PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI

PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK ETANOLIK DAUN PUKUL EMPAT (Mirabilis jalapa L.) TERHADAP VIABILITAS, APOPTOSIS DAN EKSPRESI RESEPTOR ESTROGEN-α SEL KANKER PAYUDARA T47D

SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi

Disusun Oleh: Andung Panjalu Vidityo NIM : 118114120

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2015


PENGARUH PEMBERIAN EKSTRAK ETANOLIK DAUN PUKUL EMPAT (Mirabilis jalapa L.) TERHADAP VIABILITAS, APOPTOSIS DAN EKSPRESI RESEPTOR ESTROGEN-α SEL KANKER PAYUDARA T47D

SKRIPSI Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) Program Studi Ilmu Farmasi

Disusun Oleh: Andung Panjalu Vidityo NIM : 118114120

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2015

i


ii


iii


HALAMAN PERSEMBAHAN

“Cast the burden upon the Lord, and He shall sustain thee: he shall never suffer the righteous to be moved” (Psalms 55:22)

“The Lord is my strength and my shield;

my heart

trusted in him, and I am helped: therefore my heart greatly rejoiceth; and with my song will I praise him “ (Psalms 28:7)

Kupersembahkan karyaku untuk Tuhan Yesus Kristus Bapak Supasdi Ibu Sukarsih My Sister : Yunita Ari Kurnianingsih and Karina Lismawati My whole family Almamaterku

iv


v


vi


PRAKATA

Syukur bagi Tuhan Yang Maha Esa karena atas berkat dan rahmatNya Penulis dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik. Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) program studi Farmasi. Penulis telah menerima banyak dukungan selama proses perkuliahan, penelitian dan penyusunan skripsi. Oleh karena itu, Penulis ingin mengucapkan terima kasih kepada: 1.

Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.

2.

Agustina Setiawati, M.Sc., Apt., selaku Dosen Pembimbing yang telah memberikan waktu, semangat, bimbingan, pengarahan, masukan dan pelajaran baik mengenai penelitian ataupun tentang kehidupan.

3.

Enade Perdana Istyastono, Ph.D., Apt., selaku Dosen Penguji yang telah memberikan waktu, mengajarkan program, memberikan kritik, dan saran kepada Penulis.

4.

Damiana Sapta Candrasari, S.Si., M.Sc., selaku Dosen Penguji yang telah memberikan waktu, kritik, dan saran kepada Penulis.

5.

Segenap dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah mengajar dan membimbing Penulis selama perkuliahan, serta memberi pesan-pesan moral.

vii


6.

Clara Dewi Anggraeni dan Winda Sekarjati yang telah bekerjasama, memahami dan mengerti satu dengan yang lain, memberi kritik dan saran, berbagi suka dan duka, dan kepercayaan selama proses pengerjaan skripsi.

7.

Teman-teman angkatan 2011, baik Kelas C 2011 dan FST B 2011 atas kebahagiaan, kegalauan dan kebersamaan yang indah.

8.

Mas Wagiran serta laboran-laboran lain yang telah membantu Penulis selama penelitian.

9.

Prof. dr. Supargiyono, DTM&H., SU., PhD., SpPark., yang telah menjadi supervisor yang sabar dan teliti dalam kami menyusun skripsi.

10.

Bu Rumbi dan Bu Juju yang telah dengan sabar membantu dan mengajari kami dalam pengerjaan skripsi.

11.

Team CCRC UGM yang telah membantu penelitian ini.

12.

Pihak lain yang tidak dapat disebutkan satu persatu oleh Penulis. Penulis menyadari bahwa skripsi yang saya lakukan masih ada

kekurangan dalam penyusunan skripsi ini. Oleh karena itu, Penulis mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari seluruh pihak. Semoga skripsi ini memberikan manfaat bagi kita semua.

Penulis

viii


DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ............................................................................................ i PERSETUJUAN PEMBIMBING ........................................................................ ii PENGESAHAN SKRIPSI .................................................................................. iii HALAMAN PERSEMBAHAN .......................................................................... iv LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ................................. v PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .............................................................. vi PRAKATA ........................................................................................................ vii DAFTAR ISI ...................................................................................................... ix DAFTAR TABEL ............................................................................................. xii DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ xiii DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................... xiv INTISARI .......................................................................................................... xv ABSTRACT ....................................................................................................... xvi BAB I PENDAHULUAN .................................................................................... 1 A. Latar Belakang .............................................................................................. 1 1.

Permasalahan ......................................................................................... 2

2.

Keaslian Penelitian ................................................................................. 3

3.

Manfaat Penelitian ................................................................................. 3 a.

Manfaat Teoretis ............................................................................. 3

b.

Manfaat Praktis ............................................................................... 4

B. Tujuan Penelitian .......................................................................................... 4 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA ................................................................... 5 A. Tanaman Pukul Empat (Mirabilis jalapa L.) ................................................. 5 1.

Kandungan Kimia .................................................................................. 5

2.

Khasiat Daun Pukul Empat ..................................................................... 8

B. Sel Kanker Payudara T47D ........................................................................... 8 C. Sel Kanker Payudara dan Ekspresi Reseptor Estrogen-α (ERα) ..................... 9 D. Apoptosis .................................................................................................... 12

ix


E. Landasan Teori ........................................................................................... 14 F. Hipotesis ..................................................................................................... 15 BAB III METODOLOGI PENELITIAN............................................................ 16 A. Jenis dan Rancangan Penelitian ................................................................... 16 B. Variabel dan Definisi Operasional ............................................................... 16 1.

Variabel Penelitian ............................................................................... 16

2.

Definisi Operasional ............................................................................. 17

C. Bahan Penelitian ......................................................................................... 18 1.

Subjek Penelitian.................................................................................. 18

2.

Bahan Penelitian .................................................................................. 18

D. Alat Penelitian ............................................................................................ 19 E. Tata Cara Penelitian .................................................................................... 19 1.

Pengumpulan bahan ............................................................................. 19

2.

Pengeringan ......................................................................................... 19

3.

Pembuatan ekstrak etanol daun pukul empat......................................... 20

4.

Persiapan ekstrak.................................................................................. 20

5.

Preparasi sel ......................................................................................... 20

6.

Preparasi larutan uji.............................................................................. 21

7.

Pengamatan viabilitas sel...................................................................... 21

8.

Pengamatan apoptosis .......................................................................... 22

9.

Pengamatan ekspresi protein dengan imunositokimia ........................... 23

F. Tata Cara Analisis Hasil .............................................................................. 24 a.

Analisis nilai IC50 ................................................................................. 24

b.

Analisis apoptosis sel ........................................................................... 25

c.

Analisis ekspresi ERα........................................................................... 25

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................ 27 A. Determinasi Tanaman ................................................................................. 27 B. Uji sitotoksik ekstrak terhadap sel kanker payudara T47D........................... 27 C. Uji Induksi Apoptosis ................................................................................. 31 D. Uji Imunositokimia ..................................................................................... 36 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN.............................................................. 42 x


A. Kesimpulan ................................................................................................. 42 B. Saran........................................................................................................... 42 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 43 LAMPIRAN ...................................................................................................... 48 BIOGRAFI PENULIS ....................................................................................... 60

xi


DAFTAR TABEL Tabel 1.

Data perlakuan EEDPE terhadap viabilitas sel................................ 29

Tabel 2.

Data perlakuan tamoxifen terhadap viabilitas sel............................ 30

Tabel 3.

Populasi sel pada analisis Annexin V Fluos ................................... 34

Tabel 4.

Distribusi ekspresi ERα pada sel T47D........................................... 38

xii


DAFTAR GAMBAR Gambar 1.

Bunga, daun, biji tanaman pukul empat (Mirabilis jalapa L.)..

Gambar 2.

Struktur senyawa yang terkandung dalam Mirabilis jalapa L... 6 Struktur senyawa yang terkandung dalam Mirabilis jalapa L... 6

Gambar 3. Gambar 4.

5

Gambar 5.

Struktur senyawa yang terkandung dalam Mirabilis jalapa L... 7 Struktur senyawa yang terkandung dalam Mirabilis jalapa L... 7

Gambar 6.

Alternatif regulasi transkripsional estrogen-dependent.............

11

Gambar 7.

Jalur sinyal apoptosis.................................................................

24

Gambar 8.

Bentuk komplek garam formazan dalam sel T47D.................... 28 Morfologi sel kanker payudara T47D........................................ 31

Gambar 9. Gambar 10. Gambar 11. Gambar 12.

Hasil analisis Annexin V Fluos.................................................. 33 Model sinyal induksi tamoxifen................................................. 35 Morfologi sel kanker payudara T47D dengan uji imunositokimia .......................................................................... 37

xiii


DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1.

Determinasi tanaman...............................................................

49

Lampiran 2.

Uji sitotoksik menggunakan metode MTT..............................

50

Lampiran 3.

Uji apoptosis menggunakan metode Annexin V Fluos...........

55

Lampiran 4.

Uji ekspresi gen menggunakan metode imunositokimia.........

57

xiv


INTI SARI Kanker payudara adalah keganasan yang berasal dari sel dan saluran kelenjar dan jaringan penunjang payudara, tidak termasuk kulit payudara. Berdasarkan data Sistem Informasi Rumah Sakit (SIRS) tahun 2010, kejadian kanker payudara mencapai (28,7%). Kejadian kanker payudara merupakan penyakit dengan prevalensi tinggi. Pengobatan hormonal yang diberikan pada kanker payudara ialah tamoxifen. Tamoxifen memiliki efek samping yaitu kelelahan, rasa terbakar, kanker uterin dan penggumpalan darah. Oleh karena itu, perlu penemuan agen antikanker yang memiliki aksi selektif sehingga efek samping yang ditimbulkan rendah. Daun pukul empat (Mirabilis jalapa L.) digunakan dalam bentuk ekstrak etanol, lalu diperlakukan pada sel kanker payudara T47D. Penelitian dilakukan menggunakan metode eksperimental murni acak lengkap pola searah. Metode uji yang dilakukan adalah uji sitotoksik menggunakan metode 3-[4,5-dimethylthiazol2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), kemudian dilakukan induksi apoptosis menggunakan metode Annexin V Flous, dilanjutkan uji imunositokimia untuk observasi ekspresi protein ERα. Hasil dari penelitian ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun pukul empat dapat menghambat pertumbuhan sel kanker dengan nilai IC50 sebesar 112,97 µg/mL. Mekanisme kematian sel pada pengujian nilai IC50 menunjukkan bahwa sel mengalami nekrosis dan apoptosis yaitu sebesar 54,50% dan 45,35%. Target aksi spesifik pada ERα menunjukkan tidak adanya penekanan ekspresi ERα. Kata kunci: Kanker payudara, Mirabilis jalapa L., sel T47D, ERα

xv


ABSTRACT

Breast cancer is a malignancy derived from glandular cells, glands and tissues channel supporting the breast, not including breast skin. Based on data from the Sistem Informasi Rumah Sakit (SIRS) in 2010, incidence of breast cancer was arised to 28,7%. The hormonal treatment given to breast cancer is tamoxifen. Tamoxifen has few side effects include fatigue, burning, uterine cancer and blood clots. Therefore, the anticancer discovery drug is needed to reduce those side effect. Mirabilis jalapa L. leaves used in the form of ethanolic extract, then treated in T47D breast cancer cells line. The study was conducted using the method: pure completely randomized experimental direction. The test method conducted is cytotoxic test using 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2.5diphenyltetrazolium bromide (MTT), then carried induction of apoptosis using Annexin V Flous and observation of expression ERα protein using immunocytochemistry. This study showed that ethanolic leaves Mirabilis jalapa L. extract can inhibit cancer cell growth with IC50 value of 112.97 mg/mL. The mechanism of cell death at testing IC50 value indicates that the cells undergo necrosis and apoptosis that is equal to 54,50% and 45,35% respectively. Molecular mechanism showed that the extract did not supress ERα expression. Therefore, other molecular mechanisms should be investigated.

