PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

PLAGIAT PLAGIATMERUPAKAN MERUPAKANTINDAKAN TINDAKANTIDAK TIDAKTERPUJI TERPUJI

UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN METODE DEOKSIRIBOSA DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL PADA FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOLIK DAUN JAMBU METE ( Anacardium occidentale L. )

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi

Oleh: I Putu Abhiseka Pranajaya NIM : 118114064

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2015


UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN MENGGUNAKAN METODE DEOKSIRIBOSA DAN PENETAPAN KANDUNGAN FENOLIK TOTAL PADA FRAKSI ETIL ASETAT EKSTRAK ETANOLIK DAUN JAMBU METE ( Anacardium occidentale L. )

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi

Oleh: I Putu Abhiseka Pranajaya NIM : 118114064

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA YOGYAKARTA 2015

i


ii


iii


HALAMAN PERSEMBAHAN

“Aku benci setiap menit dari latihan, tetapi saya katakan, jangan berhenti! Menderitalah sekarang dan hidup pada sisa hidupmu sebagai seorang juara” (Muhammad Ali)

Kupersembahkan skripsi ini untuk : Ida Sang Hyang Widhi penuntun hidupku Bapak dan ibu beserta seluruh keluarga yang selalu mendampingiku dan selalu ada saat senang maupun susah Sahabat, teman dan Almamaterku

iv


v


vi


PRAKATA Puji syukur kehadirat Tuhan Yang Maha Esa yang telah memberikan rahmat dan karuniaNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan skripsi yang berjudul “Uji Aktivitas Antioksidan Menggunakan Metode Deoksiribosa dan Penetapan Kandungan Fenolik Total Pada Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanolik Daun Jambu Mete (Anacardium occidentale L.)” sebagai salah satu syarat guna memperoleh gelar sarjana farmasi di Fakultas Farmasi Sanata Dharma Yogyakarta. Proses penyusunan skripsi ini banyak mendapat bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak, sehingga penyusus ingin mengucapkan terimakasih kepada: 1. Yohanes Dwiatmaka, M.Si. sebagai Dosen Pembimbing yang telah memberikan bimbingan, pengarahan serta ilmu dalam penelitian dan penyusunan skripsi ini. 2. Prof. Dr. C. J. Soegihardjo, Apt. sebagai Dosen Penguji atas pengarahan dan kesediaannya menguji skripsi ini. 3. Dr. Erna Tri Wulandari, M.Si., Apt. sebagai Dosen Penguji atas pengarahan dan kesediaanya menguji skripsi ini. 4. Aris Widayati, M.Si., Ph.D., Apt. sebagai Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 5. Segenap dosen dan karyawan Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma. 6. Ni Komang Meyla Wulandari yang selalu mendampingi, memberi semangat dan dukungan kepada penulis. vii


7. Yoanes Kapistran Ervan Prasetio sebagai teman skripsi, terimakasih atas kerjasama yang telah dilewati bersama dalam penelitian ini. 8. Teman-teman FSM B dan FST A 2011 yang telah memberikan semangat dan dukungan kepada penulis selama penyusunan skripsi. 9. Teman-teman Farmasi angkatan 2011 yang telah memberikan dukungan dalam penyelesaian skripsi 10. Teman-teman kontrakan yang selalu memberi dukungan dan bantuan dalam proses penyelesaian skripsi. 11. Semua pihak yang telah memberi dukungan dan bantuan yang tidak dapat disebutkan satu persatu. Penulis menyadari bahwa penyusunan skripsi ini banyak kekurangan dan jauh dari sempurna, untuk itu dengan segala kerendahan hati penulis mengharapkan saran dan kritik guna perbaikan dan penyempurnaan skripsi ini. Harapan penulis semoga penelitian dan penyusunan skripsi ini bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan khususnya di bidang Farmasi. Yogyakarta, Juni 2015

Penulis

viii


DAFTAR ISI

Halaman HALAMAN JUDUL..................................................................................... i HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING........................................... ii HALAMAN PENGESAHAN....................................................................... iii HALAMAN PERSEMBAHAN.................................................................... iv PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ...................................................... v LEMBAR PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ....................... vi PRAKATA.....................................................................................................vii DAFTAR ISI.................................................................................................. ix DAFTAR TABEL.......................................................................................... xiii DAFTAR GAMBAR..................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN.................................................................................. xv INTISARI...................................................................................................... xvi ABSTRACT..................................................................................................... xvii BAB I PENGANTAR................................................................................. 1 A. Latar Belakang.......................................................................................... 1 1. Permasalahan................................................................................. 4 2. Keaslian penelitian......................................................................... 4 3. Manfaat penelitian......................................................................... 6 B. Tujuan penelitian....................................................................................... 6 1. Tujuan Umum................................................................................ 6 2. Tujuan Khusus............................................................................... 6 BAB II PENELAAHAN PUSTAKA............................................................ 7 ix


A. Jambu Mete............................................................................................... 7 B. Senyawa Fenolik....................................................................................... 9 C. Metode Folin-Ciocalteu............................................................................ 11 D. Radikal Bebas............................................................................................ 11 E. Antioksidan............................................................................................... 12 F. Metode Deoksiribosa................................................................................ 15 G. Ekstraksi.................................................................................................... 16 H. Spektrofotometri....................................................................................... 18 I. Landasan Teori.......................................................................................... 20 J. Hipotesis.................................................................................................... 22 BAB III METODE PENELITIAN................................................................ 23 A. Jenis dan Rancangan Penelitian................................................................ 23 B. Variabel..................................................................................................... 23 C. Definisi Operasional.................................................................................. 23 D. Bahan-Bahan Penelitian............................................................................ 24 E. Alat-Alat penelitian................................................................................... 25 F. Tatacara Penelitian.................................................................................... 25 1. Determinasi tanaman......................................................................... 25 2. Pembuatan dan penyiapan sampel daun jambu mete......................... 25 3. Ekstraksi............................................................................................. 26 4. Fraksinasi ekstrak etanol daun jambu mete....................................... 27 5. Pembuatan reagen Fenton, deoksiribosa, TCA, TBA, pembanding, dan sampel.......................................................................................... 28

x


6. Uji pendahuluan................................................................................. 32 7. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total........................ 33 8. Penetapan kandungan fenolik total.................................................... 34 9. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan........................................ 35 10. Uji aktivitas antioksidan.................................................................... 36 G. Analisis Hasil............................................................................................ 37 BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN....................................................... 39 A. Hasil Determinasi Tanaman...................................................................... 39 B. Persiapan Sampel...................................................................................... 39 C. Hasil Ekstraksi.......................................................................................... 42 D. Hasil Fraksinasi Ekstrak............................................................................ 46 E. Uji Pendahuluan........................................................................................ 48 1. Uji pendahuluan senyawa fenolik....................................................... 48 2. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan................................................ 50 F. Optimasi Metode Uji Fenolik Total.......................................................... 52 1.

Penentuan operating time (OT).......................................................... 53

2.

Penentuan panjang gelombang serapan maksimum (λ maks)............54

G. Estimasi kandungan fenolik total.............................................................. 56 H. Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan............................................. 60 1. Penentuan operating time (OT).......................................................... 60 2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum (λ maks)........... 62 I. Estimasi Aktivitas Antioksidan dengan Radikal Hidroksil....................... 63 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN........................................................ 74

xi


A. Kesimpulan............................................................................................... 74 B. Saran.......................................................................................................... 74 DAFTAR PUSTAKA.................................................................................... 75 LAMPIRAN................................................................................................... 82 BIOGRAFI PENULIS................................................................................... 109

xii


DAFTAR TABEL Halaman Tabel I.

Hasil pembacaan panjang gelombang maksimum asam galat yang direaksikan dengan Folin-Ciocalteu..................... 55

Tabel II.

Hasil penentuan jumlah fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete..........................................58

Tabel III.

Hasil pembacaan panjang gelombang maksimum kromogen MDA-TBA............................................................................. 63

Tabel IV.

Hasil uji aktivitas antioksidan kuersetin dengan metode Deoksiribosa.......................................................................... 66

Tabel V.

Hasil uji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete dengan metode deoksiribosa........69

Tabel VI.

Hasil perhitungan IC15 kuersetin dan fraksi etil asetat...........71

xiii


DAFTAR GAMBAR Halaman Gambar 1.

Hasil uji pendahuluan fenolik (A = larutan blanko [air:metanol + Folin Ciocalteu + Natrium Karbonat]; B = kontrol positif [asam galat + Folin Ciocalteu + Natrium Karbonat]; C = larutan uji + Folin Ciocalteu + Natrium Karbonat; D = larutan asam galat; E = larutan uji).......................................................................................... 50

Gambar 2.

Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = kontrol negatif; B = kontrol positif; C = larutan uji + deoksiribosa + reagen Fenton; D = larutan uji)..................... 52

Gambar 3.

Grafik penentuan OT asam galat (Replikasi 1)......................54

Gambar 4.

Kurva baku asam galat dalam penetapan fenolik total (Rep. 1).................................................................................. 57

Gambar 5.

Grafik penentuan OT kompleks MDA-TBA......................... 61

Gambar 6.

Reaksi Pembentukan kromogen antara MDA-TBA.............. 61

Gambar 7.

Kromogen MDA-TBA........................................................... 62

Gambar 8.

Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan kuersetin (Replikasi 1)........................................................... 68

Gambar 9.

Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan fraksi etil asetat replikasi 3.................................................... 70

xiv


DAFTAR LAMPIRAN Halaman Lampiran 1.

Surat pengesahan determinasi tanaman jambu mete (Anacardium ocidentale L.)................................................... 83

Lampiran 2.

Gambar tanaman jambu mete yang diambil di perkebunan jambu mete Desa Mojolegi, Imogiri, Bantul, DIY............................................................................ 84

Lampiran 3.

Perhitungan rendemen ekstrak etanol daun jambu mete dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete........ 85

Lampiran 4.

Penimbangan uji kandungan fenolik total..............................87

Lampiran 5.

Optimasi penentuan kandungan fenolik total........................ 88

Lampiran 6.

