PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN EKSTRAK ETANOLIK DAUN SAWO KECIK (Manilkara kauki (L.) Dubard) SECARA KUALITATIF DAN KUANTITATIF DENGAN METODE DPPH

SKRIPSI Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Farmasi

Oleh: Filbert Hita Kumaro NIM : 098114017

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2013

i


ii


iii


HALAMAN PERSEMBAHAN

“Dari air kita belajar ketenangan, D ari batu kita belajar ketegaran, Dari api kita belajar keberanian, Dari angin kita belajar arah tujuan, Dari padi kita belajar rendah hati, Dari Zhuge Liang kita belajar ‘menjadi yang terbaik’” ~dHanZ_Kiryu, 2011

“Everyone got their own priority, please respect their choice and please don’t be self-centred” ~Filbert Hita Kumaro, 2013

“There are only two paths you can choose. You can sit quietly and be selected out of this world, or you can adapt and change!” ~Gai Tsutsugami (Guilty Crown)

“Till now I have been running away. But, now I will show my own self!” ~Ouma Shu (Guilty Crown)

Kupersembahkan untuk: Kedua orangtuaku, keluarga, teman-teman, orang-orang terkasih, dan almamaterku

iv


v


PRAKATA Anumodana kepada Tiratana dan para Bodhisatta sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanolik Daun Sawo Kecik (Manilkara kauki (L.) Dubard) Secara Kualitatif dan Kuantitatif dengan Metode DPPH” sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Dalam penelitian dan penulisan skripsi, berbagai pihak telah memberikan dukungan dan bantuan sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik. Oleh karena hal tersebut, penulis ingin mengutarakan ucapan terima kasih sebesar-besarnya kepada: 1.

Yohanes Dwiatmaka, M.Si. sebagai Dosen Pembimbing yang telah membimbing dan memberikan banyak masukan yang membangun dalam penelitian maupun penulisan skripsi ini.

2.

Agustina Setiawati, M.Sc., Apt. sebagai Dosen Penguji yang telah memberikan banyak kritik dan saran serta kesediannya menguji skripsi ini.

3.

Jeffry Julianus, M.Si. sebagai Dosen Penguji yang telah memberikan banyak kritik dan saran serta kesediannya menguji skripsi ini.

4.

Segenap dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

5.

Kedua orangtuaku, William Kwan dan Rosianawati, yang terus mendukung dan memberikan semangat dalam menyelesaikan skripsi ini.

6.

Indah Kertawati dan Martina Sipayung atas bantuan dan kontribusi dalam penelitian skripsi ini.

vi


7.

Jap Yulius Billy Soegianto dan Benny Ade Saputra atas banyak informasi dan pertukaran pendapat akan penelitian.

8.

Guild Valkyrian (Ragnarok Online 2 SEA – Jormungand Server) beserta semua teman-teman RO2SEA atas bantuan dan hiburannya yang dapat melepas lelah penulis.

9.

Vincent Eddy Kuncoro, Yohanes Ivan Kristian Santoso, Yoseph Edo Saputra, Gregorius Sebastian D.A., Rendy Xaverio, Meita Eryanti, dan Mayke Prasastia, yang selalu menyemangati dan menemani penulis berjalan-jalan baik untuk kebutuhan penelitian maupun hanya hiburan.

10.

Berbagai pihak yang tidak dapat disebut satu per satu. Penulis menyadari bahwa penelitian dan penulisan skripsi ini masih jauh

dari kata sempurna. Penulis juga meminta maaf sebesar-besarnya dan bertanggung jawab atas kesalahan yang ada pada penulisan skripsi ini. Oleh karena itu, setiap kritik dan saran akan diterima dengan baik oleh penulis. Akhir kata, semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.

Penulis

vii


viii


DAFTAR ISI Halaman HALAMAN JUDUL..........................................................................................i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING................................................ii HALAMAN PENGESAHAN...........................................................................iii HALAMAN PERSEMBAHAN........................................................................iv LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI............................v PRAKATA........................................................................................................vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA...........................................................viii DAFTAR ISI......................................................................................................ix DAFTAR TABEL.............................................................................................xiii DAFTAR GAMBAR........................................................................................xiv DAFTAR LAMPIRAN.....................................................................................xv INTISARI..........................................................................................................xvi ABSTRACT........................................................................................................xvii BAB I PENGANTAR.........................................................................................1 A. Latar Belakang...............................................................................................1 1. Permasalahan.............................................................................................2

ix


2. Keaslian penelitian....................................................................................2 3. Manfaat penelitian.....................................................................................3 B. Tujuan Penelitian...........................................................................................3 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA.................................................................4 A. Sawo Kecik....................................................................................................4 1. Uraian tanaman..........................................................................................4 2. Morfologi...................................................................................................4 3. Kegunaan dan khasiat................................................................................5 4. Kandungan fitokimia.................................................................................5 B. Antioksidan.....................................................................................................5 1. Radikal bebas.............................................................................................5 2. Definisi antioksidan...................................................................................8 3. Manfaat antioksidan...................................................................................9 C. Metode Pengujian Aktivitas Antioksidan.......................................................9 1. Metode pengujian aktivitas antioksidan secara umum..............................9 2. Uji DPPH..................................................................................................10 D. Skrining Fitokimia dan Ekstraksi..................................................................12 E. Landasan Teori..............................................................................................14 F. Hipotesis........................................................................................................15

x


BAB III METODOLOGI PENELITIAN............................................................16 A. Jenis dan Rancangan Penelitian......................................................................16 B. Variabel dan Definisi Operasional..................................................................16 1. Variabel......................................................................................................16 2. Definisi operasional...................................................................................16 C. Bahan Penelitian.............................................................................................16 D. Alat Penelitian................................................................................................17 E. Tata Cara Penelitian........................................................................................17 1. Determinasi sawo kecik..............................................................................17 2. Skrining fitokimia.......................................................................................17 3. Pembuatan Ekstrak Etanolik Daun Sawo Kecik.........................................20 4. Uji kualitatif DPPH dengan kromatografi lapis tipis (KLT)......................21 5. Penentuan operating time (OT) ekstrak etanolik daun sawo kecik............21 6. Penentuan operating time (OT) baku pembanding asam askorbat.............22 7. Penentuan panjang gelombang absorbansi maksimum (λmaks)...................23 8. Uji kuantitatif DPPH dengan spektrofotometri visibel..............................23 F. Analisis Hasil...................................................................................................24 1. Determinasi sawo kecik..............................................................................24 2. Skrining fitokimia.......................................................................................25

xi


3. Uji kualitatif DPPH dengan kromatografi lapis tipis (KLT)......................25 4. Uji kuantitatif DPPH dengan spektrofotometri visibel...............................25 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN..............................................................26 A. Determinasi Sawo Kecik..................................................................................26 B. Hasil Skrining Fitokimia...................................................................................26 C. Hasil Uji Kualitatif DPPH dengan KLT...........................................................31 D. Hasil Uji Kuantitatif DPPH..............................................................................35 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN................................................................41 A. Kesimpulan.......................................................................................................41 B. Saran.................................................................................................................41 DAFTAR PUSTAKA............................................................................................42 BIOGRAFI PENULIS...........................................................................................53

xii


DAFTAR TABEL Halaman Tabel I. Tingkat aktivitas antioksidan dengan metode DPPH..........................11 Tabel II. Hasil skrining fitokimia.....................................................................27

xiii


DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1. DPPH radikal dan non-radikal.....................................................11 Gambar 2. Uji tanin........................................................................................29 Gambar 3. Uji flavonoid dengan serbuk Zn, HCl 2N, dan HCl pekat...........29 Gambar 4. Uji flavonoid dengan serbuk magnesium dan HCl pekat.............29 Gambar 5. Uji triterpenoid/steroid..................................................................30 Gambar 6. Uji saponin....................................................................................30 Gambar 7. Uji alkaloid dengan Mayer............................................................31 Gambar 8. Uji alkaloid dengan Bouchardat....................................................31 Gambar 9. Kromatogram KLT uji kualitatif antioksidan (EMW).................33 Gambar 10. Kromatogram KLT uji kualitatif antioksidan (CEF)..................34 Gambar 11. Kromatogram KLT uji kualitatif antioksidan (BEA).................35 Gambar 12. Grafik optimasi OT asam askorbat.............................................36 Gambar 13. Grafik optimasi OT ekstrak etanolik daun sawo kecik..............37 Gambar 14. Optimasi λmaks DPPH pada 3 jenis konsentrasi..........................37 Gambar 15. Kurva regresi linier asam askorbat.............................................38 Gambar 16. Kurva regresi linier ekstrak etanolik daun sawo kecik..............39

xiv


DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi tanaman sawo kecik...................45 Lampiran 2. Gambar tanaman sawo kecik dari Gereja Katolik Hati Kudus Tuhan Yesus, Ganjuran, Bantul, Yogyakarta..................................................46 Lampiran 3. Optimasi uji kuantitatif antioksidan...........................................47 Lampiran 4. Scanning metanol p.a..................................................................49 Lampiran 5. Uji kuantitatif antioksidan..........................................................50 Lampiran 6. Uji statistika dengan R 2.1.4.1....................................................52

xv


INTISARI Daun tanaman sawo kecik (Manilkara kauki (L.) Dubard) digunakan sebagai antitumor di India. Radikal bebas merupakan salah satu penyebab penyakit tumor. Oleh karena antioksidan dapat menetralkan radikal bebas, maka perlu adanya pengujian antioksidan daun sawo kecik untuk mengetahui aktivitasnya sebagai antioksidan. Metode pengujian yang dipilih adalah metode DPPH (1,1-difenil-2-pikril hidrazil) baik secara kualitatif (kromatografi lapis tipis) maupun secara kuantitatif (spektrofotometri). Selain itu juga dilakukan skrining fitokimia yang mendukung keberadaan kandungan yang kemungkinan dapat menimbulkan aktivitas antioksidan tersebut. Aktivitas antioksidan ditetapkan dengan nilai IC50. Dari hasil penelitian, ditemukan bahwa daun sawo kecik mengandung tanin dan flavonoid. Nilai IC50 dari ekstrak etanolik daun sawo kecik adalah 5,00±0,04 µg/mL yang artinya mempunyai aktivitas antioksidan sangat aktif (< 50 µg/mL). Kata kunci: Ekstrak etanolik, daun sawo kecik, DPPH.