Keyword: Breast cancer, Mirabilis jalapa L., T47D cell line, ERα

xvi


BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Kanker adalah pertumbuhan sel yang tidak normal atau terus menerus dan tak terkendali, dapat merusak jaringan sekitarnya serta dapat menyebar ke tempat yang jauh dari asalnya (Direktorat Jenderal PP & PL, 2009). Menurut data dari Riskesdas (2013), kematian yang disebabkan oleh kanker ada pada posisi ketujuh. Berdasarkan data Sistem Informasi Rumah Sakit (SIRS) tahun 2010, kejadian kanker payudara mencapai (28,7%), disusul kanker leher rahim. Kanker payudara merupakan penyakit tidak menular dengan kasus terbanyak. Tamoxifen dan raloxifene adalah obat yang dapat mengobati kanker payudara dan telah disetujui untuk digunakan oleh FDA. Raloxifene hanya disetujui untuk digunakan oleh wanita setelah menopause sedangkan tamoxifen dapat dipakai baik pada wanita pre-menopause dan post-menopause. Tamoxifen juga memiliki efek samping seperti kelelahan, terbakar, uterine cancer dan penggumpalan darah (American Cancer Society, 2013). Oleh karena itu, diperlukan senyawa untuk mengatasi hal tersebut dan dipakai sebagai agen kemopreventif dengan eksplorasi senyawa dari bahan alam untuk mencegah maupun mengobati kanker payudara. Bunga pukul empat yang dianalisis oleh Siddidui et al. (1990), menghasilkan β-sitosterol, stigmasterol, ursolic acid, oleanolic acid dan

1


2

brassicasterol pada ekstrak metanol. Penelitian yang dilakukan oleh Rumzhum et al. (2008) tanaman pukul empat dapat dipakai sebagai antioksidan dan memiliki aktivitas sitotoksisitas, dan penelitian yang dilakukan oleh Augustine et al. (2013) tanaman ini dapat digunakan sebagai anti radang sendi. Pada penelitian yang dilakukan oleh Ikawati et al. (2003), fraksi protein yang berasal dari daun Mirabilis jalapa L. dapat menginduksi apoptosis pada sel HeLa dan kemungkinan nekrosis pada sel Raji. Dengan demikian, ekstrak etanol daun pukul empat (EEDPE) potensial dikembangkan sebagai agen kemopreventif. Penelitian mengenai aktivitas EEDPE terhadap sel kanker payudara T47D belum pernah dilakukan. Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas sitotoksik ekstrak etanolik daun pukul empat (Mirabilis jalapa L.) terhadap sel T47D melalui mekanisme molekuler pada reseptor estrogen-α (ERα). Dari penelitian ini dapat dipelajari mekanisme molekuler yang kemungkinan memerantarai efek yang timbul. Hasil penelitian diharapkan mampu memberikan kontribusi bagi pengembangan agen kemopreventif pada kanker payudara dengan target aksi spesifik yang memanfaatkan bahan alam di Indonesia.

1.

Permasalahan Apakah ekstrak etanol daun pukul empat (Mirabilis jalapa L.) berpengaruh terhadap viabilitas sel, apoptosis, ekspresi protein reseptor estrogen-α dan berapa nilai IC50 EEDPE terhadap sel kanker payudara T47D?


2.

3

Keaslian Penelitian Penelitian menggunakan ekstrak dari Mirabilis jalapa L. yang pernah dilakukan adalah Aktivitas Sitotoksisitas dan Antioksidan dari Ekstrak Mirabilis jalapa L. oleh Rumzhum et al. (2008), menunjukkan bahwa ekstrak petrolium eter, kloroform dan metanol memiliki aktivitas sitotoksik. Selain itu, penelitian yang dilakukan oleh Ikawati et al. (2003) menunjukkan bahwa fraksi protein yang diisolasi dari daun Mirabilis jalapa L. menginduksi apoptosis pada sel HeLa dan kemungkinan nekrosis pada sel Raji. Penelitian memberi gambaran bahwa ekstrak Mirabilis jalapa L. memiliki aktifitas sitotoksik dan menginduksi apoptosis pada sel kanker. Sejauh penelusuran pustaka yang dilakukan peneliti, penelitian tentang Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanolik Daun Pukul Empat (Mirabilis jalapa L.) Terhadap Viabilitas, Apoptosis dan Ekspresi Reseptor Estrogen-α Sel Kanker Payudara T47D belum pernah dilakukan.

3.

Manfaat Penelitian a.

Manfaat

Teoretis.

Penelitian

ini

dapat

bermanfaat

bagi

pengembangan ilmu pengetahuan khususnya ilmu kefarmasian mengenai informasi tentang agen kemopreventif terkait ekstrak etanol daun pukul empat (Mirabilis jalapa L.), sehingga dapat pula menjadi sumber acuan yang dapat digunakan untuk penelitian selanjutnya.


b.

4

Manfaat Praktis. Penelitian ini diharapkan dapat membuktikan

secara ilmiah khasiat dari ekstrak etanol daun pukul empat (Mirabilis jalapa L.) yang berpengaruh pada viabilitas, apoptosis dan mendeteksi ekspresi protein sel kanker payudara.

B. Tujuan Penelitian Mengetahui pengaruh ekstrak etanol daun pukul empat (Mirabilis jalapa L.) terhadap viabilitas sel, apoptosis, ekspresi protein reseptor estrogen-α dan nilai IC50

EEDPE

pada

sel

kanker

payudara

T47D.


5

BAB II PENELAAHAN PUSTAKA

A. Tanaman Pukul Empat (Mirabilis jalapa L.)

Gambar 1. Bunga, daun, biji tanaman pukul empat (Mirabilis jalapa L.) (Shaik et al., 2012)

Mirabilis jalapa L. adalah semak yang dapat tumbuh sampai tinggi 1 meter. Daun berbentuk hati, panjang 3-12 cm. Bunganya biseksual, berwarna merah, pink, kuning atau putih, dan berkembang menjelang sore. Buahnya hitam dan bulat, berdiameter 5-8 mm (Ling et al., 2009). 1.

Kandungan Kimia Analisis yang dilakukan oleh Mahalingnam et al. (2012), pada seluruh bagian tanaman pukul empat ekstrak metanol menggunakan GC-MS, adanya senyawa 3,3’-Methylenebis(4-hydroxycoumarin), laminaribiitol, 3-(4(dimethylamino)cinnamoyl)-4-hydroxycoumarin. Penelitian yang dilakukan oleh Kuang and Zhang (2007) menginvestigasi konstituen kimia pada akar Mirabilis jalapa L. dan didapat senyawa teridentifikasi yaitu boeravinone C, mirabijalone A, chrysophanol, stigmasterol.


6

Gambar 2. Struktur senyawa yang terkandungan dalam Mirabilis jalapa L. (a) 3,3’-Methylenebis(4-hydroxycoumarin) (Sigma, 2015) (b) Laminaribiitol (Collins, 2006) (c) 3-(4-(dimethylamino)cinnamoyl)-4-hydroxycoumarin

Gambar 3. Struktur senyawa yang kandungan dalam Mirabilis jalapa L. (a) Boeravinone C (PubChem, 2015) (b) Mirabijalone A (Wang, 2002) (c) Chrysophanol (PubChem, 2015) (d) Stigmasterol (PubChem, 2015)

Pada analisis ekstrak metanol yang dilakukan oleh (Siddiqui, 1990) `ditemukan bahwa kandungannya adalah β-sitosterol, stigmasterol, ursolic acid, oleanolic acid dan brassicasterol.


7

Gambar 4. Struktur senyawa yang terkandung dalam Mirabilis jalapa L. (a) β-sitosterol (PubChem, 2015) (b) Stigmasterol (PubChem, 2015) (c) Ursolic acid (Pubchem, 2015) (d) Oleanolic acid (Pubchem, 2015) (e) Brassicasterol (PubChem, 2015)

Gambar 5. Struktur senyawa yang terkandung dalam Mirabilis jalapa L. (a) Tanin (Ahmad, 2006) (b) Antrakinon (Kar, 2007) (c) Protein (Smith et al., 2005) (d) Flavonoid (Stefek, 2011) (e) Kumarin (Kar, 2007) (f) Glikosida (Friedli, 2015)

Menurut Kumar et al., 2010 (cit., Lim, 2014) pada ekstrak etanol daun Mirabilis jalapa L. terdapat senyawa flavonoid, fenol, kumarin, dan


8

antrakinon. Pada penelitian yang dilakukan oleh Mohammed (2013) ekstrak etanol daun Mirabilis jalapa L. terdapat kandungan senyawa glikosida, tanin, phenolic compounds dan protein.

2.

Khasiat Daun Pukul Empat Selain sebagai tanaman hias, tanaman pukul empat memiliki manfaat sebagai antioksidan dan aktivitas sitotoksisitas (Rumzhum et al., 2008), antiarthritic (Augustine et al., 2013), antispasmodic (Aoki et al., 2008), antinociceptive (Walker et al., 2008), anti inflamasi (Singh et al., 2010), efek hipoglikemia dan hipolipidemik (Zhou et al., 2011), antibakteri (Devi, 2010). Aktivitas farmakologi pada berbagai ekstrak yang dilaporkan oleh Shaik et al. (2012), menunjukkan aktivitas seperti antidiabetes, antioksidan, antimikroba, antifungal, antiviral, dan penyakit urinaria. Aktivitas antikanker daun Mirabilis jalapa L. berisi fraksi protein ribosome-inactivating protein (RIP) yang diteliti oleh Ikawati et al. (2003), dapat menyebabkan kematian sel melalui jalur apoptosis pada sel HeLa, dan diduga jalur kematian sel raji melalui nekrosis.

B. Sel Kanker Payudara T47D Sel T47D adalah hormon reseptor estrogen positif pada sel kanker payudara yang secara luas digunakan sebagai model penelitian untuk studi kanker payudara. Sel T47D termasuk dalam klasifikasi kanker payudara pada subtipe


9

luminal A yang sama dengan MCF-7 dan SUM18. Dengan profil ER positif, PR positif/negatif dan HER2 negatif (Holliday and Speirs, 2011). Pada perbandingan ekspresi mRNA protein antara sel T47D dan MCF7 yang diidentifikasi menggunakan analisis proteomik menunjukkan perbedaan protein; 17β-hydroxysteroid dehydrogenase (17 β-HSD) tipe 1 dan 12 dan reseptor androgen (AR) diekspresikan dengan jumlah yang besar pada sel T47D dibanding MCF7. Beberapa protein yang terlibat dalam pertumbuhan sel dan regulasi anti-apoptosis dan kankerogenesis lebih kuat terekspresi pada sel T47D. Protein ini yaitu caspase-3 subunit p12, Nuclear protein Hcc-1, G1/S-specific cyclin-D3, cathepsin B, protein CDV3 homolog, N(G),N(G)-dimethylarginine dimethylaminohydrolase 2 dan prohibitin (Aka and Lin, 2012).

