiswarna, 1995). Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Suwanto (2006) diketahui bahwa fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) hasil pengendapan dengan amonium sulfat 30%; 60% dan 100% jenuh memiliki efek sitotoksik terhadap kultur sel HeLa terutama pada fraksi 30% dan 60% dengan nilai LC50 sebesar 1,0 µg/ml dan 4,1 µg/ml sehingga memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai senyawa


3

antikanker. Namun, penelitian yang dilakukan oleh Suwanto (2006) tersebut perlu dilakukan penelitian dengan fraksinasi yang lebih kecil dan seri konsentrasi yang lebih banyak untuk mengetahui secara lebih spesifik fraksi protein yang bersifat sitotoksik terhadap sel HeLa serta keselektifan efek sitotoksiknya terhadap sel normal. Oleh karena itu, pada penelitian kali ini akan dilakukan fraksinasi proteinnya dengan pengendapan menggunakan amonium sulfat dengan fraksi yang lebih kecil yaitu 10% (FP10), 20%(FP20), 30% (FP30) dan 40% (FP40) jenuh dengan harapan dapat diperoleh hasil yang lebih spesifik dan membandingkan sitotoksisitasnya terhadap sel Vero (sel normal). 1. Permasalahan a. Diantara fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30 dan FP40, manakah yang mempunyai sitotoksisitas terhadap sel HeLa dan sel Vero ? b. Berapakah nilai LC50 dari fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30 dan FP40 terhadap sel HeLa dan sel Vero ? c. Apakah fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30 dan FP40 dapat dikembangkan sebagai antikanker ? 2. Keaslian penelitian Sebelumnya pernah dilakukan penelitian mengenai sitotoksisitas fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss.) hasil pengendapan dengan amonium sulfat 30%, 60% dan 100% jenuh terhadap kultur sel HeLa (Suwanto, 2006). Sejauh yang diketahui penulis belum pernah dilakukan penelitian sitotoksisitas fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss.) FP10, FP20, FP30 dan FP40 terhadap kultur sel HeLa dan sel Vero.


4

3. Manfaat penelitian a. Manfaat teoritis Penelitian ini dapat melengkapi dan memperkaya teori yang telah ada mengenai khasiat, penggunaan, dan efek sitotoksisitas fraksi protein daun mimba terhadap sel HeLa dan sel Vero yang berguna dalam kemajuan bidang ilmu kefarmasian. b. Manfaat praktis Penelitian ini diharapkan dapat digunakan sebagai acuan yang mendukung penemuan obat alternatif antikanker dari daun mimba.

B. Tujuan Penelitian Tujuan umum: untuk mengetahui apakah fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30 dan FP40 memiliki potensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker baru. Tujuan khusus: a. untuk mengetahui fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30 dan FP40 yang mempunyai daya sitotoksisitas terhadap sel HeLa dan sel Vero b. untuk mengetahui nilai LC50 dari fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30 dan FP40 terhadap sel HeLa dan sel Vero c. untuk mengetahui apakah fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30 dan FP40 berpotensi dikembangkan sebagai antikanker.


5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A. Tanaman Mimba (Azadirachta indica A. Juss) 1. Keterangan botani tanaman mimba (Azadirachta indica A. Juss) Tanaman mimba (Azadirachta indica A. Juss.) termasuk dalam divisi Spermatophyta, sub divisi Angiospermae, kelas Dicotyledonae, bangsa Meliales, suku Meliaceae, marga Azadirachta, jenis Azadirachta indica A. Juss. Tanaman mimba memiliki sinonim yaitu Melia azadirachta Linn. Dalam bahasa Inggris atau Belanda tanaman ini dikenal dengan nama Margosa tree, Neem tree, atau Margosier. (Backer and Backuizen van den Brink, 1963; 1965; Hutapea, 1993) 2. Nama daerah Tanaman mimba (Azadirachta indica A. Juss.) memiliki nama daerah Jawa yaitu Imba, mimba, membha, mempheuh. Di wilayah Pasundan (Sunda) dikenal dengan nama nimba, di Bali dan Nusa Tenggara dikenal dengan nama intaran, dan di Madura dikenal dengan nama mimba, membha, atau mempheuh (Sukrasno, 2003). 3. Deskripsi tanaman Tanaman mimba berupa pohon dengan tinggi 10-15 meter. Batang tegak, berkayu, bulat, permukaan kasar, percabangan simpodial, coklat. Daun majemuk, berhadapan, lonjong, melengkung, tepi bergerigi, ujung lancip, pangkal meruncing, pertulangan menyirip, panjang 5-7 cm, lebar 3-4 cm, tangkai panjang

5


6

8-20 cm, hijau. Bunga majemuk, berkelamin dua, di ujung cabang, tangkai silindris, panjang 8-15 cm, kelopak hijau, benang sari silindris, putih kekuningan, putik lonjong, coklat muda, mahkota halus, putih. Buah buni, bulat telur, hijau. Biji bulat, diameter kurang lebih 1 cm, putih. Akar tunggang, coklat (Hutapea, 1993). Pohon mimba dapat tumbuh di berbagai ketinggian tempat, tetapi di atas ketinggian 500 meter diatas permukaan laut sulit menghasilkan biji, hanya daunnya yang tumbuh lebat (Kardinan dan Taryono, 2003). 4. Kandungan kimia Sampai saat ini, setidaknya ada sembilan senyawa yang telah diisolasi dan diidentifikasi dari daun mimba yaitu nimonol, nimbolida, 28-deoksi nimbolida, αlinolenat, 14-15-epoksinimonol, 6-K-O-asetil-7-deasetil-mimosinol, melrasinol, dan nimbotalin. Penelitian terhadap senyawa-senyawa yang terkandung dalam daun mimba tersebut mendukung pemanfaatannya dalam dunia kesehatan (Sukrasno, 2003). 5. Penelitian terhadap tanaman mimba Beberapa penelitian untuk membuktikan kebenaran khasiat daun mimba terutama protein daun mimba sebagai antikanker telah dilakukan antara lain, penelitian sitotoksisitas fraksi total protein daun mimba terhadap kultur sel Raji (Ariyani, 2004), terhadap kultur sel SiHa (Lusia, 2004), terhadap kultur sel HeLa (Febriani, 2004), dengan kesimpulan bahwa fraksi protein daun mimba mempunyai efek sitotoksik terhadap ketiga jenis sel kanker tersebut walaupun belum dapat dinyatakan sebagai senyawa yang berpotensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker karena nilai LC50 yang diperoleh lebih besar dari 20


7

µg/ml. Penelitian lebih lanjut yaitu sitotoksisitas fraksi protein daun mimba hasil pengendapan dengan amonium sulfat 30%; 60% dan 100% terhadap sel Raji (Robbyono, 2006) dengan kesimpulan fraksi 30% berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker karena nilai LC50 < 20 µg/ml, sedangkan pada penelitian serupa terhadap sel HeLa (Suwanto, 2006), terhadap sel Myeloma (Hariadi, 2006) dan terhadap sel SiHa (Candra, 2006) menyimpulkan bahwa fraksi 30% dan 60% berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker sebab nilai LC50 yang diperoleh juga < 20 µg/ml.

B. Protein 1. Pengertian protein Kata protein berasal dari protos atau proteos yang berarti pertama atau utama. Protein merupakan komponen penting atau komponen utama sel hewan atau manusia. Oleh karena sel itu merupakan pembentuk tubuh hewan maupun manusia, maka protein yang terdapat dalam makanan berfungsi sebagai zat utama dalam pembentukan dan pertumbuhan tubuh. Tumbuhan membentuk protein dari CO2, H2O dan senyawa nitrogen. Protein adalah suatu polipeptida yang mempunyai molekul besar dengan bobot molekul bervariasi antara 5000 sampai jutaan (Poedjiadi, 1994). Protein terdapat dalam semua jenis zat hidup: tumbuhan, hewan, dan jasad renik. Semua protein, selain mengandung karbon, hidrogen, dan oksigen juga mengandung nitrogen dan sering mengandung belerang dan fosfor (Sakidja, 1989).


8

Protein merupakan polimer kondensasi asam amino dengan penghilangan unsur air dari gugus amino dan gugus karboksil. Asam amino pada protein mempunyai konfigurasi-L dan ikatan amida hanya terbentuk antara gugus aminoalfa dan gugus karboksil-alfa dari asam amino yang bersangkutan. Beberapa protein beracun mempunyai peran ekologi dalam melindungi tumbuhan dari serangan mikroba. Protein beracun lain memberi harapan dalam pengobatan kanker dan penyakit yang disebabkan virus. Fraksinasi ekstrak protein dapat dilakukan dengan cara pengendapan menggunakan amonium sulfat (Robinson, 1991). 2. Jenis protein berdasarkan kelarutan Beberapa jenis protein yang diklasifikasikan berdasarkan kelarutannya antara lain: 1. albumin merupakan protein yang dapat larut dalam air dan larutan garam, dapat terkoagulasi oleh panas. Larutan albumin di dalam air dapat diendapkan dengan penambahan amonium sulfat hingga jenuh. 2. globulin memiliki sifat sukar larut dalam air murni, tetapi dapat larut dalam larutan garam netral, misalnya larutan NaCl encer. Larutan globulin dapat diendapkan oleh penambahan garam ammonium sulfat hingga setengah jenuh. Globulin dapat diperoleh dengan jalan mengekstraksinya dengan larutan garam (5%-10%) NaCl kemudian ekstrak yang diperoleh diencerkan dengan penambahan air. Globulin akan mengendap dan dapat dipisahkan. Globulin juga dapat terkoagulasi oleh panas.


9

3. histon merupakan protein yang mempunyai sifat basa dan dapat larut dalam air. Pada proses hidrolisis menghasilkan banyak arginin dan lisin. Histon terdapat di dalam inti sel dalam bentuk ikatan dengan asam nukleat. 4. protamin merupakan protein yang bersifat basa seperti histon, tidak mengandung tirosin dan triptofan, tetapi mengandung banyak arginin sehingga mempunyai kadar nitrogen antara 25%-30%. Protamin berikatan dengan asam nukleat. Protamin larut dalam etanol 70%-80% tetapi tidak larut dalam air serta etanol absolut. 5. skleroprotein tidak larut dalam air atau larutan garam, banyak mengandung asam amino Glysin, Alanin dan Prolin. (Poedjiadi, 1994; Murray dkk, 1995) 3. Pemurnian protein Suatu jenis protein dari bahan alam dalam keadaan murni tidak mudah diperoleh sebab molekul protein tidak stabil terhadap pemanasan serta pelarut organik. Pemurnian protein diawali dengan pemilihan bahan alam yang akan diproses berdasarkan kadar protein yang terkandung didalamnya yaitu yang berkadar protein tinggi dan mudah diperoleh. Selanjutnya mengeluarkan protein dari dalam bahan alam tersebut dengan cara memecahkan sel-sel jaringan secara mekanik misal dengan cara menghancurkan dan melumatkannya dalam suatu alat tertentu dan beberapa jenis protein dapat diperoleh dengan melarutkannya dalam air atau pelarut lain. Dalam proses ini perlu dijaga agar temperatur dan pH larutan tidak merusak protein. Pada temperatur 40°C protein mudah terdenaturasi, maka pemurnian protein sering dilakukan pada temperatur rendah, yaitu mendekati titik


10

beku pelarut yang digunakan. Disamping itu, protein juga sensitif terhadap asam atau basa dengan konsentrasi tinggi, dan biasanya pemurnian protein dilakukan pada pH mendekati netral dengan menggunakan larutan buffer tertentu (Poedjiadi, 1994). Setelah diperoleh larutan yang berisi beberapa macam protein maka proses selanjutnya ialah fraksinasi yaitu memisahkan masing-masing protein dalam campuran secara fraksi demi fraksi. Dua cara yang biasa digunakan untuk proses fraksinasi ini yaitu pengendapan dan kromatografi. Proses pengendapan protein dapat dilakukan menggunakan amonium sulfat berkonsentrasi tinggi atau larutan jenuh. Beberapa protein berbeda kelarutannya dalam konsentrasi garam yang berbeda. Cara ini digunakan terutama bila diinginkan satu macam protein saja sedangkan protein lain tidak diperlukan. Selain dengan garam proses pengendapan protein dapat dilakukan dengan menyesuaikan pH titik isoelektrik protein yang diinginkan. Pada titik isoelektrik kelarutan protein berkurang hingga minimum dan protein yang diinginkan akan mengendap, sedangkan protein lain yang tidak diinginkan tetap di dalam larutan. Protein dapat dipisahkan satu dari yang lain dengan cara kromatografi. Kromatografi adsorpsi untuk pemurnian protein dilakukan dengan menggunakan alumina atau kalsium fosfat sebagai adsorben. Selain itu kromatografi penukar ion dapat digunakan pula untuk pemurnian protein. Kolom kromatografi diisi dengan DEAE-selulosa, suatu penukar ion yang mempunyai gugus dietilaminoetil yang terikat pada selulosa atau dengan penukar kation yaitu CM-selulosa yang mempunyai gugus karboksimetil terikat pada selulosa (Poedjiadi, 1994).


11

4. Pengukuran konsentrasi protein Pada umumnya, metode pemurnian protein harus dilakukan pada temperatur rendah, pada range 0-4°C. Temperatur rendah meminimalkan degradasi protein selama pemurnian dengan menghalangi aktifitas protease (enzim yang memecah ikatan peptida) dan mengurangi kemungkinan protein akan terdenaturasi, atau membuka ikatannya (banyak protein yang sangat sensitif terhadap panas). Pada pH netral tirosin, triptofan dan fenilalanin mengabsorpsi sinar ultraviolet (UV) pada panjang gelombang 280 nm (Moran dkk, 1994; Murray dkk, 1995).

C. Kanker 1. Definisi Kanker adalah penyakit yang disebabkan adanya perbanyakan dan penyebaran yang tidak terkontrol menjadi bentuk tubuh abnormal dari sel tubuh itu sendiri. Kanker merupakan salah satu penyebab utama kematian di Negara berkembang, setidaknya satu dari lima pada populasi di Eropa dan Amerika Utara diperkirakan meninggal karena kanker (Rang dkk, 2003). Kanker ditandai oleh pembelahan sel yang tidak terkontrol dan kemampuannya untuk menyerang jaringan lain, baik melalui pertumbuhan langsung pada jaringan (invasi) atau dengan migrasi sel ke jaringan yang lain (metastasis). Pertumbuhan yang tidak sesuai aturan ini disebabkan oleh kerusakan DNA, menghasilkan mutasi pada gen utama yang mengendalikan pembelahan sel, dan fungsi yang lain. Satu atau lebih


12

dari mutasi ini, baik yang diturunkan atau didapatkan, dapat menuntun ke pembelahan sel yang tak terkendali dan pembentukan tumor (Anonim, 2005b). Tumor menunjukkan suatu massa yang abnormal di jaringan, baik berupa malignan (kanker) atau benigna (nonkanker). Tumor benigna tidak menyebar ke bagian lain tubuh atau menyerang jaringan lain, dan jarang perawatannya untuk bertahan hidup jika tidak secara kebetulan menekan struktur utama (vital). Tumor malignan dapat menyerang organ lain, menyebar ke lokasi yang jauh (metastasis) dan menjadi perawatan untuk bertahan hidup (Anonim, 2005b). Istilah kanker, neoplasma malignan dan tumor malignan merupakan sinonim. Keduanya dibedakan dari tumor benigna oleh dediferensiasi, keinvasifan dan kemampuan metastasis (penyebaran ke bagian lain dari tubuh). Kedua tumor baik benigna maupun malignan menunjukkan proliferasi yang tidak terkendali. Sel kanker memiliki karakteristik yang membedakannya dari sel normal, yaitu sel kanker mengalami pertumbuhan dan pembelahan sel yang tidak terkendali oleh regulasi pembelahan sel dan pertumbuhan jaringan yang normal, adanya gangguan diferensiasi dan kehilangan fungsi pada sel kanker, sel kanker mampu melakukan invasif dan metastasis (Rang dkk, 2003). Untuk menghambat metastasis kanker, perlu diketahui cara sel tersebut menyebar. Ada dua cara sel kanker ber-metastasis: melalui angiogenesis (pembentukan pembuluh darah yang baru) dan penghancuran kolagen yang merupakan kerangka sel normal. Dengan demikian metastasis akan dapat dihambat bila angiogenesis dapat dicegah; sementara kolagen yang rusak dapat