xvi


ABSTRACT Leaves of sau (Manilkara kauki (L.) Dubard) are used as antitumor in India. One of the causes that leads to the development of tumour is free radicals. Since antioxidants are capable to neutralise free radicals, hence there is a need to test the leaves of sau for their antioxidant properties. The method used is DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) method both qualitatively (with Thin Layer Chromatography) and quantitatively (with spectrophotometry). Moreover, phytochemical screening is also done to check the compounds which might be responsible for the antioxidant property. The antioxidant activity is measured as IC50. As a result, it was found out that the leaves of sau contain tannins and flavonoids. The IC50 value of leaves of sau ethanolic extract is 5.00±0.04 µg/mL which indicates for its very high antioxidant activity (< 50 µg/mL). Keywords: Ethanolic extract, Leaves of sau, DPPH.

xvii


BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Proses oksidasi dapat merusak molekul penting dalam tubuh dan dapat membahayakan struktur penting dalam sel. Oksidasi merupakan proses alami yang dapat terjadi ketika suatu zat berikatan dengan oksigen. Antioksidan adalah zat yang dalam jumlah kecil dapat menginhibisi kecepatan proses oksidatif pada molekul penting dalam tubuh, melindungi sel, dan mencegah kerusakan dalam tubuh yang disebabkan oleh radikal bebas (Chawda, 2011). Beberapa jenis penyakit yang dapat disebabkan oleh proses oksidasi adalah kanker, penyakit kardiovaskuler, katarak, penurunan fungsi syaraf, serta penuaan dini (Mbata, 2010). Secara alami, antioksidan akan menetralisir radikal bebas hasil dari proses reaksi normal sel. Radikal bebas merupakan atom atau molekul dengan electron shell yang tidak komplit, sehingga bersifat lebih reaktif dibandingkan dengan atom atau molekul dengan electron shell yang komplit. Antioksidan dapat menginhibisi proliferasi (perbanyakan) sel. Secara selektif, antioksidan dapat menginhibisi pertumbuhan sel kanker tanpa berpengaruh pada sel normal. Antioksidan juga menunjukkan adanya peningkatan respon sel tumor terhadap kemoterapi dan radioterapi dengan dosis yang tinggi dan berulang (Chawda, 2011). Penggunaan antioksidan dari tanaman cukup mendapat perhatian untuk dijadikan sebagai suplemen makanan antioksidan dan pengawet makanan. Selain

1


2

itu, konsumen juga lebih memilih menggunakan antioksidan alami dibandingkan antioksidan sintetis karena terdapat kekhawatiran bahwa antioksidan sintetis dapat menimbulkan toksisitas pada tubuh (Vareltzis, Koufidis, Gavriilidou, Papavergou, and Vasiliadou, 1997; Timm, 2000). Di India, daun sawo kecik (Manilkara kauki (L.) Dubard) merupakan salah satu obat yang digunakan sebagai antitumor dalam bentuk pasta (Khare, 2007). Antioksidan merupakan salah satu cara untuk mengobati perkembangan sel tumor (Carter, Madl, and Padula, 2006). Dengan demikian, maka terdapat kemungkinan bahwa daun sawo kecik memiliki aktivitas antioksidan. Untuk mengetahui aktivitas antioksidan daun sawo kecik, maka dapat dilakukan melalui uji kemampuan menangkap radikal bebas. Metode yang dipilih adalah metode DPPH (1,1-difenil-2-pikril hidrazil) karena metode tersebut sederhana, cepat, sensitif, reprodusibel, dan paling sering digunakan pada pengujian antioksidan ekstrak tanaman (Shivaprasad, Mohan, Kharya, Shiradkar, and Lakshman, 2005; Savatovic, Cetkovic, Canadanovic-Brunet, and Djilas, 2012). 1. Permasalahan a. Apakah daun sawo kecik mempunyai aktivitas antioksidan? b. Berapa nilai IC50 aktivitas antioksidan ekstrak etanolik daun sawo kecik? 2. Keaslian penelitian Sejauh penelusuran yang telah dilakukan peneliti, uji aktivitas antioksidan ekstrak etanolik daun sawo kecik secara kualitatif dan kuantitatif dengan metode DPPH belum pernah dilakukan.


3

3. Manfaat penelitian a.

Manfaat

teoretis.

Memberikan

informasi

mengenai aktivitas

antioksidan daun sawo kecik. b. Manfaat metodologi. Memberikan pengetahuan mengenai tata cara pengujian aktivitas antioksidan ekstrak etanolik daun sawo kecik secara kualitatif dan kuantitatif dengan metode DPPH. c.

Manfaat

praktis.

Memberikan

informasi

mengenai

aktivitas

antioksidan daun sawo kecik dalam penangkapan radikal bebas.

B. Tujuan Penelitian Penelitian ini dilakukan dengan tujuan : 1. Untuk mengetahui ada atau tidaknya aktivitas antioksidan pada daun sawo kecik. 2. Untuk mengetahui nilai IC50 aktivitas antioksidan dari ekstrak etanolik daun sawo kecik melalui uji DPPH dalam penangkapan radikal bebas.


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Sawo Kecik 1. Uraian tanaman Sawo kecik (Manilkara kauki (L.) Dubard) merupakan tanaman dari bangsa Ericales (Sawo), suku Sapotaceae (Sawo-sawoan). Nama ilmiah lainnya adalah Mimusops kauki L. Nama lokal: sawo kecik (Jawa); sawo (Melayu); peukula (Aceh); sawo kicik (Sunda); sabu (Madura); kayu sabua (Kangean); sabo (Bali); sawo (Bima); nani (Makasar); nane (Bugis). Nama Inggris untuk sawo kecik adalah sau (Yuzammi dkk., 2010). Sawo kecik berasal dari Amerika tropis. Di Indonesia, sawo kecik tumbuh pada ketinggian 1 – 350 meter di atas permukaan laut (Yuzammi dkk., 2010). Di Kabupaten Bantul, Yogyakarta, sawo kecik dinyatakan sebagai flora identitas Kabupaten Bantul (Anonim, 2011). 2. Morfologi Sawo kecik berupa pohon dengan tinggi batang 15 – 30 m. Batang berwarna coklat, diameter 30 – 70 cm, bercabang banyak. Kanopi rimbun berbentuk payung. Daun tunggal berwarna hijau tua, berbentuk lonjong, berujung meruncing, dan berukuran 5 x 13 cm. Bunga berwarna putih kusam, keluar dari ketiak daun, terletak menggantung. Benang sari berjumlah 6 tangkai putik bertangkai panjang yang menjulang keluar dari mulut bunga. Buah berbentuk bulat telur, berwarna hijau saat masih muda dan jingga saat sudah tua. Panjang

4


5

buah 5 – 7 cm dengan diameter 4 cm. Biji berjumlah 1 – 6, berwarna coklat muda, berbentuk pipih, dan permukaannya mengkilap (Yuzammi dkk., 2010). 3. Kegunaan dan khasiat Buah sawo kecik yang masak digunakan sebagai buah untuk disantap. Kayu pohonnya dapat digunakan sebagai perkakas maupun alat tulis. Pohon sawo kecik juga dapat digunakan sebagai pohon pelindung (Anonim, 2011b). Daun sawo kecik dapat berfungsi sebagai antifungi, antidiare, antitumor (dalam bentuk pasta), astringen, antipiretik, antihelmintik, pengobatan pada beri-beri, delirium, dan lepra (Bhat, Shivaprakasan, and Jayarajan, 1994; Mathias-Mundy and Murdiati, 1991; Khare, 2007; Duke, 2012). 4. Kandungan fitokimia Seluruh bagian mengandung taraxerol, triterpene ketone, α- dan βamyrin, sinamat, α-sipnasterol, β-sitosterol, β-D-glukosida, kuersitol, kuersetin dan dihidroderivat kuersetin, dan asam ursolat. Bagian batang diketahui mengandung tanin 10% (Khare, 2007).

B. Antioksidan 1. Radikal bebas Radikal bebas adalah atom atau molekul yang mempunyai elektron tanpa pasangan (unpaired electron). Adanya elektron tanpa pasangan menyebabkan senyawa sangat reaktif untuk mencari pasangan dengan menyerang dan mengikat elektron senyawa lain yang ada di sekitarnya. Target utama radikal bebas termasuk protein, asam lemak tak jenuh dan lipoprotein, serta unsur DNA


6

termasuk karbohidrat. Namun, yang paling rentan menjadi target utama radikal bebas adalah asam lemak tak jenuh. Terjadinya kerusakan pada ikatan rangkapnya di membran sel membuat dinding sel rapuh. Radikal bebas berpotensi merusak bagian dalam pembuluh darah dan menyebabkan aterosklerosis, merusak basa DNA dan membentuk sel kanker, serta merusak jaringan lipid dan terbentuk peroksida yang memicu berbagai penyakit degeneratif. Radikal bebas dianggap salah satu oksidan karena terjadi penarikan elektron senyawa lain (Winarsi, 2007). Radikal bebas secara normal diproduksi terus-menerus dalam jumlah banyak untuk metabolisme dalam tubuh. Radikal bebas dibutuhkan untuk melawan agen infeksi seperti bakteri, fungi, dan parasit. Walaupun berguna bagi tubuh, namun dapat menjadi masalah pada jumlah tertentu. Segera setelah radikal bebas dilepaskan, tubuh akan mencari penetralnya yakni antioksidan, termasuk enzim antioksidan (endogen) maupun nutrien antioksidan (eksogen). Ketika jumlah radikal bebas lebih banyak dibanding antioksidan, maka terjadi kerusakan membran sel yang menimbulkan arthritis sendi, emphysema dan bronkitis, aterosklerosis dan penyakit jantung, ulkus peptikum, penuaan dini dan pengerutan kulit, maupun mutasi nukleus penyebab kanker. Diabetes, gangguan ginjal, gangguan hepar, dan hampir semua penyakit dapat dikaitkan dengan kerusakan oleh radikal bebas (Hari, 1995). Senyawa oksigen reaktif atau radikal bebas akan terbentuk dalam setiap kegiatan termasuk saat bernafas, namun secara umum pembentukan radikal bebas dipicu oleh faktor lingkungan seperti:


7

a. Pestisida atau karbon tetraklorida (CCl4). Setelah masuk dalam tubuh zat ini akan bereaksi dengan sitokrom P450 monooksigenase dan membentuk radikal triklorometil (CCl3●) dan triklorometilperoksil (CCl3O2●) (Winarsi, 2007). b. Benzoapirene. Senyawa hasil pemanggangan daging berlemak ini jika masuk dalam tubuh akan berubah menjadi senyawa radikal 7,8-diol-9-10 epoksida (Winarsi, 2007). Pada dasarnya radikal bebas dapat terbentuk secara endogen (sebagai respons normal biokimia intrasel maupun ekstrasel) maupun eksogen (seperti polusi, makanan, injeksi, dan absorpsi melalui kulit) (Supari, 1996). BellevilleNabet (1996) mengungkapkan beberapa reaksi pembentukan senyawa oksigen reaktif. Oksigen yang teraktivasi dapat menyebabkan pembentukan radikal bebas oksigen yang disebut anion superoksida (O2●). Secara in vitro, senyawa radikal bebas tersebut akan membentuk kompleks dengan senyawa organik. Beberapa faktor yang menyebabkan terjadinya pembentukan kompleks adalah adanya sifat permukaan membrane, muatan listrik, sifat pengikatan makromolekul, dan bagian enzim, substrat, maupun katalisator. Peristiwa pembentukan kompleks ini dapat terjadi pada sel normal, sel tidak normal, maupun sel teraktivasi. Radikal bebas juga dapat terbentuk melalui jalur enzimatis ataupun metabolik. Proses cascade dari asam arakidonat menjadi prostaglandin dan prostasiklin dipacu oleh enzim lipoksigenase dan siklooksigenase (menghasilkan senyawa oksigen reaktif berupa epoksida atau aldehid oksidase), serta oksidase (berupa monoamine oksidase atau aldehid oksidase), yang kemudian akan


8

membentuk radikal anion superoksida atau hidroperoksida. Enzim sitokrom P450 juga menghasilkan senyawa peroksida yang termasuk senyawa oksigen reaktif. Secara normal peroksida tidak berbahaya, namun keberadaan logam transisi Cu dan Fe dalam tubuh akan membentuk radikal hidroksil melalui reaksi HaberWeiss dan Fenton. Proses aktivasi makrofag dan netrofil, yang merupakan bentuk mekanisme pertahanan tubuh, juga membentuk senyawa radikal bebas dan senyawa oksigen reaktif termasuk asam hipoklorit (HOCl) yang berfungsi untuk menghancurkan virus dan bakteri namun juga berpotensi menyerang sel tubuh jika tidak terkontrol (Winarsi, 2007). 2. Definisi antioksidan Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron (electron donor) atau reduktan yang dapat memerangi aktivitas oksidan dalam tubuh (Winarsi, 2007). Antioksidan dianggap sebagai dasar kesehatan dan digunakan selama bertahuntahun dalam menanggulangi efek berbahaya dari proses oksidatif (Sing, 2007). Kerusakan oksidatif yang diakibatkan radikal bebas dalam tubuh merupakan masalah yang tidak dapat diabaikan mengingat laporan dari Dr. Bruce Ames, teman sejawat Packer dari University of California, Berkeley, mengenai jumlah kerusakan oksidatif dalam tubuh, yang menunjukkan bahwa secara in vitro dalam satu sel kira-kira terjadi 10.000 kali reaksi oksidasi dalam waktu 24 jam. Namun demikian tubuh akan mencari penetral kerusakan yang disebabkan oleh radikal bebas baik secara endogen maupun eksogen. Mekanisme tersebut dinamakan antioxidant network, yang mana dapat berkoordinasi akan kebutuhan untuk menanggulangi senyawa-senyawa oksigen reaktif (Winarsi, 2007).


9

Berdasarkan sumbernya, antioksidan dapat digolongkan menjadi dua jenis, yakni antioksidan alami dan antioksidan sintetis. Antioksidan sintetis yakni antioksidan yang dibuat dengan melakukan sintesis kimia seperti tBHQ, BHT, dan propil galat (Gulcin, Uguz, Oktay, Beydemir, and Kufrevioglu, 2004). Antioksidan alami terdiri atas berbagai senyawa fenolik atau nitrogen dan karotenoid. Antioksidan alami terdapat pada tumbuhan level tinggi (seperti sayur, buah, dan teh). Antioksidan alami dapat melindungi tubuh manusia dari radikal bebas dan menurunkan terjadinya perkembangan penyakit kronis (Sing, 2007). 3. Manfaat antioksidan Antioksidan bermanfaat dalam mencegah kerusakan oksidatif yang disebabkan oleh radikal bebas. Antioksidan dapat digunakan dalam pencegahan berbagai macam penyakit seperti penyakit kardiovaskuler, kanker, katarak, penurunan fungsi syaraf, serta penuaan dini (Mbata, 2010).

C. Metode Pengujian Aktivitas Antioksidan 1. Metode pengujian aktivitas antioksidan secara umum Pengujian aktivitas antioksidan dapat dilakukan dengan berbagai macam cara, baik secara kualitatif maupun kuantitatif. Salah satu pengujian secara kualitatif adalah dengan menggunakan metode DPPH pada kromatografi lapis tipis (Masoko and Eloff, 2007). Shivaprasad et al. (2005) melaporkan bahwa uji kuantitatif antioksidan dapat dilakukan dengan menggunakan spektrofotometri secara in vitro. Salah satu metode yang digunakan adalah metode DPPH.


10

2. Uji DPPH Metode DPPH (1,1-difenil-2-pikril hidrazil) merupakan metode yang paling sering dilakukan sebagai metode pengujian antioksidan pada ekstrak tanaman (Shivaprasad et al., 2005). Metode DPPH dapat digunakan baik pada pengujian kualitatif maupun kuantitatif (Sarker, Latif, and Gray, 2005). Metode DPPH merupakan metode yang sederhana, cepat, sensitif, dan reprodusibel untuk pengujian aktivitas antioksidan (Savatovic et al., 2012). Prinsip metode DPPH adalah reduksi larutan metanolik radikal bebas berwarna (DPPH) dengan cara penangkapan radikal bebas (Shivaprasad et al., 2005). DPPH merupakan senyawa radikal bebas stabil yang dapat berubah warna dari ungu (Gambar 1a) ke kuning (Gambar 1b) dengan adanya reduksi melalui proses pemberian (donor) hidrogen atau elektron. Oleh karena itu, senyawa yang dapat mereduksi DPPH disebut sebagai antioksidan atau penangkap radikal bebas (Dehpour, Ebrahimzadeh, Fazel, and Mohammad, 2009). Untuk pengujian secara kualitatif, pengujian antioksidan dengan metode DPPH dilakukan secara kromatografi lapis tipis. Zat yang telah terelusi disemprot dengan reagen DPPH 0,2% dalam metanol (Masoko and Eloff, 2007). Berdasarkan berbagai jurnal acuan, panjang gelombang yang dapat digunakan sebagai working wavelength adalah 515-520 nm. Operating Time (OT) yang optimal adalah 30 menit, namun dapat digunakan waktu yang lebih singkat (5 atau 10 menit) pada jenis substrat yang berbeda. Sehingga pemilihan OT tergantung pada hasil optimasi (Molyneux, 2004).


11

(a) (b) Gambar 1. (a) DPPH (radikal), berwarna ungu; (b) DPPH (non-radikal), berwarna kuning (Molyneux, 2004). Aktivitas antioksidan ditetapkan berdasarkan kadar efektif senyawa dalam menangkap radikal bebas yang dinyatakan dalam nilai “Effective Concentration” EC50 (juga disebut “Inhibitory Concentration” IC50) yang didefinisikan sebagai kadar penyebab hilangnya aktivitas DPPH sebanyak 50% (Molyneux, 2004). Nilai itu dapat diketahui dengan memplotkan nilai serapan terhadap kadar ekstrak pada kurva atau dengan menghitung kemiringan kurva menggunakan regresi linier (Marxen et al., 2007). Nilai EC50 berbanding terbalik dengan aktivitas antioksidan (Molyneux, 2004). Menurut Jun, Yu, Fong, Wan, Yang, and Ho (2003), tingkat aktivitas antioksidan menggunakan metode DPPH dapat digolongkan berdasarkan nilai IC50 (tabel I). Tabel I. Tingkat aktivitas dengan metode DPPH (Jun et al., 2003). Intensitas

Sangat

Aktif

Sedang

Lemah

aktif Nilai IC50

Tidak aktif

< 50

50 – 100

101 – 250

250 – 500

> 500

µg/mL

µg/mL

µg/mL

µg/mL

µg/mL


12

D. Skrining Fitokimia dan Ekstraksi Skrining fitokimia merupakan suatu tahap pemeriksaan awal yang digunakan untuk mendeteksi kandungan kimia suatu bahan alam. Uji ini antara lain dilakukan pada golongan alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, steroid dan triterpenoid. Pengujian tersebut dilakukan dengan metode pereaksi warna (Mustikasari dan Ariyani, 2010; Susmiati, 2010). Ekstrak merupakan sediaan pekat yang didapatkan dengan cara mengekstraksi zat aktif dari simplisia nabati atau hewani menggunakan pelarut yang sesuai dan diuapkan hingga seluruh atau hampir seluruh pelarut menguap serta massa atau serbuk yang tersisa diperlakukan hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan (Anonim, 1995). Ekstraksi adalah proses penyarian zat-zat dari suatu tubuh makhluk hidup (Yatim, 2007). Ekstraksi dilakukan berdasarkan tekstur, kandungan air simplisia, dan jenis senyawa yang akan diisolasi. Alkohol seperti etanol merupakan pelarut serba guna yang baik untuk ekstraksi pendahuluan karena dapat menarik semua senyawa berbobot molekul rendah baik polar maupun non-polar (Harborne, 1987). Teknik-teknik ekstraksi yang dapat dilakukan digolongkan menjadi ekstraksi panas dan ekstraksi dingin. Ekstraksi dingin termasuk: 1. Maserasi Maserasi merupakan proses ekstraksi simplisia menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada suhu ruang. Maserasi termasuk ekstraksi dengan prinsip pencapaian kesetimbangan konsentrasi (Anonim, 2000).