C. Sel Kanker Payudara dan Ekspresi Reseptor Estrogen-α (ERα) Kanker payudara adalah keganasan yang berasal dari sel kelenjar, saluran kelenjar dan jaringan penunjang payudara, tidak termasuk kulit payudara (Direktorat Jenderal PP & PL, 2009). Kanker payudara adalah sebuah malignant tumor yang dimulai pada sel dari payudara. Malignant tumor adalah grup sel kanker yang dapat tumbuh keseluruh jaringan atau menyebar ke area yang jauh pada tubuh (American Cancer Society, 2013). Terdapat beberapa tipe kanker payudara, namun dalam beberapa kasus tumor payudara tunggal dapat menjadi kombinasi dari beberapa tipe. Tipe kanker payudara yaitu Ductal Carcinoma In Situ (DCIS), Lobular Carcinoma In Situ


10

(LCIS), Invasive Ductal Carcinoma (IDC) dan Invasive Lobular Carcinoma (ILC) (American Cancer Society, 2013). Estrogen meregulasi beberapa proses fisiologi, termasuk pertumbuhan sel normal, perkembangan dan regulasi gen jaringan spesifik pada saluran reproduksi dan pada sistem central nervous dan sistem kerangka tulang. Estrogen juga mempengaruhi proses patologi penyakit hormone-dependent, seperti kanker payudara, endometrial dan ovarian. Aksi biologi estrogen dimediasi oleh ikatan spesifik satu dari dua reseptor estrogen (Matthews and Gustafsson, 2003). Sel kanker payudara menunjukkan over ekspresi reseptor estrogen-α (ERα) relatif pada reseptor estrogen-β (ERβ) dibandingkan dengan jaringan payudara normal (Covaleda et al., 2008). Reseptor estrogen-α meregulasi transkripsi beberapa gen sebagai faktor transkripsi yang berikatan dengan elemen respon estrogen dari gen target. Estrogen dan reseptornya berperan penting dalam genesis dan progresi malignant kanker payudara. Ekspresi reseptor estrogen-α berhubungan dekat dengan kehidupan kanker payudara, terutama perkembangan tumor. Ekspresi reseptor estrogen-α pada jaringan tumor adalah prediksi berharga untuk pengobatan endokrin (Hayashi et al., 2003). Aksi biologi estrogen diperantarai oleh ikatan pertama dari dua reseptor estrogen spesifik, reseptor estrogen-α (ERα) atau reseptor estrogen-β (ERβ), yang termasuk pada nuclear receptor (NR) superfamily, golongan ligan yang meregulasi faktor transkripsi. Reseptor estrogen dapat meregulasi ekspresi gen melalui beberapa mode berbeda termasuk ikatan DNA langsung (sebagai homodimer atau sebagai heterodimer) atau melalui tautan ke faktor transkripsi seperti activating protein-1 (AP-1) dan


11

stimulating protein 1 (Sp1) (Matthews and Gustafsson, 2003). Mekanisme klasik aksi ER terlibat pada pengikatan estrogen ke reseptor dalam nukleus, setelah reseptor berdimerisasi dan berikatan ke respon elemen spesifik yang disebut estrogen respons element (ERE) yang berlokasi dalam promoter gen target. Bagaimanapun, ER dapat juga meregulasi ekspresi gen tanpa berikatan secara langsung ke DNA. Ikatan ini dapat terjadi melalui interaksi protein-protein DNA lain dengan faktor transkripsi dalam nukleus (Bjornstrom and Sjoberg, 2005).

Gambar 6. Alternatif regulasi transkrisional estrogen-dependent oleh homodimer atau heterodimer ERα –ERβ. Perbedaan mode pengikatan DNA langsung dari subtipe ER baik sebagai homodimer atau heterodimer ke estrogen response elements (EREs) (A). Representasi regulasi transkripsional oleh subtipe ER melalui pertautan ke faktor transkripsi lain, seperti activatin protein 1 (AP-1) dan stimulating protein 1 (Sp1) (B). Aktivitas transkripsional estrogen-dependent relatif direpresentasikan oleh besar kecilnya anak panah. ERα dan ERβ direpresentasikan dengan warna biru dan putih (Matthews and Gustafsson, 2003).

Reseptor estrogen-α diekspresikan terutama dalam uterus, hati, ginjal dan jantung dapat pula di ko-ekspresikan pada beberapa jaringan termasuk kelenjar susu, epididimis, tiroid, adrenal, tulang dan area otak. ERα terletak pada lokus kromosomal 6q25.1. Fungsi transaktivasi ERα dimediasi oleh dua transkripsi activation functions (AFs) yang memperbolehkan reseptor untuk menstimulasi


12

transkripsi gen pengatur estrogen yaitu N-terminal ligand-independent activation function (AF-1) dan C-terminal ligand-dependent activation function (AF-2) terletak dalam ligand-binding domain (LBD) (Matthews and Gustafsson, 2003). Level ekspresi reseptor estrogen-α juga diregulasi melalui metilasi DNA dan kondensasi kromatin dari area promoter melalui hipermetilasi CpG islands dalam promoter ERα. Hipermetilasi promoter ERα berhubungan dengan berkurangnya nilai ekspresi mRNA ERα diantara ekspresi ERα pada sel kanker, dan penghambatan DNA-metiltransferase reaktif ekspresi ERα pada sel line kanker ini (Matthews and Gustafsson, 2003). Promoter B adalah satu dari promotor distal yang kemungkinan bertanggungajawab terhadap over ekspresi kanker spesifik ERα. Metilasi promoter dapat secara langsung meregulasi ekspresi gen ERα dengan menurunkan transkripsi gen ERα. Down-regulation ekspresi gen ERα dapat dikontrol dengan dua mekanisme: metilasi DNA area promoter atau menghilangkan aktivator transkripsi (Hayashi et al., 2003).

D. Apoptosis Apoptosis atau program kematian sel adalah bagian penting untuk menjaga keseimbangan dan kehidupan pada organisme multiseluler. Ciri anatomi apoptosis dicatat pada abad sembilan belas. Tetapi, tidak dipublikasikan pada tahun 1951 dan tahun 1960-an dideskripsikan sebagai perkembangan kematian sel atau penyusutan nekrosis, dimana konsep program kematian sel telah dikenal.


13

Istilah apoptosis diciptakan tahun 1972, mengarah pada bentuk morfologi dari kematian sel (Hacker, 2009). Jalur pemicu apoptosis ada dua yaitu jalur ekstrinsik dan jalur instrinsik. Jalur ekstrinsik (contoh diperantarai reseptor) diinisiasi oleh stimulus eksternal (ligan) yang berperan pada reseptor ikatan membran. Jalur instrinsik (contoh diperantarai mitokondria) merespon beberapa cellular stress dan berhubungan dengan beberapa pemicu apoptosis yang menghasilkan pelepasan sitokrom c dari mitokondria ke sitoplasma dimana dia akan berikatan pada protein pro-apoptosis Apaf-1, menghasilkan oligomerasi ATP-bergantung pada Apaf-1 menjadi struktur bernama apoptosome. Apoptosome mengaktifkan caspase-9 diikuti oleh aktivasi caspase-3. Akhir-akhir ini, retikulum endoplasma teridentifikasi sebagai organel lain yang dapat menginisiasi jalur apoptosis instrinsik. Retikulum endoplasma stress akan mengaktifkan jalur retikulum endoplasma spesifik seperti jalur mitokondria. Jalur ini mengaktifkan caspase-12 dan atau caspase-4 selanjutnya aktivasi caspase-3 (Hacker, 2009). Nekrosis adalah sebuah jalur kematian yang tidak diinginkan dari kematian sel karena respon inflamasi berikut menyebabkan kematian sel sekunder dan perusakan jaringan (Hacker, 2009). Onset kematian sel yang sangat cepat secara khas menghasilkan nekrosis jaringan. Konsekuensi nekrosis sel adalah gangguan akut metabolisme seluler, kehabisan energi ATP, disregulasi ion, pembengkakan mitokondria dan sel, aktivasi enzim degradasi, kegagalan plasma membran dan lisis sel (Lemasters, 1998).


14

Gambar 7. Jalur sinyal apoptosis. Garis hijau merepresentasikan regulasi positif dan garis merah menunjukkan regulasi negatif (Hacker, 2009).

E. Landasan Teori Kanker payudara adalah keganasan yang berasal dari sel kelenjar, saluran kelenjar dan jaringan penunjang payudara, tidak termasuk kulit payudara. Kanker payudara adalah malignant tumor yang berasal dari sel payudara. Malignant tumor adalah kelompok sel kanker yang dapat tumbuh (menyerang) ke sekeliling jaringan atau menyebar (metastasis) ke area yang jauh di tubuh. Kanker payudara merupakan penyakit dengan prevalensi yang tinggi. Tamoxifen dan raloxifene adalah obat yang dipakai untuk mengobati kanker

payudara.

Tamoxifen

memiliki beberapa efek samping

seperti

meningkatnya resiko kanker endometrial, penggumpalan darah, tetapi raloxifen memiliki resiko lebih rendah terhadap efek samping kanker uterin. Penemuan


15

agen kemopreventif dengan target spesifik pada kanker payudara penting dilakukan. Tanaman pukul empat mengandung senyawa asam ursolat yang dapat menghambat tumorigenesis, promosi tumor, penekan angiogenesis, menurunkan laju proliferasi sel dan menginduksi apoptosis pada sel kanker. Tanaman ini juga mengandung

fraksi

protein ribosome-inactivating

protein

yang

mampu

menginduksi kematian pada sel kanker. Kematian sel kanker yang terjadi perlu dilakukan penelitian secara molekuler untuk mengetahui target spesifik tanaman pukul empat. Pengaruh ekstrak etanolik daun pukul empat terhadap viabilitas, apoptosis dan ekspresi reseptor estrogen-α sel kanker payudara T47D belum pernah diteliti. Sel kanker payudara T47D mempunyai karakteristik molekuler ekspresi berlebih ERα. ERα merupakan target spesifik yang diinduksi oleh ekstrak etanol daun pukul empat dalam penemuan agen kemopreventif berbasis bahan alam.

F. Hipotesis Adanya pengaruh pemberian ekstrak etanol daun bunga pukul empat (Mirabilis jalapa L.) terhadap proliferasi sel kanker payudara T47D menggunakan metode uji 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) dan diketahui ekspresi sel protein kanker payudara menggunakan imunositokimia.


BAB III METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian yang berjudul “Pengaruh Pemberian Ekstrak Etanolik Daun Pukul Empat Terhadap Viabilitas, Apoptosis dan Ekspresi Reseptor Estrogen-α Sel Kanker Payudara T47D” termasuk penelitian eksperimental murni acak lengkap pola searah. Penelitian ini termasuk jenis eksperimental karena terdapat perlakuan terhadap subyek uji. Rancangan penelitian acak lengkap pola searah karena penelitian ini memiliki satu faktor dengan banyak level.

B. Variabel dan Definisi Operasional 1. Variabel Penelitian a. Variabel Utama 1) Variabel Bebas

: tujuh peringkat konsentrasi ekstrak etanol

daun pukul empat (Mirabilis jalapa L.) yaitu (2.000; 1.000; 100; 10; 1; 0,1; 0,01) µg/mL. 2) Variabel Tergantung : viabilitas sel, % sel apoptosis, level ekspresi protein ERα. b. Variabel pengacau 1) Variabel pengacau terkendali Lama pengeringan, kondisi sel uji (sel T47D).