13

diperbaiki oleh tubuh sendiri dengan memanfaatkan makanan tertentu (Hartono, 1999). Pendekatan utama dalam pengobatan kanker yaitu pembedahan, irradiasi, dan kemoterapi. Penggunaan masing-masing pengobatan tersebut tergantung pada tipe tumor dan tingkat perkembangannya (Rang dkk, 2003). 2. Proses terjadinya kanker Sel normal berubah menjadi sel kanker karena satu atau lebih mutasi pada DNA-nya baik secara diturunkan, bukan kanker itu sendiri yang diturunkan melainkan gen yang telah termutasi dan mudah berkembang menjadi kanker maupun dengan cara didapat dari luar sel akibat pemaparan zat kimia, kokarsinogen, dan lain-lain. Perkembangan kanker merupakan proses yang rumit, melibatkan tidak hanya satu perubahan genetik tetapi juga yang lain, seperti faktor-faktor epigenetik (aksi hormonal, ko-karsinogen dan efek pemacu tumor) yang tidak hanya menghasilkan kanker itu sendiri melainkan dengan meningkatkan kemungkinan mutasi genetik yang akan menimbulkan kanker (Rang dkk, 2003). Sel kanker mempunyai antigen pada permukan sel yang dapat dikenali dan bereaksi dengan sistem imun inang sehingga mampu mencegah pertumbuhan tumor yang tak terkendali. Teori ini dikenal sebagai immunosurveillance (pemantauan imun). Teori ini bermula dari percobaan yang dilakukan oleh Paul Ehrlich yang mengamati bahwa hewan dengan pertumbuhan tumor bervirulensi rendah mengalami penurunan pertumbuhan tumor setelah dilakukan inokulasi sel tumor berikutnya. Ehrlich menduga lubang pada struktur permukaan sel tumor


14

yang dapat dikenali sebagai sesuatu yang abnormal oleh inang. Penelitian dilanjutkan oleh Lewis Thomas yang memberikan teori penolakan allograft menggambarkan mekanisme utama dalam pertahanan alami terhadap neoplasia. Berdasarkan penelitian-penelitian tersebut, Macfarlane Burnet memberikan teori immunosurveillance yang berpusat adanya antigen yang tergabung pada sel tumor (Schwartz, 1991; Dasgupta, 1992). Teori tersebut menyatakan bahwa sel efektor pada sistem imun secara aktif beredar di dalam tubuh untuk mengenali dan membasmi sel-sel tumor yang mulai terbentuk. Penelitian pada tahun 1970 mampu menemukan dan mengidentifikasi adanya sel T, sel ini menjadi sel efektor yang diduga memperantarai dalam immunosurveillance. Lebih dari dua dekade terakhir, data-data memunculkan pendapat bahwa konstituen sistem imun seperti sel natural killer (NK) dan jaringan cytokine mampu memberi pertahanan terhadap kanker (Ichim, 2005). Aktivitas sel NK menjadi tanda penunjuk pada beberapa tipe tumor. Selsel NK terlibat baik secara langsung maupun tidak langsung dalam pemantauan kemunculan tumor dan mikrometastasis. Teori ini kemudian dibuktikan dengan data yang menunjukkan bahwa onkogen tertransfeksi fibroblas dapat lisis secara selektif oleh sel NK bila dibandingkan dengan kontrol yang tidak tertransfeksi. Mekanisme secara tepat sel NK dalam immunosurveillance belum diketahui secara pasti. Berkaitan dengan efek sitotoksik secara langsungnya, kemungkinan sel NK mengaktifkan sel lain dalam sistem imun dengan cara memperlengkapinya dengan bantuan cytokine. Sel NK yang mature tidak menghasilkan cytokine Thelper 2 (Th2), tetapi lebih pada cytokine T-helper 1 (Th1), tumor necrosis factor


15

(TNF)-α, interferon (IFN)-γ dan granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). Pada kenyataanya, sekresi IFN-γ oleh sel NK dapat mempengaruhi pembentukan respon imun tipe Th1 terhadap agen patogen maupun tumor terinduksi 3-methylcholanthrene (MCA) (Ichim, 2005). Langkah awal respon imun memerlukan cytokine yang dihasilkan oleh selsel T-helper. Perbedaan cytokine yang dihasilkan oleh sel menentukan tipe respon imun. Respon imun yang diperantarai sel membutuhkan cytokine Th1, sedangkan respon imun yang diperantarai antibodi membutuhkan cytokine Th2. Sel T-helper yang terdiferensiasi menjadi sel Th1 mensekresikan IFN-γ dan sedikit interleukin (IL)-2 dan IL-12, sedangkan sel Th2 mensekresikan IL-10, IL-4, dan sedikit IL-5. Namun, tumor memiliki beberapa cara baik spesifik maupun non-spesifik untuk menghindari respon Th1. Tumor mensekresikan sejumlah agen, termasuk transforming growth factor (TGF)-β, IL-10 dan prostaglandin E-2, yang menunjukkan meningkatkan respon imun Th2 ketika menekan respon imun Th1. Hal ini telah ditunjukkan bahwa jaringan cytokine dari beberapa pasien kanker cenderung mengarah ke Th2. Pasien-pasien tersebut menunjukkan peningkatan cytokine Th2 atau penurunan cytokine Th1 baik tumor sistemik maupun lokal. Penelitian mengenai tumor yang mengembangkan beberapa cara untuk menghindari respon Th1 sesuai dengan pengertian immunosurveillance. Fakta bahwa malignan memiliki banyak cara dalam menghindari respon Th1 menunjukkan bahwa kemampuan untuk menghindari respon ini memberikan keuntungan pertahanan pada sel malignan, yang selanjutnya menunjukkan bahwa respon Th1 menjadi ancaman bagi neoplasma (Ichim, 2005).


16

Cytokine Th1 IFN-γ berfungsi sebagai antitumor baik secara langsung maupun tidak langsung. Serangkaian penelitian menunjukkan arti penting IFN-γ dalam membasmi tumor awal dengan adanya peningkatan keberhasilan karsinogenesis saat tidak ada IFN-γ. IFN-γ menghambat pertumbuhan tumor dengan mempengaruhi proliferasi, apoptosis dan angiogenesis. IFN-γ juga mempunyai efek antitumor tidak langsung dengan memacu respon imun antitumor yang efektif. Sebagai tambahan dalam mempengaruhi keseimbangan cytokine Th1-Th2, IFN-γ mampu mengaktifkan makrofag sitotoksik, sel-sel NK dan sel-sel T NK (Ichim, 2005). Bukti dari prinsip tipe respon imun yang tidak tepat akan meningkatkan pertumbuhan tumor telah dibuktikan pada awal 1907 oleh Flexner dan Jobling, yang menunjukkan bahwa injeksi sel tumor autologous mati meningkatkan pertumbuhan tumor yang ada lebih dulu. Secara umum, Th2 membawa respon antibodi ke tumor yang tidak terlindungi dan mendukung perkembangan tumor dengan menghambat respon imun yang diperantarai sel Th1. Namun, paham bahwa respon imun yang diperantarai antibodi dapat merugikan pada kanker telah diusulkan lama sebelum Mossman dan Coffman menunjukkan paradigma Th1Th2 pada tahun 1986. Pada tahun 1950-an Kaliss mempopulerkan istilah ”immunological enhancement” untuk menggambarkan peningkatan pertumbuhan tumor oleh antibodi non-sitotoksik. Teori ini menyebutkan bahwa antibodi berikatan dengan sel tumor, melapisi atau menutup epitop sel tumor dan kemudian mencegah respon imun yang diperantarai sel sehingga sel tumor tidak bereaksi


17

dengan imun dan tetap bisa tumbuh dan berkembang, meskipun hal ini belum pernah dibuktikan dengan percobaan (Ichim, 2005). Ada dua kategori utama perubahan genetik yang dapat mengakibatkan munculnya kanker, yaitu: Aktivasi proto-onkogen menjadi onkogen Proto-onkogen adalah gen yang secara normal mengendalikan pembelahan sel, apoptosis, dan diferensiasi tetapi dapat berubah menjadi onkogen oleh adanya aksi virus atau karsinogen. Inaktivasi gen penekan tumor Sel normal mengandung gen yang mempunyai kemampuan untuk menekan perubahan malignan yang disebut gen penekan tumor (anti-onkogen) dan sekarang terdapat bukti bahwa mutasi terhadap gen ini terlibat dalam pembentukan kanker yang berbeda-beda. Kehilangan fungsi dari gen penekan tumor dapat menjadi peristiwa penting dalam karsinogenesis (Rang dkk, 2003). Kanker akan muncul bila DNA sel normal mengalami kerusakan sehingga menyebabkan mutasi genetik. Kalau ini tidak segera dikoreksi, perbanyakan sel yang DNA-nya rusak tersebut potensial menghasilkan sel kanker. Padahal perbanyakan sel dimaksudkan untuk pemulihan sel-sel yang aus atau rusak (Hartono, 1999). Tingkatan perubahan sel pada pertumbuhan kanker adalah sebagai berikut: a. hiperplasi yaitu pembengkakan organ tubuh akibat pertumbuhan sel-sel baru yang abnormal karena hilangnya kontrol pertumbuhan.


18

b. metaplasi yaitu perubahan epitel suatu jenis jaringan dewasa menjadi jaringan lain yang juga dewasa. c. displasi yaitu perubahan sel dewasa ke arah kemunduran dalam hal bentuk, besar dan orientasinya. Masih bersifat reversibel. d. anaplasi yaitu perubahan serupa displasi yang menyimpang lebih jauh dari normal. Merupakan suatu ciri tumor ganas yang sangat ireversibel. e. karsinoma insitu yaitu gambaran sel menjadi sangat atipik namun belum terdapat pertumbuhan infiltratif. f. invasi yaitu sel kanker telah menembus lapisan basal jaringan (Kuswibawati, 2000). 3. Kanker leher rahim Kanker servik merupakan suatu bentuk malignan pada leher rahim (servik). Kanker leher rahim merupakan jenis kanker paling banyak kedua di dunia yang menyerang wanita dan peringkat ketiga kanker yang dapat menyebabkan kematian setelah kanker payudara dan kanker paru-paru. Kanker ini menyerang 16 per 100.000 orang wanita dan menyebabkan kematian 9 per 100.000 setiap tahunnya (Anonim, 2007a). Uji sitologi cervical (Pap smear) menunjukkan identifikasi dan penghilangan lesi prekanker (Anonim, 2005b). Gejala klinik kanker leher rahim adalah keputihan yang tidak gatal, nyeri dan perdarahan sehabis senggama, anemia serta gejala-gejala lain yang ditimbulkan pada metastasis jauh (Fenty, 2000). Istilah Cervical Intra-epithelial Neoplasia (CIN) digunakan saat pada servik mengalami perubahan stadium displasia premalignan. Human Papilloma


19

Virus (HPV) pada stadium ini merupakan virus yang beresiko rendah dalam arti tidak selalu berkembang menjadi kanker tetapi bisa juga menjadi virus beresiko tinggi menyebabkan kanker leher rahim. Apabila kanker leher rahim dideteksi lebih dini, maka kanker ini dapat diobati tanpa mempengaruhi kesuburan (Anonim, 2007a). Kanker leher rahim atau karsinoma servik uteri paling sering ditemukan di antara tumor ganas ginekologik, dan umumnya paling banyak ditemukan pada wanita berusia 31-60 tahun (Fenty, 2000). Lebih dari 90% kasus kanker leher rahim disebabkan oleh Human Papilloma Virus (HPV) terutama tipe 16 dan 18. Human Papilloma Virus (HPV) tipe 16 dan 18 mengandung dua macam gen yaitu E6 dan E7 yang menghambat p53 dan Rb. Gen p53 dan Rb merupakan gen penekan tumor yang ada di dalam tubuh manusia. Gen p53 terlibat dalam regulasi apoptosis (bunuh diri sel) dan Rb bertanggung jawab untuk menghentikan siklus sel pada fase G1. Pada saat fungsi Rb melemah, sel melanjutkan siklus ke fase S dan mengalami mitosis sempurna, kemudian menghasilkan proliferasi sel dan dari hal ini menyebabkan adanya pembentukan neoplastik (Anonim, 2007a).

D. Kultur Sel Kultur sel yang baru diisolasi dari suatu jaringan dan kemudian ditumbuhkan secara in vitro dikenal sebagai kultur sel primer. Subkultur adalah pemindahan sel ke flask baru dengan medium yang baru. Subkultur memungkinkan terjadinya perluasan kultur yang sekarang dikenal sebagai cell line. Setelah mengalami beberapa kali subkultur, cell line akan mati (disebut finite


20

cell line) atau berubah menjadi continuous cell line. Sel normal dapat mengalami perubahan menjadi continuous cell line tanpa menjadi malignan, sedangkan tumor malignan dapat tumbuh pada media kemudian mengalami perubahan dan menjadi lebih atau kurang tumorigenik. Keuntungan penggunaan continuous cell line adalah lebih cepat tumbuh sehingga kepadatan populasi sel lebih tinggi, membutuhkan serum yang lebih rendah dan cukup mudah perawatannya pada media sederhana, serta memiliki kemampuan untuk tumbuh dalam suspensi. Kerugiannya meliputi ketidakstabilan kromosomal yang lebih besar, adanya penyimpangan dari fenotip donor, dan terjadi kehilangan penanda khusus jaringan (Freshney, 1986). 1. Sel HeLa HeLa cell line merupakan continouous cell line yang tumbuh sebagai sel yang semi melekat. HeLa cell line diturunkan dari sel epitel kanker leher rahim (cervix) manusia. Sel ini diisolasi dari seorang wanita penderita kanker leher rahim bernama Henrietta Lacks berusia 31 tahun, yang meninggal pada tahun 1951 akibat kanker yang dideritanya. HeLa cell line ini cukup aman dan umum digunakan untuk kepentingan kultur sel. Sel HeLa merupakan cell line cervix intraepitel (Cervical Intraepithelial Carcinoma) akibat infeksi HPV 18 (Widiyani, 2005). Sel HeLa diketahui dapat hidup dan berkembang dengan sangat baik dalam kultur buatan di laboratorium. Kultur sel HeLa mengalami proliferasi yang sangat cepat, bahkan jika dibandingkan dengan jenis sel kanker yang lain. Sel-sel tersebut memiliki telomerase aktif selama pembelahan sel, yang dapat mencegah


21

bertambah pendeknya telomer-telomer yang mengakibatkan penuaan dan bahkan kematian sel. Sel HeLa mudah menginvasi atau mengkontaminasi kultur sel lain dalam satu laboratorium yang sama (Anonim, 2007b). HeLa cell line merupakan immortal cell line yang digunakan dalam penelitian dibidang kesehatan seperti uji antitumor, uji sitotoksisitas, biologi sel, dan kemampuan invasi bakteri. Sel ini dapat dikultur menggunakan media RPMI 1640. Media RPMI 1640 mengandung nutrisi yang dibutuhkan oleh sel seperti asam amino, vitamin, garam-garam anorganik dan glukosa (Freshney, 1986). 2. Sel Vero Vero epithelial cell line ditemukan pertama pada tahun 1962 oleh Y. Yasumura dan Y. Kawakita di Universitas Chiba di Chiba, Jepang. Sel Vero diambil dari ginjal kera dewasa (jenis African Green Monkey) yang sehat. Walaupun sering digunakan dalam tranfections dan produksi vaksin, sel Vero juga sering digunakan untuk mendeteksi verotoksin (sekelompok toksin yang berhubungan yang dihasilkan oleh beberapa strain Escherichia coli yang merupakan penyebab utama hemorrhagic colitic dan sindrom hemolytic uremic pada manusia) (Anonim, 2006b).

E. Uji Sitotoksisitas In Vitro Uji untuk identifikasi agen kemoterapetik kanker yang baru biasanya dilakukan pada hewan percobaan yang mempunyai kesamaan sifat dengan manusia. Namun, ada beberapa pertimbangan yang menyebabkan kecenderungan untuk menggunakan kultur sel dibanding hewan uji. Pertimbangan tersebut antara


22

lain, tes in vitro lebih murah dibanding in vivo, ada perbedaan proses fisiologis antara hewan percobaan dan manusia, dan adanya pertimbangan moral di dalam penggunaan hewan sebagai objek penelitian (Freshney, 1986). Uji MTT (3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-dipheniltetrazolium bromide) didasarkan pada aktivitas mitokondria, yang diinterpretasikan sebagai tolok ukur kelangsungan hidup sel. Pada uji MTT, garam tetrazolium, 3-(4,5-dimetil-tiazol2-il)-2,5-dipheniltetrazolium bromide secara aktif akan diabsorpsi ke dalam sel hidup dan direduksi dalam mitokondria sel membentuk suatu produk formazan berwarna ungu. Produk tersebut terakumulasi di dalam sel karena tidak bisa keluar menembus membran sel. Dengan penambahan DMSO, isopropanil, atau solven lain yang cocok, produk formazan ungu yang terbentuk tadi baru dapat larut atau dibebaskan dan siap diukur dengan metode kolorimetri (Barile, 1997).

N Br

S

-

N

N N

+

N

NADH

S HN

N

N

NAD

N MTT (3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazolium bromide)

N

Formazan ((2E,4Z)-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-3,5diphenylformazan)

Gambar 1. Reaksi reduksi MTT menjadi formazan

Kematian sel merupakan respon uji sitotoksisitas maka konsentrasi yang menimbulkan kematian pada 50% populasi pada sel dalam waktu yang spesifik dan kondisi percobaan yang sesuai diistilahkan dengan median lethal


23

concentration atau LC50 (Cassaret and Doull, 2001). Semakin kecil harga LC50 suatu senyawa berarti senyawa tersebut semakin besar sitotoksisitasnya.