13

2. Perkolasi Perkolasi merupakan proses ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru hingga ekstraksi sempurna pada suhu ruang. Proses perkolasi terdiri atas tahapan pengembangan bahan, tahapan maserasi antara, tahapan perkolasi sebenarnya (penetesan atau penampungan ekstrak), dan terus-menurus hingga terbentuk perkolat (Anonim, 2000). Teknik-teknik ekstraksi panas termasuk: 1. Refluks Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada suhu titik didih zat selama waktu tertentu dan dalam jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik (Anonim, 2000). 2. Digesti Digesti adalah maserasi dengan pengadukan kontinu pada suhu yang lebih tinggi dari suhu ruang, yakni 40 – 50°C (Anonim, 2000). 3. Infundasi Infundasi merupakan teknik ekstraksi menggunakan pelarut air pada penangas air mendidih selama 15 menit (Anonim, 2000). 4. Dekoksi Dekoksi merupakan teknik ekstraksi yang memiliki prinsip yang sama dengan infundasi dalam waktu 30 menit (Anonim, 2000).


14

5. Sokletasi Sokletasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru yang dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik (Anonim, 2000).

E. Landasan Teori Radikal bebas diproduksi secara terus-menerus dalam tubuh untuk berbagai kebutuhan. Namun pada jumlah tertentu, radikal bebas dapat menjadi masalah bagi tubuh. Untuk mencegah timbulnya kerusakan molekul penting dalam tubuh dan bahaya pada struktur penting dalam sel, maka tubuh akan mencari penetralnya yakni antioksidan.

Antioksidan dapat

menginhibisi

perkembangan sel tumor. Antioksidan alami diyakini lebih aman penggunaannya dibandingkan antioksidan sintetik. Di India, secara tradisional daun sawo kecik digunakan sebagai pengobatan antitumor. Oleh karena itu ada kemungkinan bahwa sawo kecik memiliki aktivitas antioksidan. Dengan demikian, perlu adanya pengujian kualitatif dan kuantitatif antioksidan. DPPH adalah metode yang sederhana, cepat, sensitif, reprodusibel, dan paling sering digunakan untuk pengujian antioksidan pada ekstrak tanaman. Aktivitas antioksidan kemudian ditetapkan dengan nilai IC50 dan digolongkan sesuai dengan penggolongan aktivitas antioksidan Jun et al. (2003).


15

F. Hipotesis 1. Daun sawo kecik mempunyai aktivitas antioksidan. 2. Nilai IC50 ekstrak etanolik daun sawo kecik menunjukkan aktivitas antioksidan sangat aktif.


BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini termasuk dalam penelitian eksperimental murni.

B. Variabel dan Definisi Operasional 1. Variabel a. Variabel bebas: konsentrasi ekstrak etanolik daun sawo kecik. b. Variabel tergantung: aktivitas antioksidan ekstrak etanolik sawo kecik. c. Variabel pengacau terkendali: tempat tumbuh tanaman. d. Variabel pengacau tidak terkendali: umur tanaman dan iklim tumbuh tanaman. 2. Definisi operasional a. Ekstrak etanolik daun sawo kecik adalah sari hasil proses maserasi daun sawo kecik dengan pelarut etanol. b. %IC adalah besaran aktivitas antioksidan ekstrak etanolik daun sawo kecik.

C. Bahan Penelitian Bahan yang digunakan adalah daun sawo kecik, akuades, DPPH (Aldrich), asam klorida, metanol teknis, metanol p.a. (E. Merck), pereaksi Mayer, pereaksi Bouchardat, natrium sulfat anhidrat, pereaksi asam fosfomolibdat, pereaksi Hager, ammonia, ammonium hidroksida, eter, kloroform, eter minyak tanah, etanol, serbuk magnesium, serbuk seng, serbuk halus asam borat, serbuk halus asam oksalat, pereaksi besi (III) ammonium sulfat, kalium hidroksida, asam

16


17

sulfat, etil asetat, asam askorbat (Brataco), aseton, formic acid, benzena, silica gel 60 GF-254 (E. Merck), dan asam asetat anhidrat.

D. Alat Penelitian Alat yang digunakan adalah alat-alat gelas, neraca analitik, oven, blender, maserator, corong Buchner, vacuum rotary evaporator, waterbath, alat pendingin balik, lemari pendingin, lemari asam, pelat dan chamber KLT, vortex, stopwatch, lampu UV,

dan spektrofotometer

UV-visibel (UV

mini-1240 UV-Vis

Spectrophotometers Shimadzu).

E. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi sawo kecik Daun sawo kecik yang diperoleh dari pohon sawo kecik pada kompleks Gereja Katolik Hati Kudus Tuhan Yesus, Ganjuran, Bantul diidentifikasi di Laboratorium Kebun Tanaman Obat Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. 2. Skrining fitokimia a. Pembuatan serbuk simplisia. Daun sawo kecik dicuci dengan air mengalir, diangin-anginkan, dikeringkan dengan oven pada suhu 40°C hingga kering (mudah dihancurkan), dan dihaluskan dengan blender. b. Uji alkaloid (Anonim, 1989). Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 0,5 g ditambah 1 mL HCl 2 N dan 9 mL akuades, dipanaskan di atas waterbath selama 2 menit. Campuran didinginkan dan disaring. Filtrat kemudian dibagi menjadi 3 bagian:


18

1) Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah 2 tetes pereaksi Mayer, akan terbentuk endapan menggumpal berwarna putih atau kuning yang larut dalam metanol. 2) Filtrat sebanyak 3 tetes ditambah pereaksi Bouchardat, akan terbentuk endapan berwarna coklat hingga hitam. 3) Jika terjadi endapan pada kedua percobaan, maka simplisia kemungkinan mengandung alkaloid. Sebaliknya, jika tidak terjadi endapan pada kedua percobaan, maka simplisia tidak mengandung alkaloid. Filtrat ke-3 digunakan untuk prosedur berikutnya. Sisa filtrat dikocok dengan 3 mL amonia pekat dan 10 mL campuran eter:kloroform (3:1). Fase organik diambil, ditambah natrium sulfat anhidrat, dan disaring. Filtrat diuapkan di atas waterbath dan residu yang diperoleh dilarutkan dengan sedikit HCl 2 N. Larutan diuji dengan: 1) asam fosfomolibdat atau asam foswolframat 2) Bouchardat atau Wagner 3) Mayer atau Dragendorff atau Marme 4) Hager Jika pada pengujian terdapat paling sedikit 2 golongan yang bereaksi, maka simplisia positif mengandung alkaloid. c. Uji saponin (Anonim, 1989). Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dimasukkan dalam tabung reaksi, ditambah 10 mL akuades panas. Campuran didinginkan dan dikocok kuat-kuat selama 10 detik. Saponin positif jika terbentuk buih 1 – 10 cm, tidak kurang dari 10 menit dan tidak hilang pada penambahan HCl 2 N.


19

d. Uji tanin (Sutrisno, 1986; Odebiyi and Sofowora, 1978). Larutan besi (III) ammonium sulfat 0,5 N diencerkan dengan air 5 kali volume awal. Larutan tersebut diteteskan pada cuplikan simplisia. Tanin positif ditandai dengan warna hijau atau biru sampai hitam. Metode lainnya adalah dengan memasukkan 0,5 g ekstrak ke dalam 10 mL kalium hidroksida 10% yang dibuat baru dan dikocok untuk melarutkan. Tanin positif ditandai dengan keberadaan endapan kotor. e. Uji triterpenoid dan steroid (Harborne, 1998; Shah and Seth, 2010). Serbuk simplisia (0,5 g) diekstraksi dengan etanol (dimaserasi dan difiltrasi), dievaporasi hingga kering (dalam oven), dan diekstraksi dengan kloroform (dengan perbandingan ekstrak : penyari (1:5)). Hasilnya disaring dengan kapas, kemudian ditambah asam asetat anhidrat dan dilanjutkan dengan H2SO4 pekat. Terbentuknya cincin ungu hingga biru pada batas kedua cairan menandakan adanya triterpenoid atau steroid. f. Uji flavonoid (Anonim, 1989). Sebanyak 0,5 g serbuk diekstraksi dengan 10 mL metanol, menggunakan alat pendingin balik selama 10 menit. Cairan panas disaring menggunakan kertas saring berlipat, kemudian filtrat diencerkan dengan 10 mL air. Setelah dingin, larutan ditambah 5 mL eter minyak tanah, dikocok hati-hati, dan didiamkan. Lapisan metanol (lapisan bawah) diambil, diuapkan pada suhu 40°C di bawah tekanan. Residu hasil evaporasi dilarutkan dalam 5 mL etil asetat dan disaring untuk mendapatkan larutan percobaan: 1) Sebanyak 1 mL larutan percobaan diuapkan hingga kering (di atas waterbath), residunya dilarutkan dalam 1 mL etanol 95%, kemudian ditambahkan 0,5 g


20

serbuk seng dan 2 mL asam klorida 2N, dan didiamkan selama 1 menit. Kemudian ditambahkan 10 tetes asam klorida pekat, jika dalam waktu 2 sampai 5 menit terjadi warna merah intensif, menunjukkan adanya flavonoid. 2) Sebanyak 1 mL larutan percobaan diuapkan hingga kering (di atas waterbath), residunya dilarutkan dalam 1 mL etanol 95%, kemudian ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 10 tetes HCl pekat. Jika terjadi warna merah jingga sampai merah ungu menunjukkan flavonoid positif. Jika terjadi warna kuning jingga, menunjukkan adanya flavon, kalkon, dan auron. 3) Sebanyak 1 mL larutan percobaan diuapkan hingga kering (di atas waterbath), residunya dibasahkan dengan aseton, ditambah serbuk halus asam borat dan serbuk halus asam oksalat, dan dipanaskan secara hati-hati di atas waterbath. Sisa yang diperoleh dicampur dengan 10 mL eter dan diamati di bawah sinar UV 366 nm; larutan berfluorosensi kuning intensif menunjukkan adanya flavonoid. 3. Pembuatan ekstrak etanolik daun sawo kecik Serbuk simplisia yang telah diblender dimasukkan dalam bejana maserasi, ditambah etanol 70% hingga terendam sempurna dengan perbandingan serbuk : cairan penyari (1:5), dan diaduk homogen. Kemudian campuran dimaserasi pada suhu ruang selama 48 jam dengan kecepatan 140 rpm. Setelah itu, dilakukan penyaringan dengan corong Buchner. Filtratnya yang disimpan dalam lemari pendingin, sedangkan residunya diremaserasi dengan etanol 70% sejumlah penyari awal selama 48 jam dengan kecepatan 140 rpm. Kemudian, dilakukan penyaringan dengan corong Buchner dan diambil filtratnya. Filtrat pertama dicampur dengan filtrat kedua dan disaring kembali dengan corong