16


17

2) Variabel pengacau tak terkendali Umur tanaman, lama inkubasi dalam uji apoptosis, cuaca, kontaminasi lingkungan.

2. Definisi Operasional a. Ekstrak etanol daun pukul empat (Mirabilis jalapa L.) adalah larutan kental hasil ekstraksi total daun pukul empat yang diperoleh dengan cara mengekstraksi. b. Viabilitas sel adalah data hasil ELISA reader berupa absorbansi (Abs) tiap sumuran dikonversikan dalam persentase kehidupan sel c. IC50 adalah nilai konsentrasi yang menghasilkan penghambatan pertumbuhan sel sampai 50%. d. Uji apoptosis adalah data hasil pengamatan warna (warna dapat diatur pada alat) menggunakan program cellquest. Sel hidup berfluoresensi hijau, sel apoptosis berwarna pink dan kuning, sel nekrosis berwarna merah. e. Ekspresi protein sel adalah pengamatan ekspresi protein sel yang diamati secara kualitatif dan semikuantitatif. Pengamatan kualitatif dilakukan dengan mengamati warna sel di bawah mikroskop, di mana sel yang berwarna coklat baik pada nukleus dan atau sitoplasma adalah sel yang mengekspresikan ERα dan sel yang berwarna biru tidak. Pengamatan semikuantitatif dilakukan dengan menggunakan level scoring.


18

f. Level ekspresi adalah persentasi populasi sel yang berwarna coklat baik pada nukleus dan atau sitoplasma dalam tiga lapang pandang.

C. Bahan Penelitian 1.

Subjek Penelitian Subjek uji yang digunakan adalah sel kanker payudara T47D, yang diperoleh dari Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Universitas Gadjah Mada Yogyakarta.

2.

Bahan Penelitian Bahan uji yang digunakan daun bunga pukul empat (Mirabilis jalapa L.) yang diperoleh dari distributor Dipokusumo Farm (Rasamala A4, Semarang Kota, Jawa Tengah) berasal dari kebun di Malang, Jawa Timur yang dipanen pada bulan Juni 2014. Bahan untuk kontrol positif adalah tamoxifen (Nolvadex). Etanol 70% (Merck), DMSO (Merck), RPMI, Fungizone 0,5% (Gibco), Fetal Bovine Serum (FBS) 10% (v/v) (Gibco), penisilin-streptomisin 1% (v/v) (Gibco), tripsin EDTA 0,25%, reagen MTT (Sigma), reagen stopper, reagen Annexin V Flous Staining Kit (Roche), peroxidase blocking solution, Prediluted Blocking Serum, antibodi primer ERα (Thermo Fisher Scientific Pierce), biotinylated universal secondary antibody (Thermo Lab), streptavidin HRP (Lab Vision), peroxidase substrat solution DAB, mayer hematoxylin (Dako), alkohol, xylol, aquades.


19

D. Alat Penelitian Gelas beaker, maserator, gelas ukur, rotary evaporator, neraca analitik, treated tissue culture dish diameter 10 cm (Iwaki), 96 well-plate (Nune), 24 well-plate (Nune), 6 well-plate (Nune), cover slip (Nune), sentrifuge tube, object-glass, inkubator CO2 (Heracus), mikropipet (Gilson), tabung conical (Iwaki), sentrifuge, laminar air flow cabinet (Labconco), mikropipet, yellow-tip, blue-tip, pinset, autoklaf (Hirayama), hemositometer (Neubauer), mikroskop inverted (Zeiss MC 80), ELISA reader, cell counter, mikroskop fluoresensi, vortex, eppendorf (Plasti brand), kamera digital, mikroskop cahaya.

E. Tata Cara Penelitian

1.

Pengumpulan bahan Bahan uji yang digunakan adalah simplisia basah daun pukul empat (Mirabilis jalapa L.) yang diperoleh dari distributor Dipokusumo Farm (Rasamala A4, Semarang Kota, Jawa Tengah) berasal dari kebun di Malang, Jawa Timur yang dipanen pada bulan Juni 2014.

2.

Pengeringan Tanaman segar yang didapat, dipisahkan dari batang, akar, dan bunga. Kemudian bagian daun dikeringkan untuk mendapatkan simplisia kering yang akan digunakan dalam penelitian.


3.

20

Pembuatan ekstrak etanol daun pukul empat Simplisia yang telah disortasi, dibuat serbuk dengan menggunakan blender. Serbuk yang telah halus kemudian diekstrak dengan merendam 10 gram serbuk daun pukul empat dalam 50 mL etanol : air (7:3). Kemudian dilakukan homogenisasi campuran dengan cara pengadukan. Lalu, dimaserasi selama 48 jam dengan kecepatan 150 rpm. Setelah dimaserasi, kemudian larutan disaring, bagian cair diambil dan dipekatkan menggunakan rotatory evaporator dengan suhu 80oC selama 5 menit dan dilanjutkan dengan penguapan menggunakan waterbath suhu 80oC selama 4,5 jam. Hasil diperoleh hingga didapat bobot tetap pada ekstrak dengan konsistensi semisolid berwarna hijau gelap.

4.

Persiapan ekstrak Ekstrak kental yang telah dibuat ditimbang dan dilarutkan menggunakan DMSO. Kemudian di-vortex agar ekstrak kental dan DMSO menjadi homogen.

5.

Preparasi sel Semua alat disterilisasi terlebih dahulu. Sel diambil dari tangki nitrogen cair, kemudian dicairkan dalam penangas air pada suhu 37oC. Ampul disemprot dengan etanol 70% dan dimasukkan ke dalam LAF. Lalu ampul dibuka dan sel dipindahkan ke dalam conical tube steril yang berisi media.


21

Suspensi sel disentrifus dengan kecepatan 650 rpm selama 3 menit, kemudian supernatan dibuang. Media yang baru ditambahkan pada endapan sel kemudian disuspensi perlahan hingga homogen. Sel ditumbuhkan dalam beberapa buah tissue culture dish/flask dan diinkubasi dalam inkubator CO2 pada suhu 37oC dengan aliran CO2 5%. Setelah diinkubasi selama 24 jam, kemudian dilakukan penggantian media kultur. Sel ditumbuhkan hingga konfluen dan jumlahnya cukup untuk penelitian. Setelah sel konfluen, media dibuang dan sel diresuspensi hingga terlepas semua dari dinding dish/flask. Suspensi sel kemudian dipindahkan ke dalam conical tube steril baru. Sel dihitung dengan haecytometer dan cell counter lalu dibuat suspensi sel dengan konsentrasi sel sesuai dengan kebutuhan. Jumlah sel dihitung dengan cara :

(Doyle and Griffiths, 2000). 6.

Preparasi larutan uji Larutan uji dilarutkan dalam DMSO sehingga diperoleh konsentrasi larutan induk dengan konsentrasi 100.000 µg/mL. Larutan induk selanjutnya diencerkan dengan media kultur sehingga diperoleh konsentrasi 2000-0,01 µg/mL untuk uji sitotoksik tunggal.

7.

Pengamatan viabilitas sel Sel T47D (kepadatan 5 x 104 sel/sumuran) diambil dan ditanam pada coverslip dalam 96 well-plate dengan kondisi 80% konfluen untuk dipanen.


22

Kemudian diinkubasi selama 24 jam. Plate diambil, media sel dibuang (dibalikkan 180o plate, dikeringkan diatas tisu). Larutan ekstrak etanol daun pukul empat (seri konsentrasi sampel, triplo) ditambahkan dalam sumuran dan diinkubasi selama 24 jam. Plate diambil, media sel dibuang, dicuci PBS 1x. Reagen MTT 100 µL ditambahkan, diinkubasi selama 2-4 jam dalam inkubator (sampai terbentuk formazan). SDS 10% dalam 0,1 N HCl 100 µL ditambahkan jika formazan telah terbentuk. Plate dibungkus dengan aluminium foil dan diinkubasi selama 24 jam di tempat gelap (tidak dalam inkubator). Kemudian plate dibaca dengan ELISA reader pada λ 595 nm (ATCC, 2011).

8.

Pengamatan apoptosis Sel T47D sejumlah 5 x 105/2mL/sumuran didistribusikan ke dalam 6 well-plate. Kemudian diinkubasi 24 jam, supaya sel beradaptasi. Sel yang telah diinkubasi kemudian dicuci PBS, diberi perlakuan dan diinkubasi kembali selama 24 jam. Pada akhir inkubasi, media pada tiap sumuran diambil dan dipindahkan pada tiap konical. Conical tube diberi label. Kemudian sumuran pada 6 well-plate diberi PBS, PBS diambil dan dimasukkan pada tiap conical yang sesuai. Pada 6 well-plate diberi tripsin sebanyak 200 µL dan diinkubasi selama 3 menit. Lalu diberi media kultur 1 mL dan ditampung ke conical yang sesuai. Konikal disentrifugasi selama 4 menit, 4000 rpm. Kemudian supernatan dibuang dan sisa endapan diberi PBS dingin 1 mL, diresuspensi dan dipindahkan ke eppendorf sebanyak 1 mL.


23

Eppendorf kemudian disentrifugasi selama 5 menit, 5000 rpm. Supernatan dibuang dan sisa endapan ditambah dengan Reagen Annexin V Flous dan diinkubasi selama 10 menit dalam ruangan tanpa cahaya. Reagen annexin berupa campuran dari buffer, reagen annexin dan reagen pi. Setelah diinkubasi kemudian larutan ditambah buffer 300 µL dan dianalisis (CCRC, 2009).

9.

Pengamatan ekspresi protein dengan imunositokimia Sel T47D sejumlah 5 x 104 sel/sumuran ditanam pada coverslip dalam 24 well-plate dengan kondisi 80% konfluen untuk dipanen dan diinkubasi selama 24 jam di dalam inkubator. Kemudian 24 well-plate diambil dan medium sel dibuang. Well-plate diisi PBS masing-masing 500 µL, lalu buang PBS (dicuci PBS). Sampel larutan uji ditambahkan dalam sumuran, dan diinkubasi selama 24 jam. Pada jam ke-24 diambil plate dan media sel dibuang, lalu dicuci dengan PBS. Coverslip diambil dan diletakkan dalam kaca preparat. Lalu diberi label pada kaca preparat. Metanol dingin 300 µL diteteskan, diinkubasi selama 10 menit. Metanol dibuang secara perlahan. Preparat dicuci menggunakan PBS. Kemudian ditambah 500 µL aquades, didiamkan 5 menit, dan dibuang (dicuci aquades). Selanjutnya preparat ditetesi larutan hidrogen peroxsidase (blocking solution), diinkubasi 10 menit. Lalu larutan dibuang. Selanjutnya ditetesi prediluted blocking serum, diinkubasi selama 10 menit. Lalu larutan dibuang. Kemudian ditetesi Primer Antibodi Monoklonal anti-ERα pengenceran 1:100 selama 1 jam dan dicuci


24

dengan PBS. Kemudian ditetesi biotinylated universal secondary antibody sebanyak 100 µL, diinkubasi 20 menit dan dicuci PBS selama 5 menit. Reagen kompleks streptavidin-peroxidase ditetesi sebanyak 100 µL dan diinkubasi selama 10 menit. Lalu dicuci dengan PBS. Larutan DAB 100 µL diteteskan, lalu diinkubasi selama 2 menit. Kemudian dicuci aquades. Lalu larutan Mayer Haematoxylin sebanyak 100 µL diteteskan dan diinkubasi 5 menit, kemudian dicuci aquades. Coverslip diangkat dan dicelupkan dalam etanol absolut. Kemudian dicelupkan dalam xylol, keringkan. Coverslip diletakkan di atas object glass, ditetesi dengan etelen (mounting media), cover slip ditutup dan diamati menggunakan mikroskop cahaya perbesaran 10-100x (Javois, 2007).