Penentuan kandungan fenolik total........................................ 91

Lampiran 7.

Data perhitungan konsentrasi reagen dan fraksi etil asetat aktivitas antioksidan.................................................... 94

Lampiran 8.

Optimasi metode uji aktivitas antioksidan............................. 100

Lampiran 9.

Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal hidroksil......103

Lampiran 10. Perhitungan nilai IC15 kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etnolik daun jambu mete............................................ 106 Lampiran 11. Uji Statistik............................................................................. 107

xv


INTISARI Salah satu penyebab penyakit degeneratif adalah paparan radikal bebas yang menyebabkan kerusakan pada sel manusia. Antioksidan dapat mencegah kerusakan yang disebabkan radikal bebas. Tanaman jambu mete merupakan salah satu tanaman yang memiliki aktivitas antioksidan. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui seberapa besar aktivitas antioksidan dan kandungan fenolik total yang terdapat dalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete (Anacardium occidentale L.). Pengukuran aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode deoksiribosa dan penetapan kandungan fenolik total dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteu yang nilainya dinyatakan dengan massa ekuivalen asam galat per massa fraksi. Deoksiribosa yang terdegradasi akan menghasilkan produk berupa malonaldehida yang ketika direaksikan dengan TBA pada pH rendah akan menghasilkan chromogen berwarna merah muda. Chromogen yang dihasilkan selanjutnya dibaca serapannya dengan spektrofotometer. Hasil penelitian menunjukkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete mempunyai kandungan fenolik total sebesar 632,6 ± 23,45 mg ekuivalen asam galat per g fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete dengan nilai IC15 sebesar 17,38 ± 3,1 μg/mL. Aktivitas antioksidan dari fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete tidak berbeda bermakna dibandingkan dengan aktivitas antioksidan dari kuersetin dengan nilai IC15 sebesar 14,07 ± 0,70 μg/mL. Kata kunci : Anacardium occidentale L., antioksidan, fenolik total, deoksiribosa, Folin-Ciocalteu.

xvi


ABSTRACT One of the causes of degenerative disease is due to free radicals exposure that causes damage to human cells. Antioxidants can prevent cells damage that cause by free radicals. Cashew is one of the plants that have antioxidant activity. This research aims to determine the antioxidant activity and the total phenolic content from ethyl acetate fraction of ethanolic extract of cashew leaf. Determination of antioxidant activity performed by deoxyribose method and determinatin of total phenolic content performed by Folin-Ciocalteu method expressed by gallic acid equivalent mass per mass fraction. Deoxyribose which degraded will produce malonaldehyde that can reacted with TBA at low pH and will produce pink chromogen. Further, the chromogen will read with a spectrophotometer. The results showed that the ethyl acetate fraction of ethanolic extract of cashew leaf contain a total phenolic content of 632,6 ± 23,45 mg gallic acid equivalent per g of ethyl acetat fraction of ethanolic extract of cashew leaf and IC15 values is 17,38 ± 3,1 µg/mL. The antioxidant activity of ethyl acetate fraction of ethanolic extract of cashew leaf was not significantly different compared with the antioxidant activity of quercetin with IC15 values is 14,07 ± 0,70 µg/mL. Keywords : Anacardium occidentale L., antioxidant, total phenolic content, deoxyribose, Folin-Ciocalteu.

xvii


BAB I PENGANTAR A. Latar Belakang Dewasa ini, dunia kesehatan banyak membahas tentang radikal bebas (free radical) dan antioksidan. Penyakit-penyakit degeneratif diawali dengan adanya reaksi oksidasi berlebihan di dalam tubuh. Beberapa penyakit degeneratif berhubungan erat dengan oksidasi berlebihan akibat dari radikal bebas di antaranya kanker, penyakit jantung dan pembuluh darah, pikun, katarak dan penurunan fungsi kognitif, selain itu proses penuaan dini juga berhubungan erat dengan oksidasi berlebihan yang diakibatkan oleh senyawa-senyawa radikal bebas (Winarsi, 2007). Radikal bebas itu sendiri merupakan suatu molekul yang kehilangan elektron terluarnya yang dengan cepat dapat bereaksi dengan atom-atom atau senyawa-senyawa di lingkungannya (Droge, 2002). Selain radikal bebas juga terdapat istilah antioksidan yang merupakan senyawa yang bertindak sebagai penangkal radikal bebas dan mencegah terjadinya kerusakan yang diakibatkan oleh senyawa radikal sehingga dapat meningkatkan pertahanan kekebalan tubuh dan menurunkan risiko penyakit kanker serta penyakit degeneratif lainnya (Pham-Huy, 2008). Industri-industri kesehatan

seringkali

makanan serta obat-obatan dan suplemen menambahkan

antioksidan

sintetik

didalam

produknya, baik untuk mencegah oksidasi dan mempertahankan mutu 1


2

produk dalam kemasan maupun sebagai zat aditif untuk memberikan efek antioksidan dalam tubuh. Penambahan antioksidan sintetik ini diberi batasan karena dicurigai bersifat karsinogenik bila dipakai berlebihan (Saikia, 2011). Salah satu sumber antioksidan yang kaya di bumi ini adalah tanaman. Antioksidan yang berasal dari tanaman berfungsi untuk melindungi tanaman itu sendiri dari radikal bebas akibat terkena paparan sinar matahari (Khrisnaveni, 2013). Penelitian Sulistyawati (2009), menunjukkan masyarakat Jawa Barat sering mengkonsumsi daun jambu mete yang masih muda sebagai lalap. Menurut penelitian Ifesan, Fashakin, Ebosele dan Oyerinde (2013), tanaman jambu mete merupakan salah satu jenis tanaman yang memiliki kandungan antioksidan tinggi. Daun jambu mete mengandung senyawa kimia antara lain tanin, asam anakardat, kardol, karbohidrat, protein lemak, vitamin dan mineral (Ariyani, 2007). Selain itu, daun jambu mete juga mengandung senyawa fenol yang memiliki kemampuan sebagai antioksidan. Aktivitas antioksidan ekstrak etanol daun jambu mete mempunyai korelasi bermakna dengan total fenol, total flavonoid dan total tanin (Fidrianny, 2012). Adanya senyawa fenolik yang memiliki aktivitas antioksidan pada daun jambu mete maka dapat meningkatkan kesehatan dan mencegah penyakit degeneratif pada masyarakat yang mengkonsumsi daun jambu mete muda.


3

Daun tanaman jambu mete memiliki kandungan asam hidroksi benzoat, glikosida kaemferol, glikosida, dan kuersetin yang diketahui memiliki aktivitas antioksidan. Terdapat komponen minyak atsiri pada daun jambu mete yang terdiri dari golongan monoterpen (pinen, feladren, borneol, dan karvakrol) (Sudarsono et al, 2002). Tanaman jambu mete akan tumbuh baik bila persyaratan tumbuhnya dipenuhi seperti tercukupinya paparan sinar matahari, suhu harian sekitar 27oC dengan kelembaban sekitar 70-80%, tumbuh pada tanah liat berpasir dan curah hujan antara 1.000-2.000 mm/tahun (Suhadi, 2007). Tanaman yang tumbuh pada lingkungan yang sesuai dengan syarat tumbuhnya memiliki kandungan fitokimia yang dapat berbeda dengan tanaman yang sama pada kondisi lingkungan yang tidak sesuai. Terdapat kandungan senyawa yang bisa saja hilang pada tanaman dengan tempat tumbuh yang tidak sesuai dengan syarat tumbuh tanaman tersebut (Rahardjo, 2006). Salah satu metode dalam mengukur nilai aktivitas antioksidan adalah metode deoksiribosa, metode deoksiribosa merupakan metode yang sederhana dalam mengukur nilai aktivitas antioksidan (Halliwell, 1987). Metode deoksiribosa dapat menggambarkan penyerangan radikal hidroksil terhadap DNA manusia karena dioksiribosa merupakan gula penyusun DNA

manusia.

Selain

itu,

metode

deoksiribosa

juga

dapat

menggambarkan apakah sebuah senyawa antioksidan dapat melindungi deoksiribosa yang merupakan bagian dari DNA tubuh secara baik atau


4

tidak. Prinsip dari metode deoksiribosa adalah degradasi dari 2deoksiribosa oleh senyawa radikal hidroksil yang dihasilkan dari reagen Fenton yang telah dibuat sebelumnya (Giao et al, 2008). Aktivitas antioksidan yang ada dalam daun jambu mete diperkirakan berasal dari golongan aglikon flavonoid (Fidrianny, 2012). Flavonoid yang dalam bentuk aglikonnya akan bersifat kurang polar, sehingga dengan fraksinasi dengan pelarut etil asetat dan air maka senyawa yang diharapkan berupa flavonoid aglikon akan tersari dalam fraksi etil asetat sehingga dapat menspesifikasikan penyarian. Dari latar belakang tersebut maka perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap aktivitas antioksidan dan fenolik total dari fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete. 1. Permasalahan a. Berapakah kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete yang diukur dengan metode Folin-Ciocalteu dan dinyatakan dengan massa ekuivalen asam galat ? b. Berapakah besar nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete dengan metode deoksiribosa ? 2. Keaslian Penelitian Penelitian tentang kandungan antioksidan dalam daun jambu mete pernah dilakukan oleh Jaiswal, Tatke, Gabhe, and Vaidya (2010). Penelitian tersebut menggunakan daun jambu mete yang didapat dari


5

hutan Tungareshwar India yang memiliki karakteristik lingkungan dengan curah hujan tinggi. Uji aktivitas aktioksidan dilakukan dengan metode DPPH dan ditetapkan kandungan fenolik totalnya menggunakan metode Folin-Ciocalteu. Penelitian tentang daun jambu mete juga dilakukan oleh Fidrianny, Ruslan, dan Saputra (2012). Penelitian menggunakan daun jambu mete yang diperoleh dari Desa Bencah Kelubi, Kecamatan Tapung, Kabupaten Kampar, Riau. Kemudian dalam keadaan kering diekstrak dengan metode refluks. Uji aktivitas aktioksidan dilakukan dengan metode DPPH dan ditetapkan kandungan fenolik totalnya menggunakan metode FolinCiocalteu. Perbedaan antara penelitian ini dengan penelitian sebelumnya adalah penelitian ini menggunakan daun jambu mete dari daerah Desa Wisata Karangtengah Mojolegi, Imogiri, Bantul, Yogyakarta yang memiliki lingkungan yang tepat sebagai syarat tumbuh tanaman jambu mete. Daun dikering-anginkan pada udara terbuka dan dihindarkan dari sinar matahari, diekstraksi menggunakan etanol dan difraksinasi dengan etil asetat. Kandungan fenolik total ditetapkan dengan pereaksi FolinCiocalteu sedangkan pengujian aktivitas antioksidan digunakan metode deoksiribosa.