21

Buchner. Filtrat hasil penyaringan dievaporasi dengan vacuum rotary evaporator dan oven hingga didapatkan ekstrak kering etanolik daun sawo kecik. 4. Uji kualitatif DPPH dengan kromatografi lapis tipis (KLT) Fase diam yang digunakan adalah silica gel 60 GF-254. Fase gerak dibuat 3 macam, yakni: a. Etil asetat : metanol : akuades (40:5,4:4) [EMW] (polar/netral) b. Kloroform : etil asetat : formic acid (5:4:1) [CEF] (semi-polar/asam) c. Benzena : etanol : amonium hidroksida (90:10:1) [BEA] (non-polar/basa) Sebanyak 1% larutan uji dan asam askorbat (baku) dalam metanol p.a. dibuat. Setelah 3 chamber dijenuhkan dengan fase gerak yang berbeda, dilakukan penotolan larutan uji (dengan 3 replikasi) dan larutan baku pada 3 pelat KLT menggunakan pipa kapiler. Kemudian ketiga pelat tersebut dimasukkan ke dalam ketiga chamber yang telah dijenuhkan untuk dielusi setinggi 10 cm. Setelah elusi selesai pelat-pelat tersebut diangkat, dibiarkan mengering, dan disemprot dengan larutan DPPH 0,2% pada lemari asam. Latar belakang pelat akan berwarna ungu dan warna kuning pada bercak mencerminkan adanya aktivititas antioksidan. Intensitas warna diamati selama 10 menit yang menandakan besarnya aktivitas antioksidan. 5. Penentuan operating time (OT) ekstrak etanolik daun sawo kecik Sebanyak 25 mg ekstrak dimasukkan dalam labu ukur 50 mL dan ditambah metanol p.a. hingga tanda batas sebagai larutan stok (500 µg/mL). Kemudian sebanyak 10 mL larutan stok diambil, dimasukkan dalam labu ukur 50 mL, dan ditambah metanol p.a. hingga tanda batas sebagai larutan intermediet


22

(100 µg/mL). Kemudian sebanyak 4, 6, dan 8 mL diambil dari larutan intermediet, dimasukkan dalam labu ukur 100 mL, dan ditambah metanol p.a. hingga tanda batas (4, 6, dan 8 µg/mL). Selain itu, sebanyak 3,9 mg DPPH dimasukkan dalam labu ukur 100 mL dan ditambah metanol p.a. hingga tanda batas (DPPH 0,1 mM). Sebanyak 5 mL dari masing-masing konsentrasi (4, 6, dan 8 µg/mL) dimasukkan dalam tabung reaksi berbeda, ditambah larutan DPPH 0,1 mM sebanyak 5 mL, di-vortex selama 30 detik, didiamkan selama 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, dan 60 menit, dan diukur dengan spektrofotometer visibel dengan panjang gelombang teoretis 517 nm. 6. Penentuan operating time (OT) baku pembanding asam askorbat Sebanyak 25 mg asam askorbat dimasukkan dalam labu ukur 50 mL dan ditambah metanol p.a. hingga tanda batas sebagai larutan stok (500 µg/mL). Kemudian sebanyak 10 mL larutan stok diambil, dimasukkan dalam labu ukur 50 mL, dan ditambah metanol p.a. hingga tanda batas sebagai larutan intermediet (100 µg/mL). Kemudian sebanyak 2, 4, dan 6 mL diambil dari larutan intermediet, dimasukkan dalam labu ukur 100 mL, dan ditambah metanol p.a. hingga tanda batas (2, 4, dan 6 µg/mL). Selain itu, sebanyak 3,9 mg DPPH dimasukkan dalam labu ukur 100 mL dan ditambah metanol p.a. hingga tanda batas (DPPH 0,1 mM). Sebanyak 5 mL dari masing-masing konsentrasi (2, 4, dan 6 µg/mL) dimasukkan dalam tabung reaksi berbeda, ditambah larutan DPPH 0,1 mM sebanyak 5 mL, di-vortex selama 30 detik, didiamkan selama 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, dan 60 menit, dan diukur dengan spektrofotometer visibel dengan panjang gelombang teoretis 517 nm.


23

7. Penentuan panjang gelombang absorbansi maksimum (λmaks) Sebanyak 3,9 mg DPPH dimasukkan dalam labu ukur 100 mL dan ditambah metanol p.a. hingga tanda batas (DPPH 0,1 mM). Sebanyak 2,5 mL, 5 mL, dan 7,5 mL diambil dari DPPH 0,1mM, dimasukkan dalam labu ukur 10 mL, dan ditambah metanol p.a. hingga tanda batas. Larutan di-vortex selama 30 detik dan didiamkan selama Operating Time (OT). Kemudian dilakukan scanning panjang gelombang maksimum (λmaks) dari 400 – 600 nm. 8. Uji kuantitatif DPPH dengan spektrofotometri visibel a. Pengukuran absorbansi kontrol. Sebanyak 3,9 mg DPPH dimasukkan dalam labu ukur 100 mL dan ditambah metanol p.a. hingga tanda batas (DPPH 0,1 mM). Kemudian, sebanyak 10 mL DPPH 0,1 mM dimasukkan dalam tabung reaksi., di-vortex selama 30 detik, dan dibaca absorbansinya pada OT dan λmaks. Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali. Pengukuran ini digunakan sebagai kontrol terhadap pengukuran absorbansi larutan pembanding asam askorbat dan larutan uji ekstrak etanolik daun sawo kecik. b. Pengukuran larutan pembanding asam askorbat dan larutan uji ekstrak etanolik daun sawo kecik. Sebanyak 25 mg ekstrak dimasukkan dalam labu ukur 50 mL dan ditambah metanol p.a. hingga tanda batas sebagai larutan stok (500 µg/mL). Kemudian sebanyak 10 mL larutan stok diambil, dimasukkan dalam labu ukur 50 mL, dan ditambah metanol p.a. hingga tanda batas sebagai larutan intermediet (100 µg/mL). Kemudian sebanyak 4, 5, 6, 7, dan 8 mL diambil dari larutan intermediet, dimasukkan dalam labu ukur 100 mL, dan ditambah metanol p.a. hingga tanda batas (4, 5, 6, 7, dan 8 µg/mL).


24

Sebanyak 25 mg asam askorbat dimasukkan dalam labu ukur 50 mL dan ditambah metanol p.a. hingga tanda batas sebagai larutan stok (500 µg/mL). Kemudian sebanyak 10 mL larutan stok diambil, dimasukkan dalam labu ukur 50 mL, dan ditambah metanol p.a. hingga tanda batas sebagai larutan intermediet (100 µg/mL). Kemudian sebanyak 2, 3, 4, 5, dan 6 mL diambil dari larutan intermediet, dimasukkan dalam labu ukur 100 mL, dan ditambah metanol p.a. hingga tanda batas (2, 3, 4, 5, dan 6 µg/mL). Selain itu, sebanyak 3,9 mg DPPH dimasukkan dalam labu ukur 100 mL dan ditambah metanol p.a. hingga tanda batas (DPPH 0,1 mM). Sebanyak 5 mL dari masing-masing konsentrasi ekstrak (4, 5, 6, 7, dan 8 µg/mL) maupun asam askorbat (2, 3, 4, 5, dan 6 µg/mL) dimasukkan dalam tabung reaksi berbeda, ditambah larutan DPPH 0,1 mM sebanyak 5 mL, di-vortex selama 30 detik, didiamkan selama OT, dan dibaca pada spektrofotometer visibel pada λmaks. Replikasi dilakukan sebanyak 3 kali. c. Estimasi aktivitas antioksidan. Hasil prosedur 8 a dan 8 b dihitung aktivitas antioksidannya dalam IC50.

F. Analisis Hasil 1. Determinasi sawo kecik Identifikasi dilakukan untuk meyakinkan bahwa bahan uji yang digunakan benar-benar daun sawo kecik sehingga menghindari kesalahan dalam pengambilan bahan dan menjaga kemurniannya dari bahan lainnya. Hasil


25

identifikasi berupa surat keterangan hasil identifikasi daun sawo kecik dari laboratorium tersebut. 2. Skrining fitokimia Skrining fitokimia dilakukan untuk mengetahui kandungan fitokimia yang ada dalam daun sawo kecik. Hasil uji berupa perubahan warna atau endapan yang terbentuk sesuai dengan pustaka acuan. 3. Uji kualitatif DPPH dengan kromatografi lapis tipis (KLT) Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui apakah ekstrak etanolik daun sawo kecik dapat berfungsi sebagai antioksidan atau tidak. Hasilnya dinyatakan dengan warna pada bercak setelah disemprot dengan pereaksi DPPH. Warna kuning menunjukkan adanya aktivitas antioksidan. 4. Uji kuantitatif DPPH dengan spektrofotometri visibel Pengujian kuantitatif DPPH akan menentukan seberapa besar aktivitas antioksidan ekstrak etanolik daun sawo kecik yang ditetapkan dengan nilai IC50. Data nilai IC50 diuji normalitas distribusinya dengan metode Shapiro-Wilk dan dilanjutkan dengan uji parametrik (untuk distribusi normal) atau uji nonparametrik (untuk distribusi tidak normal) untuk perbandingan nilai rata-rata IC50 ekstrak etanolik daun sawo kecik dengan nilai IC50 asam askorbat. Pengujian statistik dilakukan dengan bantuan software R 2.1.4.1.


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Determinasi Sawo Kecik Langkah pertama dalam penelitian adalah melakukan determinasi pada tanaman guna mengetahui ketepatan identitas tanaman yang akan dipergunakan. Kebenaran identitas tanaman digunakan untuk menghindari adanya kemungkinan kesalahan dalam pengambilan sampel pada analisis fitokimia (Harborne, 1987). Daun sawo kecik diperoleh dari Gereja Katolik Hati Kudus Tuhan Yesus, Ganjuran, Bantul pada tanggal 3 Januari 2013 pada jam 10.00 WIB dan dipreparasi sesuai tata cara penelitian. Hasil determinasi tanaman (lampiran 1) menyatakan kebenaran tanaman yang diteliti, yakni Manilkara kauki (L.) Dubard atau sawo kecik.