F. Landasan Teori Penyakit kanker merupakan penyakit yang telah menjadi ancaman di seluruh dunia, sementara obat spesifik untuk menghentikan perkembangan sel kanker belum juga ditemukan. Tetapi upaya pencegahan terus diusahakan dengan terapi alternatif obat antikanker yang berasal dari tanaman. Tanaman mimba merupakan salah satu tanaman yang diyakini mempunyai khasiat untuk mengobati kanker. Fraksi protein daun mimba ternyata dapat memberikan efek sitotoksik terhadap beberapa tipe sel kanker termasuk sel HeLa. Sel HeLa dapat hidup dan berkembang sangat baik dalam kultur buatan di laboratorium, diakui aman untuk digunakan dalam kultur sel, dan mampu memberikan respon yang cukup baik terhadap aktivitas dari senyawa-senyawa yang diujikan. Beberapa penelitian tentang sitotoksisitas fraksi protein daun mimba terhadap sel HeLa sebagai subyek uji telah banyak dilakukan. Dari penelitian Suwanto (2006) diketahui bahwa fraksi protein hasil pengendapan amonium sulfat 30% dan 60% memiliki nilai LC50 yang berpotensi untuk dikembangkan sebagai senyawa antikanker. Diduga bahwa protein yang berperan sebagai antikanker berada terutama antara kedua fraksi protein tersebut sehingga dimungkinkan untuk memfraksinasi protein kedalam konsentrasi yang lebih kecil lagi dengan cara pengendapan menggunakan amonium sulfat dengan tingkat kejenuhan 10%


24

(FP10), 20%(FP20), 30% (FP30) dan 40% (FP40). Dengan demikian, diharapkan dapat diketahui pada fraksi mana protein yang memiliki potensi sebagai antikanker tersebut paling banyak terendapkan dan kespesifikan protein yang bersifat antikanker. Namun, fraksi protein daun mimba belum pernah dicobakan pada sel normal (sel Vero). Jika ternyata tidak menimbulkan kerusakan pada sel normal (sel Vero), fraksi protein daun mimba dapat diajukan sebagai alternatif obat antikanker baru. Hal-hal tersebutlah yang mendasari dilakukan penelitian fraksinasi protein daun mimba menjadi lebih kecil lagi untuk dilihat keberadaan protein yang berpotensi untuk dikembangkan menjadi senyawa antikanker.

G. Hipotesis Fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP10, FP20, FP30 dan FP40 memiliki efek sitotoksik terhadap sel HeLa dan berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker.


25

BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian eksperimental murni sederhana tunggal dengan rancangan penelitian acak lengkap pola searah.

B. Variabel-variabel Penelitian 1. Variabel bebas Konsentrasi fraksi protein daun Azadirachta indica A. Juss FP10, FP20, FP30 dan FP40. 2. Variabel tergantung Prosentase kematian sel HeLa dan sel Vero pada masing-masing kultur sel. 3. Variabel pengacau terkendali a. Medium tumbuh sel dikendalikan dengan menggunakan medium RPMI 1640 untuk sel HeLa dan medium M199 untuk sel Vero. b. Tempat tumbuh dan waktu pemanenan daun mimba dikendalikan dengan memanen daun pada tempat dan waktu yang sama. c. pH dan suhu pembuatan fraksi protein, dikendalikan pada pH 7,2 dan suhu 4oC. 4. Variabel pengacau tak terkendali Kematian sel HeLa dan sel Vero secara alami.

25


26

C. Definisi Operasional 1. Uji sitotoksisitas adalah uji toksisitas secara in vitro menggunakan kultur sel. 2. Fraksi protein adalah protein yang didapat dari ekstrak gubal daun mimba dengan pengendapan menggunakan amonium sulfat. 3. Lethal Concentration (LC50) adalah konsentrasi fraksi protein daun mimba yang dapat mengakibatkan kematian 50% populasi sel HeLa maupun sel Vero.

D. Bahan atau Materi Penelitian 1. Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun segar tanaman mimba (Azadirachta indica A. Juss). Daun mimba diambil dari tanaman mimba (Azadirachta indica A. Juss) yang tumbuh di pekarangan Laboratorium Hayati LPPT Unit III, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, pada bulan Juni 2006. Daun mimba diambil pada saat tanaman mimba belum berbunga dan berbiji. 2. Kultur sel HeLa dari stok Laboratorium Ilmu Hayati Universitas Gadjah Mada 3. Kultur sel Vero dari stok Laboratorium Ilmu Hayati Universitas Gadjah Mada 4. Pereaksi untuk isolasi dan penetapan konsentrasi protein dari daun Azadirachta indica A. Juss dengan bahan p.a (Merck): a. larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 b. larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl c. amonium sulfat 5. Pereaksi untuk uji sitotoksisitas pada sel HeLa dan sel Vero a. Media pencuci : RPMI 1640 (Sigma), natrium bikarbonat, Hepes (Sigma)


27

b. Media penumbuh sel HeLa : RPMI 1640 (Sigma), Foetal Bovine Serum (FBS) 10% (Gibco), Penisilin-Streptomisin 2% (Gibco), dan Fungison 0,5% (Gibco) c. Media penumbuh sel Vero : M199 (Sigma), Foetal Bovine Serum (FBS) 10% (Gibco), Penisilin-Streptomisin 2% (Gibco), dan Fungison 0,5% (Gibco) d. Reagen Stopper : natrium dodeksil sulfat 10% dalam HCl 0,01 N (Merck) e. MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) 5 mg/ml (Sigma) f. Trypsin 0,25% (Sigma)

E. Alat-alat Penelitian Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: alat-alat gelas (Pyrex), mortir dan stamper, kain monel, sentrifuge (Sigma K PLC series), spektrofotometer UV (CECIL Serie 2) dan kuvet 1 ml, mikroskop (Olympus Model IMT-2), haemocytometer (Nebauer), laminar air flow (Nuraire Class II type A/B3), inkubator 37ºC, aliran 5% CO2 (Nuraire IR Airflow), 96-well plate (Nunc), ELISA Reader SLT 340ATC, tissue culture flask, pipet Pasteur, membran / tabung dialisis (Sigma), tangki nitrogen cair, penangas air, almari es (National), mikropipet, timbangan analitik (AND ER-400 H), alumunium foil, magnetic stirrer, pH meter (TOA electronic HM-5S), mesin vortex (Thermolyne Maximi), autoklaf, Hi-Mac Sentrifuge (HITACHI SCP85H), tissue, glove, dan masker.


28

F. Tatacara Penelitian 1. Determinasi tanaman Bahan utama yang akan digunakan dalam penelitian yaitu daun mimba, telah dideterminasi terlebih dahulu di laboratorium Farmakognosi Fitokimia, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta dan dipastikan juga kebenarannya menggunakan acuan baku (Backer and Backuizen van den Brink, 1963; 1965). 2. Pengumpulan daun mimba Daun mimba yang digunakan diambil dari pohon mimba yang tumbuh di pekarangan Laboratorium Hayati, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta, pada bulan Juni 2006. 3. Sterilisasi alat dan bahan Untuk mencegah terjadinya kontaminasi oleh organisme, maka alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini harus disterilkan terlebih dahulu. Alat-alat tersebut dicuci dengan larutan sabun hingga bersih dan dikeringkan, setelah itu dibungkus dengan alumunium foil dan disterilkan dalam autoklaf selama 20 menit pada suhu 121oC (Gennaro, 2000). 4. Pembuatan fraksi protein dari daun mimba Daun segar tanaman Azadirachta indica A. Juss dikumpulkan, diseleksi, dan dicuci bersih dengan air mengalir. Daun dipotong kecil-kecil, tulang daun dibuang dan ditimbang sebanyak 450 gram. Daun kemudian dibungkus dengan kantong plastik bersih dan disimpan dalam freezer –20ºC selama semalam, bersama dengan mortir, stamper, dan juga reagen-reagen yang akan digunakan


29

untuk proses selanjutnya dimana bahan-bahan tersebut sebelumnya telah disterilkan. Daun ditumbuk halus dengan penambahan sesedikit mungkin dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl dalam mortir yang ditempatkan dalam baskom berisi air es. Hasil tumbukan diperas dengan kain monel, ditampung dalam tabung conical yang bersih dan steril. Cairan yang diperoleh disentrifus pada 8000 rpm selama 30 menit. Supernatan dikumpulkan dalam labu ukur 500 ml yang bersih dan steril. Supernatan yang diperoleh kemudian diendapkan proteinnya dengan menambahkan 27,45 gram amonium sulfat perlahan-lahan sambil terus diaduk menggunakan magnetic stirrer dan dijaga suhunya, kemudian didiamkan selama semalam di dalam lemari es sambil terus diaduk. Supernatan kemudian disentrifus lagi pada 8000 rpm selama 25 menit. Supernatan (1) ditampung dalam labu ukur 500 ml sedang pelet yang yang diperoleh dilarutkan dengan larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 hingga volumenya mencapai 3 ml. Supernatan (1) yang telah ditampung ditambahkan dengan 27,47 gram amonium sulfat perlahan-lahan sambil terus diaduk menggunakan magnetic stirrer selama semalam dan dijaga suhunya dalam lemari es. Selanjutnya supernatan (1) disentrifus 8000 rpm selama 25 menit. Supernatan (2) ditampung dalam labu ukur 500 ml sedang pelet yang diperoleh dilarutkan dengan larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 hingga volumenya mencapai 3 ml.


30

Supernatan (2) yang ditampung ditambah dengan 28,35 gram amonium sulfat perlahan-lahan sambil terus diaduk menggunakan magnetic stirrer selama semalam dan dijaga suhunya dalam lemari es. Selanjutnya supernatan (2) disentrifus 8000 rpm selama 25 menit. Supernatan (3) ditampung dalam labu ukur 500 ml sedang pelet yang diperoleh dilarutkan dengan larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 hingga volumenya mencapai 3 ml. Supernatan (3) ditambah dengan 29,28 gram amonium sulfat perlahanlahan sambil terus diaduk menggunakan magnetic stirrer selama semalam dan dijaga suhunya dalam lemari es. Selanjutnya supernatan (3) disentrifus 8000 rpm selama 25 menit. Supernatan (4) ditampung dalam labu ukur 500 ml sedang pelet yang diperoleh dilarutkan dengan larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 hingga volumenya mencapai 3 ml. Langkah selanjutnya dilakukan dialisis dengan memasukkan keempat sampel fraksi protein yang diperoleh tadi ke dalam tabung dialisis dan direndam dalam larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2, diaduk menggunakan magnetic stirrer selama semalam dalam lemari es. Hasil dialisis ditambahkan larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl hingga volumenya mencapai 10 ml, sentrifus 8000 rpm selama 20 menit. Pelet dibuang sedang supernatan diambil sebagai sampel fraksi protein dengan konsentrasi 10% jenuh, sampel fraksi protein dengan konsentrasi 20% jenuh, sampel fraksi protein dengan konsentrasi 30% jenuh dan sampel fraksi protein dengan konsentrasi 40% jenuh.


31

5. Pengukuran konsentrasi protein total Fraksi protein 10%, 20%, 30% dan 40% jenuh yang diperoleh, masingmasing sebanyak 10 μl kemudian ditambah larutan dapar natrium fosfat 5mM hingga volumenya mencapai 1 ml. Ambil dan masukkan ke dalam kuvet. Ukur serapan dengan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm dengan blanko larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2. Concentration = [1.55E(280)] – [0.76E(260)] mg ml-1 (Layne cit., Richterich and Colombo, 1981) 6. Propagasi dan panen sel HeLa a. Propagasi sel HeLa Sel diambil dari tangki nitrogen cair, lalu dengan segera dicairkan diatas penangas air 37ºC. Ampul disemprot dengan etanol 70% dan dibuka. Sel kemudian dipindahkan ke dalam tabung conical steril yang berisi medium RPMI 1640. Suspensi sel disentrifus 8000 rpm selama 5 menit, supernatan yang didapat dibuang, kemudian medium RPMI diganti dengan yang baru, disuspensikan secara perlahan-lahan. Suspensi sel kemudian disentrifus lagi selama 5 menit. Supernatan dibuang sedang pelet ditambah dengan 1 ml medium penumbuh yang mengandung 20% FBS. Disuspensikan perlahan hingga homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam 3-4 tissue culture flask kecil, diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37ºC dengan aliran 5% CO2. Setelah 24 jam, medium diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian.


32

b. Panen sel HeLa Setelah jumlah sel cukup, medium RPMI 1640 kemudian diganti dengan medium RPMI 1640 yang baru sebanyak 5 ml. Sel dilepaskan dari dinding flask dengan cara diresuspensikan menggunakan pipet Pasteur. Sel kemudian dipindahkan ke dalam tabung conical steril, ditambah medium RPMI 1640 sampai volume 10 ml dan kemudian disentrifus 8000 rpm selama 5 menit. Supernatan yang didapat dibuang sedang pelet diresuspensi kembali secara perlahan dengan 1 ml media. Jumlah sel dihitung menggunakan haemocytometer. Suspensi sel kemudian ditambahkan sejumlah medium sehingga diperoleh konsentrasi sel sebesar 5 x 104 sel / 200 μl yang akan digunakan untuk penelitian. 7. Propagasi dan panen sel Vero a. Propagasi sel Vero Sel diambil dari tangki nitrogen cair, lalu dengan segera dicairkan diatas penangas air 37ºC. Ampul disemprot dengan etanol 70% dan dibuka. Sel kemudian dipindahkan ke dalam tabung conical steril yang berisi medium M199. Suspensi sel disentrifus 8000 rpm selama 5 menit, supernatan yang didapat dibuang, kemudian medium M199 diganti dengan yang baru, disuspensikan secara perlahan-lahan. Suspensi sel kemudian disentrifus lagi selama 5 menit. Supernatan dibuang sedang pelet ditambah dengan 1 ml medium penumbuh yang mengandung 20% FBS. Disuspensikan perlahan hingga homogen, kemudian sel ditumbuhkan dalam 3-4 tissue culture flask kecil, diinkubasi dalam inkubator pada suhu 37ºC dengan aliran 5% CO2. Setelah 24 jam, medium diganti dan sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian.


33

b. Panen sel Vero Setelah jumlah sel cukup (kurang lebih setelah berumur 7 hari), sel dicuci dengan FBS 10% sebanyak 3 ml. Untuk melepaskan sel-sel dari dinding flask, diberi trypsin 0,25% sebanyak 1 ml. Sel dipindahkan dalam tabung conical steril yang sudah berisi M199 sebanyak 7 ml. Kemudian sel dibilas kembali dengan FBS 10% sebanyak 3 ml. Hasil bilasan dituang ke dalam tabung conical yang sama dan disentrifus selama 5 menit. Untuk menghilangkan sisa trypsin, sel dicuci sekali lagi dengan menggunakan medium yang sama. Kemudian pelet ditambah media kultur sebanyak 1 ml. Selanjutnya lakukan perhitungan jumlah sel dengan menggunakan haemocytometer. Suspensi sel ditambah sejumlah medium sehingga memperoleh konsentrasi sel sebesar 2,5x104/100 μl dan siap dipakai untuk penelitian (Freshney, 1986; Jacoby and Pastan, 1979; Sambrook et al, 1989). 8. Uji sitotoksisitas terhadap sel HeLa dan sel Vero a. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT terhadap sel HeLa Seratus μl suspensi sel HeLa dengan konsentrasi 5 x 104 sel / 200 μl dimasukkan ke dalam sumuran-sumuran pada 96-well plate dan diinkubasi bersama fraksi protein satu seri kadar selama 24 jam. Replikasi dilakukan sebanyak 5 kali dengan memberikan perlakuan yang sama terhadap 11 baris sumuran. Sebagai kontrol, 100 μl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 sedangkan untuk faktor koreksi, 100 μl sampel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium RPMI 1640 dan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2. Selanjutnya sel diinkubasikan dalam inkubator dengan aliran 5% CO2 pada suhu 37ºC. Pada akhir


34

inkubasi, pada masing-masing sumuran ditambahkan 10 μl MTT 5 mg/ml, dan diinkubasi lagi semalam pada suhu 37ºC. Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk kristal formazan berwarna ungu. Reaksi MTT dihentikan dengan penambahan reagen stopper, diinkubasi lagi selama semalam pada suhu kamar. Kemudian serapan dapat dibaca dengan ELISA Reader pada panjang gelombang 550 nm. b. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT terhadap sel Vero Seratus μl suspensi sel Vero dengan konsentrasi 5 x 104 sel / 200 μl dimasukkan ke dalam sumuran-sumuran pada 96-well plate dan diinkubasi bersama fraksi protein satu seri kadar selama 24 jam. Replikasi dilakukan sebanyak 5 kali dengan memberikan perlakuan yang sama terhadap 11 baris sumuran. Sebagai kontrol, 100 μl suspensi sel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium M199 dan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 sedangkan untuk faktor koreksi, 100 μl sampel ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi medium M199 dan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2. Selanjutnya sel diinkubasikan dalam inkubator dengan aliran 5% CO2 pada suhu 37ºC. Pada akhir inkubasi, pada masing-masing sumuran ditambahkan 10 μl MTT 5 mg/ml, dan diinkubasi lagi semalam pada suhu 37ºC. Sel yang hidup akan bereaksi dengan MTT membentuk kristal formazan berwarna ungu. Reaksi MTT dihentikan dengan penambahan reagen stopper, diinkubasi lagi selama semalam pada suhu kamar. Kemudian serapan dapat dibaca dengan ELISA Reader pada panjang gelombang 550 nm.