6

3. Manfaat Penelitian a. Manfaat teoritis

:

Penelitian

ini

diharapkan

dapat

memberi

pengetahuan tentang aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete dengan menggunakan metode deoksiribosa. b. Manfaat praktis

: Penelitian ini diharapkan dapat memberikan

informasi tentang aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete sehingga dapat digunakan dan dimanfaatkan demi memelihara kesehatan manusia dengan cara menangkal radikal bebas. B. Tujuan Penelitian 1. Tujuan umum Untuk menetapkan kandungan fenolik total dan menguji aktivitas antioksidan menggunakan metode deoksiribosa pada fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete. 2. Tujuan khusus a.

Untuk mengetahui kadar kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete dengan menggunakan metode Folin-Ciocalteu yang dinyatakan dalam mg ekuivalen asam galat.

b.

Untuk mengetahui besar aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete dengan menggunakan metode deoksiribosa.


BAB II PENELAAHAN PUSTAKA A. Jambu Mete Menurut United States Department of Agriculture (2014) klasifikasi dari tanaman jambu mete, yaitu: Kerajaan

: Plantae

Sub kerajaan : Tracheobionta Super divisi

: Spermatophyta

Divisi

: Magnoliophyta

Kelas

: Magnoliopsida

Sub kelas

: Rosidae

Ordo

: Sapindales

Suku

: Anacardiaceae

Marga

: Anacardium

Jenis

: Anacardium occidentale L.

Tanaman jambu mete berasal dari Brazil dan masuk ke Indonesia sekitar 400 tahun yang lalu dibawa oleh orang-orang Portugis ke India dan menyebar ke seluruh daerah tropis di Asia dan Afrika termasuk Indonesia. Di Indonesia, tanaman jambu mete mula-mula hanya dianggap sebagai tanaman penghijauan. Namun, setelah diketahui berpotensi meningkatkan kesejahteraan

masyarakat,

tanaman

jambu

mete

tersebut

mulai

dikembangkan ke seluruh daerah di Nusantara yang memiliki kondisi tanah yang

sedikit

gersang

seperti di daerah Nusa Tenggara.

7


8

Pengembangan tersebut dimaksudkan untuk memenuhi permintaan terhadap kacang mete yang terus meningkat (Suprapti, 2003). Tanaman jambu mete memiliki bagian vegetatif dan generatif. Bagian vegetatif tanaman jambu mete terdiri dari akar, batang, dan daun sedangkan bagian generatif terdiri dari bunga, buah, dan biji. Daun jambu mete berbentuk telur, bagian ujung berbentuk bulat namun pada pangkalnya berbentuk runcing. Jambu mete memiliki jenis daun tunggal dan memiliki letak tersebar di seluruh ranting. Bunga jambu mete berukuran kecil, harum, dan sangat banyak jumlahnya. Bunga jambu mete termasuk bunga majemuk yang berbentuk malai dan bermunculan pada setiap ujung ranting. Pada satu malai terdapat bunga jantan dan bunga hemafrodit (berkelamin dua). Dari sekian banyak bunga yang dibuahi, hanya 4-6% yang dapat bertahan hingga matang dan bunga lainnya berguguran pada berbagai tingkat umur (Suhadi, 2007). Buah jambu mete terdiri dari dua bagian, yaitu buah semu yang mirip jambu air dan buah sejati yang berbentuk menyerupai ginjal. Bagian buah semu sebenarnya merupakan tangkai buah yang membesar dari normalnya seolah-olah daging buah normal. Buah jambu mete termasuk kelompok buah batu, berbentuk seperti ginjal manusia. Buah berukuran jauh lebih kecil dibandingkan buah semunya, yaitu dengan panjang antara 15-25 mm dan lebar antara 18-20 mm (Suhadi, 2007).


9

Daun jambu mete sendiri memiliki banyak senyawa kimia yang masih belum terindentifikasi secara sempurna. Beberapa senyawa kimia dalam daun jambu mete terbukti memiliki efek biologis yang dapat membantu memperbaiki kesehatan manusia.

Beberapa kandungan

senyawa kimia dalam daun jambu mete adalah tanin-galat, flavonol, asam akardiol, asam elagat, senyawa fenol, kardol, dan metil kardol (Yuliarti, 2009). Menurut penelitian dari Nugroho (2013), daun jambu mete memiliki kandungan fenolik total yang tinggi.

Hasil penelitian

menunjukkan bahwa ekstrak daun jambu mete memiliki kandungan fenolik sebesar 20 mg ekuivalen asam galat per 100 g ekstrak etanolik daun jambu mete. Kandungan senyawa fenolik dalam daun jambu mete ini diketahui memberikan efek biologis pada kesehatan manusia. Beberapa bagian tanaman jambu mete memiliki khasiat dan kegunaan. Di daerah Jawa Barat, daun muda tanaman jambu mete dikonsumsi sebagai lalapan (Sulistyawati, 2009). Daun dan kulit batang tanaman jambu mete dapat digunakan untuk mengobati beberapa penyakit seperti hipertensi, diabetes mellitus, disentri, beberapa jenis radang, asma, dan bronkitis (Edet, 2013). B. Senyawa Fenolik Secara umum senyawa fenolik merupakan zat atau senyawa yang mengandung satu atau lebih cincin aromatik dengan satu atau lebih gugus


10

hidroksil yang menempel. Senyawa fenolik dapat diklasifikasikan menjadi beberapa jenis, yaitu fenol sederhana, asam fenolat dan aldehid, asetopenon dan asam fenilasetat, asam sinamat, kumarin, flavonoid, bifalvonil, stilben dan benzofenon, benzoquinon, lignan, betacianin, tanin dan plobafen. Asam fenolat, flavonoid, stilben dan lignan merupakan senyawa fenolik yang paling melimpah pada tanaman (Vermerris dan Nicholson, 2006). Senyawa fenolik bertindak sebagai metabolit yang sangat penting dalam tanaman. Selain sangat penting dalam pertumbuhan dan reproduksi, senyawa fenolik sangat penting dalam tanaman karena berguna sebagai agen pelindung terhadap berbagai patogen. Selain itu, senyawa fenolik dalam tanaman berkaitan dengan sifat tampilan tanaman itu sendiri, terutama mengenai warna tanaman apakah akan berwarna cerah atau gelap (Mujica, 2009). Senyawa fenolik memiliki efek antimutagenik, anti-kanker dan anti-inflamasi, namun studi klinis lebih lanjut untuk mendukung efek tersebut pada manusia masih perlu dibahas lebih lanjut. Selain karena efek kesehatannya, aktivitas senyawa fenolik sebagai antioksidan sering dibahas, karena senyawa fenolik dapat bereaksi dengan reactive oxygen species (ROS) dan menghilangkan aktivitas radikalnya sehingga tidak berbahaya lagi terhadap sel tubuh manusia (Sochor, 2010).


11

C. Metode Folin – Ciocalteu Metode Folin-Ciocalteu sering digunakan dalam penentuan total senyawa fenol dalam suatu tanaman atau buah (Hemingway, 1991). Metode ini didasarkan pada reduksi asam fosfotungstat dalam larutan alkali menjadi fosfotungstat biru. Absorbansi yang terbentuk akibat fosfotungstat biru sebanding dengan jumlah senyawa fenolik yang terdapat dalam sampel, sehingga dapat diketahui seberapa besar jumlah kandungan senyawa dengan gugus fenol dalam suatu sampel tanaman yang dinyatakan dengan ekuivalen asam galat (Cindrić et al, 2011). Banyak penelitian telah menggunakan reagen Folin-Ciocalteau untuk menentukan kandungan fenolik total yang terkandung dalam suatu tanaman, hal tersebut karena kelebihan dari metode ini. Kelebihan dari metode Folin – Ciocalteu adalah fleksibilitas metode sehingga beberapa rincian spesifik dari proses ini dapat dimodifikasi, sehingga dapat memudahkan dalam penggunaannya (Blainski, 2013). D. Radikal Bebas Dalam struktur atom dan molekul, elektron biasanya saling berpasangan, setiap pasangan bergerak dalam orbitnya. Namun dapat terjadi suatu elektron yang mampu bergerak dalam orbital namun dalam keadaan tanpa pasangan. Jenis elektron yang mampu bergerak dalam orbitnya tanpa pasangan biasa masuk dalam istilah “free”. Atom yang memiliki

elektron

tanpa

pasangan

tersebut

lebih

reaktif

untuk


12

menstabilkan dirinya, sehingga akan bersifat radikal dan mudah berinteraksi dengan senyawa-senyawa lain. Senyawa dengan elektron tak berpasangan tersebut disebut radikal bebas (Nonhebel, 1974). Senyawa radikal bebas bereaksi secara langsung dengan senyawa kimia dalam suatu sel pada tubuh manusia yang menyebabkan kerusakan reversibel maupun irreversibel pada sel tersebut. Semakin tinggi kadar radikal bebas dalam tubuh dapat mengakibatkan ketidakseimbangan antara jumlah antioksidan dalam tubuh dengan kadar radikal bebas sehingga terjadi kerusakan pada sebagian sel tubuh manusia, keadaan ini disebut dengan stres oksidatif (Trilaksani, 2003). E. Antioksidan Antioksidan adalah suatu senyawa yang mampu bereaksi secara mudah dengan senyawa-senyawa radikal bebas. Dalam konsentrasi rendah berada bersama substrat yang mudah teroksidasi, antioksidan secara signifikan mampu menunda atau menghambat reaksi oksidasi dari substrat tersebut (Cadenas dan Packer, 2002). Antioksidan merupakan senyawa pemberi elektron atau reduktan. Senyawa tersebut mampu menginaktivasi berkembangnya reaksi oksidasi. Antioksidan menghambat suatu radikal bebas dengan cara bereaksi dengan radikal bebas reaktif membentuk radikal bebas tak reaktif dan relatif stabil (Fessenden and Fessenden, 1982). Penyebab kerusakan oksidatif di dalam tubuh adalah senyawa oksidan yang berbentuk radikal bebas maupun berbentuk senyawa oksigen