F. Tata Cara Analisis Hasil a.

Analisis nilai IC50 Data absorbansi tiap sumuran diperlukan untuk memperoleh nilai IC50 yang kemudian dikonversi kedalam persen viabilitas sel. Persen sel dihitung menggunakan rumus : %viabilitas sel = (Doyle and Griffiths, 2000). Dibuat regresi linear antara log konsentrasi dengan persen viabilitas sel. Kemudian diproses menggunakan Program R untuk mendapatkan nilai IC50.


25

b. Analisis apoptosis sel Analisis apoptosis dilakukan dengan metode cellquest dan dibaca menggunakan alat FACS Calibur. Kemudian dikonversikan dalam diagram menjadi warna sel (warna sel yang terlihat merupakan pengaturan yang dapat diubah–ubah). Dalam hal ini, warna hijau menunjukkan sel hidup (Annexin/PI-),

warna

kuning

menunjukkan

sel

mengalami

early

apoptosis

(Annexin+/PI-), warna merah muda menunjukkan sel mengalami late apoptosis (Annexin+/PI+) (Span, 2001) dan warna merah menunjukkan sel mengalami nekrosis (Annexin-/PI+) (Nurzijah et al., 2012). Konversi persentase populasi sel pada setiap kondisi akan diperoleh hasil secara kuantitatif.

c.

Analisis ekspresi ERα Pengamatan kualitatif dilakukan dengan mengamati warna sel di bawah mikroskop, di mana sel yang berwarna coklat mengelilingi sel atau pada inti sel dengan inti biru adalah sel yang mengekspresikan ER- dan sel yang berwarna biru tidak. Pengamatan semikuantitatif dilakukan dengan level scoring (Vang et al., 2006). Reaksi diintepretasikan sebagai hasil positif berdasarkan pengecatan. Hasil skor berdasar persentase sel yang menunjukkan ekspresi: negatif (≤ 5%) dan positif (>5%). Pengamatan semikuantitatif ini digunakan untuk tujuan deskripsi, distribusi pengecatan diukur berdasar skor secara


26

semikuantitatif pada persentasi sel positif: 0: ≤ 5%; 1+ : 6-25%; 2+ : 26-50%; 3+ : 51-75%; 4+ : 76-100%.


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Determinasi Tanaman Determinasi tanaman pada penelitian ini dilakukan untuk memastikan kebenaran tanaman yang digunakan dalam penelitian. Determinasi dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada. Hasil determinasi menunjukkan bahwa tanaman yang digunakan adalah tanaman pukul empat (Mirabilis jalapa L.) dan termasuk dalam suku Nyctaginaceae (Lampiran 1). B. Uji sitotoksik ekstrak terhadap sel kanker payudara T47D Uji sitotoksik dilakukan untuk mengetahui potensi penghambatan pertumbuhan sel akibat perlakuan ekstrak dan menentukan kadar sampel yang dapat menghambat pertumbuhan sel sampai 50% (Meiyanto et al., 2008). Uji sitotoksisitas pada penelitian ini dinyatakan dalam parameter IC50. Nilai IC50 merupakan nilai konsentrasi yang menghasilkan penghambatan pertumbuhan sel sampai 50%. Viabilitas sel dapat dihitung menggunakan beberapa metode pengecatan, dan dapat diukur menggunakan Multiwell Scanning Spectrophotometers (ELISA Reader) (Mossmann, 1983). Pada penelitian ini, pengukuran viabilitas sel menggunakan uji MTT. Secara umum metode pengecatan menggunakan prinsip kolorimetri menggunakan beberapa perubahan warna sebagai titik akhir untuk kuantitasi jumlah sel.

27


28

MTT (3,(4,5-dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) adalah garam tetrazolium yang dimetabolisme menjadi garam formazan berwarna yang tidak larut air oleh aktivitas enzim mitokondrial dalam sel hidup (Frei, 2011). Dengan reduksi, struktur tetrazolium berubah dari tidak berwarna atau weakly coloured salt menjadi produk formazan berwarna terang dengan menganggu cincin tetrazole (Berridge et al., 2005). Garam tetrazolium MTT kemudian terpecah menjadi komplek garam formazan berwarna ungu yang tidak larut air oleh enzim suksinat dehidrogenase. Dengan ditambahkan stopper maka komplek garam tersebut menjadi larut. Bentuknya seperti jarum berwarna ungu. Sel hidup membentuk kristal formazan, sel mati tidak mengalami perubahan dan tidak menimbulkan warna. Pada kelompok perlakuan intensitas warna ungu yang dihasilkan semakin bertambah seiring menurunnya konsentrasi ekstrak yang diberikan. Intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan sel yang hidup.

Gambar 8. Bentuk komplek garam formazan dalam sel T47D. Keterangan :

Sel yang

hidup akan terbentuk garam formazan, sel yang mati tidak terbentuk garam formazan.


29

Tabel 1. Data perlakuan EEDPE terhadap viabilitas sel

Konsentrasi (µg/mL) 2000 1000 100 10 1 0,1 0,01

5,318 -0,413 57,357 83,376 93,289 85,390 81,518

Viabilitas sel 5,627 5,937 -2,117 -1,342 57,666 58,131 99,639 98,245 99,329 102,736 90,811 103,975 91,120 93,443

Rata-rata ± SD 5,627 ± 0,310 -1,291 ± 0,853 57,718 ± 0,390 93,753 ± 9,014 98,451 ± 4,785 93,392 ± 9,558 88,694 ± 6,322

Pengujian dilakukan dengan memberikan perlakuan pada sel T47D dengan konsentrasi EEDPE sebesar (2.000; 1.000; 100; 10; 1; 0,1; 0,01) µg/mL. Berdasarkan hasil pengukuran serapan menggunakan ELISA reader diketahui bahwa ekstrak etanol daun pukul empat (EEDPE) dapat mengakibatkan kematian sel T47D. Hasil uji sitotoksik menunjukkan bahwa dengan kenaikan konsentrasi EEDPE, sel yang hidup mengalami penurunan (Tabel 1). Pada konsentrasi tertinggi EEDPE, terjadi sedikit kenaikan persen viabilitas sel. Hal ini dapat terjadi karena pengaruh dari konsentrasi EEDPE yang masih cukup pekat, dan intensitas warna hasil pengenceran berwarna kuning kehijauan. Pada saat proses MTT selesai larutan akan berubah menjadi relatif ungu, bergantung pada sel yang masih hidup. Karena adanya pengaruh konsentrasi EEDPE yang tinggi, ELISA reader tidak hanya membaca absorbansi dari larutan yang berkorelasi dengan sel hidup tetapi juga ekstrak. Menurut Kealey and Haines (2002), absorbansi sebanding dengan konsentrasi, dengan demikian konsentrasi semakin tinggi maka absorbansi juga akan semakin tinggi. Hasil uji sitotoksik yang dihitung menggunakan program R, menunjukkan nilai IC50 sebesar 112,97 µg/mL (Lampiran 2).


30

Tabel 2. Data perlakuan tamoxifen terhadap viabilitas sel.

Konsentrasi (µg/mL) 371,5 37,15 3,715 0,3715 0,03715 0,003715

4,233 1,910 107,537 105,834 103,201 88,952

Viabilitas sel 5,163 4,698 2,375 2,530 106,763 102,891 100,568 92,514 105,524 104,440 100,258 93,908

Rata-rata ± SD 4,698 ± 0,465 2,272 ± 0,322 105,731 ± 2,489 99,639 ± 6,708 104,388 ± 1,162 94,373 ± 5,667

Pengujian juga dilakukan dengan memberikan perlakuan terhadap sel kanker payudara T47D menggunakan tamoxifen. Konsentrasi yang dipakai untuk pengujian yaitu (371,5; 37,15; 3,715; 0,3715; 0,03715; 0,003715) µg/mL. Hasil uji sitotoksik menunjukkan hal yang sama dengan EEDPE, yaitu mengalami penurunan viabilitas sel dengan meningkatnya konsentrasi tamoxifen (Tabel 2). Hasil uji sitotoksik yang dihitung menggunakan program R, menunjukkan nilai IC50 sebesar 13,98 µg/mL. Tamoxifen merupakan salah satu pengobatan hormonal yang dipakai untuk penderita kanker payudara. Tamoxifen juga dipakai sebagai pembanding dalam penelitian ini. Berdasarkan nilai IC50 antara EEDPE dengan tamoxifen, terlihat bahwa tamoxifen lebih sitotoksik dibanding EEDPE. EEDPE memiliki nilai IC50 sebesar 112,97 µg/mL, dan nilai penghambatan mendekati angka 100 µg/mL, sehingga masih bisa berpotensi sebagai agen kemopreventif. Nilai IC50 dibawah 100 µg/mL menunjukkan adanya potensi ekstrak uji sebagai agen kemoprevensi (Meiyanto et al., 2008). Berdasarkan hasil uji sitotoksisitas yang telah dilakukan, EEDPE memiliki potensi untuk dapat diteliti lebih jauh. Aktivitas sitotoksisitas digunakan sebagai acuan pengembangan penelusuran mekanisme suatu sampel dalam menghambat pertumbuhan sel kanker (Meiyanto et al., 2008). Menurut Choon et


31

al., 2008 (cit., Putra et al., 2012), secara umum efek sitotoksik ekstrak menunjukkan fenomena dose-dependent, dimana efek sitotoksik meningkat seiring meningkatnya konsentrasi ekstrak dan lamanya inkubasi. Penelitian ini menggunakan sel T47D, sel ini berbentuk lonjong saat normal. Kemudian sel mati mengalami perubahan morfologi yaitu sel berwarna gelap dan tidak menempel pada dasar plate (Suhesti and Aditiyono, 2012).