35

G. Analisis Hasil Prosentase kematian sel pada metode MTT adalah selisih absorbansi kontrol dengan absorbansi perlakuan dibagi absorbansi kontrol dikalikan 100% atau :

Persen kematian =

kontrol - (perlakuan - perlakuan tanpa sel) x 100% kontrol

(Meyer, Ferrigni, Putnam, Jacobsen, Nochols, Mc Laughlin, 1982) Hasil uji berupa prosentase kematian sel tersebut kemudian dianalisis secara statistik menggunakan analisis probit untuk mengetahui konsentrasi protein yang dapat mengakibatkan kematian 50% populasi sel HeLa maupun sel Vero (LC50). Analisis statistik menggunakan uji t-independent sample dilakukan untuk membandingkan daya sitotoksisitas fraksi protein daun mimba terhadap sel HeLa dengan sel Vero.


36

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Preparasi Fraksi Protein Daun Mimba Daun segar tanaman Azadirachta indica A. Juss yang telah dikumpulkan dan diseleksi, dicuci bersih dengan air mengalir supaya pengotor-pengotor yang menempel pada daun dapat dihilangkan. Daun dipotong dari tangkainya, kemudian digerus dengan penambahan larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 yang mengandung 0,14 M NaCl sedikit demi sedikit dalam mortir yang ditempatkan dalam wadah berisi air es. Larutan dapar digunakan untuk menjaga stabilitas, sedangkan kandungan NaCl di dalam larutan dapar tersebut berfungsi untuk mempermudah kelarutan protein yang terkandung di dalam daun tanaman mimba. Penggerusan daun dalam mortir yang ditempatkan dalam wadah berisi air es dimaksudkan untuk menjaga temperatur percobaan supaya protein daun tetap stabil dan tidak mengalami kerusakan. Ekstrak gubal yang diperoleh dari 450 gram daun mimba sebanyak 515 ml. Pembuatan fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) dilakukan dengan cara pengendapan protein menggunakan amonium sulfat. Mekanisme pengendapan protein dengan penambahan amonium sulfat ini disebut salting out. Amonium sulfat memiliki ion anorganik yang berkompetisi dengan molekul protein dalam mengikat air. Amonium sulfat dapat mengikat air lebih banyak daripada protein karena sifat amonium sulfat lebih polar dibandingkan protein sehingga kelarutan protein dalam air menurun dan dapat mengendap.

36


37

Fraksi protein dibuat secara bertingkat dengan menambahkan amonium sulfat dalam jumlah tertentu hingga mencapai kejenuhan 10%, 20%, 30%, dan 40%. Fraksi protein 10% jenuh (FP10) diperoleh dengan menambahkan amonium sulfat sebanyak 27,45 gram ke dalam ekstrak gubal yang pertama kali diperoleh yaitu 515 ml. Fraksi protein 20% jenuh (FP20) diperoleh dengan menambahkan amonium sulfat sebanyak 27,47 gram ke dalam 500 ml ekstrak gubal dari pembuatan fraksi protein 10%. Fraksi protein 30% jenuh (FP30) diperoleh dengan menambahkan amonium sulfat sebanyak 28,35 gram ke dalam 500 ml ekstrak gubal dari pembuatan fraksi protein 20%. Fraksi protein 40% jenuh (FP40) diperoleh dengan menambahkan amonium sulfat sebanyak 29,28 gram ke dalam 500 ml ekstrak gubal dari pembuatan fraksi protein 30%. Fraksi protein yang telah diperoleh kemudian dimurnikan dari amonium sulfat yang ikut terendapkan bersama protein dengan cara dialisis. Tabung dialisis dipanaskan dalam larutan EDTA-NaHCO3 untuk membersihkan tabung dialisis tersebut dari bahan kimia yang tertinggal pada saat pembuatannya. Masingmasing fraksi protein dimasukkan ke dalam tabung dialisis terpisah tetapi direndam di dalam satu beaker glass yang berisi larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 dengan pengadukan menggunakan magnetic stirrer selama semalam dan dijaga suhunya. Hal ini dilakukan supaya kejenuhan tidak hanya terjadi di sekitar tabung dialisis tetapi merata di seluruh isi beaker glass sehingga proses dialisis ini dapat berlangsung sempurna. Proses dialisis terjadi dengan mekanisme difusi pasif karena konsentrasi amonium sulfat di dalam tabung dialisis lebih tinggi daripada di luar tabung dialisis sehingga amonium sulfat akan keluar dari


38

tabung dialisis ke dalam beaker glass yang berisi larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2. Tabung dialisis bersifat semipermeabel dan mempunyai pori yang hanya mengeluarkan partikel-partikel kecil yang berukuran kurang dari 15.00020.000 Dalton, misalnya partikel amonium sulfat, sedangkan protein yang merupakan makromolekul akan tersaring dan tetap tertinggal di dalam tabung dialisis. Pada saat dialisis dilakukan penggantian larutan dapar guna menjaga perbedaan konsentrasi amonium sulfat yang berada di dalam tabung dialisis dan yang berada di luar tabung dialisis tetap besar sehingga konsentrasi amonium sulfat di dalam larutan dapar tidak terlalu jenuh serta mekanisme difusi pasif tetap terjadi. Proses dialisis dilakukan selama satu malam dan diharapkan amonium sulfat dapat dikeluarkan semua dari sampel sehingga diperoleh fraksi protein murni. Penggunaan larutan dapar berfungsi menjaga nilai pH. Nilai pH larutan dapar dipengaruhi oleh perubahan temperatur. Oleh sebab itu, selama proses dialisis temperatur tetap dijaga dengan melakukan dialisis di dalam lemari es.

B. Penetapan Konsentrasi Fraksi Protein Fraksi protein yang telah diperoleh selanjutnya ditetapkan konsentrasinya secara kolorimetri dengan menggunakan spektrofotometer ultraviolet pada panjang gelombang 280 nm dan 260 nm. Metode ini digunakan karena protein di dalam daun mimba mengandung residu asam amino tirosin, triptofan dan fenilalanin yang strukturnya mempunyai kromofor dan auksokrom sehingga mampu mengabsorpsi sinar secara maksimal pada panjang gelombang 280 nm. Penetapan konsentrasi fraksi protein juga dilakukan pada panjang gelombang 260


39

nm sebagai faktor koreksi. Faktor koreksi ini diperlukan untuk mengoreksi adanya senyawa-senyawa lain yang akan terabsorpsi secara maksimal pada panjang gelombang 260 nm seperti asam nukleat beserta komponennya dan senyawasenyawa yang di dalam strukturnya memiliki cincin purin dan pirimidin. Perhitungan konsentrasi protein dapat dilihat pada lampiran. Konsentrasi protein yang diperoleh untuk FP10 adalah 16,40 mg/ml, FP20 adalah 16,15 mg/ml, FP30 adalah 15,94 mg/ml, dan FP40 adalah 9,25 mg/ml.

C. Uji Sitotoksisitas Fraksi Protein Uji sitotoksisitas dilakukan terhadap kultur sel HeLa. Kultur sel HeLa diperoleh dari stok kultur sel HeLa yang telah ditumbuhkan terlebih dahulu di laboratorium hayati Universitas Gadjah Mada. Uji sitotoksisitas menggunakan metode MTT dilakukan dengan cara menginkubasi kultur sel HeLa konsentrasi 5x104 sel/200 µl media dengan 11 seri konsentrasi untuk masing-masing fraksi protein daun mimba selama 24 jam pada suhu 37°C. Selanjutnya MTT ditambahkan ke dalam sumuran berisi sel HeLa dan fraksi protein tersebut, kemudian diinkubasikan kembali selama 24 jam pada suhu 37°C supaya reaksi antara sel HeLa dengan MTT dapat tejadi sempurna. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT ini berdasarkan prinsip pemecahan garam

tetrazolium

MTT

(3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-dipheniltetrazolium

bromide) oleh sistem enzim reduktase suksinat tetrazolium yang terdapat di dalam mitokondria sel membentuk kristal formazan berwarna ungu dan tidak larut. Sel HeLa yang tetap hidup setelah perlakuan dengan senyawa uji dapat membentuk


40

kristal formazan ungu karena aktivitas metabolisme berlangsung secara aktif hanya pada sel hidup. Oleh karena itu, garam tetrazolium MTT yang ditambahkan pada sel hidup akan segera bereaksi dengan cara dipecah oleh enzim reduktase suksinat tetrazolium membentuk kristal formazan ungu di dalam mitokondria sel hidup tersebut. Reaksi pembentukan kristal formazan ini dihentikan dengan menambahkan reagen stopper dan diinkubasikan kembali selama 24 jam pada suhu 37°C. Reagen stopper yang terdiri dari SDS 1% dalam HCl 0,01 N ini berfungsi untuk melarutkan kristal formazan sehingga intensitas warna ungu yang terbentuk dapat dibaca menggunakan ELISA Reader. Alat ELISA Reader ini mampu mengukur intensitas senyawa pada multiwell. Pemilihan metode MTT didasarkan pada keakuratan dan kecepatannya di dalam mengukur absorbansi senyawa yang diukur. Hal ini dikarenakan absorbansi yang terukur pada ELISA Reader berbanding lurus dengan jumlah sel yang masih hidup. Penggunaan ELISA Reader ini membutuhkan waktu singkat, dapat mengurangi subyektivitas peneliti dan mampu mengukur sampel dalam jumlah banyak. Selain itu, metode MTT ini cukup aman dan sederhana karena tidak digunakan bahan-bahan berbahaya serta preparasi dan perlakuan terhadap sampel cukup mudah. Namun demikian, metode MTT ini tidak dapat digunakan untuk sampel-sampel yang memiliki warna sebab akan mempengaruhi absorbansi yang terukur pada ELISA Reader. Senyawa uji yang diperoleh berwarna hijau kecokelatan mempengaruhi pengukuran absorbansi pada ELISA Reader. Oleh karena itu, dilakukan juga pengukuran absorbansi senyawa uji sebagai faktor koreksi untuk meminimalkan


41

gangguan dari warna sampel sehingga akan diperoleh absorbansi yang benarbenar berasal dari warna sel hidup setelah perlakuan dengan senyawa uji. Selain senyawa uji, digunakan juga kontrol negatif yang berisi sel, medium dan larutan dapar natrium fosfat 5mM pH 7,2 supaya dapat diketahui bahwa perlakuan yang diberikan benar-benar berefek terhadap sel HeLa maupun sel Vero.

i

ii

ii i (a)

(b)

Gambar 2. (a) i. Sel HeLa hidup dan ii. Sel HeLa mati tanpa perlakuan. (b) i. Sel Vero hidup dan ii. Sel Vero mati tanpa perlakuan

Sebelum melakukan uji sitotoksisitas menggunakan metode MTT, terlebih dahulu dilakukan pengamatan morfologi baik terhadap sel HeLa maupun sel Vero. Sel HeLa hidup berbentuk seperti daun memanjang dan hidup melekat di dasar flask, sedangkan sel HeLa yang mati berbentuk bulat tidak beraturan dan mengapung di dalam media. Sel Vero hidup berbentuk lonjong dan hidup melekat di dalam dasar flask, sedangkan sel Vero yang mati berbentuk bulat dan mengapung pada media. Perbedaan ciri morfologi antara sel HeLa dengan sel Vero tersebut tampak pada gambar 2.


42

i ii

ii

i

(a)

(b)

Gambar 3. (a) i. Sel HeLa hidup dan ii. Sel HeLa mati setelah perlakuan dengan fraksi protein daun mimba. (b) i. Sel Vero hidup dan ii. Sel Vero mati setelah perlakuan dengan fraksi protein daun mimba

Pada gambar 3 menunjukkan setelah perlakuan dengan fraksi protein daun mimba, jumlah sel HeLa hidup maupun jumlah sel Vero hidup semakin berkurang. Sebaliknya, jumlah sel HeLa mati maupun jumlah sel Vero yang mati semakin bartambah banyak.

ii

ii

i

i

(a)

(b)

Gambar 4. (a) i. Kristal formazan ungu dan ii. Sel HeLa mati setelah perlakuan dengan MTT. (b) i. Kristal formazan ungu dan ii. Sel Vero mati setelah perlakuan dengan MTT


43

Kristal formazan berwarna ungu terbentuk setelah sel HeLa dan Sel Vero di dalam media masing-masing diberikan perlakuan dengan fraksi protein daun mimba dan MTT. Pada gambar 4, tampak baik sel HeLa hidup maupun sel Vero hidup membentuk kristal formazan berwarna ungu, sedangkan sel HeLa yang mati maupun sel Vero yang mati tidak membentuk kristal formazan ungu. Sel Hela dan sel Vero yang mati tetap dalam bentuknya semula seperti saat sebelum ditambahkan MTT yaitu bulat atau tidak beraturan dan berwarna kuning. Sel HeLa dan sel Vero yang telah diberi perlakuan, kontrol dan senyawa uji yang akan digunakan sebagai faktor koreksi diukur absorbansinya menggunakan ELISA Reader pada panjang gelombang 550 nm. Absorbansi yang diperoleh berbanding lurus dengan jumlah sel yang hidup setelah perlakuan. Hasil percobaan menunjukkan sumuran sel yang diberi perlakuan memiliki intensitas warna yang lebih rendah daripada sumuran sel kontrol. Hasil percobaan ini sekaligus menunjukkan bahwa pada sumuran sel perlakuan terdapat lebih banyak sel yang mati daripada sumuran kontrol. Data absorbansi juga menunjukkan bahwa nilai absorbansi perlakuan semakin meningkat sesuai dengan semakin kecilnya kadar protein yang diberikan. Hal-hal tersebut dapat membuktikan bahwa fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) mampu mengakibatkan kematian sel HeLa dan sel Vero. Data yang diperoleh dari uji sitotoksisitas fraksi protein daun mimba terhadap kultur sel HeLa dan sel Vero berupa respon kematian masing-masing sel dalam bentuk prosentase kematian sel. Tabel I berikut menunjukkan prosentase kematian sel HeLa seteleh diberi senyawa uji FP10, FP20, FP30 dan FP40 daun


44

mimba dengan konsentrasi terkecil 0,20 µg/ml dan konsentrasi tertinggi 200 µg/ml pada masing-masing fraksi protein. Gambar 5 menunjukkan grafik antara prosentase kematian sel HeLa dengan konsentrasi fraksi protein daun mimba.

Tabel I. Prosentase kematian dari uji sitotoksisitas fraksi protein terhadap sel HeLa

Konsentrasi fraksi protein daun mimba (µg/ml) 0,20 0,39 0,78 1,56 3,13 6,25 12,50 25,00 50,00 100,00 200,00

FP10

Rata-rata Persen Kematian Sel HeLa ( % ) FP20 FP30 FP40

52,67 59,72 56,13 58,01 71,36 63,28 62,11 56,54 45,16 114,58 131,94

63,19 70,54 59,41 66,89 69,27 65,93 69,36 74,72 78,78 89,70 74,86

85,50 86,70 85,54 94,09 97,10 90,35 84,60 97,55 105,16 110,46 89,48

57,60 58,92 68,26 78,89 94,91 87,47 79,25 88,38 73,32 90,56 121,76

Grafik % Kematian Sel HeLa 140

% Kematian

120 100

FP10

80

FP20

60

FP30

40

FP40

20 0 0.2 0.39 0.78 1.56 3.13 6.25 12.5 25

50 100 200

Konsentrasi (μ g/ml)

Gambar 5. Grafik prosentase kematian sel HeLa vs konsentrasi fraksi protein daun mimba (µg/ml).