13

reaktif lain yang memiliki sifat oksidator. Kerusakan oksidatif terjadi karena kurangnya senyawa antioksidan dalam tubuh sehingga tidak dapat mengimbangi aktivitas dari senyawa oksidan (Tapan, 2005). Antioksidan dibagi menjadi 2 kelompok, yaitu antioksidan enzimatis dan non-enzimatis. Contoh dari antioksidan enzimatis berupa enzim-enzim dalam tubuh manusia seperti enzim superoksida dismutase (SOD), katalase, dan glutation peroksidase. Antioksidan non-enzimatis masih dibagi menjadi antioksidan larut lemak dan antioksidan larut air. Contoh antioksidan larut lemak, yaitu tokoferol, karotenoid, flavonoid, quinon, dan bilirubin, sedangkan antioksidan yang larut air adalah asam askorbat, asam urat, protein pengikat logam, dan protein pengikat heme. Kedua jenis antioksidan yang ada dalam tubuh bekerja sama mengurangi aktivitas senyawa oksidan ataupun radikal bebas dalam tubuh (Winarsi, 2007). Menurut Birangane (2011), berdasarkan mekanisme kerjanya, antioksidan digolongkan menjadi 3 kelompok, yaitu antioksidan primer, sekunder dan tersier. Antioksidan primer atau bisa disebut dengan antioksidan endogenus merupakan jenis antioksidan yang bekerja dengan mencegah pembentukan spesies senyawa radikal baru, yaitu dengan mengubah radikal bebas yang ada menjadi molekul yang tidak berbahaya sebelum mereka dapat bereaksi, atau dengan memutus reaksi berantai dari radikal bebas. Beberapa contoh dari golongan antioksidan primer adalah enzim katalase, enzim peroksidase, dan enzim superoksida dismutase


14

(SOD). Antioksidan sekunder disebut juga antioksidan eksogenus atau non-enzimatis. Antioksidan dalam kelompok ini biasanya didapat dari nutrisi yang masuk kedalam tubuh seperti vitamin c, vitamin e, dan beberapa jenis flavonoid yang mempertahankan tubuh dari senyawa radikal bebas dengan cara menangkap atau menjebak senyawa radikal (free radical scavenger), kemudian mencegah reaktivitas amplifikasinya serta memotong reaksi oksidasi berantai dari radikal bebas. Antioksidan tersier meliputi sistem enzim DNA-repair dan metionin sulfoksida reduktase yang berfungsi dalam perbaikan biomolekuler yang rusak akibat reaktivitas radikal bebas (Birangane, 2011). Pada saat ini hampir semua makanan olahan telah ditambahkan antioksidan sintetik, beberapa jenis dilaporkan aman, meskipun beberapa studi menunjukkan sebaliknya. Dalam beberapa tahun terakhir, beberapa negara (Jepang dan beberapa negara Eropa) telah mengurangi penggunaan antioksidan sintetik dalam setiap produk industri makanannya karena mempunyai potensi karsinogenisitas. Pengggunaan antioksidan sintesik menyebabkan

kekhawatiran

Kekhawatiran

ini

konsumen

mendorong

beberapa

akan

keamanan

produsen

pangan.

menggunakan

antioksidan alami sebagai salah satu zat aditif (Mudawaroch, 2012). Beberapa antioksidan sintetik dapat berdampak pada kesehatan manusia, meskipun tidak beracun pada pemakaian normal dan penggunaan dalam industri makanan, namun beberapa jenis antioksidan sintetis benarbenar telah menunjukkan keterlibatannya dalam beberapa penyakit


15

degeneratif seperti kanker (Ito et al, 1983). Sebaliknya, permintaan produk alam secara umum telah meningkat. Kedua fakta ini memberikan dorongan terhadap identifikasi alternatif sumber antioksidan alami yang memiliki keamanan dalam penggunaan jangka panjang. Oleh karena itu, penelitian tentang sumber tanaman yang memiliki kandungan antioksidan tinggi sangat penting dilakukan demi mencari dan mengidentifikasi alternatif sumber antioksidan baru (Guimaraes, 2007). F. Metode Deoksiribosa Metode deoksiribosa juga dapat disebut sebagai hydroxyl radical scavenging assay merupakan salah satu metode sederhana dalam pengukuran

aktivitas

antioksidan.

Metode

deoksiribosa

memiliki

sensitivitas yang tinggi dan tidak memerlukan alat yang canggih dalam analisisnya. Prinsip dari metode deoksiribosa ini berdasarkan pemecahan oksidatif 2-deoksiribosa oleh senyawa radikal hidroksil dan hasil dari pemecahan tersebut akan bereaksi dengan asam tiobarbiturat dan menghasilkan warna. Penambahan senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan, akan melindungi deoksiribosa dari radikal hidroksil sehingga pembentukan warna menjadi berkurang (Halliwell, 1987). Radikal hidroksil merupakan ROS (Reactive Oxygen Species) yang paling reaktif. Radikal hidroksil dapat dibentuk oleh iradiasi sinar gamma pada air, sinar ultraviolet yang menginduksi fisi homolytic pada hidrogen peroksida,

dan dekomposisi dari hidrogen peroksida atau lipid

hidroperoksida akibat adanya logam transisi. Radikal OH yang terbentuk


16

memiliki waktu yang sangat singkat, sehingga memiliki jalur difusi yang rendah untuk keluar dari organ, yang menunjukkan bahwa radikal OH bereaksi hanya pada tempat dimana radikal OH tersebut terbentuk. Metode deoksiribosa adalah metode yang paling umum dalam menghitung aktivitas OH radikal. Radikal yang dihasilkan melalui reaksi Fenton menggunakan sistem Fe3+-EDTA/asam askorbat/H2O2 pada pH 7,4. Produk malondialdehid terbentuk dari degradasi 2-deoksiribosa, diukur setelah reaksi dengan penambahan asam tiobarbiturat menggunakan spektrofotometri visibel dengan deteksi pada panjang gelombang 532 nm. Namun meskipun sederhana, metode ini memiliki beberapa kelemahan, misalnya, metode ini sangat sensitif terhadap perubahan pH dan tidak kompatibel dengan pelarut organik (Decker, 2010). Secara singkat, proses pembentukan warna merah muda akibat dari degradasi dari deoksiribosa menurut Halliwel (1987) dijelaskan melalui reaksi berikut : Fe2+- EDTA + O2

Fe3+-EDTA + O2-

Fe3+-EDTA + ascorbate

Fe2+- EDTA + oxidized ascorbate

Fe2+- EDTA + H2O2

OH- + OH + Fe3+-EDTA

.OH + deoxyribose

fragment

2TBA + MDA

chromogen

.

heat with TBA + acid

MDA

G. Ekstraksi Ekstraksi merupakan perpindahan massa zat aktif yang semula berada di dalam sel kemudian ditarik oleh cairan penyari. Ekstraksi simplisia bertujuan untuk mendapatkan zat aktif yang diinginkan.


17

Pelaksanaan fraksinasi dapat dilakukan setelah ekstraksi yang bertujuan untuk mengisolasi suatu senyawa kimia yang lebih spesifik (Handa, 2008). Ekstrak merupakan suatu sediaan kental yang dapat diperoleh dengan cara mengekstraksi senyawa aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan. Dalam memilih penyari atau pelarut dalam metode ekstraksi, harus dipertimbangkan banyak faktor dan kriteria. Kriteria dari suatu pelarut yang baik adalah stabil secara fisika maupun kimia, selektif dalam melarutkan senyawa tertentu, tidak mempengaruhi zat yang berkhasiat dalam simplisia yang akan diekstrak, dan diperbolehkan oleh peraturan yang berlaku (Dirjen POM, 1995). Penggunaan

pelarut

dalam

suatu

metode

ekstraksi

harus

disesuaikan dengan kepolaran senyawa-senyawa yang diinginkan. Pelarut polar akan cenderung lebih melarutkan senyawa yang lebih polar dalam simplisia bahan alam dan pelarut non polar akan melarutkan senyawa yang lebih non polar sehingga ekstraksi akan lebih efisien dalam menyari senyawa alam yang diinginkan (Heinrich et al., 2012). Kegagalan dalam melakukan ekstraksi pada biomassa dapat menyebabkan kehilangan akses dalam mendapatkan zat aktif. Selain itu, penggunaan metode ekstraksi yang tidak tepat, seperti pemanasan berlebihan terhadap suatu biomassa dengan suatu pelarut, dapat menyebabkan penguraian bahan alam yang berakibat aktivitas biologisnya menjadi berkurang bahkan dapat hilang (Heinrich et al., 2012).