Gambar 9. Morfologi sel kanker payudaraT47D. Kontrol Sel (A), Perlakuan EEDPE konsentrasi 2000 µg/mL (B), Perlakuan EEDPE konsentrasi 10 µg/mL (C), Perlakuan EEDPE konsentrasi 0,01 µg/mL (D) dan Tamoxifen (E). Keterangan : sel normal, sel mengalami perubahan morfologi

C. Uji Induksi Apoptosis Apoptosis disebut

juga kematian sel terprogram. Sinyal yang

menginduksi apoptosis dapat diinduksi dari luar seperti hormon, atau induksi dari dalam seperti infeksi viral. Sel yang mengalami apoptosis akan memperlihatkan perubahan morfologi spesifik seperti penyusutan sel, penebalan sitoplasma dan pemadatan organel-organel sel, kondensasi kromatin, kerusakan nuclear envelope,


32

bleb pada membran sel dan pemisahan bagian sel menjadi beberapa vesikel (Gabriel, 2007). Pada penelitian ini, uji apoptosis dilakukan untuk mengetahui mekanisme kematian sel melalui jalur apoptosis atau nekrosis. Deteksi apoptosis menggunakan alat FASC Calibur dengan program cellquest dan metode yang digunakan adalah Annexin V Fluos. Metode flowcytometry hanya mendeteksi satu ciri spesifik dari proses apoptosis (Span et al., 2001). Metode ini dapat mengukur spesifik populasi sel baik yang mengalami apoptosis, nekrosis dan sel yang masih hidup. Annexin V adalah ion kalsium yang bergantung pada phospholipid binding protein (PBP) dengan afinitas kuat pada phosphatidylserine (PS) dan memiliki ikatan lemah pada spesies fosfolipid seperti phosphatidylcholine dan sphingomyeline, yang ada pada bagian luar membran plasma (Vermes et al., 1995). Phosohatidylserine adalah fosfolipid bermuatan negatif, secara normal yang sebagian besar ada pada membran leaflet menghadap ke sitosol. Ketika terjadi kematian sel, PS terlokasi pada lapisan luar membran. Hal ini terjadi pada fase dini apoptosis selama membran sel itu sendiri masih utuh. Hasil analisis flow cytometry menggunakan annexin V (fluoresensi hijau) dan propidium iodine (PI) (flouresensi merah) dapat membedakan sel yang utuh/hidup (Annexin-/PI-), sel yang mengalami early apoptosis (Annexin+/PI-), sel yang mengalami late apoptosis (Annexin+/PI+) (Span, 2001) dan sel yang mengalami nekrosis (Annexin-/PI+) (Nurzijah et al., 2012). Sel memasuki fase apoptosis menunjukkan hilangnya asimetris fosfolipid, dengan terbukanya PS pada bagian luar. Annexin


33

V berikatan pada muatan negatif PS (Koopman et al., 1994). Pada sel nekrosis, sel pecah dan isi sel keluar ke lingkungan. Kemudian, PI akan berikatan dengan DNA (Riccardi and Nicoletti, 2006). Sehingga, ikatan antara PI dan DNA dapat dideteksi oleh flowcytometry.

Gambar 10. Hasil analisis Annexin V Fluos. Kontrol Sel (A), Perlakuan dengan EEDPE (B), Perlakuan dengan Tamoxifen (C). Gambar R1 atau titik berwarna hijau menunjukkan populasi sel yang masih hidup, R2 dan R3 atau titik berwarna kuning dan merah muda menunjukkan populasi sel yang mengalami early apoptosis dan late apoptosis dan R4 atau titik berwarna merah menunjukkan populasi sel yang mengalami nekrosis


34

Tabel 3. Persentasi populasi sel pada analisis Annexin V Fluos. Kontrol Sel (A), Perlakuan dengan EEDPE (B), Perlakuan dengan Tamoxifen (C). Region R1 menunjukkan populasi sel yang masih hidup, R2 dan R3 menunjukkan populasi sel yang mengalami early apoptosis dan late apoptosis dan R4 menunjukkan populasi sel yang mengalami nekrosis Region

Kontrol Sel

EEDPE

Tamoxifen

R1 (%)

91,85

0,73

4,55

R2 (%)

6,24

5,71

65,61

R3 (%)

1,75

39,64

27,62

R4(%)

0,21

54,50

2,38

Dari hasil Annexin V Fluos pada kontrol sel, menunjukkan 91,85% sel masih hidup. Pada hasil analisis populasi sel dengan perlakuan EEDPE, menunjukkan bahwa sel yang mengalami nekrosis sebanyak 54,50%, sel mengalami apoptosis sebanyak 45,35% dan sel masih hidup sebanyak 0,73% pada penggunaan konsentrasi IC50. Hal ini menunjukkan bahwa EEDPE menginduksi sel melalui jalur nekrosis. Namun, perlu diperhatikan bahwa ada sebagian kecil populasi sel yang mengalami apoptosis, sehingga perlu adanya optimasi konsentrasi EEDPE supaya populasi sel yang mengalami apoptosis lebih optimal. Selain itu, terdapat hasil nekrosis dimungkinkan kerana menurut Choon 2008 (cit., Putra et al., 2012), secara umum efek sitotoksik menunjukkan fenomena dosedependent, dimana efek sitotoksik meningkat seiring meningkatnya konsentrasi ekstrak dan lamanya inkubasi. Sehingga, semakin lama inkubasi yang dilakukan, beberapa sel akan menunjukkan ciri kematian sel secara nekrosis. Pada analisis Annexin V Fluos terhadap tamoxifen, menunjukkan bahwa sel hidup sebesar 4,55%, sel mengalami apoptosis sebesar 93,23%, dan sel yang mengalami nekrosis sebesar 2,38%. Jika dibandingkan antara EEDPE dan tamoxifen,


35

pemacuan apoptosis ekstrak lebih sedikit dibandingkan dengan tamoxifen. Hal ini membuktikan bahwa mekanisme aksi tamoxifen terhadap kematian sel melalui jalur apoptosis. Mekanisme apoptosis tamoxifen seperti modulasi sinyal protein seperti protein kinase C (PKC), calmodulin, transforming growth factor-β (TGFβ) dan protooncogene c-myc, selain itu peran dari caspase dan mitogen-activated protein kinase (MAPK), termasuk c-Jun N-terminal kinase (JNK) dan p38 juga induksi apoptosis oleh karena tamoxifen (Mandlekar and Kong, 2001). Selain jalur ekstrinsik, tamoxifen juga menginduksi oxidative stress dan apoptosis melalui

jalur

mitochondria-dependent

dan

nitric

oxide

(NO)-dependent

(Nazarewicz et al., 2007).

Gambar 11. Model sinyal induksi tamoxifen untuk modulasi jalur MAPK (JNK atau p38), ER, calmodulin, ceramide, PLC/D, PKC, c-Myc, TGFβ, dan jalur mitokondria/caspase, yang menghasilkan respon apoptosis (Mandlekar and Kong, 2001)


36

D. Uji Imunositokimia Imunositokimia adalah identifikasi konstituen jaringan in situ dengan cara interaksi spesifik antigen-antibodi dimana antibodi dilabel dengan marker terlihat. Pengecatan sel adalah metode yang bagus untuk mendemonstrasikan baik keberadaan dan lokasi subseluler dari molekul khusus yang menarik. Metode yang lebih sensitif dan serbaguna yaitu metode tidak langsung. Pada metode ini, spesifik antibodi berikatan ke antigen, dideteksi dengan reagen sekunder, biasanya antibodi lain yang telah dilabel dengan fluorophore atau enzim. Penggunaan label enzim secara luas, digunakan untuk dapat dilihat dengan mikroskop cahaya standar. Enzim berlabel dideteksi dengan penambahan substrat pada akhir reaksi antigen-antibodi. Reaksi enzim-substrat menghasilkan intensitas warna yang dapat dilihat dibawah mikroskop (Javois, 2007).


37

Gambar 12. Morfologi Sel Kanker PayudaraT47D dengan Uji Imunositokimia. Kontrol sel dengan antibodi ERα (A), Kontrol sel tanpa antibodi ERα (B), Sel kanker payudara T47D dengan perlakuan EEDPE konsentrasi IC50 (C) dan Sel kanker payudara T47D dengan perlakuan tamoxifen konsentrasi IC50 (D). Keterangan : Sel tidak mengekspresikan ERα,

Sel mengekspresikan ERα

Pada morfologi sel T47D, kontrol sel T47D dengan antibodi menunjukkan bahwa inti sel berwarna biru dan sitoplasma berwarna coklat yang menunjukkan ekspresi ERα. Menurut Bjornstrom and Sjoberg (2005), mekanisme klasik aksi ER terlibat pada pengikatan estrogen ke reseptor dalam nukleus, setelah reseptor berdimerisasi dan berikatan ke respon elemen spesifik yang disebut estrogen respon element (ERE) yang berlokasi dalam promoter gen target, sehingga pada uji imunositokimia juga terdapat warna coklat pada nukleus yang mengindikasikan adanya ekspresi ERα. Sedangkan kontrol sel tanpa antibodi ERα berwarna biru baik pada inti sel dan atau sitoplasma. Hal ini menunjukkan bahwa tidak adanya ekspresi ERα. Sedangkan sel dengan perlakuan EEDPE pada


38

konsentrasi IC50 menunjukkan bahwa sel dapat mengekspresikan ERα, namun ada juga sel yang tidak mengekspresikan ERα. Tabel 4. Distribusi ekspresi ERα pada sel T47D dengan perlakuan EEDPE, tamoxifen dan kontrol negatif. Distribusi pengecatan (persentasi sel positif): 0: ≤ 5% ; 1+ : 6-25% ; 2+ : 26-50% ; 3+ : 51-75% ; 4+ : 76-100%

Lapang Pandang 1 (n = 126) 2 (n = 192) 3 (n = 144) Lapang Pandang 1 (n = 56) 2 ( n = 80) 3 ( n = 63)

Lapang Pandang 1 (n = 514) 2 ( n = 365) 3 ( n = 193)

Ekspresi ERα pada perlakuan EEDPE 126 (100%) 44 (22,92%) 46 (31,94%) Ekspresi ERα pada perlakuan Tamoxifen 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%) Ekspresi ERα pada kontrol sel tanpa Antibodi ERα 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)

Ekspresi ERα pada kontrol sel dengan Antibodi ERα 1 (n = 175) 175 (100%) 2 ( n = 101) 101 (100%) 3 ( n = 177) 177 (100%) Lapang Pandang

Level 4+ 1+ 2+

Level 0 0 0

Level 0 0 0

Level 4+ 4+ 4+

Pada tabel 4 menunjukkan ada dan tidaknya ekspresi ERα. Pada tabel ekspresi ERα dengan perlakuan EEDPE menunjukkan skor 4+ pada lapang pandang pertama, sel T47D mengekspresikan ERα. Di lapang pandang kedua, diperoleh skor 1+ untuk sel yang mengekspresikan ERα. Dan pada lapang


39

pandang ketiga diperoleh skor 2+ untuk sel yang dapat mengekspresikan ERα. Hasil ekspresi ERα dengan perlakuan EEDPE menunjukkan sel kanker payudara T47D mengekspresikan ERα. Target spesifik yang dituju pada ERα menunjukkan adanya beberapa penekanan ekspresi ERα walaupun penekanan ekspresi tidak spesifik pada ERα. Sehingga EEDPE tidak menekan ekspresi ERα. Gambar yang ditunjukkan mirip dengan kontrol sel dengan antibodi ERα. Pada tabel ekspresi ERα dengan perlakuan tamoxifen menunjukkan skor 0 (nol) pada ketiga lapang pandang. Sel T47D dengan perlakuan tamoxifen tidak mengekspresikan ERα, yang menunjukkan bahwa adanya penekanan ekspresi ERα. Hal ini menunjukkan bahwa tamoxifen merupakan obat dengan target spesifik ERα. Begitu pula pada kontrol sel tanpa antibodi, hasil menunjukkan bahwa tidak ada ekspresi ERα pada sel kanker payudara T47D. Gen ERα bertanggung jawab dalam peningkatan transkripsi gen. Dan metilasi gen promoter ERα juga berkontribusi untuk regulasi transkripsi gen. Down-regulation ekspresi gen ERα dapat dikontrol oleh dua mekanisme yaitu metilasi DNA dari area promoter atau penghilangan aktivator transkripsional (Hayashi, 2003). Daun pukul empat juga diketahui memiliki senyawa glikosida, protein, phenolic compound, dan tanin (Mohammed, 2013) dalam ekstrak etanolik. Selain itu, menurut Kumar et al. (2010) (cit., Lim, 2014), senyawa yang terkandung dalam ekstrak etanol daun pukul empat yaitu flavonoid, fenol, kumarin, antrakinon.