45

Berdasarkan tabel I dan gambar 5 grafik prosentase kematian sel HeLa yang telah diberi perlakuan dengan masing-masing fraksi protein pada 11 seri konsentrasi

menunjukkan

bahwa

fraksi

protein

daun mimba

memiliki

sitotoksisitas yang besar terhadap kultur sel HeLa. Pada perlakuan dengan FP10 dan FP40, grafik cenderung mengalami kenaikan, sedangkan perlakuan dengan FP20 dan FP30, grafik cenderung menurun meskipun nilai prosentase kematian fluktuatif yang berarti peningkatan konsentrasi fraksi protein tidak selalu diikuti oleh peningkatan prosentase kematian sel HeLa. Nilai yang fluktuatif ini menyebabkan tidak dapat ditarik suatu korelasi hubungan antara prosentase kematian sel HeLa dan konsentrasi fraksi protein. Hal ini terjadi karena kematian alami sel HeLa sebagai subjek uji yang merupakan variabel pengacau tak terkendali yang dapat mempengaruhi hasil uji. Pada penelitian yang dilakukan oleh Suwanto (2006) memberikan hasil bahwa fraksi protein daun mimba 30% dan 60% berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker. Namun respon uji % kematian yang diperoleh juga fluktuatif sehingga perlu dilakukan ekstrapolasi untuk mengetahui nilai LC50. Nilai LC50 merupakan konsentrasi fraksi protein daun mimba yang mampu membunuh 50% dari populasi sel. Analisis regresi probit dilakukan untuk mengetahui nilai LC50 dari tiap fraksi protein. Pada perlakuan terhadap sel HeLa nilai LC50 FP10 sebesar 1,5.107 µg/ml yang menunjukkan bahwa FP10 daun mimba tidak mempunyai potensi untuk dikembangkan menjadi senyawa antikanker sebab nilai LC50 yang diperoleh lebih besar dari 20 µg/ml. Pada perlakuan terhadap sel HeLa nilai LC50 untuk FP20 sebesar 6.10-3 µg/ml; FP30 sebesar 3,7.10-13 µg/ml dan

46


FP40 sebesar 1,8.10-2 µg/ml yang berarti lebih kecil dari 20 µg/ml. Hasil tersebut menunjukkan

bahwa

FP20,

FP30

dan

FP40

mempunyai

potensi

untuk

dikembangkan menjadi senyawa antikanker. Penelitian sebelumnya (Suwanto, 2006) memperoleh nilai LC50 sebesar 1,0 µg/ml untuk fraksi protein 30% dan 4,1 µg/ml untuk fraksi protein 60%. Hasil tersebut berbeda dengan LC50 yang diperoleh pada penelitian ini terutama pada fraksi protein 30% (FP30) yaitu 3,7.10-13 µg/ml. Hal ini diduga disebabkan kandungan protein dalam FP30 pada penelitian ini berbeda dengan protein yang ada di dalam fraksi protein 30% pada penelitian sebelumnya (Suwanto, 2006). Berdasarkan nilai r square, maka dapat dinyatakan bahwa FP10 daun mimba mempengaruhi respon kematian sel HeLa sebesar 1,8%, FP20 mimba mempengaruhi respon kematian sel HeLa sebesar 53,1%, FP30 mimba mempengaruhi respon kematian sel HeLa sebesar 9,2% dan FP40 mimba mempengaruhi respon kematian sel HeLa sebesar 37,8%.

Tabel II. Prosentase kematian dari uji sitotoksisitas fraksi protein terhadap sel Vero

Konsentrasi fraksi protein daun mimba (µg/ml) 0,20 0,39 0,78 1,56 3,13 6,25 12,50 25,00 50,00 100,00 200,00

FP10 66,88 64,96 56,89 71,44 63,82 66,04 75,06 60,73 73,62 70,65 84,79

Rata-rata Persen Kematian Sel Vero ( % ) FP20 FP30 FP40 93,45 85,33 77,10 79,35 80,01 73,63 69,91 67,59 65,56 70,43 75,13

63,66 68,93 67,71 69,34 76,81 82,06 78,38 85,49 90,60 79,88 89,50

82,75 79,64 85,06 75,84 77,03 70,07 66,81 79,22 85,14 73,39 74,41


47

Grafik % Kematian Sel Vero 100

% Kematian

80 FP10 60

FP20

40

FP30 FP40

20 0 0.2 0.39 0.78 1.56 3.13 6.25 12.5 25

50 100 200

Konsentrasi (μ g/ml )

Gambar 6. Grafik prosentase kematian sel Vero vs konsentrasi fraksi protein daun mimba (µg/ml).

Berdasarkan tabel II dan gambar 6 grafik prosentase kematian sel Vero yang telah diberi perlakuan dengan masing-masing fraksi protein pada 11 seri konsentrasi

menunjukkan

bahwa

fraksi

protein

daun mimba

memiliki

sitotoksisitas terhadap kultur sel Vero. Pada perlakuan dengan FP10 dan FP30, grafik cenderung mengalami kenaikan, sedangkan perlakuan dengan FP20 dan FP40, grafik cenderung menurun meskipun nilai prosentase kematian fluktuatif yang berarti peningkatan konsentrasi fraksi protein tidak selalu diikuti oleh peningkatan prosentase kematian sel Vero. Nilai yang fluktuatif ini menyebabkan tidak dapat ditarik suatu korelasi hubungan antara prosentase kematian sel Vero dan konsentrasi fraksi protein. Hal ini terjadi karena kematian alami sel Vero sebagai subjek uji yang merupakan variabel pengacau tak terkendali yang dapat mempengaruhi hasil uji.


48

Respon uji % kematian sel Vero yang diperoleh juga fluktuatif sehingga perlu dilakukan ekstrapolasi untuk mengetahui nilai LC50. Analisis regresi probit dilakukan untuk mengetahui nilai LC50 dari tiap fraksi protein. Pada perlakuan terhadap sel Vero nilai LC50 FP20 sebesar 1,2.104 µg/ml dan FP40 sebesar 2,3.1011 µg/ml yang menunjukkan bahwa FP20 dan FP40 daun mimba mempunyai potensi untuk dikembangkan menjadi senyawa antikanker sebab nilai LC50 yang diperoleh > 20 µg/ml dan lebih besar dari nilai LC50 FP20 dan FP40 daun mimba terhadap sel HeLa. Pada perlakuan terhadap sel Vero nilai LC50 untuk FP10 sebesar 1,2.10-3 µg/ml dan FP30 sebesar 1,2.10-2 µg/ml yang berarti < 20 µg/ml. Hasil tersebut menunjukkan

bahwa

FP10

dan

FP30

tidak

mempunyai

potensi

untuk

dikembangkan menjadi senyawa antikanker karena LC50 FP10 terhadap sel Vero < 20 µg/ml dan lebih kecil dari LC50 FP10 terhadap sel HeLa yang berarti FP10 daun mimba lebih toksik terhadap sel Vero (sel normal) dibandingkan sel HeLa, seddangkan LC50 FP30 terhadap sel Vero lebih besar dibandingkan sel HeLa tetapi nilai LC50 FP30 pada sel Vero < 20 µg/ml. Berdasarkan nilai r square, maka dapat dinyatakan bahwa FP10 daun mimba mempengaruhi respon kematian sel Vero sebesar 37,3%, FP20 mimba mempengaruhi

respon

kematian

sel

Vero

sebesar

62%,

FP30

mimba

mempengaruhi respon kematian sel Vero sebesar 79,6% dan FP40 mimba mempengaruhi respon kematian sel Vero sebesar 12,5%. Bila hasil prosentase kematian sel HeLa pada tabel I dibandingkan dengan sel Vero pada tabel II maka prosentase kematian sel Vero setelah perlakuan dengan fraksi protein daun mimba cenderung lebih besar daripada sel HeLa,


49

seperti pada FP10 dengan konsentrasi terkecil yaitu 0,2 μg/ml mampu membunuh sel Vero 66,88%; sedangkan terhadap sel HeLa mampu membunuh sebanyak 52,67%. Selain itu, nilai LC50 yang telah diketahui melalui analisis probit kemudian dihitung secara statistik untuk menentukan distribusi dari masingmasing kelompok uji. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa setiap fraksi memiliki distribusi normal dalam setiap perlakuan sebab nilai p > 0,05. Oleh karena itu, dapat dilanjutkan analisis menggunakan uji t-independent sample untuk membandingkan sitotoksisitas fraksi protein terhadap sel HeLa dengan sel Vero secara statistik. Hasil uji t-independent sample menunjukkan bahwa p > 0,05 pada setiap fraksi. Hal ini berarti sitotoksisitas masing-masing fraksi protein daun mimba terhadap sel HeLa berbeda tidak bermakna dengan sitotoksisitasnya terhadap sel Vero. Berdasarkan analisis hasil yang telah dilakukan maka fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30 dan FP40 mempunyai kemampuan yang sama dalam hal menginduksi kematian sel kanker (sel HeLa) dan sel normal (sel Vero) sehingga tidak memiliki potensi untuk dikembangkan lebih lanjut sebagai antikanker. Hasil yang diperoleh dari penelitian ini ternyata sama dengan penelitian serupa yang juga telah dilakukan yaitu, penelitian sitotoksisitas fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30 dan FP40 terhadap sel myeloma (Purnamasari, 2007) yang menyatakan bahwa FP10, FP20, FP30 dan FP40 daun mimba tidak berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker. Hasil yang sama juga ditunjukkan pada penelitian sitotoksisitas fraksi protein FP30, FP40, FP50 dan FP60 terhadap sel HeLa


50

(Puspitaningrum, 2007), begitu pula hasil penelitian serupa terhadap sel myeloma (Saptawati, 2007) Namun hasil yang berbeda ditunjukkan pada penelitian sitotoksisitas fraksi protein FP10, FP20, FP30 dan FP40 terhadap kultur sel Raji (Lahrita, 2006) yang menyatakan bahwa FP20 daun mimba berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker dengan LC50 terhadap sel Raji 2,4.10-11 μg/ml dan LC50 terhadap sel Vero 1,1.104 μg/ml, juga pada penelitian serupa terhadap sel SiHa (Harsono, 2007) yang menyatakan bahwa FP20 daun mimba berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker dengan LC50 terhadap sel SiHa 0,48 μg/ml dan LC50 terhadap sel Vero 11,4.103 μg/ml. Hasil berbeda juga ditunjukkan pada pada penelitian sitotoksisitas fraksi protein FP30, FP40, FP50 dan FP60 terhadap kultur sel Raji (Jenny, 2007) yang menyatakan bahwa FP60 daun mimba berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker dengan LC50 terhadap sel Raji 9,71 x 10-3 μg/ml dan LC50 terhadap sel Vero 4,85 x 10-2 μg/ml, begitu pula hasil penelitian serupa terhadap sel SiHa (Mellina, 2007) yang menyatakan bahwa FP40 daun mimba berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker dengan LC50 terhadap sel SiHa 0,45 μg/ml dan LC50 terhadap sel Vero > 1 g/ml. Apabila dibandingkan dengan penelitian Suwanto (2006) yang meneliti mengenai fraksi protein daun mimba 30%, 60% dan 100% dengan kesimpulan bahwa fraksi 30% dan 60% berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker maka pada penelitian kali ini diketahui bahwa FP10, FP20, FP30 dan FP40 daun mimba terutama FP30 tidak berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker. Nilai LC50 dari FP30 pada sel HeLa < 20 µg/ml tetapi LC50 FP30 pada sel Vero


51

juga < 20 µg/ml sehingga FP30 memiliki kemampuan yang sama dalam menginduksi kematian sel HeLa dan sel Vero. Suatu senyawa dapat digunakan sebagai antikanker bila memiliki LC50 ≤ 20 µg/ml (Suffness and Pezzuto, 1991). Selain itu, senyawa tersebut harus selektif yaitu mampu menekan atau membunuh sel kanker tanpa merusak sel normal tubuh. Suatu penelitian mengenai efek antihepatotoksik rebusan daun mimba (Azadirachta indica A. Juss.) pada mencit jantan dengan metode pengukuran waktu tidur heksobarbital (Murdiana, 2000) menyimpulkan bahwa rebusan daun mimba pada kisaran dosis 18,2-72,8 mg/kg berat badan mempunyai efek antihepatotoksik terhadap induksi karbon tetraklorida. Diduga rebusan daun mimba mengandung asam amino penyusun protein, sedangkan protein adalah bahan penyusun enzim sehingga rebusan daun mimba mampu menggantikan enzim-enzim yang terlepas oleh induksi karbon tetraklorida dan asam amino yang berasal dari rebusan daun mimba dapat memperbaiki fungsi hati terutama Multi Function Oxidase (MFO) dan sitokrom P-450. Jika dibandingkan dengan penelitian tersebut, maka fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30 dan FP40 dalam penelitian ini sebaiknya digunakan secara hati-hati pada pengobatan kanker.

Namun,

bila

digunakan

untuk

pengobatan

yang

lain

seperti

hepatoprotektor berdasarkan beberapa penelitian salah satunya yang dilakukan oleh

Murdiana

(2000)

maka

daun

mimba

dapat

digunakan

sebagai

hepatoprotektor. Penelitian ini menggunakan waktu 24 jam untuk inkubasi sel HeLa maupun sel Vero dengan fraksi protein dan MTT. Apabila enzim mitokondria


52

masih berfungsi meskipun sel sudah mati maka MTT akan tetap tereduksi oleh enzim tersebut membentuk kristal formazan ungu. Oleh sebab itu, terdapat dugaan bahwa lama waktu inkubasi turut mempengaruhi hasil penelitian. Jenis protein yang bersifat sitotoksik di dalam daun mimba ini maupun mekanisme aktivitas sitotoksiknya terhadap sel HeLa dan sel Vero belum dapat ditentukan secara pasti. Namun demikian, berdasarkan cara isolasi protein yang dilarutkan ke dalam larutan dapar mengandung garam, maka diduga protein yang memiliki aktivitas sitotoksik adalah protein yang dapat larut dalam pelarut tersebut yaitu protein albumin, globulin, atau histon.


53

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan 1. Fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP10, FP20, FP30 dan FP40 memiliki sitotoksisitas terhadap kultur sel HeLa dan sel Vero. 2. Nilai LC50 fraksi protein daun mimba terhadap sel HeLa untuk FP10 sebesar 1,5.107 µg/ml; FP20 sebesar 6.10-3 µg/ml; FP30 sebesar 3,7.10-13 µg/ml dan FP40 sebesar 1,8.10-2 µg/ml, sedangkan nilai LC50 fraksi protein daun mimba terhadap sel Vero FP10 sebesar 1,2.10-3 µg/ml; FP20 sebesar 1,2.104 µg/ml; FP30 sebesar 1,2.10-2 µg/ml dan FP40 sebesar 2,3.1011 µg/ml. 3. Fraksi protein daun mimba FP10, FP20, FP30 dan FP40 tidak berpotensi untuk dikembangkan sebagai antikanker.

B. Saran 1. Perlu dilakukan penelitian yang sama dengan waktu inkubasi sel dan fraksi protein lebih dari 24 jam. 2. Perlu dilakukan penelitian mengenai jenis-jenis protein daun mimba yang memiliki mekanisme sitotoksisitas terhadap sel HeLa dan mekanisme perlindungan terhadap sel normal.

53


54

DAFTAR PUSTAKA Anonim, 2005a, Neem, http://encyclopedia.thefreedictionary.com/Neem. Diakses pada 27 Januari 2006 Anonim, 2005b, Cancer, http://encyclopedia.thefreedictionary.com/Cancer. Diakses pada 27 Januari 2006 Anonim, 2006a, Methods for Concentrating Protein Solutions, Protein Concentration,http://sbio.uct.ac.za/Sbio/documentation/Protein%20Conce ntration.html. Diakses 9 Oktober 2006 Anonim, 2006b, Normal African Green Monkey Kidney Epithelial Cells (Vero line),http://www.olympusmicro.com/primer/techniques/fluorescence/galler y/cells/vero/verocells.html, Diakses pada 5 Febuari 2006 Anonim, 2007a, Cervical Cancer, http://en.wikipedia.org/wiki/Cervical_cancer, Diakses pada 6 Februari 2007 Anonim, 2007b, HeLa, http://en.wikipedia.org/wiki/HeLa, Diakses pada 6 Februari 2007 Ariyani, 2004, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss.) Terhadap Kultur Sel Raji, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Backer, C.A. dan Bakhuizen Van Den Brink, R.C., 1963, Flora of Java, Vol I, 312, N.V.P. Noordhoof, Groningen, The Netherlands Backer, C.A. dan Bakhuizen Van Den Brink, R.C., 1965, Flora of Java, Vol II, 116-117, 121, N.V.P. Noordhoof, Groningen, The Netherlands Barile, F.A., 1997, Invitro: Methods in Pharmaceutical Research, 2-3, 34-43, Academic Press, Valencia, Spanyol Candra, 2006, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss.) Hasil Pengendapan dengan Amonium Sulfat 30%, 60% dan 100% Jenuh Terhadap Kultur Sel SiHa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Cassaret, J.M. and Doull, J., 2001, Toxicology, The Basic Science of Poison, 27, MacMilan Publishing, Co.Inc., New York Dasgupta, A., 1992, Modern Immunology: Basic, Clinical, Laboratory, Jaypee Brothers Medical Publisher Ltd., New Delhi


55

Febriani, A.C., 2004, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss.) Terhadap Kultur Sel HeLa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Fenty, 2000, Kanker Leher Rahim, dalam Yuswanto, Ag. dan Sinaradi, F., Kanker, 1-13, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Freshney, R.I., 1986, Culture of Animal Cell: a Manual of Basic Technique, second (2nd) Ed, 3-10, 183-197, Liss. Inc, New York Ganiswarna, S.G. dan Nafrialdi, 1995, Antikanker dan Imunosupresan, 686-701, dalam Ganiswarna, S.G., (Ed), Farmakologi dan Terapi, Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran, Universitas Indonesia, Jakarta Gennaro, A.R., 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, 757-762, Philadelphia College of Pharmacy and Science, Philadelphia Hariadi A., 2006, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss.) Hasil Pengendapan dengan Amonium Sulfat 30%, 60% dan 100% Jenuh Terhadap Kultur Sel Myeloma, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Harsono, V.K., 2007, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss.) FP10, FP20, FP30 dan FP40 Terhadap Kultur Sel SiHa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Hartono, A., 1999, Terapi Nutrisi dan Herbal untuk http://www.indomedia.com/intisari/1999/oktober/b1_terapi.htm. pada 27 Februari 2006