18

Salah satu teknik ekstraksi yang sering digunakan adalah maserasi. Maserasi dilakukan dengan cara merendam serbuk simplisia tanaman dalam cairan penyari. Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif, zat aktif akan larut dan karena adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dengan yang diluar sel, maka larutan yang terpekat didesak keluar. Maserasi dilakukan berulang kali sehingga keseimbangan larutan terjadi dan ekstrak yang didapatkan maksimal. Selain maserasi beberapa teknik ekstraksi yang lain adalah perkolasi, digesti, dan soxhletasi (Handa et al, 2008). H. Spektrofotometri Spektrofotometri UV/Visibel merupakan salah satu instrumen penting dalam penelitian analisis senyawa. Spektrofotometri UV/Vis memiliki prinsip radiasi pada rentang panjang gelombang 200 – 700 nm yang dilewatkan melalui suatu larutan senyawa. Elektron pada ikatan dalam molekul menjadi tereksitasi yang menyebabkan elektron berada pada keadaan energi yang lebih tinggi dalam proses menyerap sejumlah energi yang melewati larutan tersebut (Watson, 2010). Metode pengukuran menggunakan prinsip spektrofotometri adalah berdasarkan absorbsi cahaya pada panjang gelombang tertentu melalui suatu larutan yang mengandung senyawa uji yang ingin ditentukan konsentrasinya. Proses absorbsi cahaya pada metode ini dapat disebut dengan “absorbsi spektrofotometri”, dan jika panjang gelombang yang


19

digunakan adalah gelombang cahaya tampak, maka disebut sebagai “kolorimetri”, karena senyawa dalam pelarut yang diuji memberikan warna. Prinsip kerja dari metode ini adalah cahaya yang diabsorpsi oleh larutan sebanding dengan konsentrasi kontaminan dalam larutan. Prinsip ini dijabarkan dalam Hukum Beer-Lambert, yang menghubungkan antara konsentrasi dengan absorbansi cahaya yang terukur pada suatu bahan yang mengabsorpsi (Lestari, 2007). Persamaan dari hukum Beer-Lambert yang dapat menjelaskan prinsip dari metode spektrofotometri : T = Transmittansi = Il/Io A = Absorbansi = abc I = Ioe-abc A = -log T Il Io a b c

= Intensitas cahaya masuk = Intensitas cahaya keluar = Tetapan absorpsivitas molar = Panjang jalur = Konsentrasi suatu bahan yang mengabsorpsi (Robinson, 1996).

Interaksi antara senyawa yang memiliki gugus kromofor dengan radiasi elektromagnetik yang dipancarkan menuju senyawa tersebut pada daerah UV-Vis (200-700 nm) menghasilkan transisi elektromagnetik yaitu perpindahan elektron dari orbital dasar yang energinya rendah menuju keadaan tereksitasi yang energinya jauh lebih tinggi. Jumlah radiasi elektromagnetik yang diserap oleh detektor akan sebanding dengan jumlah molekul penyerapnya, sehingga spektra absorbansi dapat digunakan untuk


20

analisis kuantitatif pada beberapa metode penelitan (Fessenden and Fessenden, 1982). Molekul – molekul yang memerlukan energi lebih banyak untuk memindahkan elektron, akan menyerap pada panjang gelombang yang lebih pendek dan begitu sebaliknya. Senyawa yang menyerap cahaya dalam daerah tampak memiliki elektron yang lebih mudah untuk dipindahkan daripada senyawa yang menyerap pada panjang gelombang UV yang lebih pendek (Fesenden and Fessenden, 1982). I.

Landasan Teori

Radikal bebas merupakan suatu atom, molekul maupun senyawa yang kehilangan elektron terluarnya yang dengan cepat dapat bereaksi dengan atom-atom atau senyawa-senyawa di lingkungannya. Molekul yang bereaksi cepat dengan radikal bebas akan menjadi radikal bebas juga dan menghasilkan reaksi berantai. Apabila reaksi berlangsung di tubuh maka dapat merusak jaringan dan mengacaukan fungsi mereka. Industriindustri makanan serta obat-obatan dan suplemen kesehatan seringkali menambahkan antioksidan sintetik didalam produknya untuk memberikan efek penangkal radikal, namun penambahan antioksidan sintetik ini diberi batasan karena dicurigai bersifat karsinogenik bila dipakai berlebihan. Pada penelitian sebelumnya daun jambu mete memiliki kandungan flavonoid dan fenolik yang cukup tinggi. Kandungan flavonoid dan fenolik ini diduga sebagai sumber aktivitas antioksidan daun jambu mete. Daun jambu mete digunakan sebagai sumber pangan dan juga sebagai obat


21

tradisional di Indonesia. Daun jambu mete digunakan untuk mengobati penyakit diabetes dan tekanan darah tinggi. Ekstrak etanol daun jambu mete diketahui dapat menurunkan hipertensi (Nugroho, 2013). Daun jambu mete memiliki senyawa kimia yang berperan penting dalam memberikan khasiat pada tubuh manusia seperti tanin-galat, flavonol, asam akardiol, asam elagat, senyawa fenol, kardol, dan metil kardol (Yuliarti, 2009). Flavonoid dalam bentuk aglikon merupakan salah satu senyawa yang berperan penting dalam aktivitas antioksidan daun jambu mete. Untuk mendapatkan senyawa yang lebih spesifik, yaitu flavonoid dalam

bentuk

aglikon

maka

perlu

dilakukan

proses

fraksinasi

menggunakan etil asetat. Flavonoid dalam bentuk aglikon akan cenderung masuk kedalam fase non polar, yaitu etil asetat dibandingkan masuk kedalam fase polar, yaitu air. Metode Folin-Ciocalteu merupakan salah satu metode dalam penentuan kandungan fenolik total dalam tanaman, metode ini didasarkan pada reduksi asam fosfotungstat dalam larutan alkali menjadi fosfotungstat biru. Absorbansi yang terbentuk akibat fosfotungstat biru sebanding dengan jumlah senyawa fenolik aromatik yang terdapat dalam sampel, sehingga dapat diketahui seberapa besar jumlah kandungan senyawa dengan gugus fenol dalam suatu sampel tanaman yang dinyatakan dengan ekuivalen asam gallat sebagai pengkalibrasi. Metode deoksiribosa merupakan metode pengukuran aktivitas antioksidan suatu senyawa terhadap radikal OH yang sederhana dan


22

efektif dengan prinsip pendegradasian deoksiribosa oleh radikal hidroksi yang terbentuk dari reagen fenton. J.

Hipotesis

1. Fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete memiliki kandungan senyawa fenolik yang diukur dengan metode FolinCiocalteu dan dinyatakan dalam mg ekivalen asam galat. 2. Fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete memiliki aktivitas antioksidan yang diukur dengan metode deoksiribosa.


BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan Rancangan Penelitian Penelitian ini merupakan jenis penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak sederhana. B. Variabel 1. Variabel bebas dalam penelitian ini berupa konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete. 2. Variabel tergantung yang ada dalam penelitian berupa aktivitas penangkapan radikal bebas oleh antioksidan (%IC) fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete. 3. Variabel pengacau dalam penelitian ini, yaitu : a. Variabel pengacau terkendali, yaitu waktu pemanenan daun, cara panen, umur daun, waktu inkubasi, serta suhu dalam inkubasi penelitian. b. Variabel pengacau tak terkendali berupa cuaca atau musim, curah hujan, kelembaban dan kestabilan bahan dalam pelarut. C. Definisi Operasional 1. Daun Jambu mete adalah daun (folium) dari tanaman jambu mete yang telah dihilangkan bagian tangkainya. 2. Ekstrak etanolik daun jambu mete adalah ekstrak hasil proses maserasi serbuk daun jambu mete dengan penyari etanol 70% selama 24 jam.

23


24

3. Fraksi air dan etil asetat adalah hasil fraksinasi ekstrak etanolik jambu mete dengan menggunakan etil asetat dan air (1:1) yang selanjutnya dikeringkan dengan oven selama 24 jam. 4. Larutan kontrol merupakan larutan yang terdiri dari FeCl3, EDTA, H2O2, buffer fosfat pH 7,4 dan asam askorbat tanpa penambahan fraksi etil asetat sampel. 5. Larutan sampel merupakan larutan kontrol yang telah diberi fraksi etil asetat dengan berbagai konsentrasi. 6. Persen inhibition concentration (%IC) adalah persen yang menyatakan kemampuan fraksi etil asetat untuk menangkap suatu radikal bebas. D. Bahan-bahan Penelitian Daun jambu mete Anacardium occidentale L. (dari desa Wisata Karangtengah

Mojolegi,

Imogiri,

Bantul,

Yogyakarta),

akuades

(Laboratorium Kimia Organik Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma), dan bahan-bahan kualitas p.a. E. Merck yaitu : etanol, etil asetat, kalium hidroksida, natrium klorida, natrium karbonat, dinatrium hidrogen fosfat, kalium dihidrogen fosfat, ferri klorida heksahidrat, natrium etilendiamin asam tetreasetat (Na EDTA), larutan hidrogen peroksida 30%, L(+) asam askorbat (vitamin C), asam tiobarbiturat (TBA), dan asam trikloroasetat (TCA). Sementara bahan yang lain : kloroform, reagen Folin Ciocalteu dan 2-deoksi-D-ribosa (Sigma Chem. Co., USA).