40

Protein yang terkandung dalam daun pukul empat ini termasuk dalam ribosome-inactivating proteins (RIPs) yang secara luas terdistribusi tinggi pada tanaman. RIP adalah kelompok protein yang dapat menginaktifkan ribosome dengan memodifikasi 28S rRNA melalui aktivitas N-glikosidase. Melalui mekanisme ini, ikatan faktor perpanjangan 2 dihambat, hasilnya adalah penghambatan sintesis protein (Ikawati et al., 2003). Jika sintesis protein terhambat, maka perkembangan sel juga akan terhambat. Perkembangan kanker adalah proses multistage yang terlibat dalam serangkaian tahap individual termasuk inisiasi, promosi, progresi, invasi dan metastasis. Inisiasi tumor dimulai ketika DNA dalam sel atau populasi sel rusak oleh paparan karsinogen, yang diturunkan dari tiga sumber utama yaitu rokok, infeksi/inflamasi, dan nutisi/diet. Jika kerusakan DNA lolos dari perbaikan, hal ini akan menyebabkan mutasi genetik. Promosi tumor adalah pengembangan klon selektif dari sel terinisiasi untuk membentuk populasi sel tumor premalignant yang secara aktif berproliferasi multi seluler. Selama progresi, sel premalignant berkembang menjadi tumor melalui proses perkembangan klon. Pada tahap akhir perkembangan kanker, terjadi invasi dan metastasis, dimana sel tumor dari massa tumor primer, berpindah melalui sekeliling jaringan lewat aliran darah atau aliran limfa dan membuat lesi kedua. Efek penghambatan fenolik alami dalam karsinogenik dan pertumbuhan tumor kemungkinan melalui dua pokok mekanisme yaitu memodifikasi status redoks dan mempengaruhi fungsi dasar seluler (siklus sel, apoptosis, inflamasi, angiogenesis, invasi dan metastasis) (Dai


41

and Mumper, 2010). Sehingga antioksidan juga dapat digunakan sebagai antikanker. Ekstrak etanol daun pukul empat memiliki efek sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D dengan nilai IC50 sebesar 112,97 µg/mL. Hal ini dapat membuktikan bahwa EEDPE berpotensi untuk dikembangkan sebagai agen kemopreventif untuk kanker payudara. Induksi EEDPE terhadap sel kanker payudara T47D menyebabkan sel kanker mengalami kematian sel dengan mekanisme nekrosis lebih besar dibanding apoptosis. Mekanisme molekuler dengan target spesifik ERα diketahui bahwa tidak adanya penekanan pada ekspresi ERα, sehingga perlu dilakukan penelusuran target spesifik lainnya.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan Ekstrak etanol daun pukul empat (EEDPE) berpengaruh terhadap viabilitas sel, menginduksi apoptosis, mampu menghambat pertumbuhan sel dengan nilai IC50 sebesar 112,97 µg/mL pada sel kanker payudara T47D dan menunjukkan tidak adanya penekanan ekspresi ERα. B. Saran 1.

Perlu dilakukan analisis kandungan senyawa yang terkandung dalam ekstrak.

2.

Perlu dilakukan uji sitotoksik menggunakan sel normal untuk mengetahui keselektifan ekstrak etanol daun pukul empat terhadap sel kanker.

3.

Perlu dilakukan penelitian lanjutan mengenai target spesifik molekuler selain ERα.

42


43

DAFTAR PUSTAKA Ahmad, I., Aqil, M., and Owais, M., 2006, Modern Phytomedicine, WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA, Jerman. Aka, J.A., and Lin, S.X., 2012, Comparison of Fungsional Proteomic Analyses Breast Cancer Cell Lines T47D and MCF7, PLoS ONE, 7(2):e31532. American Cancer Society, 2013, Breast Cancer, American Cancer Society, Atlanta. Aoki, K., et al., 2008, Pharmacological Study of Antispasmodic Activity of Mirabilis jalapa Linn Flowers, J. Ethnopharmacol., 116(1):96-101. ATCC, 2011, MTT Cell Proliferation Assay, American Type Culture Collection, USA. Augustine, B.B., Dash, S., Lahkar, M., Lihite, R.J., Samudrala, P.K., Pitta, S., Effect of Mirabilis jalapa L. Linn Flowers in Experimentally Induced Arthritis and Consecutive Oxidative Stress, International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences Vol. 5, Issue 2. Berridge, M.V., Herst, P.M., Tan, A.S., 2005, Tetrazolium Dyes as Tools in Cell Biology : New Insights Into Their Cellular Reduction, Biotechnology Annual Review, Volume 11, 127-152. Bjornstrom, L., and Sjoberg, M., 2005, Mechanisms Estrogen Receptor Signaling : Convergence of Genomic and Nongenomic Actions on Target Genes, Molecular Endocrinology, 19(4):833-842. CCRC, 2009, Preparasi Sampel Untuk Flowcytometry, UGM, Yogyakarta. Collins, P.M., 2006, Dictionary of Carbohydrates with CD-ROM, 2nd edition, Taylor & Francis Group, Boca Raton, p. 542. Covaleda A.M.S., et al., 2008, Influence of Cellular ERα/ERβ Ratio on the ERα– Agonist Induced Proliferation of Human T47D Breast Cancer Cells, Toxicological Sciences, 105(2), 303-311. Dai, J., and Mumper, R.J., 2010, Plant Phenolics: Extraction, Analysis and Their Antioxidant and Anticancer Properties, Molecules, 15:7313-7352. Devi, S.L., Dhanamani, M., and Kannan, S., 2010, In-vitro Antibacterial Activity of Various Extract of Mirabilis jalapa L. Stem, Der. Pharmacia Lettre, 2(6):329-332. Direktorat Jenderal P.P. & P.L., 2009, Buku Saku Pencegahan Kanker Leher Rahim dan Kanker Payudara, Jakarta, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, pp. 1. 11.


44

Doyle, A., and Griffiths, J.B., 2000, Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedure in Biotechnology, John Wiley and Sons, Singapore, pp. 62-64. Frei, M., 2011, Biofiles, Volume 6, Sigma-Aldrich Co, Nomor 5. Friedli, G.L., 2015, Glycoside, Friedli enterprises, http://www.friedli.com/herbs/phytochem/glycosides.html, diakses tanggal 18 Februari 2015. Gabriel, J., 2007, The Biology of Cancer, 2nd edition, John Wiley & Sons, England Hacker, M., Bachmann, K., and Messer, W., 2009, Pharmacology : Principle and Practice, Academic Press, London, pp. 455. Hayashi, S.I., et al., 2003, The Expression and Function of Estrogen Receptor α and β in Human Breast Cancer and Its Clinical Application, EndocrineRelated Cancer, 10:193-202. Holliday, D.L., and Speirs, V., 2011, Choosing The Right Cell Line for Breast Cancer Research, Breast Cancer Research, 13:215. Ikawati, Z., Sudjadi, Elly, W., Puspitasari, D., and Sismindari, 2003, Induction of Apoptosis by Protein Fraction Isolated from The Leaves of Mirabilis jalapa L on HeLa and Raji Cell-Line, Oriental Pharmacy and Experimental Medicine, 3(3), 151-156. Javois, L.C., 2007, Immunocytochemical Methods and Protocols, 2nd edition, Humana Press Inc, Totowa. Kar, A., 2007, Pharmacognosy and Pharmacobiotecnology, New Age International, New Delhi. Kealey, D., and Haines, P.J., 2002, Analytical Chemistry, BIOS Scientific Publisher limited, UK, pp. 198. Koopman, G., et al., 1994, Annexin V for Flow Cytometric Detection of Phosphatidylserine Expression on B cells Undergoing Apoptosis, Blood, 84: 1415-1420. Kuang, J.L. and Zhang, D.Z., 2007, Chemical Constituents of The Root of Mirabilis jalapa L., Journal of Guangdong College of Pharmacy, China. Lemasters, J.J., 1998, The Mitochondrial Permeability Transition in Cell Death : a Common Mechanism in Necrosis, Apoptosis an Autophagy, Biochimica et Biophysica Acta, 1366:177-196. Lim, T.K., 2014, Mirabilis jalapa, Edible Medical and Non Medical Plants, Volume 8, 497-513.


45

Ling, K.H., et al., 2009, A Guide To Medical Plants: An Illustrated, Scientific and Medicinal Approach, World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd, Singapore. Mahalingam, R., et al., 2012, GC-MS Detemination of Bioactive Compounds of Mirabilis jalapa L., Asian Journal of Plant Science and Research, 2 (3):224-227. Mandlekar, S., and Kong, A.N.T., 2001, Mechanisms of Tamoxifen-Induced Apoptosis, Kluwer Academic Publishers, 6:469-477. Matthews, J., and Gustafsson, J.A. 2003, Estrogen Signaling : A Subtle Balance Between ERα and ERβ, Molecular Intervention, Volume 3, Issue 5. Meiyanto, E., Susidarti, R.A., Handayani, S., Rahmi, F., 2008, Ekstrak Etanolik Biji Buah Pinang (Areca catechu L.) Mampu Menghambat Proliferasi dan Memacu Apoptosis Sel MCF-7, Majalah Farmasi Indonesia, 19(1):12-19. Mohammed, M.T., 2012, Study of Some Mirabilis jalapa L. Leaves Components and Effect of Their Extracts on Growth of Pathogenic Bacteria, AlMustansiriyah J. Sci., Volume 23, No 6. Mosmann, T., 1983, Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and Survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays, Journal of Immunological Methods, 65: 55-63. Nazarewicz., R.R., et al., 2007, Tamoxifen Induces Oxidative Stress and Mitochondrial Apoptosis via Stimulating Mitochondrial Nitric Oxide Synthase, Cancer Res., 67:(3). Nurzijah, I., Putri, D.P.P., Rivanti, E., and Meiyanto, E., Secang (Caesalpinia sappan L.) Heartwood Ethanolic Extracts Shows Activity as Doxorubicin Co-chemotherapeutic Agent by Apoptotis Induction on T47D Breast Cancer Cells, Indonesia Journal of Cancer Chemoprevention, 3(2): 377384. PubChem, 2015, Boeravinone C, NCBI, http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?sid=103510962, diakses tanggal 18 Februari 2015. PubChem, 2015, Brassicasterol, NCBI, http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?sid=223439140, diakses tanggal 18 Februari 2015. PubChem, 2015, Chrysophanol, NCBI, http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?sid=225146908, diakses tanggal 18 Februari 2015.