Kanker, Diakses

Hutapea, J., 1993, Inventaris Tanaman Obat Indonesia, 67-68, Badan Litbang Kesehatan, Departemen Kesehatan Republik Indonesia Ichim, C.V., 2005, Revisiting immunosurveillance and immunostimulation: Implications For Cancer Immunotherapy, Volume 3, 1-14, Journal Of Translational Medicine, http://www.translationalmedicine.com/content/3/1/8, Diakses pada 27 Maret 2007 Jacoby, W.B. and Pastan, I.H., 1979, Methods in Enzymology Cell Culture, Volume VIII, Academia Press Inc, New York Jenny, 2007, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss.) FP30, FP40, FP50 dan FP60 Terhadap Kultur Sel Raji, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta


56

Kardinan, A. dan Taryono, 2003, Tanaman Obat Penggempur Kanker, 22-29, PT Agromedia Pustaka, Jakarta Kuswibawati, L., 2000, Apa itu Kanker?, dalam Yuswanto, Ag. dan Sinaradi, F., Kanker, 29-35, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Lahrita, L., 2007, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss.) FP10, FP20, FP30 dan FP40 Terhadap Kultur Sel Raji, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Lusia, S.W.K., 2004, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss.) Terhadap Kultur Sel HeLa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Mellina, B., 2007, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss.) FP30, FP40, FP50 dan FP60 Terhadap Kultur Sel SiHa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Meyer, B.N., Ferrigni, N.R., Putnam, J.E., Jacobsen, L.B., Nochols, D.E., and Mc Laughlin, J.L., 1982, Brine Shrimp: A Convenient General Bioassay for Active Plant Concenient, Volume 45, 32-34, Planta Medica Moran, L.A., Scrimgeur, K.G., Horton, H.R., Ochs, R.S. and Rawn, J.D., 1994, Biochemistry, 2nd ed, 4.18, 5.1-5.3, Neil Patterson Publisher/Prentice Hall Inc., London Mulyadi, 1996, Kanker: Karsinogen, Karsinogenesis dan Antikanker, 93-98, Tiara Wacana, Yogyakarta Murdiana, H.E., 2000, Efek Antihepatotoksik Rebusan Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss.) Pada Mencit Jantan dengan Metode Pengukuran Waktu Tidur Heksobarbital, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Murray, R.F., Granner, D.K., Mayes, P.A. and Rodwell, V.W., 1995, Biokimia Harper, ed 22, 47, 52, 53, alih bahasa: Hartono, A., EGC, Jakarta Purnamasari, A., 2007, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss.) FP10, FP20, FP30 dan FP40 Terhadap Kultur Sel Myeloma, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Puspitaningrum, L.E., 2007, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss.) FP30, FP40, FP50 dan FP60 Terhadap Kultur Sel HeLa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta


57

Rang, H.P., Dale, M.M., Ritter, J.M. and Moore, P.K., 2003, Pharmacology, fifth (5th) Ed, 693-696, Elsevier Science, London, UK Richterich, R. and Colombo, J.P., 1981, Clinical Chemistry: Theory, Practice, and Interpretation, 408, John Wiley & Sons, Ltd, New York, USA Robbyono, 2006, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss.) Hasil Pengendapan dengan Amonium Sulfat 30%, 60% dan 100% Jenuh Terhadap Kultur Sel Raji, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Robinson, T., 1991, Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi, 245-254, Penerbit ITB, Bandung Sakidja, M.S., 1989, Kimia Pangan, 204, Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi, Jakarta Sambrook, Fritsch, E.F. and Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Coldspring Harbor Laboratory Press Saptawati, A.Y.E., 2007, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss.) FP30, FP40, FP50 dan FP60 Terhadap Kultur Sel Myeloma, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Schwartz, B.D., 1991, Immunology, 218, The UpJohn Company, Kalamazoo, Michigan Suffness, M. and Pezzuto, J.M., 1991, Assays Related to Cancer Drug Discovery, Methods in Plant Biochemistry: Assay for Bioactivity, Vol. 6, Academic Press, London Sukrasno, 2003, Mimba: Tanaman Obat Multifungsi, 1-10, 20-30, PT Agromedia Pustaka, Jakarta Suwanto, N.B., 2006, Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss.) Hasil Pengendapan dengan Amonium Sulfat 30%, 60% dan 100% Jenuh Terhadap Kultur Sel HeLa, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta Widiyani, L.R., 2005, Uji Sitotoksisitas Senyawa (2E)-3 (4’-Hidroksi-3’metoksifenil)-1-(4”-metoksifenil)prop-2-en-1-on dan Calkon Terhadap Sel HeLa dan Sel Vero, Skripsi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta


58

LAMPIRAN

Lampiran 1. Jumlah penambahan amonium sulfat pada derajat kejenuhan tertentu Tabel III. Volume larutan ekstrak gubal protein daun mimba

Fraksi Protein FP10 FP20 FP30 FP40

Volume Ekstrak (ml) 515 500 500 500

Pada kondisi percobaan tertentu yaitu percobaan pada suhu 4°C maka jumlah amonium sulfat yang ditambahkan dihitung menggunakan rumus: G= G S1 S2

533(S2 - S1) (100 - 0,3.S1)

= Jumlah amonium sulfat yang ditambahkan per 1 liter larutan (g) = derajat kejenuhan awal = derajat kejenuhan akhir (Anonim, 2006a)

a. Jumlah amonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai derajat kejenuhan 10% dari kejenuhan total 533(10 - 0) (100 - 0,3.0) = 53,30 g dalam 1 liter

G =

515 ml x 53,30 g 1000 ml = 27,45 g dalam 515 ml

G =

Jumlah amonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai kejenuhan 10% (FP10) = 27,45 g b. Jumlah amonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai derajat kejenuhan 20% dari kejenuhan total


59

533(20 - 10) (100 - 0,3.10) = 54,95 g dalam 1 liter 500 ml G = x 54,95 g 1000 ml = 27,47 g dalam 500 ml G =

Jumlah amonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai kejenuhan 20% (FP20) = 27,47 g c. Jumlah amonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai derajat kejenuhan 30% dari kejenuhan total 533(30 - 20) (100 - 0,3.20) = 56,70 g dalam 1 liter

G =

500 ml x 56,70 g 1000 ml = 28,35 g dalam 500 ml

G =

Jumlah ammonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai kejenuhan 30% (FP30) = 28,35 g d. Jumlah amonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai derajat kejenuhan 40% dari kejenuhan total 533(40 - 30) (100 - 0,3.30) = 58,57 g dalam 1 liter

G =

500 ml x 58,57 g 1000 ml = 29,28 g dalam 500 ml

G =

Jumlah ammonium sulfat yang ditambahkan untuk mencapai kejenuhan 40% (FP40) = 29,28 g


60

Lampiran 2. Perhitungan konsentrasi protein Perhitungan menurut Layne: Concentration = [1.55E(280)] – [0.76E(260)] mg ml-1 (Layne cit., Richterich and Colombo, 1981) Tabel IV. Absorbansi fraksi protein pada panjang gelombang 280 nm dan 260 nm Fraksi protein daun mimba

Absorbansi pada λ 280 nm

Absorbansi pada λ 260 nm

FP10 FP20 FP30 FP40

0,197 0,191 0,223 0,195

0,186 0,177 0,245 0,276

Faktor pengenceran = 100 kali a. Konsentrasi FP10 = (1,55 x 0,197) - (0,76 x 0,186) = 0,16399 mg/ml x 100 = 16,399 mg/ml b.Konsentrasi FP20 = (1,55 x 0,191) - (0,76 x 0,177) = 0,16153 mg/ml x 100 = 16,153 mg/ml c. Konsentrasi FP30 = (1,55 x 0,223) - (0,76 x 0,245) = 0,15945 mg/ml x 100 = 15,945 mg/ml d. Konsentrasi FP40 = (1,55 x 0,195) - (0,76 x 0,276) = 0,09249 mg/ml x 100 = 9,249 mg/ml

61


Lampiran 3. Absorbansi sel dengan metode MTT A. Sitotoksisitas fraksi protein daun mimba terhadap sel HeLa Tabel V. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP10 terhadap kultur sel HeLa Absorbansi Konsentrasi fraksi protein (µg/ml)

Perlakuan

0.2

0.39

0.78

1.56

3.13

6.25

12.5

25

50

100

200

Kontrol

I

1.033

1.104

1.108

1.016

0.863

0.98

0.831

1.008

0.797

0.819

0.669

0.869

II

0.944

0.844

0.882

0.829

0.855

0.902

0.841

0.871

1.681

0.822

0.7

0.841

III

0.957

0.642

0.879

0.823

0.778

0.792

0.791

0.85

0.785

0.664

0.681

0.919

IV

1.095

1.08

1.042

1.013

0.843

0.865

0.9

0.821

0.817

0.806

0.675

0.939

V

0.854

0.88

0.856

0.876

0.886

0.837

0.844

0.875

0.815

0.758

0.678

0.942

0.977

0.91

0.953

0.911

0.845

0.875

0.841

0.885

0.979

0.774

0.681

0.902

I

0.521

0.521

0.53

0.504

0.513

0.497

0.451

0.477

0.45

0.442

0.525

II

0.541

0.526

0.545

0.539

0.548

0.542

0.486

0.471

0.468

0.467

0.503

III

0.587

0.593

0.598

0.555

0.699

0.593

0.562

0.531

0.535

1.807

1.878

0.550

0.547

0.558

0.533

0.587

0.544

0.500

0.493

0.484

0.905

0.969

Rata-rata

Perlakuan tanpa sel

Rata-rata

Tabel VI. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP20 terhadap kultur sel HeLa Absorbansi Konsentrasi fraksi protein (µg/ml)

Perlakuan

0.2

0.39

0.78

1.56

3.13

6.25

12.5

25

50

100

200

Kontrol

I

0.951

0.973

0.992

0.937

0.931

0.921

0.901

0.83

0.763

0.663

0.622

0.986

II

1.064

0.981

0.94

1.048

0.916

0.929

0.903

0.839

0.767

0.705

0.596

1.001

III

1.184

0.799

1.163

0.879

0.916

0.958

0.88

0.827

0.77

0.688

1.818

0.993

IV

0.969

0.947

0.939

0.909

0.896

0.871

0.861

0.817

0.705

0.584

0.529

0.998

V

0.984

0.941

0.938

0.935

0.927

0.905

0.865

0.818

0.714

0.573

0.474

1.004

1.030

0.928

0.994

0.942

0.917

0.917

0.882

0.826

0.744

0.643

0.808

0.996

I

0.605

0.61

0.577

0.611

0.578

0.557

0.542

0.506

0.501

0.528

0.549

II

0.725

0.638

0.524

0.562

0.599

0.531

0.572

0.644

0.542

0.533

0.57

III

0.661

0.656

0.669

0.662

0.656

0.644

0.616

0.573

0.554

0.559

0.553

0.664

0.635

0.59

0.612

0.611

0.577

0.577

0.574

0.532

0.54

0.557

Rata-rata

Perlakuan tanpa sel

Rata-rata

62


Tabel VII. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP30 terhadap kultur sel HeLa Absorbansi Konsentrasi fraksi protein (µg/ml)

Perlakuan

0.2

0.39

0.78

1.56

3.13

6.25

12.5

25

50

100

200

Kontrol

I

0.776

0.755

0.822

0.776

0.772

0.755

0.743

0.75

0.805

0.747

0.657

0.825

II

0.743

0.745

0.774

0.775

0.797

0.83

0.82

0.826

0.796

0.71

1.684

0.779

III

0.782

0.731

0.731

0.796

0.766

0.743

0.903

0.886

0.907

0.686

0.978

0.976

IV

0.773

0.728

0.711

0.746

0.764

0.76

0.731

0.723

0.702

0.733

1.813

0.953

V

0.729

0.69

0.705

0.755

0.731

0.73

0.72

0.707

0.693

0.694

0.667

0.832

0.761

0.73

0.749

0.77

0.766

0.764

0.783

0.778

0.781

0.714

1.16

0.873

I

0.558

0.568

0.552

0.512

0.637

0.569

0.639

0.952

1.146

1.183

0.957

II

0.603

0.598

0.616

0.645

0.67

0.697

0.538

0.594

0.711

0.647

1.689

III

0.741

0.675

0.699

0.997

0.915

0.772

0.77

0.725

0.62

0.586

0.558

0.634

0.614

0.622

0.718

0.741

0.679

0.649

0.757

0.826

0.805

1.068

Rata-rata

Perlakuan tanpa sel

Rata-rata

Tabel VIII. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP40 terhadap kultur sel HeLa Absorbansi Konsentrasi fraksi protein (µg/ml)

Perlakuan

0.2

0.39

0.78

1.56

3.13

6.25

12.5

25

50

100

200

Kontrol

I

1.116

0.988

1.073

1.021

0.824

0.827

0.792

0.813

0.733

0.662

0.529

0.878

II

0.855

0.873

0.832

0.848

0.817

0.821

0.794

0.797

0.691

0.596

0.392

0.878

III

0.882

0.804

0.831

0.767

0.905

0.774

1.003

0.921

0.751

0.592

0.352

0.914

IV

0.947

1.044

0.823

0.719

0.553

0.642

0.859

0.745

0.803

0.736

0.419

0.892

V

1.029

1.075

0.761

0.782

0.834

0.921

0.845

0.787

0.707

0.639

0.352

0.854

0.966

0.957

0.864

0.827

0.787

0.797

0.859

0.813

0.737

0.645

0.409

0.883

I

0.57

0.56

0.579

0.699

0.788

0.875

0.577

0.778

0.464

0.566

0.522

II

0.552

0.573

0.557

0.583

0.564

0.502

0.519

0.531

0.521

0.497

0.648

III

0.652

0.649

0.615

0.641

0.873

0.682

0.93

0.821

0.519

0.622

0.633

0.591

0.594

0.584

0.641

0.742

0.686

0.675

0.71

0.501

0.562

0.601

Rata-rata

Perlakuan tanpa sel

Rata-rata

63


B. Sitotoksisitas fraksi protein daun mimba terhadap sel Vero Tabel IX. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP10 terhadap kultur sel Vero Absorbansi Konsentrasi fraksi protein (µg/ml)

Perlakuan

0.2

0.39

0.78

1.56

3.13

6.25

12.5

25

50

100

200

Kontrol

I

0.893

0.842

1.14

1.149

1.175

0.869

0.905

0.895

0.873

0.79

0.699

0.872

II

0.867

0.858

0.857

0.88

0.889

0.883

0.898

0.849

0.869

0.853

0.659

0.918

III

0.879

0.861

0.781

0.849

0.884

0.803

0.88

0.869

0.844

0.806

0.738

0.853

IV

1.165

1.117

0.99

0.819

0.919

0.875

0.877

0.896

0.852

0.827

0.716

1.05

V

0.873

0.871

0.782

0.852

0.906

0.874

0.879

0.871

0.844

0.846

0.768

0.908

0.935

0.91

0.91

0.91

0.955

0.861

0.888

0.876

0.856

0.824

0.716

0.920

I

0.608

0.594

0.617

0.633

0.613

0.643

0.666

0.545

0.722

0.6

0.594

II

0.642

0.602

0.393

0.678

0.648

0.641

0.657

0.606

0.591

0.575

0.508

III

0.642

0.566

0.53

0.63

0.604

0.361

0.652

0.393

0.528

0.488

0.626

0.631

0.587

0.513

0.647

0.622

0.548

0.658

0.515

0.614

0.554

0.576

Rata-rata

Perlakuan tanpa sel

Rata-rata

Tabel X. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP20 terhadap kultur sel Vero Absorbansi Konsentrasi fraksi protein (µg/ml)

Perlakuan

0.2

0.39

0.78

1.56

3.13

6.25

12.5

25

50

100

200

Kontrol

I

0.879

0.892

0.866

0.862

0.89

0.934

0.857

0.884

0.853

0.844

0.769

0.904

II

0.9

0.819

0.901

0.876

0.903

0.932

0.868

0.88

0.88

0.828

0.818

0.852

III

0.931

0.886

0.776

0.89

0.916

0.848

1.093

1.102

1.151

0.966

0.932

0.924

IV

0.889

0.88

0.851

0.845

0.855

0.91

0.841

1.012

0.829

0.854

0.818

1.122

V

0.891

0.921

0.886

0.803

0.904

0.841

0.818

0.866

0.841

0.855

0.825

0.957

0.898

0.88

0.856

0.855

0.894

0.893

0.895

0.949

0.911

0.869

0.832

0.952

I

0.844

0.87

0.615

0.633

0.737

0.639

0.598

0.666

0.556

0.555

0.586

II

0.939

0.685

0.619

0.621

0.676

0.593

0.601

0.631

0.61

0.564

0.59

III

0.724

0.665

0.68

0.722

0.697

0.694

0.628

0.624

0.583

0.645

0.611

0.836

0.74

0.638

0.659

0.703

0.642

0.609

0.640

0.583

0.588

0.596

Rata-rata

Perlakuan tanpa sel

Rata-rata

64


Tabel XI. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP30 terhadap kultur sel Vero Absorbansi Konsentrasi fraksi protein (µg/ml)