25

E. Alat-alat Penelitian Seperangkat spektrofotometer UV-Vis Perkin Elmer Lamda 20, pH-meter Metrohm 632, vacuum rotary evaporator (Janke &Kunkel), timbangan elektrik BP 160 readability 0.10 mg, waterbath (Emerson), mikropipet 200-1000 µL (Acura 825, Socorex), tabung reaksi bertutup (Scott-Germany), hot plate (Heidolph), freezer (Toshiba), oven, maserator, termometer, corong pisah, blender, pengayak, software Minitab 7.1 trial dan alat-alat gelas yang lazim digunakan untuk penelitian di laboratorium analisis (Pyrex-Germany dan Iwaki). F. Tata Cara Penelitian 1. Determinasi tanaman Determinasi tanaman jambu mete dilakukan di Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dengan acuan Van Steenis (1981). 2. Pembuatan dan penyiapan sampel daun jambu mete Tanaman jambu mete diperoleh dari Desa Wisata Karangtengah Mojolegi, Imogiri, Bantul, Jogjakarta. Pengumpulan pada musim kemarau bulan Juni 2014. Pemanenan dilakukan pagi hari pukul 07.00 dengan bahan yang dipakai adalah daun muda, yaitu pucuk daun dari ruas ketiga sampai ruas keenam pada tangkai daun. Bahan baku yang telah dikumpulkan, dipisahkan dari bahan-bahan pengganggu seperti debu, tanah, kerikil, rumput, bagian tanaman yang tidak dibutuhkan (ranting dan bunga), bagian dari tanaman lain (tangkai, daun, bunga dan biji inang),


26

bahan yang tidak dibutuhkan lainnya dan lain-lain. Daun jambu mete dicuci dengan cara dialiri dengan air sambil dibersihkan kotoran yang melekat pada daun. Pencucian dilakukan sebanyak 3 kali. Daun jambu mete dirajang dengan ukuran seragam dengan panjang daun kurang lebih 1 cm. Daun jambu mete yang masih basah selanjutnya dikeringkan pada udara terbuka dan harus terlindung dari sinar matahari. Daun jambu mete dihamparkan di atas kertas atau alas yang telah disiapkan dan diatur agar tidak terlalu menumpuk. Posisi daun harus sering dibalik sehingga pengeringan dapat merata. Pengeringan berakhir ketika daun yang sedang dikeringkan mudah dipatahkan. Daun jambu mete yang telah kering (ditandai dengan mudah hancurnya daun ketika diremas) dipisahkan dari bahan-bahan pengganggu yang ikut serta ketika proses pengeringan terjadi seperti tanah, kerikil, bahan yang rusak dan lain-lain (tanpa pencucian). Daun jambu mete dibuat menjadi serbuk dengan bantuan alat penyerbuk, yaitu blender, kemudian dilakukan pengayakan dengan ayakan nomor mesh 40. Serbuk daun jambu mete kemudian disimpan dengan membungkus serbuk menggunakan wadah kedap udara. Penyimpanan setelah dibungkus dilakukan di suhu ruangan. 3. Ekstraksi Daun jambu mete yang telah menjadi serbuk diambil dari tempat penyimpanan dan ditimbang sebanyak 100,0 g lalu dimasukkan ke dalam erlenmeyer 500 mL, ditambah dengan pelarut yang digunakan yaitu berupa etanol sampai terendam sempurna, dan dicampur homogen.


27

Campuran yang telah homogen dimaserasi dengan bantuan orbital shaker pada suhu ruangan selama satu hari. Setelah satu hari campuran diambil filtratnya melalui penyaringan dengan corong Buchner dengan bantuan pompa vakum. Maserasi tidak hanya dilakukan satu kali, tetapi dilakukan berulang. Ampas hasil penyaringan selanjutnya dimaserasi dengan pelarut yang sama yaitu etanol, ampas ditambah etanol sampai terendam sempurna dan dimaserasi hingga satu hari kemudian dilanjutkan dengan penyaringan menggunakan kertas saring dan bantuan corong Buchner dan pompa vaccum. Proses maserasi dan penyaringan dilakukan berulang hingga filtrat yang diperoleh hampir tidak berwarna. Seluruh filtrat hasil maserasi digabungkan menjadi satu. Pelarut yang masih ada pada filtrat diuapkan hingga volumenya berkurang menjadi sepersepuluh dari volume awal. Diperoleh ekstrak kental daun jambu mete. 4. Fraksinasi ekstrak etanol daun jambu mete Ekstrak

kental

yang

didapatkan

kemudian

difraksinasi

menggunakan ekstraksi cair – cair. Ekstrak kental dilarutkan dalam akuades, kemudian difraksinasi menggunakan 100 mL etil asetat dengan perbandingan larutan air : etil asetat 1:1 v/v. Akan terbentuk dua lapisan, yaitu lapisan air dan lapisan etil asetat. Kedua lapisan dimasukan ke dalam erlenmeyer bertutup lalu dengan bantuan orbital shaker digojog hingga 24 jam. Lapisan etil asetat kemudian diambil dan ditampung dalam wadah. Lapisan air diekstraksi kembali menggunakan 100 mL etil asetat. Fraksinasi ini diulang hingga 3 kali. Fraksi etil asetat kemudian dipekatkan


28

menggunakan vaccum rottary evaporator dimasukkan dalam cawan porselin yang sebelumnya telah ditimbang hingga bobot tetap. Cawan berisi fraksi kental dimasukkan dalam oven hingga 24 jam. Fraksi kering yang didapat digunakan untuk analisis lebih lanjut. 5. Pembuatan reagen Fenton, Deoksiribosa, TCA, TBA, Pembanding, dan Sampel a)

Pembuatan reagen Fenton 1) Larutan FeCl3 1 mM Timbang seksama lebih kurang 13,52 mg FeCl3.6H2O,

dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml dan dilarutkan dengan akuades hingga tanda. Sebanyak 2,0 ml larutan tersebut diambil dan dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml. Selanjutnya diencerkan dengan akuades hingga tanda. 2) Larutan EDTA 1mM EDTA ditimbang sebanyak 18,61 mg, dimasukkan ke dalam gelas beaker dan dilarutkan menggunakan akuades.

Larutan

dimasukkan ke dalam labu ukur 10 mL, kemudian tambahkan aquades hingga batas tanda. Ambil 2,0 mL larutan, masukkan ke dalam labu ukur 10 mL, tambahkan akuades hingga tanda. 3) Larutan vitamin C 1 mM Vitamin C sebanyak lebih kurang 17,61 mg ditimbang secara seksama, dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml dan dilarutkan hingga


29

tanda. Larutan vitamin C tersebut diambil kembali sebanyak 1,0 ml lalu dimasukan kedalam labu ukur 10 ml dan kemudian ditambahkan akuades hingga mencapai tanda. 4) Larutan H2O2 20 mM Sebanyak 0,091 ml larutan H2O2 30% diambil dan dimasukkan kedalam labu ukur 10 ml lalu dilanjutkan dengan penambahan akuades hingga tanda. Dari larutan yang telah dibuat, diambil sebanyak 2,5 ml dan dimasukkan kedalam labu ukur 10 ml, kemudian encerkan hingga tanda dengan menggunakan akuades. b) Pembuatan larutan deoksiribosa 2,5 mM Sebanyak lebih kurang 20,95 mg deoksiribosa ditimbang dengan seksama, lalu dilarutkan dengan akuades dalam labu ukur 10 ml hingga tanda. Dari larutan tersebut, diambil 4,0 ml dan diencerkan dalam labu ukur 25 ml dengan menggunakan akuades hingga batas tanda. c)

Pembuatan larutan TCA 5% Sebanyak 2,5 g TCA ditimbang dengan seksama dan

dimasukkan kedalam beker glass 50 ml lalu ditambah dengan akuades secukupnya. Larutan dipindahkan ke dalam labu ukur 50 ml dan ditambahkan akuades hingga tanda.


30

d) Pembuatan larutan TBA 1% Sebanyak 0,25 g TBA ditimbang dengan seksama dan dimasukkan kedalam beker glass 100 ml lalu ditambahkan akuades secukupnya, dilanjutkan dengan pemanasan diatas hot plate hingga seluruh TBA larut. Setelah itu, larutan TBA dipindahkan ke dalam labu ukur 25 ml dan tambahkan akuades hingga tanda. e)

Pembuatan larutan bufer fosfat Sebanyak 1,4196 g Na2HPO4 ditimbang dengan seksama lalu

dimasukkan ke dalam labu ukur 500 ml dan dilarutkan dengan akuades hingga tanda. Kemudian sebanyak 0,6805 g KH2PO4 ditimbang secara seksama, lalu dilarutkan dengan akuades dalam labu ukur 250 ml hingga tanda. Selanjutnya larutan Na2HPO4 dimasukkan secukupnya kedalam beker glass dan ditambahkan larutan KH2PO4 yang telah dibuat sebelumnya, penambahan KH2PO4 dilakukan dengan cara penetesan hingga tercapai pH 7,4 dengan bantuan pH meter. f)

Pembuatan larutan baku asam galat Sebanyak 10,0 mg asam galat ditimbang dengan seksama, lalu

ditambahkan 10,0 mL akuades : metanol p.a (1:1) sehingga diperoleh konsentrasi larutan asam galat sebesar 1000,0 μg/mL. Diambil sebanyak 0,4; 0,5; 0,6; 0,7 dan 0,8 mL larutan tersebut, kemudian ditambahkan akuades : metanol p.a (1:1) sampai 10,0 mL, sehingga


31

diperoleh konsentrasi larutan baku asam galat 40; 50; 60; 70; dan 80 μg/mL. g) Pembuatan larutan stok, intermediet kuersetin, dan larutan pembanding Sebanyak 10,0 mg kuersetin dilarutkan dengan metanol p.a dalam labu ukur 10, 0 mL sampai tanda sebagai larutan stok. Larutan intermediet dibuat dengan mengambil 1,0 mL larutan stok kuersetin dan ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL dalam labu ukur 10 mL, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi sebesar 100,0 μg/mL. Pembuatan larutan pembanding dilakukan dengan mengambil sebanyak 0,5; 0,75; 1,0; 1,25; 1,5 mL larutan kuersetin konsentrasi 100,0 μg/mL, kemudian ditambahkan metanol p.a sampai 10,0 mL, sehingga diperoleh konsentrasi larutan standar kuersetin sebesar 5,0; 7,5; 10,0; 12,5; dan 15,0 μg/mL. h) Preparasi larutan uji fraksi etil asetat 1. Larutan uji untuk penentuan kandungan fenolik total Sebanyak 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang, lalu ditambahkan 10,0 mL metanol p.a dalam labu ukur 10 mL sehingga diperoleh konsentrasi sebesar 1000,0 μg/mL. Kemudian larutan tersebut diambil 1,0 mL dan dimasukkan kedalam labu ukur 10 mL ditambahkan metanol p.a hingga batas sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 100,0 μg/mL.