46

PubChem, 2015, Oleanolic acid, NCBI, http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?sid=221672509, diakses tanggal 18 Februari 2015. PubChem, 2015, Stigmasterol, NCBI, http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?sid=160855454, diakses tanggal 18 Februari 2015. PubChem, 2015, Ursolic acid, NCBI, http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?sid=57654721, diakses tanggal 18 Februari 2015. PubChem, 2015, β-Sitosterol, NCBI, http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/summary/summary.cgi?sid=85165263, diakses tanggal 18 Februari 2015. Putra, A., et al., 2012, Efektivitas Ekstrak Umbi Typhonium flagelliforme Fraksi Diklorometanolik dalam Menghambat Proliferasi Sel MCF-7 Kanker Payudara, J. Indon. Med. Assoc., Volume 62, Nomor 1. Riccardi, C., and Nicoletti, I., 2006, Analysis of Apoptosis by Propidium Iodine Staining and Flow Cytometry, Nature Protocols, Volume 1, Nomor 3. Rumzhum, N.N., et al., 2008, Cytotoxicity and Antioxidant Activity of Extractives from Mirabilis jalapa L., S.J. Pharm. Sci., 1(1&2):85-88. Shaik, S., et al., 2012, Phytochemical and Pharmacological Studies of Mirabilis jalapa Linn., International Journal of Pharmacy & Technology, Volume 4, Issue 2:2075-2084. Siddiqui, S., et al., 1990, Constituents of Mirabilis jalapa L., Fitoterapia Vol. 61, 5:471. Sigma, 2015, Product Specification, Sigma-Aldrich, http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1390?lang=en&re gion=ID, diakses tanggal 18 Februari 2015. Singh, M., et al., 2010, Anti-inflammatory Activity of Aqueous Extract of Mirabilis jalapa L. Leaves, Pharmacognosy Res., 2(6):364-367. Smith, C., Marks, A.D., and Lieberman, M., 2005, Basic Medical Biochemistry : A Clinical Approach, 2nd edition, Lippincott Williams & Wilkins. Span, L.F.R., et al., 2001, The Dynamic Process of Apoptosis Analyzed by Flow Cytometry Using Annexin-V/Propidium Iodide and a Modified In Situ End Labeling Technique, Cytometry, 47:24-31.


47

Stefek, M., 2011, Natural Flavonoids as Potential Multifungsional Agents in Prevention of Diabetic Cataract, Interdiscip. Toxicol., 4(2): 69-77. Suhesti, E.P.N.R.T.S., and Aditiyono, R.W., 2012, The Breast of Anticancer from Leaf Extract of Annona Muricata Agents Cell Line in T47D, International Journal of Applied Science and Technology, 2(1):157-164. Vang, R., et al., 2006, Immunohistochemistry for Estrogen and Progesterone Receptors in The Distinction of Primary and Metastatic Mucinous Tumors in The Ovary: an Analysis of 124 Cases, Modern pathology, 19:97-105. Vermes, I., et al., 1995, A Novel Assay for Apoptosis Flow Cytometric Detection of Phosphatidylserin Expression on Early Apoptotic Cells Using Fluorescein Labelled Annexin V, Journal of Immunological Methods, 184 : 39-51. Walker, C.I., et al., 2008, Antinociceptive Activity of Mirabilis jalapa L. in Mice, J. Ethnopharmacol., 120(2):169-75. Wang, 2002, Mirabijalone A, Helv. Chim. Acta, http://kanaya.naist.jp/knapsack_jsp/information.jsp?mode=r&word=C00 019747&key=0, diakses tanggal 18 Februari 2015. Zhou, J.Y., et al., 2012, Hypoglycemic and Hypolipidemic Effects of Etanolic Extract of Mirabilis jalapa L. Root on Normal and Diabetic Mice. Hindawi Publishing Corporation, China.


48

LAMPIRAN


Lampiran 1. Surat Determinasi Tanaman Mirabilis jalapa L.

49


50

Lampiran 2. Uji Sitotoksik menggunakan metode MTT A.

Pembuatan larutan stok EEDPE Larutan stok dibuat dengan menimbang ekstrak EEDPE sebesar 10 mg dan dilarutkan menggunakan 100 µL DMSO.

B.

Pembuatan seri konsentrasi EEDPE Dilarutkan 10 mg EEDPE dalam 100 µL DMSO Larutan Stok

Larutan Intermediet (10.000 µg/mL) C1 = 2.000 µg/mL

C2 = 1.000 µg/mL

C3 = 100 µg/mL

C4 = 10 µg/mL

C5 = 1 µg/mL

C6 = 0,1 µg/mL

C7 = 0,01 µg/mL

=

=

C x V = C’ x V’ 10.000 µg/mL x 1.000 µL = 100.000 µg/mL x V’ V’ = 100 µL C x V = C’ x V’ 2.000 µg/mL x 500 µL = 10.000 µg/mL x V’ V’ = 100 µL C x V = C’ x V’ 1.000 µg/mL x 500 µL = 2.000 µg/mL x V’ V’ = 250 µL C x V = C’ x V’ 100 µg/mL x 500 µL = 1.000 µg/mL x V’ V’ = 50 µL C x V = C’ x V’ 10 µg/mL x 500 µL = 100 µg/mL x V’ V’ = 50 µL C x V = C’ x V’ 1 µg/mL x 500 µL = 10 µg/mL x V’ V’ = 50 µL C x V = C’ x V’ 0,1 µg/mL x 500 µL = 1 µg/mL x V’ V’ = 50 µL C x V = C’ x V’ 0,01 µg/mL x 500 µL = 0,1 µg/mL x V’ V’ = 50 µL


C.

51

Pembuatan stok tamoxifen Tamoxifen ditimbang sebesar 10 mg dan dilarutkan dengan 100 µL DMSO. Perhitungan stok tamoxifen =

D.

= 19,7242 x 10-7 ≈ 2.000 µM

Pembuatan seri konsentrasi tamoxifen Larutan Stok C1 = 1.000 µM

C2 = 100 µM

C3 = 10 µM

C4 = 1 µM

C5 = 0,1 µM

C6 = 0,01 µM

Konsentrasi stok tamoxifen 2.000 µM C x V = C’ x V’ 1.000 µM x 500 µL = 2.000 µM x V’ V’ = 250 µL C x V = C’ x V’ 100 µM x 500 µL = 1.000 µM x V’ V’ = 50 µL C x V = C’ x V’ 10 µM x 500 µL = 100 µM x V’ V’ = 50 µL C x V = C’ x V’ 1 µM x 500 µL = 10 µM x V’ V’ = 50 µL C x V = C’ x V’ 0,1 µM x 500 µL = 1 µM x V’ V’ = 50 µL C x V = C’ x V’ 0,01 µM x 500 µL = 0,1 µM x V’ V’ = 50 µL


E.

Hasil Pembacaan MTT Perlakuan EEDPE menggunakan Elisa Reader

Konsentrasi 2.000 µg/mL 1.000 µg/mL 100 µg/mL 10 µg/mL 1 µg/mL 0,1 µg/mL 0,01 µg/mL

F.

A3 0,133 0,086 0,47 0,729 0,758 0,766 0,698

Hasil Viabilitas vs Konsentrasi Perlakuan EEDPE

Konsentrasi 2.000 µg/mL 1.000 µg/mL 100 µg/mL 10 µg/mL 1 µg/mL 0,1 µg/mL 0,01 µg/mL

G.

A1 0,129 0,092 0,465 0,633 0,697 0,646 0,621

Absorbansi A2 0,131 0,081 0,467 0,738 0,736 0,681 0,683

V1 5,318 -0,413 57,357 83,376 93,289 85,390 81,518

Viabilitas V2 5,627 -2,117 57,666 99,639 99,329 90,811 91,120

V3 5,937 -1,342 58,131 98,245 102,736 103,975 93,443

Hasil Pembacaan MTT Perlakuan Tamoxifen menggunakan Elisa Reader

Konsentrasi 371,5 µg/mL 37,15 µg/mL 3,715 µg/mL 0,3715 µg/mL 0,03715 µg/mL 0,003715 µg/mL

A1 0,122 0,107 0,789 0,778 0,761 0,669

Absorbansi A2 0,128 0,11 0,784 0,744 0,776 0,742

A3 0,125 0,111 0,759 0,692 0,769 0,701

52


H.

Hasil Viabilitas vs Konsentrasi Perlakuan Tamoxifen

Konsentrasi 371,5 µg/mL 37,15 µg/mL 3,715 µg/mL 0,3715 µg/mL 0,03715 µg/mL 0,003715 µg/mL

I.

V1 4,233 1,910 107,537 105,834 103,201 88,952

Viabilitas V2 5,163 2,375 106,763 100,568 105,524 100,258

V3 4,698 2,530 102,891 92,514 104,440 93,908

Hasil Grafik Viabilitas Sel versus Konsentrasi Perlakuan EEDPE

53


J.

Hasil Grafik Viabilitas Sel versus Konsentrasi Perlakuan Tamoxifen

54


55

Lampiran 3. Uji Apoptosis menggunakan Annexin V Fluos A.

Pembuatan Larutan Stok EEDPE Larutan stok dibuat dengan menimbang ekstrak EEDPE sebesar 10 mg dan dilarutakan menggunakan 100 µL DMSO.

B.

Pembuatan Larutan EEDPE konsentrasi IC50 Larutan stok yang telah dibuat diencerkan hingga didapat larutan EEDPE dengan konsentrasi 112,97 µg/mL.

C.

Hasil Analisis Flow Cytometry

Sample ID: MIRABILIS T47D Patient ID: 1124.14 Acquisition Date: 24-Nov-14 Gate: No Gate Total Events: 20000 Quad Location: 46, 41 Quad % Gated % Total UL 55.99 55.99 UR 37.51 37.51 LL 0.73 0.73 LR 5.78 5.78

R4

Sample ID: MIRABILIS T47D Patient ID: 1124.14 Acquisition Date: 24-Nov-14 Gate: No Gate Total Events: 20000

R2 R1

Region % Gated % Total R1 0.73 0.73 R2 5.71 5.71 R3 39.64 39.64 R4 54.50 54.50


56


57

Lampiran 4. Uji Ekspresi Gen menggunakan metode Imunositokimia A.

Pembuatan Larutan Stok Larutan stok dibuat dengan menimbang ekstrak EEDPE sebesar 10 mg dan dilarutakan menggunakan 100 µL DMSO.

B.

Pembuatan Larutan EEDPE konsentrasi IC50 Larutan stok yang telah dibuat diencerkan hingga didapat larutan EEDPE dengan konsentrasi 112,97 µg/mL.

C.

Hasil ICC dengan perlakuan EEDPE Lapang pandang 1 = A. Lapang pandang 2 = B. Lapang pandang 3 = C.


D.

Hasil ICC dengan perlakuan tamoxifen Lapang pandang 1 = A. Lapang pandang 2 = B. Lapang pandang 3 = C.

E.

Hasil ICC kontrol sel tanpa perlakuan antibodi

58


F.

Hasil ICC kontrol sel dengan perlakuan antibodi

59


60

BIOGRAFI PENULIS

Andung Panjalu Vidityo dilahirkan di Purworejo, 16 Desember 1992, anak ketiga dari tiga bersaudara pasangan Supasdi dan Sukarsih. Penulis menempuh pendidikan di TK Seruni, Purworejo dan melanjutkan ke jenjang berikutnya di SD Kristen Pangen Purworejo pada tahun 1999 - 2005, SMP Negeri 1 Purworejo pada tahun 2005 - 2008, SMA Negeri 6 Purworejo pada tahun 2008 - 2011. Penulis melanjutkan pendidikan ke jenjang Strata Satu (S1) di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta. Selama kuliah penulis pernah aktif di Paduan Suara Fakultas “Veronica”.

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Recommend Documents