B. Hasil Skrining Fitokimia Skrining fitokimia dilakukan untuk mengetahui kandungan fitokimia yang ada dalam daun sawo kecik. Menurut Khare (2007), seluruh bagian tanaman sawo kecik mengandung taraxerol (triterpenoid), triterpene ketone (triterpenoid), α- dan β-amyrin (triterpenoid), sinamat (fenilpropanoid), α-spinasterol (steroid), β-sitosterol (steroid), β-D-glukosida (glikosida), kuersitol (inositol), kuersetin dan dihidroderivat kuersetin (flavonoid), dan asam ursolat (triterpenoid). Penulis melakukan skrining fitokimia meliputi golongan alkaloid, flavonoid, saponin, tanin, steroid dan triterpenoid, yang mengacu pada penelitian Mustikasari dan Ariyani (2010) serta Susmiati (2010). Hasil skrining fitokimia yang dilakukan

26


27

menunjukkan bahwa daun sawo kecik mengandung tanin (berwarna hijau kehitaman dengan penambahan besi (III) ammonium sulfat 0,5 N [Gambar 2a]; terdapat endapan kotor setelah dikocok dengan kalium hidroksida [Gambar 2b]) dan flavonoid (hasil positif kuning jingga, yang menandakan keberadaan flavon, kalkon, atau auron, pada pemberian serbuk magnesium dan asam klorida [Gambar 4], hasil negatif pada kedua metode lainnya (warna abu-abu pada pemberian serbuk seng dan asam klorida [Gambar 3]; warna hijau dengan pemberian asam borat dan asam oksalat di bawah sinar UV 366 nm)), tetapi tidak mengandung saponin (tidak timbul busa setelah dikocok) [Gambar 6], alkaloid (tidak ada endapan pada penambahan Mayer atau Bouchardat) [Gambar 7 dan 8], steroid dan triterponoid (cincin berwarna coklat) [Gambar 5]. Hasil ini sedikit berbeda dengan yang telah disampaikan oleh Khare (2007). Adanya hasil positif pada tanin memungkinkan adanya senyawa baru pada tanaman ini untuk diteliti lebih lanjut. Ketidakadaan steroid dan triterpenoid pada pengujian dapat dikarenakan oksidasi dari kedua asam (asam asetat anhidrat dan asam sulfat pekat) juga mengoksidasi zat lain pada ekstrak yang jumlahnya lebih banyak daripada triterpenoid dan steroid. Tabel II. Hasil skrining fitokimia

Uji

Reagen

Tanin (Metode Sutrisno)

Besi (III) ammonium sulfat

Hasil Positif Menurut Acuan Hijau atau biru sampai hitam

Tanin (Metode Odebiyi dan Sofowora)

Kalium hidroksida

Adanya endapan kotor

Hasil Pengujian

Gambar

Hijau sampai hitam

2 (a)

Terdapat endapan kotor

2 (b)


Flavonoid

Flavonoid

Flavonoid

Serbuk seng, asam klorida Serbuk magnesium, asam klorida Aseton, asam borat, asam oksalat, eter

Asam asetat Triterpenoid/Steroid anhidrat, asam sulfat

Saponin

Akuades panas

Alkaloid

Mayer

Alkaloid

Bouchardat

28

Merah intensif dalam 2-5 menit

Abu-abu

3

Kuning jingga

Kuning jingga

4

Fluoresensi hijau

N/A

Terbentuk cincin coklat

5

Tidak ditemukan buih

6

Tidak terbentuk endapan

7

Tidak terbentuk endapan

8

Fluoresensi kuning intensif Terbentuk cincin ungu hingga biru pada batas kedua cairan Terbentuk buih 1-10 cm Terbentuk endapan putih atau kuning yang larut dalam metanol Terbentuk endapan coklat hingga hitam


(a)

(b)

Gambar 2. (a) Uji tanin dengan metode Sutrisno (1986); (b) Uji tanin dengan metode Odebiyi dan Sofowora (1978)

Gambar 3. Uji flavonoid dengan serbuk seng dan asam klorida

Gambar 4. Uji flavonoid dengan serbuk magnesium dan asam klorida

29


Gambar 5. Uji triterpenoid/steroid

Gambar 6. Uji saponin

30


31

Gambar 7. Uji alkaloid dengan reagen Mayer

Gambar 8. Uji alkaloid dengan reagen Bouchardat

C. Hasil Uji Kualitatif DPPH dengan KLT Pengujian kualitatif DPPH dilakukan untuk mengetahui apakah senyawa dalam ekstrak etanolik daun sawo kecik memiliki aktivitas antioksidan atau tidak. Untuk pengujian secara kualitatif, pengujian antioksidan dengan metode DPPH dilakukan secara kromatografi lapis tipis. Zat yang telah terelusi disemprot


32

dengan reagen DPPH 0,2% dalam metanol (Masoko and Eloff, 2007). Hasil positif ditunjukkan apabila timbul bercak berwarna kuning dan jika intensitasnya tidak memudar dalam waktu 10 menit menandakan aktivitas antioksidan yang cukup tinggi. Hasil dari penelitian menunjukkan bahwa pemisahan terbaik ekstrak daun sawo kecik ditunjukkan pada fase gerak polar/netral (EMW) dengan nilai Rf 0,80 (Gambar 9), pemisahan kurang baik pada fase gerak semi-polar/asam (CEF) dengan nilai Rf 0,05 (Gambar 10), dan tidak terjadi pemisahan fase gerak nonpolar/basa (BEA) atau nilai Rf 0,00 (Gambar 11). Zat yang digunakan sebagai pembanding (kontrol positif) adalah asam askorbat. Hasil dari penelitian menunjukkan bahwa asam askorbat hanya menunjukkan pemisahan pada fase gerak polar/netral (EMW) dengan Rf 0,40 (Gambar 9). Asam askorbat dapat terelusi sempurna karena merupakan zat murni. Pada gambar, didapatkan hasil bahwa senyawa uji ekstrak etanolik daun sawo kecik dan senyawa pembanding asam askorbat mempunyai aktivitas antioksidan. Hal ini ditandai dengan adanya perubahan warna dari ungu menjadi kuning pada bercak-bercak. Baik ekstrak etanolik daun sawo kecik maupun asam askorbat mengalami peningkatan intensitas setelah 2 menit dan tidak memudar selama 10 menit. Hal ini menggambarkan kemungkinan bahwa ekstrak etanolik daun sawo kecik maupun asam askorbat merupakan antioksidan dengan kekuatan yang cukup poten.


(a)

(b)

Gambar 9. (a) Kromatogram KLT uji kualitatif antioksidan (EMW) sebelum didiamkan selama 10 menit; (b) sesudah didiamkan selama 10 menit Keterangan: A, B, C: ekstrak etanolik daun sawo kecik D: asam askorbat Fase diam: Silica gel 60 GF-254 Fase gerak: Etil asetat : metanol : akuades (40:5,4:4) Jarak elusi: 10 cm Deteksi dengan DPPH 0,2% Rf A, B, C: 0,80 Rf D: 0,40

33


(a)

(b)

Gambar 10. (a) Kromatogram KLT uji kualitatif antioksidan (CEF) sebelum didiamkan selama 10 menit; (b) sesudah didiamkan selama 10 menit Keterangan: A, B, C: ekstrak etanolik daun sawo kecik D: asam askorbat Fase diam: Silica gel 60 GF-254 Fase gerak: Kloroform : etil asetat : formic acid (5:4:1) Jarak elusi: 10 cm Deteksi dengan DPPH 0,2% Rf A, B, C: 0,05 Rf D: 0,00

34


35

Gambar 11. Kromatogram KLT uji kualitatif antioksidan (BEA) sesudah didiamkan selama 10 menit Keterangan: A, B, C: ekstrak etanolik daun sawo kecik D: asam askobat Fase diam: Silica gel 60 GF-254 Fase gerak: Benzena : etanol : amonium hidroksida (90:10:1) Jarak elusi: 10 cm Deteksi dengan DPPH 0,2% Rf A, B, C, D: 0,00

D. Hasil Uji Kuantitatif DPPH Berdasarkan berbagai jurnal acuan, panjang gelombang yang dapat digunakan sebagai working wavelength adalah 515-520 nm. Operating Time (OT) yang optimal adalah 30 menit, namun dapat digunakan waktu yang lebih singkat (5 atau 10 menit) pada jenis substrat yang berbeda. Sehingga pemilihan OT tergantung pada hasil optimasi (Molyneux, 2004). Hasil optimasi OT dan λmaks yang didapat pada penelitian adalah 30 menit dan 515 nm (Lampiran 3) yang mana sesuai dengan pernyataan Molyneux (2004). Scanning terhadap metanol (Lampiran 4) yang berfungsi sebagai pelarut juga dilakukan untuk memastikan


36

bahwa penggunaan metanol tidak memberikan serapan supaya tidak mengganggu hasil dari pembacaan absorbansi. Optimasi OT (Operating Time) dilakukan untuk menetapkan waktu ketika larutan pembanding maupun larutan uji telah mereduksi radikal DPPH dengan sempurna (reaksi telah berjalan sempurna) sehingga dapat diperoleh absorbansi yang stabil. Absorbansi yang stabil memastikan reprodusibilitas dan meminimalkan terjadinya kesalahan pada analisis. Penentuan OT dilakukan pada λ teoretis DPPH yakni 517 nm tiap 5 menit selama 60 menit baik pada larutan pembanding maupun larutan uji. Dapat dilihat pada gambar 12 dan 13 bahwa OT yang didapat dan akan digunakan adalah 30 menit. 0.45

Absorbansi (Abs)

0.4 0.35 0.3

2 µg/mL

0.25

4 µg/mL 6 µg/mL

0.2 0.15 0

10

20

30

40

50

60

70

Waktu (menit)

Gambar 12. Grafik optimasi OT asam askorbat


37

Absorbansi (Abs)

0.5

0.45

0.4

4 µg/mL 6 µg/mL

0.35

8 µg/mL

0.3 0

10

20

30

40

50

60

70

Waktu (menit)