32

2. Larutan uji untuk aktivitas antioksidan Sejumlah 10,0 mg fraksi etil asetat ditimbang dan dimasukkan kedalam labu ukur 10 mL lalu ditambahkan metanol p.a sampai batas sebagai larutan stok. Kemudian dibuat larutan intermediet dengan mengambil 5,0 mL stok larutan uji kemudian dimasukkan kedalam labu ukur 50 mL lalu ditambahkan metanol p.a sampai batas, sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi sebesar 100,0 μg/mL. Diambil sebanyak 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0 mL larutan tersebut, kemudian dimasukkan kedalam labu ukur 10 mL lalu ditambahkan metanol p.a sampai batas tanda, sehingga diperoleh konsentrasi larutan uji sebesar 10,0; 20,0; 30,0; 40,0; 50,0 μg/mL. 6. Uji pendahuluan a. Uji keberadaan senyawa fenolik

Larutan uji dengan konsentrasi 500,0 μg/mL dan larutan pembanding asam galat 150,0 μg/mL diambil sebanyak 0,5 mL kemudian ditambahkan 2,5 mL pereaksi fenol Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v) ke dalam tabung reaksi lalu didiamkan selama 10 menit. Larutan natrium karbonat 1 M ditambahkan sebanyak 2,0 mL, kemudian amati warna larutan tersebut. Bandingkan dengan warna larutan yang berisi air : metanol (1:1) + pereaksi, fraksi etil asetat dan asam galat tanpa diberi pereaksi.


33

b. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan Dalam 2 tabung reaksi, dimasukkan larutan uji fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete sebanyak 1000 µl dengan konsentrasi sebesar 50,0 μg/mL. Sebagai kontrol negatif, dimasukkan metanol pa kedalam tabung sebesar 1000 µl. Sebagai kontrol positif selanjutnya dimasukkan 1000 µl larutan standar kuersetin dengan konsentrasi sebesar 15,0 μg/mL kedalam tabung. Selanjutnya masingmasing tabung dipanaskan dalam waterbath dengan suhu tidak lebih dari 60°C hingga seluruh metanol menguap. Kemudian pada masingmasing tabung ditambahkan 3400 µl buffer fosfat pH 7,4, 600 µl larutan deoksiribosa 2,5 mM, 500 µl FeCl3 1 mM, 500 µl EDTA 1 mM, 500 µl H2O2 20 mM, dan 500 µl asam askorbat 1 mM sehingga volume akhir campuran adalah 6 ml. Selanjutnya campuran diinkubasikan pada temperatur 37°C selama 60 menit. Setelah inkubasi lalu campuran ditambahkan 1 ml TCA 5% dan 1 ml TBA 1%. Campuran yang ada kemudian dipanaskan diatas waterbath selama 30 menit dengan temperatur 80°C. Setelah dipanaskan, dilakukkan pendinginan selama 5 menit di bawah air mengalir. Ketiga kontrol dibandingkan satu sama lainnya. 7. Optimasi metode penetapan kandungan fenolik total a. Penentuan operating time (OT) Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 40; 60; dan 80 μg/mL ditambahkan dengan 2,0 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah


34

diencerkan dengan akuades (1:10 v/v), kemudian larutan didiamkan selama 5 menit. Setelah 5 menit larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Setelah itu dibaca absorbansinya

dengan

spektrofotometer

visibel

pada

panjang

gelombang 750 nm selama 60 menit. Dilakukan demikian juga untuk larutan uji 100 μg/mL dengan waktu pengamatan selama 60 menit. b. Penentuan panjang gelombang maksimum (λ maks) Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 40; 50; dan 60 μg/mL ditambahkan dengan 2,0 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan air (1:10 v/v) ), kemudian larutan didiamkan selama 5 menit. Larutan selanjutnya ditambahkan dengan 4,0 mL natrium karbonat 1 M. Diamkan selama operating time, dibaca panjang

gelombang

pada

absorbansi

maksimum

dengan

spektrofotometer visibel pada panjang gelombang 600-800 nm. 8. Penetapan kandungan fenolik total a. Pembuatan kurva baku asam galat Sebanyak 0,5 mL larutan asam galat 40; 50; 60; 70; dan 80 μg/mL ditambah dengan 2,0 mL reagen Folin-Ciocalteu yang telah diencerkan dengan akuades (1:10 v/v) ), kemudian larutan didiamkan selama 5 menit. Larutan selanjutnya ditambah dengan 4,0 mL natrium karbonat

1

M.

Setelah

menunggu

selama

operating

time,

absorbansinya dibaca pada panjang gelombang maksimum yang telah


35

didapat terhadap blanko yang terdiri atas akuades : metanol p.a (1:1), reagen Folin-Ciocalteu dan larutan natrium karbonat 1M. Dilakukkan replikasi pengerjaan sebanyak tiga kali. b. Estimasi kandungan fenolik total larutan uji Diambil 0,5 mL larutan uji 100 μg/mL, lalu dilanjutkan sebagaimana perlakuan pada pembuatan kurva baku asam galat. Kandungan fenolik total dinyatakan sebagai mg ekuivalen asam galat per g fraksi etil asetat. Dilakukan tiga kali replikasi. 9. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan a. Penentuan operating time (OT) Sebanyak 300 µL larutan deoksiribosa 2,5 mM dimasukkan kedalam tabung reaksi kemudian ditambahkan 300 µl FeCl3 1 mM, 300 µl EDTA 1 mM, 300 µl H2O2 20 mM, 4200 µl buffer fosfat pH 7,4 dan 300 µl asam askorbat 1 mM. Larutan yang telah tercampur selanjutnya diinkubasikan selama 60 menit pada temperatur 37°C, setelah inkubasi dilakukan penambahan 1 ml TCA 5% dan 1 ml TBA 1%. Campuran yang ada kemudian dipanaskan diatas waterbath selama 30 menit dengan temperatur 80°C. Tabung reaksi diangkat setelah 30 menit dan didinginkan dengan bantuan air mengalir selama 5 menit. Dilakukan pembacaan absorbansi dengan panjang gelombang maksimum teoritis sebesar 532 nm selama 1 jam.


36

b. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum (λmaks) Masukkan berturut-turut 200, 300, dan 400 µl larutan deoksiribosa 2,5 mM pada tabung reaksi tertutup, pada setiap tabung kemudian diberikan 300 µl FeCl3 1 mM, 300 µl EDTA 1 mM, 300 µl H2O2 20 mM, 4200 µl buffer fosfat pH 7,4 dan 300 µl asam askorbat 1 mM (penambahan buffer fosfat disesuaikan dengan volume deoksiribosa sehingga volume akhir campuran adalah 6 ml). Selanjutnya campuran diinkubasikan selama 60 menit pada temperatur 37°C, setelah inkubasi dilakukan penambahan 1 ml TCA 5% dan 1 ml TBA 1%. Campuran yang ada kemudian dipanaskan diatas waterbath selama 30 menit dengan temperatur 80°C. Larutan didinginkan dengan bantuan air mengalir selama 5 menit. Dilakukkan scanning absorbansi pada panjang gelombang 400-600 nm. 10. Uji aktivitas antioksidan Dalam 11 tabung reaksi, dimasukkan larutan uji fraksi etil asetat ekstrak etanol jambu mete sebanyak 1000 µl dengan konsentrasi sebesar 10,0; 20,0; 30,0; 40,0; 50,0 μg/mL. Sebagai kontrol negatif, dimasukkan metanol pa kedalam tabung sebesar 1000 µl. Sebagai kontrol positif selanjutnya dimasukkan 1000 µl larutan standar kuersetin dengan konsentrasi sebesar 5,0; 7,5; 10,0; 12,5; dan 15,0 μg/mL kedalam 5 tabung lainnya. Selanjutnya masing-masing tabung dipanaskan dalam waterbath dengan suhu tidak lebih dari 60°C hingga


37

seluruh metanol menguap. Kemudian pada masing-masing tabung ditambahkan 3400 µl buffer fosfat pH 7,4, 600 µl larutan deoksiribosa 2,5 mM, 500 µl FeCl3 1 mM, 500 µl EDTA 1 mM, 500 µl H2O2 20 mM, dan 500 µl asam askorbat 1 mM sehingga volume akhir campuran adalah 6 ml. Selanjutnya campuran diinkubasikan pada temperatur 37°C selama 60 menit. Setelah inkubasi lalu campuran ditambahkan 1 ml TCA 5% dan 1 ml TBA 1%. Campuran yang ada kemudian dipanaskan diatas waterbath selama 30 menit dengan temperatur 80°C. Setelah dipanaskan, dilakukkan pendinginan dan dibaca absorbansinya pada daerah operating time dan panjang gelombang maksimum yang didapatkan dari hasil pengukuran sebelumnya. Hasil absorbansi yang didapat dapat digunakan untuk menghitung % inhibiton concentration (%IC) dan dibuat persamaan regresi linier yang merupakan hubungan antara konsentrasi fraksi etil asetat vs % IC. G. Analisis Hasil 1.

Aktivitas antioksidan Aktivitas penangkapan radikal hidroksil dari larutan uji daun

jambu mete dilaporkan sebagai % inhibisi degradasi deoksiribosa yang dihitung sebagai : % IC =

A kontrol

𝐴 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 −𝐴 𝑢𝑗𝑖 𝐴 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙

x 100 %

= Absorbansi campuran reaksi kontrol


A uji

38

= Absorbansi campuran larutan uji

Nilai IC ditetapkan menggunakan persamaan regresi linier, dengan sumbu x adalah konsentrasi fraksi etil asetat daun jambu mete dan sumbu y adalah % inhibition concentration. 2.