Perlakuan

0.2

0.39

0.78

1.56

3.13

6.25

12.5

25

50

100

200

Kontrol

I

0.868

0.886

1.097

1.153

1.034

0.824

0.776

0.749

0.753

0.783

0.847

1.02

II

0.85

0.796

0.957

0.821

0.798

0.814

0.83

0.739

0.785

0.708

0.751

0.88

III

0.84

0.857

0.838

0.851

0.818

0.807

0.784

0.802

0.837

0.835

0.72

0.811

IV

1.185

1.167

0.772

0.833

0.927

0.746

0.793

0.773

0.793

0.724

0.7

1.098

V

0.854

0.798

0.794

0.766

0.796

0.782

0.812

0.766

0.779

0.752

0.707

0.732

0.919

0.901

0.892

0.885

0.875

0.795

0.799

0.766

0.789

0.760

0.745

0.908

I

0.589

0.596

0.558

0.565

0.598

0.557

0.566

0.699

0.578

0.577

0.601

II

0.586

0.648

0.593

0.641

0.604

0.68

0.603

0.586

0.811

0.593

0.793

III

0.593

0.612

0.644

0.613

0.79

0.658

0.639

0.617

0.723

0.563

0.555

0.589

0.619

0.598

0.606

0.664

0.632

0.603

0.634

0.704

0.578

0.65

Rata-rata Perlakuan tanpa sel

Rata-rata

Tabel XII. Hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP40 terhadap kultur sel Vero Absorbansi Konsentrasi fraksi protein (µg/ml)

Perlakuan

0.2

0.39

0.78

1.56

3.13

6.25

12.5

25

50

100

200

Kontrol

I

0.799

0.813

0.815

0.822

0.786

0.762

0.791

0.759

0.696

0.754

0.804

0.843

II

0.788

0.762

0.783

0.753

0.741

0.79

0.78

0.727

0.671

0.753

0.763

0.834

III

0.768

0.759

0.856

0.721

0.764

1.027

1.091

0.905

0.818

0.782

0.737

0.866

IV

0.776

0.815

0.753

0.757

0.755

0.764

0.768

0.599

0.691

0.746

0.758

0.833

V

0.788

0.77

0.767

0.742

0.744

0.73

0.713

0.695

0.693

0.709

0.781

0.811

0.784

0.784

0.795

0.759

0.758

0.815

0.829

0.737

0.714

0.749

0.769

0.837

I

0.489

0.552

0.679

0.524

0.548

0.541

0.522

0.552

0.64

0.515

0.562

II

0.831

0.56

0.561

0.568

0.582

0.554

0.549

0.562

0.549

0.553

0.55

III

0.598

0.728

0.769

0.578

0.567

0.597

0.581

0.575

0.579

0.51

0.551

0.639

0.613

0.67

0.557

0.566

0.564

0.551

0.563

0.589

0.526

0.554

Rata-rata

Perlakuan tanpa sel

Rata-rata


Persen kematian sel dihitung dengan rumus :

% Kematian =

A − (B − C) x 100% A

Keterangan : A = Rata-rata absorbansi kontrol B = Rata-rata absorbansi perlakuan C = Rata-rata absorbansi perlakuan tanpa sel

65


66

Lampiran 4. Hasil analisis probit nilai LC50 fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) terhadap kultur sel HeLa FP10

Probit * * * * * * * * * * * * * * * * * * * DATA

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *

Information

9 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 2 cases rejected because no. responses is greater than no. subjects. 0 cases rejected because LOG-transform can’t be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *

Parameter estimates converged after 5 iterations. Optimal solution found. Parameter Estimates (PROBIT model: BX): Regression Coeff. konsentr

=

Pearson .017

(PROBIT(p)) = Intercept +

Standard Error

Coeff./S.E.

-.03146

.05401

-.58259

Intercept

Standard Error

Intercept/S.E.

.22600

.04995

4.52458

Goodness-of-Fit

Chi Square =

17.070

DF = 7

P

Since Goodness-of-Fit Chi square is significant, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


67

C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *

Observed and Expected Frequencies

konsentr

Number of Subjects

Observed Expected Responses Responses

-.71

100.0

52.7

59.806

-7.137

-.41

100.0

59.7

59.439

.280

-.11

100.0

56.1

59.071

-2.944

.19

100.0

58.0

58.703

-.691

.49

100.0

71.4

58.333

13.027

.80

100.0

63.3

57.963

5.318

1.10

100.0

62.1

57.593

4.521

1.40

100.0

56.5

57.221

-.680

1.70

100.0

45.2

56.849

-11.690

Residual

Prob

.59806 .59439 .59071 .58703 .58333 .57963 .57593 .57221 .56849 C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S

Confidence Limits for Effective konsentr

Prob

konsentr

.01 .02 .03 .04 .05 .06 .07 .08 .09 .10 .15 .20 .25

1.31070E+081 2.84373E+072 9.05950E+066 6.63876E+062 2.87455E+059 3.94174E+056 1.21759E+054 6.88538E+051 6.22085E+049 8.17095E+047 1.32447E+040 8.52338E+033 4.15831E+028

95% Confidence Limits Lower Upper . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . .

* * * * *


.30 7.06075E+023 .35 2.68333E+019 .40 1.71537E+015 .45 150074968944 .50 15226422.4269 .55 1544.85416 .60 .13516 .65 .00001 .70 3.28356E-010 .75 5.57544E-015 .80 2.72009E-020 .85 1.75047E-026 .90 2.83742E-034 .91 3.72688E-036 .92 3.36719E-038 .93 1.90412E-040 .94 5.88177E-043 .95 8.06540E-046 .96 3.49228E-049 .97 2.55913E-053 .98 8.15280E-059 .99 1.76886E-067

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Abbreviated Name

Extended Name

konsentr

konsentrasi

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Probit Transformed Responses

0.6

Probit

0.4

0.2

0.0 R Sq Linear = 0.018

-0.2 -1.0

-0.5

0.0

0.5

Log of konsentrasi

1.0

1.5

2.0

68


69

FP20

Probit C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * DATA

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *

Information

11 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can’t be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *


Standard Error

Coeff./S.E.

.18789

.04268

4.40196

Intercept

Standard Error

Intercept/S.E.

.41734

.05074

8.22500 DF = 9

P

Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits.

no

=

Pearson .074


Goodness-of-Fit

Chi Square =

15.677

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


70

C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *


konsentr

Number of Subjects


-.71

100.0

63.2

61.183

2.012

-.41

100.0

70.5

63.331

7.209

-.11

100.0

59.4

65.439

-6.025

.19

100.0

66.9

67.500

-.612

.49

100.0

69.3

69.509

-.239

.80

100.0

65.9

71.460

-5.529

1.10

100.0

69.4

73.350

-3.994

1.40

100.0

74.7

75.175

-.452

1.70

100.0

78.8

76.930

1.847

2.00

100.0

89.7

78.614

11.088

2.30

100.0

74.9

80.225

-5.362

Residual

Prob

.61183 .63331 .65439 .67500 .69509 .71460 .73350 .75175 .76930 .78614 .80225 C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S


Prob

konsentr

.01 .02 .03 .04 .05 .06 .07 .08 .09 .10

2.49547E-015 7.04721E-014 5.86873E-013 2.89082E-012 1.05754E-011 3.18958E-011 8.39664E-011 1.99755E-010 4.39352E-010 9.07640E-010

95% Confidence Limits Lower Upper 1.21035E-027 4.97667E-025 2.26621E-023 4.00610E-022 4.14313E-021 3.02591E-020 1.72961E-019 8.23738E-019 3.40576E-018 1.25775E-017

1.35451E-010 1.37091E-009 5.95595E-009 .00000 .00000 .00000 .00000 .00000 .00000 .00000

* * * * *


.15 .20 .25 .30 .35 .40 .45 .50 .55 .60 .65 .70 .75 .80 .85 .90 .91 .92 .93 .94 .95 .96 .97 .98 .99

.00000 2.80678E-015 .00000 2.06081E-013 .00000 8.20246E-012 .00001 2.23754E-010 .00005 4.77654E-009 .00027 .00000 .00129 .00000 .00601 .00002 .02803 .00034 .13402 .00536 .67542 .08426 3.71367 1.13509 23.36843 8.66667 181.20077 46.21050 1972.49752 267.70475 39775.77079 2264.04632 82171.18658 3772.50660 180731.53836 6560.77891 429958.91565 12040.93936 1131876.35610 23694.21109 3413779.74903 51213.98955 12488540.6296 126503.08967 61516011.2064 383927.90711 512288959.937 1676414.02534 14467024385.7 17062735.7222

Abbreviated Name

Extended Name

konsentr

konsentrasi

.00001 .00004 .00017 .00062 .00202 .00629 .01894 .05648 .17098 .54375 1.95675 10.20112 131.38301 4079.73916 271775.75098 57727295.3208 211676513.510 869498438.563 4116198616.02 23396717131.8 169976372986 1749035370912 3.07659E+013 1.39393E+015 5.69944E+017


1.4

1.2

Probit

1.0

0.8

0.6

0.4

R Sq Linear = 0.531

0.2 -1

0

1

Log of konsentrasi

2

71


72

FP30

Probit C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * DATA

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *

Information


* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *


=

Pearson .003


Standard Error

Coeff./S.E.

.09948

.06437

1.54553

Intercept

Standard Error

Intercept/S.E.

1.23647

.06516

18.97602

Goodness-of-Fit

Chi Square =

21.265

DF = 7

P



73

C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *


konsentr

Number of Subjects


-.71

100.0

85.5

87.817

-2.319

-.41

100.0

86.7

88.412

-1.715

-.11

100.0

85.5

88.986

-3.450

.19

100.0

94.1

89.540

4.550

.49

100.0

97.1

90.073

7.026

.80

100.0

90.3

90.585

-.238

1.10

100.0

84.6

91.078

-6.473

1.40

100.0

97.5

91.552

5.997

2.30

100.0

89.5

92.859

-3.375

Residual

Prob

.87817 .88412 .88986 .89540 .90073 .90585 .91078 .91552 .92859 C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S


Prob

konsentr

.01 .02 .03 .04 .05 .06 .07 .08 .09 .10 .15 .20 .25

1.53360E-036 8.43223E-034 4.61882E-032 9.38432E-031 1.08707E-029 8.74505E-029 5.44144E-028 2.79643E-027 1.23916E-026 4.87816E-026 1.41985E-023 1.28986E-021 6.17430E-020

95% Confidence Limits Lower Upper . . . . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . . . .

* * * * *


.30 1.99215E-018 .35 4.98181E-017 .40 1.05685E-015 .45 2.03022E-014 .50 3.72153E-013 .55 6.82181E-012 .60 1.31047E-010 .65 2.78007E-009 .70 .00000 .75 .00000 .80 .00011 .85 .00975 .90 2.83914 .91 11.17671 .92 49.52668 .93 254.52378 .94 1583.72643 .95 12740.49665 .96 147584.10760 .97 2998554.24722 .98 164248076.599 .99 90308944932.0

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Abbreviated Name

Extended Name

konsentr

konsentrasi

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .


2.0

1.8

Probit

1.6

1.4

1.2 R Sq Linear = 0.092

1.0 -1

0

1

Log of konsentrasi

2

74


75

FP40

Probit C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * DATA

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *

Information


* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *


=

Pearson .000


Standard Error

Coeff./S.E.

.33439

.05236

6.38605

Intercept

Standard Error

Intercept/S.E.

.57906

.05224

11.08494

Goodness-of-Fit

Chi Square =

47.202

DF = 8

P



76

C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *


konsentr

Number of Subjects


-.71

100.0

57.6

63.378

-5.777

-.41

100.0

58.9

67.095

-8.173

-.11

100.0

68.3

70.651

-2.391

.19

100.0

78.9

74.017

4.878

.49

100.0

94.9

77.172

17.740

.80

100.0

87.5

80.100

7.370

1.10

100.0

79.2

82.789

-3.539

1.40

100.0

88.4

85.234

3.149

1.70

100.0

73.3

87.435

-14.118

2.00

100.0

90.6

89.396

1.169

Residual

Prob

.63378 .67095 .70651 .74017 .77172 .80100 .82789 .85234 .87435 .89396 C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S


Prob

konsentr

.01 .02 .03 .04 .05 .06 .07 .08 .09 .10 .15

2.04853E-009 .00000 .00000 .00000 .00000 .00000 .00000 .00000 .00000 .00000 .00001

95% Confidence Limits Lower Upper 4.25516E-075 1.81961E-068 2.92961E-064 4.27773E-061 1.60340E-058 2.48677E-056 2.07129E-054 1.08595E-052 3.97737E-051 1.09390E-049 9.93913E-044

.00004 .00012 .00023 .00037 .00055 .00077 .00103 .00134 .00170 .00212 .00530

* * * * *


.20 .25 .30 .35 .40 .45 .50 .55 .60 .65 .70 .75 .80 .85 .90 .91 .92 .93 .94 .95 .96 .97 .98 .99

.00006 .00018 .00050 .00131 .00324 .00781 .01855 .04407 .10616 .26341 .68637 1.92928 6.09817 23.32288 126.12584 189.60554 295.24906 480.47844 827.69426 1539.05012 3189.64912 7813.17070 25706.75379 167977.01396

5.38615E-039 .01101 6.17972E-035 .02070 2.72229E-031 .03664 6.44961E-028 .06250 1.02114E-024 .10436 1.26235E-021 .17277 1.37786E-018 .28706 1.47667E-015 .48575 1.71460E-012 .85615 2.35942E-009 1.64477 .00000 3.92201 .00578 21.15718 .66135 3988.48019 4.06749 73043884.1969 14.34524 4.70281E+013 18.64032 1.24113E+015 24.55781 4.38401E+016 32.99289 2.22570E+018 45.54924 1.80095E+020 65.34581 2.72037E+022 99.16792 9.94981E+024 164.39945 1.41939E+028 319.13864 2.23318E+032 896.36092 9.31496E+038

Abbreviated Name

Extended Name

konsentr

konsentrasi


Probit

1.5

1.0

0.5

R Sq Linear = 0.378

0.0 -1.0

-0.5

0.0

0.5

Log of konsentrasi

1.0

1.5

2.0

77


78

Lampiran 5. Hasil analisis probit nilai LC50 fraksi protein daun mimba (Azadirachta indica A. Juss) terhadap kultur sel Vero FP10

Probit * * * * * * * * * * * * * * * * * * * DATA

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *

Information

11 unweighted cases accepted. 0 cases rejected because of missing data. 0 cases are in the control group. 0 cases rejected because LOG-transform can't be done. MODEL Information ONLY Normal Sigmoid is requested. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *


=

Pearson .030


Standard Error

Coeff./S.E.

.13161

.04190

3.14109

Intercept

Standard Error

Intercept/S.E.

.38448

.05056

7.60404

Goodness-of-Fit

Chi Square =

18.446

DF = 9

P

Since Goodness-of-Fit Chi square is significant, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


79

C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *


konsentr

Number of Subjects


-.71

100.0

66.9

61.453

5.431

-.41

100.0

65.0

62.958

1.998

-.11

100.0

56.9

64.445

-7.551

.19

100.0

71.4

65.909

5.532

.49

100.0

63.8

67.350

-3.531

.80

100.0

66.0

68.766

-2.722

1.10

100.0

75.1

70.155

4.909

1.40

100.0

60.7

71.514

-10.781

1.70

100.0

73.6

72.844

.778

2.00

100.0

70.7

74.141

-3.490

2.30

100.0

84.8

75.406

9.380

Residual

Prob

.61453 .62958 .64445 .65909 .67350 .68766 .70155 .71514 .72844 .74141 .75406 C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S


Prob

konsentr

.01 .02 .03 .04 .05 .06 .07 .08 .09 .10

2.53016E-021 2.98092E-019 6.14416E-018 5.98436E-017 3.81181E-016 1.84314E-015 7.33950E-015 2.52925E-014 7.79235E-014 2.19531E-013

95% Confidence Limits Lower Upper . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . .

* * * * *


.15 .20 .25 .30 .35 .40 .45 .50 .55 .60 .65 .70 .75 .80 .85 .90 .91 .92 .93 .94 .95 .96 .97 .98 .99

1.59919E-011 4.83148E-010 8.99379E-009 .00000 .00000 .00001 .00013 .00120 .01080 .10084 1.01477 11.56365 159.76106 2973.95020 89849.11856 6545132.03372 18439348.1089 56809591.1626 195770488.967 779571042.006 3769489757.60 24010215055.4 233857529836 4820181708110 5.67893E+014

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Abbreviated Name

Extended Name

konsentr

konsentrasi

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .


1.50

1.25

Probit

1.00

0.75

0.50

0.25

R Sq Linear = 0.373

0.00 -1

0

1

Log of konsentrasi

2

80


81

FP20

Probit C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * DATA

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *

Information


* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *


Standard Error

Coeff./S.E.

-.22236

.04496

-4.94529

Intercept

Standard Error

Intercept/S.E.

.90406

.05851

15.45084 DF = 9

P


no

=

Pearson .076


Goodness-of-Fit

Chi Square =

15.602

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


82

C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *


konsentr

Number of Subjects


-.71

100.0

93.5

85.583

7.868

-.41

100.0

85.3

84.009

1.324

-.11

100.0

77.1

82.327

-5.231

.19

100.0

79.4

80.537

-1.186

.49

100.0

80.0

78.641

1.369

.80

100.0

73.6

76.641

-3.012

1.10

100.0

69.9

74.542

-4.633

1.40

100.0

67.6

72.348

-4.757

1.70

100.0

65.6

70.065

-4.505

2.00

100.0

70.4

67.700

2.735

2.30

100.0

75.1

65.262

9.866

Residual

Prob

.85583 .84009 .82327 .80537 .78641 .76641 .74542 .72348 .70065 .67700 .65262 C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S


Prob

konsentr

.01 .02 .03 .04 .05 .06 .07 .08 .09 .10

3.37101E+014 2.00369E+013 3342092548080 868760839022 290369962998 114246978338 50424913497.0 24244114168.3 12455544527.6 6747043484.27

95% Confidence Limits Lower Upper 44625101266.3 5893512100.66 1630839035.64 620285427.797 282512175.810 144633637.847 80404249.3021 47525529.6876 29458792.6954 18966333.1264

3.03288E+023 2.83323E+021 1.46123E+020 1.57116E+019 2.56145E+018 5.47080E+017 1.41337E+017 4.20718E+016 1.39769E+016 5.06886E+015

* * * * *


.15 .20 .25 .30 .35 .40 .45 .50 .55 .60 .65 .70 .75 .80 .85 .90 .91 .92 .93 .94 .95 .96 .97 .98 .99

533053311.577 3060798.92809 7.61229E+013 70902815.7960 717225.62765 2709839349368 12561501.2869 206255.97216 155170683243 2654983.45522 67246.45620 11912793826.8 628915.80498 23758.94952 1106105695.97 160355.29251 8831.78063 116238118.083 42742.14059 3379.43128 13184913.4626 11634.11604 1306.86059 1555310.99482 3166.72619 501.63657 184834.44707 844.07976 187.10284 21508.78054 215.21586 65.65723 2394.34412 50.98060 20.23691 254.83890 10.77520 4.45919 28.94818 1.90899 .46228 4.59820 .25392 .02046 .86681 .02006 .00034 .12778 .01087 .00012 .08130 .00558 .00004 .04986 .00268 .00001 .02919 .00118 .00000 .01609 .00047 .00000 .00817 .00016 .00000 .00369 .00004 .00000 .00139 .00001 6.45831E-010 .00038 .00000 6.08117E-012 .00005

Abbreviated Name

Extended Name

konsentr

konsentrasi


1.6

1.4

Probit

1.2

1.0

0.8

0.6

R Sq Linear = 0.62

0.4 -1

0

1

Log of konsentrasi

2

83


84

FP30

Probit C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * DATA

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *

Information


* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *


Standard Error

Coeff./S.E.

.28479

.04556

6.25033

Intercept

Standard Error

Intercept/S.E.

.55599

.05190

10.71352 DF = 9

P


no

=

Pearson .376


Goodness-of-Fit

Chi Square =

9.698

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


85

C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *


konsentr

Number of Subjects


-.71

100.0

63.7

63.833

-.176

-.41

100.0

68.9

66.993

1.942

-.11

100.0

67.7

70.037

-2.328

.19

100.0

69.3

72.946

-3.608

.49

100.0

76.8

75.707

1.104

.80

100.0

82.1

78.308

3.751

1.10

100.0

78.4

80.741

-2.359

1.40

100.0

85.5

82.999

2.489

1.70

100.0

90.6

85.079

5.517

2.00

100.0

79.9

86.983

-7.103

2.30

100.0

89.5

88.711

.792

Residual

Prob

.63833 .66993 .70037 .72946 .75707 .78308 .80741 .82999 .85079 .86983 .88711 C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S


Prob

konsentr

.01 .02 .03 .04 .05 .06 .07 .08 .09 .10

7.57238E-011 6.86137E-010 2.77786E-009 7.95348E-009 .00000 .00000 .00000 .00000 .00000 .00000

95% Confidence Limits Lower Upper 8.84349E-016 2.18697E-014 1.67365E-013 7.73471E-013 2.68615E-012 7.74976E-012 1.96207E-011 4.50711E-011 9.60167E-011 1.92598E-010

.00000 .00000 .00000 .00000 .00000 .00000 .00001 .00001 .00001 .00002

* * * * *


.15 .00000 .20 .00001 .25 .00005 .30 .00016 .35 .00050 .40 .00144 .45 .00404 .50 .01116 .55 .03083 .60 .08656 .65 .25161 .70 .77461 .75 2.60671 .80 10.06797 .85 48.63928 .90 352.91663 .91 569.57856 .92 958.05107 .93 1697.09584 .94 3213.94433 .95 6657.89486 .96 15665.60089 .97 44853.30691 .98 181590.65951 .99 1645401.75198

3.43479E-009 .00008 .00000 .00028 .00000 .00078 .00000 .00198 .00001 .00471 .00003 .01072 .00015 .02382 .00064 .05248 .00276 .11633 .01202 .26385 .05393 .62733 .25096 1.63271 1.17802 5.13253 5.11370 23.68381 21.12552 188.65653 106.05048 3048.36793 154.88046 6035.16471 233.10976 12707.32132 364.55432 28883.52522 599.33886 72426.09374 1054.29149 207106.80517 2042.53058 713282.55098 4594.10765 3270170.90223 13455.65179 24827202.5424 72876.95481 608663179.429

Abbreviated Name

Extended Name

konsentr

konsentrasi


1.4

1.2

Probit

1.0

0.8

0.6 R Sq Linear = 0.796 0.4

R Sq Linear = 0.796

0.2 -1

0

1

Log of konsentrasi

2

86


87

FP40

Probit C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * DATA

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *

Information


* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *


=

Pearson .046


Standard Error

Coeff./S.E.

-.07076

.04432

-1.59662

Intercept

Standard Error

Intercept/S.E.

.80398

.05584

14.39921

Goodness-of-Fit

Chi Square =

17.153

DF = 9

P

Since Goodness-of-Fit Chi square is significant, a heterogeneity factor is used in the calculation of confidence limits. - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -


88

C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S

* * * * *


konsentr

Number of Subjects


-.71

100.0

82.7

80.350

2.399

-.41

100.0

79.6

79.754

-.111

-.11

100.0

85.1

79.148

5.909

.19

100.0

75.8

78.531

-2.694

.49

100.0

77.0

77.904

-.872

.80

100.0

70.1

77.267

-7.193

1.10

100.0

66.8

76.619

-9.809

1.40

100.0

79.2

75.962

3.260

1.70

100.0

85.1

75.294

9.843

2.00

100.0

73.4

74.616

-1.222

2.30

100.0

74.4

73.929

.484

Residual

Prob

.80350 .79754 .79148 .78531 .77904 .77267 .76619 .75962 .75294 .74616 .73929 C

* * * * * * * * * * * * * * * * * * *

P R O B I T

A N A L Y S I S


Prob

konsentr

.01 .02 .03 .04 .05 .06 .07 .08 .09 .10

1.73343E+044 2.43470E+040 8.75354E+037 1.26899E+036 4.05322E+034 2.16152E+033 1.65406E+032 1.65622E+031 2.04257E+030 2.97504E+029

95% Confidence Limits Lower Upper . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . .

* * * * *


.15 1.02188E+026 .20 1.80405E+023 .25 7.83953E+020 .30 5.93168E+018 .35 6.42173E+016 .40 8.76112E+014 .45 1.37424E+013 .50 230235727855 .55 3857306078.81 .60 60504245.1658 .65 825455.53089 .70 8936.50022 .75 67.61696 .80 .29383 .85 .00052 .90 .00000 .91 .00000 .92 3.20056E-009 .93 3.20476E-010 .94 2.45238E-011 .95 1.30781E-012 .96 4.17720E-014 .97 6.05567E-016 .98 2.17720E-018 .99 3.05801E-022

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Abbreviated Name

Extended Name

konsentr

konsentrasi

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .


1.1

1.0

Probit

0.9

0.8

0.7

0.6

R Sq Linear = 0.125

0.5

0.4 -1

0

1

Log of konsentrasi

2

89


90

Lampiran 6. Hasil analisis distribusi data dengan Uji Kolmogorov-Smirnov

A. FP10 daun mimba terhadap sel HeLa

NPar Tests Descriptive Statistics N LC50

Mean 9E+015

5

Std. Deviation 1.991E+016

Minimum 1.17772

Maximum 4E+016

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test LC50 N Normal Parameters

a,b

Mean Std. Deviation Absolute Positive Negative

Most Extreme Differences Kolmogorov-Smirnov Z Asymp. Sig. (2-tailed)

5 9E+015 ******* .473 .473 -.327 1.057 .214

a. Test distribution is Normal. b. Calculated from data.

B. FP20 daun mimba terhadap sel HeLa


Mean .0344780

5

Std. Deviation .02738529

Minimum .01058


a,b

Most Extreme Differences


Kolmogorov-Smirnov Z Asymp. Sig. (2-tailed) a. Test distribution is Normal. b. Calculated from data.

5 .0344780 .02738529 .283 .283 -.191 .633 .819

Maximum .07703


C. FP30 daun mimba terhadap sel HeLa

NPar Tests Warnings The data for NPAR TESTS include oversize values. These values will be treated as missing. 1 unusable values were encountered.

Descriptive Statistics N LC50

Mean 107.3571

4

Std. Deviation 162.36157888

Minimum .00000

Maximum 343.13087


a,b


Most Extreme Differences Kolmogorov-Smirnov Z Asymp. Sig. (2-tailed)

4 107.3571 162.3616 .302 .302 -.254 .603 .860


D. FP40 daun mimba terhadap sel HeLa


Mean .0791380

5


Minimum .00001


a,b




5 .0791380 .13657745 .345 .345 -.281 .772 .591

Maximum .31905

91


E. FP10 daun mimba terhadap sel Vero


Mean .1020320

5


Minimum .00000

Maximum .33193


a,b



Kolmogorov-Smirnov Z Asymp. Sig. (2-tailed)

5 .1020320 .14990898 .352 .352 -.248 .787 .565


F. FP20 daun mimba terhadap sel Vero


Mean 417771.3

5

Std. Deviation 524053.3728

Minimum 136.15536


a,b




5 417771.3 524053.4 .323 .323 -.213 .723 .673

Maximum 1143218

92


G. FP30 daun mimba terhadap sel Vero


Mean .0692440

5


Minimum .00002

Maximum .26334


a,b



Kolmogorov-Smirnov Z Asymp. Sig. (2-tailed)

5 .0692440 .11402530 .324 .324 -.272 .725 .670


H. FP40 daun mimba terhadap sel Vero

NPar Tests Warnings The data for NPAR TESTS include oversize values. These values will be treated as missing. 1 unusable values were encountered.

Descriptive Statistics N LC50

Mean 5E+018

4

Std. Deviation 9.330E+018

Minimum 7973.899


a,b




4 5E+018 ******* .425 .425 -.301 .851 .464

Maximum 2E+019

93

PLAGIAT MERUPAKAN MERUPAKAN TINDAKAN TINDAKAN TIDAK TIDAK TERPUJI TERPUJI PLAGIAT

94

Lampiran 7. Hasil analisis Uji t-independent sample

A. FP10 terhadap sel HeLa dan sel Vero

T-Test Group Statistics

LC50

sel vero 10 hela 10

N 5 5

Mean .1020320 9E+015

Std. Error Mean .06704134 *******

Std. Deviation .14990898 1.991E+016

Independent Samples Test Levene's Test for Equality of Variances

F LC50

Equal variances assumed Equal variances not assumed

7.111

Sig. .029

t-test for Equality of Means

t

df

Sig. (2-tailed)

Mean Difference

Std. Error Difference

95% Confidence Interval of the Difference Lower Upper

-1.000

8

.347

8.90E+015

9E+015

-3E+016

*******

-1.000

4.000

.374

8.90E+015

9E+015

-3E+016

*******


95

B. FP20 terhadap sel HeLa dan sel Vero


LC50

sel vero 20 hela 20

N 5 5

Mean 417771.3 .0344780

Std. Error Mean 234363.8 .01224707

Std. Deviation 524053.3728 .02738529


F LC50


38.265

Sig. .000


t

df

Sig. (2-tailed)

Mean Difference



1.783

8

.113

417771.31

234363.79

-122673

958215.2

1.783

4.000

.149

417771.31

234363.79

-232927

1068470


96

C. FP30 terhadap sel HeLa dan sel Vero


LC50

sel vero 30 hela 30

N 5 5

Mean .0692440 2E+085

Std. Error Mean .05099366 2E+085

Std. Deviation .11402530 3.8284E+085


F LC50


7.111

Sig. .029


t

df

Sig. (2-tailed)

Mean Difference



-1.000

8

.347

1.71E+085

1.71E+085

-6E+085

2E+085

-1.000

4.000

.374

1.71E+085

1.71E+085

-6E+085

3E+085


97

D. FP40 terhadap sel HeLa dan sel Vero


LC50

sel vero 40 hela 40

N 5 5

Mean 5E+040 .0791380

Std. Error Mean 5E+040 .06107929

Std. Deviation 1.0144E+041 .13657745


F LC50


7.111

Sig. .029


t

df

Sig. (2-tailed)

Mean Difference



1.000

8

.347

4.54E+040

4.54E+040

-6E+040

1E+041

1.000

4.000

.374

4.54E+040

4.54E+040

-8E+040

2E+041


Lampiran 8. Foto tanaman dan daun mimba (Azadirachta indica A. Juss)

Gambar 7. Foto tanaman Azadirachta indica A. Juss

Gambar 8. Foto daun Azadirachta indica A. Juss

98


99

Lampiran 9. Foto Hi-Mac Sentrifuge HITACHI SCP85H, ELISA reader SLT 340ATC dan mikroskop (Olympus IMT-2)

Gambar 9. Foto Hi-Mac Sentrifuge HITACHI SCP85

Gambar 10. Foto ELISA reader SLT 340ATC

Gambar 11. Foto Mikroskop (Olympus IMT-2)


100

Lampiran 10. Foto hasil uji sitotoksik fraksi protein daun mimba FP40 terhadap kultur sel HeLa dan sel Vero dalam 96 well plate

Gambar 12. Foto perlakuan dengan sel HeLa dalam 96 well plate

Gambar 13. Foto perlakuan dengan sel Vero dalam 96 well plate

Keterangan: A1 sampai E11: kelompok perlakuan sel (sel + media + fraksi protein) menggunakan FP40 dengan konsentrasi sebagai berikut: 1 = 0,2 μg/ml

7 = 12,5 μg/ml

2 = 0,39 μg/ml

8 = 25 μg/ml

3 = 0,78 μg/ml

9 = 50 μg/ml

4 = 1,56 μg/ml

10 = 100 μg/ml

5 = 3,13 μg/ml

11=200μg/ml

6 = 6,25 μg/ml F1 sampai H11: kelompok perlakuan tanpa sel (media + fraksi protein) A12 sampai E12: kelompok kontrol (sel + media)


Lampiran 11. Surat determinasi tanaman

101


102

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi dengan judul “Sitotoksisitas Fraksi Protein Daun Mimba (Azadirachta indica A. Juss) FP10, FP20, FP30, dan FP40 terhadap Kultur Sel HeLa” memiliki nama lengkap Lestarining Wahyu Ndadari. Penulis dilahirkan di Yogyakarta pada tanggal 12 Desember 1985 dan merupakan putri tunggal dari pasangan Bapak Wahjudi dan Ibu J. Endang Lestari. Penulis mengawali pendidikan

formalnya

Indriyasana

Yogyakarta

di

Taman

pada

tahun

Kanak-Kanak 1990-1991

kemudian melanjutkan ke SD N Maguwoharjo 2 pada tahun 1991-1997. Tahun 1997 hingga 2000 penulis melanjutkan pendidikan di SLTP N 4 Depok Yogyakarta. Setelah menyelesaikan pendidikan SLTP, tahun 2000 melanjutkan ke SMU N 9 Yogyakarta dan lulus pada tahun 2003. Tahun 2003 hingga 2007 berkesempatan untuk menempuh pendidikan S1 di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama kuliah, penulis juga tergabung dalam sebuah komunitas tari yang dikenal dengan nama Komunitas Tari Genta Rakyat dan Persekutuan Mahasiswa Kristen (PMK) Apostolos sejak tahun 2003 hingga sekarang.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Recommend Documents