Gambar 13. Grafik optimasi OT ekstrak etanolik daun sawo kecik Optimasi λmaks dilakukan untuk mengetahui panjang gelombang yang dapat memberikan serapan tertinggi dengan sensitivitas tertinggi (terdapat perbedaan absorbansi dengan sedikit perbedaan konsentrasi). Dilakukan pada 3 jenis konsentrasi untuk memastikan bahwa pada konsentrasi manapun tetap akan memberikan serapan tertinggi yang konstan. Optimasi λmaks dilakukan pada hasil OT yang telah dilakukan sebelumnya (30 menit). Panjang gelombang yang didapat adalah 515 nm (gambar 14). C B A

Gambar 14. Optimasi λmaks DPPH pada 3 jenis konsentrasi (A: 2,5 µg/mL, B: 5 µg/mL, dan 7,5 µg/mL)


38

Hasil dari optimasi OT dan λmaks digunakan untuk pengukuran aktivitas antioksidan. Sebelum melakukan pengukuran aktivitas antioksidan, perlu dilakukan pengukuran pada pelarut yang digunakan sebagai kontol negatif. Dalam hal ini pelarut yang digunakan adalah metanol. Hasil scanning pelarut metanol menunjukkan tidak adanya serapan (Lampiran 4). Untuk

mendapatkan

nilai

IC50

yang

menggambarkan

aktivitas

antioksidan, dilakukan pengukuran dengan 5 konsentrasi uji yang berbeda yang kemudian ditetapkan % IC dari tiap-tiap konsentrasi. Setelah dilakukan perhitungan % IC, dilakukan perhitungan regresi linier antara konsentrasi larutan uji/pembanding dengan % IC. Pada kurva persamaan regresi linier asam askorbat didapatkan persamaan y = 6,584x + 30,846 (replikasi 1) dengan nilai r terbaik yakni 0,9947. Sedangkan pada kurva persamaan regresi linier ekstrak etanolik daun sawo kecik didapatkan persamaan y = 3,168x + 34,046 (replikasi 1) dengan nilai r terbaik yakni 0,9944. 75 70 65 y = 6,584x + 30,846 r = 0,9947

% IC

60 55 50 45 40 35 30 0

2

4

6

8

Konsentrasi (µg/mL)

Gambar 15. Kurva persamaan regresi linier asam askorbat

10


39

65 60

y = 3,168x + 34,046 r = 0,9944

%IC

55 50 45 40 0

2

4

6

8

10

Konsentrasi (µg/mL)

Gambar 16. Kurva persamaan regresi linier ekstrak etanolik daun sawo kecik Dari lampiran 5, sub-bagian 4 didapatkan bahwa IC50 asam askorbat adalah 3,03±0,15 µg/mL, sedangkan IC50 ekstrak etanolik daun sawo kecik adalah 5,00±0,04 µg/mL. Dari data tersebut dapat disimpulkan bahwa keduanya merupakan antioksidan sangat aktif (< 50 µg/mL) menurut penggolongan Jun et al. (2003). Guna memastikan ada atau tidaknya perbedaan yang bermakna antara IC50 asam askorbat dengan IC50 ekstrak etanolik daun sawo kecik, maka digunakanlah pengujian secara statistik. Oleh karena jumlah data yang kecil (kurang dari 50 data), maka digunakan metode Shapiro-Wilk untuk pengujian normalitas. Setelah itu dilanjutkan dengan uji parametrik (untuk data dengan distribusi normal) atau non-parametrik (untuk data dengan distribusi tidak normal). Hasil uji normalitas menunjukkan bahwa baik asam askorbat maupun ekstrak etanolik daun sawo kecik mengikuti distribusi normal karena p-value dari


40

keduanya lebih dari 0,05 (p-value asam askorbat 0,1623; p-value ekstrak etanolik daun sawo kecik 0,8428). Oleh karena hasil uji normalitas menunjukkan keduanya mengikuti distribusi normal, maka digunakan uji parametrik yakni uji T tidak berpasangan. Uji ini dilakukan karena kedua sampel berdiri secara individu dan tidak saling bergantung satu sama lainnya. Pada uji ini nilai H0 (Hipotesis nol) adalah IC50 asam askorbat yang tidak lebih kecil daripada IC50 ekstrak etanolik daun sawo kecik, sedangkan nilai H1 (Hipotesis alternatif) adalah nilai IC50 asam askorbat yang lebih kecil daripada IC50 ekstrak etanolik daun sawo kecik. Hasil pengujian statistik menunjukkan p-value sebesar 4,58x10-5 yang lebih kecil dibanding p-value yang ditentukan yakni 0,05. Oleh karena itu, H0 ditolak karena nilai signifikansi yang didapat di bawah nilai signifikansi yang ditentukan, sehingga dapat disimpulkan bahwa IC50 asam askorbat lebih rendah dibanding IC50 ekstrak etanolik daun sawo kecik.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan 1. Daun sawo kecik memiliki aktivitas antioksidan. 2. Nilai IC50 ekstrak etanolik daun sawo kecik sebesar 5,00±0,04 µg/mL (aktivitas antioksidan sangat aktif) pada pengujian dengan menggunakan DPPH.

B. Saran Perlu dilakukan isolasi lebih lanjut pada bercak kromatogram KLT pada uji antioksidan kualitatif untuk mengetahui kandungan fitokimia yang paling berperan pada daun sawo kecik.

41


42

DAFTAR PUSTAKA Anonim, 1989, Materia Medika Indonesia, Jilid V, Departemen Kesehatan, Jakarta, hal. 549, 552-553. Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, Departemen Kesehatan, Jakarta, hal. 7. Anonim, 2000, Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat, Departemen Kesehatan, Jakarta, hal. 10-11. Anonim, 2010, Australian Tropical Rainforest Plants, http://keys.trin.org.au/keyserver/data/0e0f0504-0103-430d-8004060d07080d04/media/Html/taxon/Manilkara_kauki.htm, diakses tanggal 22 Maret 2013. Anonim, 2011, Flora Identitas Kabupaten/Kota di Provinsi Daerah Istimewa Yogyakarta, http://bk.menlh.go.id/florafauna/12diy/_12diy_flora.htm, diakses tanggal 19 Oktober 2012. Belleville-Nabet, F., 1996, Zat Gizi Antioksidan Penangkal Senyawa Radikal Pangan dalam Sistem Biologis, Prosiding Seminar Senyawa Radikal dan Sistem Pangan: Reaksi Biomolekuler, Dampak terhadap Kesehatan dan Penangkalan, CFNS, IPB dan Kedutaan Besar Perancis, Jakarta. Bhat, N., Shivaprakasan, M.L., and Jayarajan, R., 1994, Antifungal activity of some plant extracts, Indian J For, 17, 10-14. Carter, J.W., Madl, R., and Padula, F., 2006, Wheat antioxidants suppress intestinal tumor activity in Min mice, Nutrition Research, Volume 26, Issue 1, 33-38. Chawda, H.S., 2011, Prospective Study of Antioxidants, Its Mechanism and Potential Role in Cancer, International Journal of Research in Pharmaceutical and Biomedical Sciences, Vol 2 (3), 888-894. Dehpour, A.A., Ebrahimzadeh, M.A., Fazel, N.S., and Mohammad, N.S., 2009, Antioxidant activity of the methanol extract of Ferula assafoetida and its essential oil composition, Grasas Y Aceites, 60 (4), 405-412. Duke, J.A., 2012, Dr. Duke’s Phytochemical and Ethnobotanical Databases, http://www.ars-grin.gov/cgibin/duke/ethnobot.pl?ethnobot.taxon=Manilkara%20kauki, diakses tanggal 19 Oktober 2012. Gulcin, I., Uguz, M.T., Oktay, M., Beydemir, S., and Kufrevioglu, O.I., 2004, Evaluation of the Antioxidant and Antimicrobial Activities of Clary Sage (Salvia sclarea L.), Turk. J. Agric. For., 28, 25-33. Harborne, J.B., 1987, Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan, Penerbit ITB, Bandung, hal. 6. Harborne, J.B., 1998, Phytochemical Methods: A Guide to Modern Technique of Plant Analysis, Chapman & Hall, London, pp. 129. Hari, S., 1995, Free Radicals: A Major Cause of Aging and Disease, http://www.consumerhealth.org/articles/display.cfm?ID=1999030317253 3, diakses tanggal 19 Oktober 2012.


43

Jun, M.H.Y., Yu, J., Fong, X., Wan, C.S., Yang, C.T., and Ho, 2003, Comparison of antioxidant activities of isoflavones from kudzu roots (Pueraria labata Ohwl), J. Food Sci., Institute of Technologist, 68, 2117-2122. Khare, C.P., 2007, Indian Medicinal Plants: An Illustrated Dictionary, SpringerVerlag, New Delhi, pp. 397-398. Marxen, K., Vanselow, K.H., Lippemeier, S., Hintze, R., Ruser, A., and Hansen, U., 2007, Determination of DPPH Radical Oxidation Caused by Methanolic Extracts of Some Microalgal Species by Linear Regression Analysis of Spectrophotometric Measurements, Sensors, Vol. 7, 20802095. Masoko, P., and Eloff, J.N., 2007, Screening of Twenty-Four South African Combretum and Six Terminalia Species (Combretaceae) for Antioxidant Activities, Afr J Trad CAM, 4 (2), 231-239. Mathias-Mundy, E., and Murdiati, T.B., 1991, Traditional Veterinary Medicine for Small Ruminants in Java, Indonesian Small Ruminant Network, Bogor, pp. 4. Mbata, T.I., 2010, Antioxidant Nutrients: Beneficial or Harmful, Internet Journal of Food Safety V, 7, 29-33. Molyneux, P., 2004, The use of the stable free radical diphenylpicrylhydrazyl (DPPH) for estimating antioxidant activity, Songklanakarin J. Sci. Technol., 26 (2), 211-219. Mulja, M., dan Suherman, 1995, Analisis Instrumental, Airlangga University Press, Surabaya, hal. 224-228. Mustikasari, K., dan Ariyani, D., 2010, Skrining Fitokimia Ekstrak Metanol Biji Kalangkala (Litsea angulata), Sains dan Terapan Kimia, Vol. 4, No. 2, 131-136. Odebiyi, O.O., and Sofowora, E.A., 1978, Phytochemical screening of Nigerian medicinal plants II, Lloydia, 41(3), 234-246. Sarker, S.D., Latif, Z., and Grey, A.I., 2006, Natural Products Isolation, Second Edition, Humana Press, Inc., New Jersey, pp. 20. Savatovic, S.M., Cetkovic, G.S., Canadanovic-Brunet, J.M., and Djilas, S.M., 2012, Kinetic behaviour of the DPPH radical-scavenging activity of tomato waste extracts, J. Serb. Chem. Soc., 77(0), 1-12. Shah, B., and Seth, A., 2010, Textbook of Pharmacognosy and Phytochemistry, Elsevier, Chennai, pp. 239-240. Shivaprasad, H.N., Mohan, S., Kharya, M.D., Shiradkar, M.R., and Lakshman, K., 2005, In-Vitro Models for Antioxidant Activity Evaluation: A Review, Pharmainfo Net, 3 (4), 1-11. Sing, Y.Y., 2007, Determination of Synthetic Phenolic Antioxidants in Food Items Using HPLC and Total Antioxidants Using Fia Approaches, Thesis, 3-5, Universiti Sains Malaysia, Penang. Supari, F., 1996, Radikal Bebas dan Patofisiologi Beberapa Penyakit, Prosiding Seminar Senyawa Radikal Bebas dan Sistem Pangan: Reaksi Biomolekuler, Dampak terhadap Kesehatan dan Penangkalan, Pusat Studi Pangan dan Gizi IPB dan Kedubes Perancis, Jakarta.


44

Susmiati, W., 2010, Isolasi dan Penentuan Aktivitas Antidiabet Fraksi Diklorometan Daun Salam (Syzigium polyantum) Asal Nusa Tenggara Barat (NTB), Skripsi, 32, Universitas Pendidikan Indonesia, Bandung. Sutrisno, R.B., 1986, Analisis Jamu, Penerbit Fakultas Farmasi Universitas Pancasila, Jakarta, hal. 113. Timm, M., 2000, α-Tocopherol in Meat and Meat Products: Influence of Feeding on α-Tocopherol Concentration, Quality Attributes and Storage Stability, Dissertation, 83. Vareltzis, K., Koufidis, D., Gavriilidou, E., Papavergou, E., and Vasiliadou, S., 1997, Effectiveness of a natural Rosemary (Rosmarinus officinalis) extract on the stability of filleted and minced fish during frozen storage, Zeitschrift für Lebensmitteluntersuchung und -Forschung A, 205 (2), 9396. Winarsi, H., 2007, Antioksidan Alami dan Radikal Bebas, Penerbit Kanisius, Yogyakarta, hal. 12-17, 26-28, 77-78, 260. Yatim, W., 2007, Kamus Biologi, Yayasan Obor Indonesia, Jakarta, hal. 369. Yuzammi, Witono, J.R., Hidayat, S., Handayani, T., Sugiarti, Mursidawati, S., dkk., 2010, Ensiklopedia Flora, Jilid III, PT Kharisma Ilmu, Jakarta, hal. 195-196.


LAMPIRAN Lampiran 1. Surat pengesahan determinasi tanaman sawo kecik

45


46

Lampiran 2. Gambar tanaman sawo kecik dari Gereja Katolik Hati Kudus Tuhan Yesus, Ganjuran, Bantul, Yogyakarta


Lampiran 3. Optimasi uji kuantitatif antioksidan 1. Penentuan Operating Time (OT) Waktu (menit) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Konsentrasi asam askorbat (µg/mL) 2 4 6 0,387 0,299 0,205 0,389 0,302 0,215 0,391 0,305 0,216 0,394 0,309 0,224 0,395 0,313 0,228 0,399 0,317 0,229 0,399 0,317 0,229 0,399 0,317 0,229 0,399 0,317 0,229 0,399 0,317 0,229 0,399 0,317 0,229 0,399 0,317 0,229

Konsentrasi ekstrak etanolik daun sawo kecik (µg/mL) 4 6 8 0,457 0,438 0,350 0,455 0,431 0,345 0,453 0,427 0,339 0,451 0,426 0,335 0,451 0,425 0,333 0,449 0,424 0,332 0,449 0,424 0,332 0,449 0,424 0,332 0,449 0,424 0,332 0,449 0,424 0,332 0,449 0,424 0,332 0,449 0,424 0,332

2. Penentuan λmaks a. Spektra DPPH 0,1 mM (2,5 mL) dengan metanol (7,5 mL)

Keterangan: Diperoleh λmaks = 515 nm

47


b. Spektra DPPH 0,1 mM (5 mL) dengan metanol (5 mL)

Keterangan: Diperoleh λmaks = 515 nm c. Spektra DPPH 0,1 mM (7,5 mL) dengan metanol (2,5 mL)

Keterangan: Diperoleh λmaks = 515 nm

48


Lampiran 4. Scanning metanol p.a.

Keterangan: Pada λ515 nm = Tidak ada serapan

49


50

Lampiran 5. Uji kuantitatif antioksidan 1. Hasil uji aktivitas antioksidan asam askorbat dengan DPPH Blank OD Absorbansi 1 Absorbansi 2 Absorbansi 3 Rata-rata % IC 1 % IC 2 % IC 3

0,888 0,888 0,886 0,887

Konsentrasi asam askorbat (µg/mL) 2 0,485 0,488 0,502 0,492 45,32 44,98 43,40

3 0,447 0,446 0,464 0,452 49,61 49,72 47,69

4 0,390 0,395 0,425 0,403 56,03 55,47 52,09

5 0,321 0,318 0,328 0,322 63,81 64,15 63,02

6 0,256 0,255 0,261 0,257 71,14 71,25 70,58

Persamaan regresi linier 1: y = 6,584x + 30,846 (nilai r = 0,9947) Persamaan regresi linier 2: y = 6,697x + 30,326 (nilai r = 0,9940) Persamaan regresi linier 3: y = 6,969x + 27,480 (nilai r = 0,9827) 2. Hasil uji aktivitas antioksidan ekstrak etanolik daun sawo kecik dengan DPPH Blank OD Absorbansi 1 Absorbansi 2 Absorbansi 3 Rata-rata % IC 1 % IC 2 % IC 3

0,888 0,888 0,886 0,887

Konsentrasi ekstrak etanolik daun sawo kecik (µg/mL) 4 5 6 7 8 0,478 0,441 0,412 0,386 0,365 0,476 0,439 0,413 0,388 0,367 0,478 0,434 0,413 0,384 0,364 0,477 0,438 0,413 0,386 0,365 46,11 50,28 53,55 56,48 58,85 46,34 50,51 53,44 56,26 58,62 46,11 51,07 53,44 56,71 58,96

Persamaan regresi linier 1: y = 3,168x + 34,046 (nilai r = 0,9944) Persamaan regresi linier 2: y = 3,031x + 34,848 (nilai r = 0,9941) Persamaan regresi linier 3: y = 3,134x + 34,454 (nilai r = 0,9894)


51

3. Contoh perhitungan %IC Nilai %IC konsentrasi asam askorbat 2 µg/mL (replikasi 1): %

−

= %

=

× 100%

0,887 − 0,485 × 100% = 45,32% 0,887

4. Perhitungan nilai IC50 IC50 Sampel Asam askorbat Ekstrak etanolik daun sawo kecik

Rep.1 (µg/mL)

Rep.2 (µg/mL)

Rep.3 (µg/mL)

Ratarata (µg/mL)

SD

% CV (%)

2,91

2,94

3,23

3,03

0,15

4,95

5,03

5,00

4,96

5,00

0,04

0,80

Persamaan regresi linier digunakan sesuai dengan %IC rata-rata yakni y = Bx + A y = aktivitas antioksidan (%IC) x = konsentrasi (µg/mL) Nilai IC50 adalah nilai x ketika y sebesar 50% Contoh perhitungan IC50 (Asam askorbat, replikasi 1): y = 6,584x + 30,846 50 = 6,584x + 30,846 x = 2,91 µg/mL Contoh perhitungan SD (Asam askorbat): SD =

(

̅)

=

( ,

,

)

( ,

,

)

( ,

,

)

=

Contoh perhitungan % CV (Asam askorbat): ( ) % = %

=

0,15 × 100% = 4,95% 3,03

,

= 0,15

× 100%


Lampiran 6. Uji statistika dengan R 2.1.4.1 1. Uji normalitas

2. Uji T tidak berpasangan

52


53

BIOGRAFI PENULIS

Skripsi dengan judul “Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Etanolik Daun Sawo Kecik (Manilkara kauki (L.) Dubard) Secara Kualitatif dan Kuantitatif dengan Metode DPPH” ditulis oleh Filbert Hita Kumaro. Penulis lahir di kota Magelang (Jawa Tengah) pada tanggal 29 Juni 1991 dan merupakan anak tunggal dari William Kwan dan Rosianawati. Pendidikan yang telah ditempuh penulis termasuk TK Regina Pacis Bogor (1995-1997), SD Regina Pacis Bogor (1997-2001), SBI Madania Bogor (2001-2003), dan Sevilla School Jakarta (2003-2009). Selanjutnya pada tahun 2009, penulis melanjutkan kuliah di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. Penulis berperan aktif sebagai Koordinator Sie. Dokumentasi OSIS Sevilla School periode 20072008. Selama perkuliahan, penulis pernah menjadi asisten dosen Praktikum Biokimia (2011), anggota humas (pengurus harian) Keluarga Mahasiswa Buddhis (2010), ketua panitia “Pengobatan Gratis” (2010), sekretaris panitia “Donor Darah JMKI” (2009), bendahara panitia “AIDS??? Don’t Know, Don’t Care!!!” (2010), anggota seksi konsumsi “Open House Paingan” (2009), dan anggota seksi acara “Latihan Kepemimpinan Keluarga Mahasiswa Buddhis” (2010). Penulis juga pernah menjadi anggota tim dalam pelatihan “Homeschooling Herbal Medicine” di Umbulharjo, Cangkringan (2012) dan koordinator tim dalam “Penyuluhan Penggunaan Obat Bebas dan Obat Bebas Terbatas yang Rasional” (2010). Di samping itu, penulis juga pernah mengikuti berbagai seminar dan beberapa pendidikan non-akademis seperti piano dan DJ.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Recommend Documents