Fenolik total Penetapan kandungan fenolik total ditentukan dengan nilai yang

didapat dari hasil pengukuran absorbansi. Absorban yang didapat selanjutnya dimasukkan kedalam rumus persamaan regresi linier yang didapat dari kurva baku asam galat. Selanjutnya, setelah didapat konsentrasi hasil perhitungan dari absorbansi sampel, hasil yang didapat dimasukkan kedalam rumus yaitu : 𝑣

Kandungan fenolik total = x . 𝑚 x

= konsentrasi hasil perhitungan dari absorbansi yang didapat

v

= volume senyawa uji

m

= massa senyawa uji


BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil Determinasi Tanaman Determinasi tanaman dilakukan untuk memastikan kebenaran dari suatu tanaman yang akan digunakan dalam penelitian. Pemastian identitas dalam penelitian perlu dilakukan untuk menghindari terjadinya kesalahan pada saat pengambilan sampel pada analisis fitokimia. Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Kebun Obat Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma dengan acuan dari van Steenis (1981). Berdasarkan hasil determinasi tanaman yang dilakukan, dapat dipastikan bahwa tanaman yang digunakan adalah Anacardium occidentale L. atau secara umum dikenal dengan jambu mete. B. Persiapan sampel Daun jambu mete diambil dari pohon jambu mete yang terletak di perkebunan Desa Wisata Karangtengah Mojolegi, Imogiri, Bantul, Yogyakarta. Pengambilan bahan dilakukan pada bulan Oktober saat musim kemarau, diambil pada pagi hari sekitar pukul 06.00–07.00. Pengambilan dilakukan di kebun jambu mete yang terletak di perkebunan desa. Bahan berupa daun jambu mete hanya berasal dari satu tempat, hal tersebut bertujuan agar tidak terjadi variasi kandungan senyawa pada tanaman yang dapat disebabkan oleh perbedaan kondisi tanah, lingkungan,

39


40

dan unsur hara dari tempat tanaman berasal (Rahardjo, 2006). Sampel daun jambu mete yang diambil berupa daun yang tidak terlalu muda hingga daun yang tidak terlalu tua, yaitu daun yang berada pada ruas ketiga hingga keenam cabang ranting pohon. Pengambilan daun pada ruas tertentu dikarenakan daun yang digunakan dan diolah oleh masyarakat sebagai sayuran adalah daun yang tidak terlalu tua. Selain itu penggunaan daun yang terlalu muda tidak akan menghasilkan aktivitas antioksidan yang optimal karena metabolit sekunder yang dihasilkan belum terlalu banyak kuantitasnya dan belum sempurna pembentukannya. Umumnya kandungan metabolit sekunder pada tanaman belum terbentuk maksimal pada daun yang sangat muda dan akan berkurang pada daun yang sudah tua. Pengambilan daun dilakukan sebelum tanaman berbunga atau berbuah, hal tersebut dikarenakan kemungkinan besar bila tanaman telah berbunga banyak metabolit sekunder yang berpindah menuju bunga dan buah sehingga kandungan metabolit sekunder pada daun akan berkurang dibandingkan dengan pohon yang belum berbunga atau berbuah. Pengumpulan daun pada pagi hari dan pada musim kemarau agar tanaman yang diambil belum terpapar sinar matahari. Hal tersebut dikarenakan metabolit sekunder yang ada pada daun akan jauh berkurang bila dilakukan pemetikan pada siang hari dikarenakan dapat terjadi penguapan atau berperan dalam proses fotosintesis, sehingga bila pemanenan dilakukan siang hari maka banyak metabolit sekunder yang telah hilang. Pemanenan pada musim kemarau dilakukan untuk


41

menghindari kelembaban yang tinggi. Kelembaban yang kecil dapat meminimalisir jamur yang kemungkinan tumbuh pada daun dan mempermudah proses pengeringan (Agoes, 2007). Pasca pemanenan, sampel daun jambu mete yang telah diperoleh dikumpulkan dan dipisahkan dari bahan-bahan pengganggu yang terikut pada saat pengumpulan seperti bagian tanaman yang tidak diinginkan ataupun kerikil. Kemudian daun jambu mete dicuci dengan air mengalir untuk membersihkan kotoran yang melekat pada daun maupun debu-debu yang masih menempel pada daun. Selanjutnya daun dirajang dengan ukuran seragam kurang lebih 1 cm untuk mempercepat pengeringan. Tahapan selanjutnya adalah pengeringan daun yang telah dirajang. Pengeringan merupakan kegiatan yang paling penting dalam pengolahan tanaman obat, kualitas produk yang digunakan sangat dipengaruhi oleh proses pengeringan yang dilakukan (Mahapatra, 2009). Daun yang telah dirajang kemudian dikering-anginkan pada udara terbuka dan terlindungi dari paparan cahaya matahari langsung agar senyawa yang terkandung dalam daun jambu mete tidak mengalami kerusakan. Pengeringan dilakukan pada jam 7 pagi hingga jam 10 pagi agar tidak mendapatkan panas yang terlalu tinggi yang dapat merusak senyawa kimia yang terkandung di dalam daun jambu mete. Posisi daun harus sering dibalik agar pengeringan merata pada seluruh sisi daun. Pengeringan selesai ketika daun sudah rapuh dan mudah dipatahkan yang berarti daun sudah kering. Pengeringan membutuhkan waktu selama 6 hari. Daun jambu mete


42

yang sudah kering selanjutnya disortasi kering untuk memisahkan bahanbahan pengganggu yang mungkin ikut masuk ketika proses pengeringan. Kemudian daun kering diserbuk menggunakan mesin penyerbuk, namun karena keterbatasan alat, digunakan blender untuk menyerbukkan daun yang telah kering. Proses penyerbukan dilakukan untuk memperbesar luas permukaan daun yang akan kontak dengan cairan penyari sehingga senyawa kimia yang terkandung dalam daun akan tersari secara sempurna dan akan masuk kedalam penyari secara optimal. Daun kering yang telah menjadi serbuk selanjutnya diayak dengan ayakan mesh No. 40 agar serbuk yang selanjutnya akan disari dengan penyari memiliki ukuran partikel seragam. Serbuk yang telah diayak siap digunakan untuk tahap selanjutnya yaitu tahap ekstraksi. C. Hasil Ekstraksi Daun jambu mete yang telah menjadi serbuk kering selanjutnya diekstraksi. Tujuan ekstraksi sampel adalah untuk menyari senyawasenyawa kimia yang terkandung dalam daun jambu mete. Senyawa kimia yang berperan sebagai antioksidan dalam daun jambu mete diekstraksi dengan etanol. Penggunaan daun yang telah kering dalam ekstraksi bertujuan agar kandungan fenolik yang memiliki aktivitas antioksidan seperti flavonoid tetap terjaga dan tidak terdegradasi oleh enzim. Bila menggunakan daun yang segar maka kandungan fenolik yang memiliki aktivitas antioksidan akan terdegradasi oleh enzim (Gupta, 2010). Daun jambu mete yang telah menjadi serbuk akan memberikan luas permukaan


43

yang lebih besar dan kontak dengan pelarut menjadi meningkat, efektifitas dalam ekstraksi pun menjadi tinggi (Gupta, 2010). Metode ekstraksi yang digunakan untuk mengekstraksi daun jambu mete adalah metode maserasi (Heinrich et al., 2012). Metode maserasi merupakan metode yang sederhana dengan perendaman bahan tanaman serta pelarut yang sesuai dengan pengadukan pada suhu kamar. Menurut Williamson (1996), penggunaan metode maserasi dalam ekstraksi bahan alam dikarenakan metode ini tidak memerlukan pemanasan dalam proses ekstraksi sehingga tidak terjadi dekomposisi senyawa kimia yang terkandung di dalamnya. Selain itu, metode maserasi memiliki keuntungan dalam mengekstraksi senyawa dari sampel, karena dengan metode maserasi dapat mengakibatkan membran sel dan dinding sel dari sampel yang terendam oleh pelarut pecah karena perbedaan tekanan dari dalam dan luar sel sehingga senyawa kimia yang terkandung dalam sel akan dapat keluar sel dan larut dalam pelarut dan proses ekstraksi menjadi maksimal (Sambamurthy, 2005). Pelarut yang digunakan dalam ekstraksi daun jambu mete adalah etanol 70%. Pemilihan penyari atau pelarut dalam tahap ekstraksi sangat penting. Dalam pemilihan suatu penyari harus dipertimbangkan beberapa persyaratan khusus, salah satunya yang paling penting adalah kemampuan dari pelarut atau penyari dalam menyari senyawa yang diinginkan. Pemilihan penyari atau pelarut yang tidak sesuai dapat menyebabkan senyawa kimia yang terkandung dalam bahan alam tidak tersari secara


44

maksimal (Dai, 2010). Digunakan pelarut etanol 70% dikarenakan senyawa fenolik yang diduga memiliki aktivitas antioksidan dapat tersari dan masuk kedalam penyari secara maksimal (Dai, 2010). Pemilihan etanol dibandingkan metanol sebagai penyari dikarenakan metanol mempunyai ketoksikan yang lebih tinggi dibandingkan dengan etanol, baik untuk lingkungan maupun untuk tubuh sehingga bila menggunakan metanol dalam ekstraksi akan dirasakan kurang aman apabila digunakan untuk tujuan konsumsi. Maserasi dilakukan dengan bantuan orbital shaker yang akan memberikan energi mekanik pada saat maserasi, yaitu penggojogan, sehingga dapat meningkatkan kontak serbuk dengan penyari. Peningkatan kontak antara serbuk dengan penyari akan mengakibatkan seluruh serbuk menjadi

terbasahi

sehingga

hasil

maserasi

menjadi

maksimal.

Penggojogan juga diperlukan agar tidak terjadi pengendapan yang mengakibatkan kontak antara pelarut dengan serbuk menjadi berkurang. Proses maserasi dilakukan selama selama satu hari, setelah satu hari cairan ekstrak diambil dengan cara penyaringan dengan bantuan corong Buchner, kertas saring, dan pompa vakum. penggunaan corong Buchner dan pompa vakum dalam penyaringan adalah untuk mempercepat penyaringan dan filtrat yang didapat menjadi maksimal. Kemudian sisa serbuk hasil maserasi dimaserasi kembali dengan pelarut yang sama. Maserasi dilakukan berulang kali dengan serbuk yang sama hingga hasil ekstrak yang didapatkan telah tidak berwarna lagi yang menandakan kandungan


45

senyawa metabolit sekunder yang terkandung dalam serbuk kering daun jambu mete telah tersari dengan sempurna. Hasil filtrat dari tiap pengulangan maserasi dikumpulkan menjadi satu. Tujuan dari maserasi berulang adalah untuk menarik sebanyak mungkin kandungan kimia yang terkandung dalm serbuk kering daun jambu mete sehingga hasil ekstraksi akan menjadi maksimal. Setelah proses maserasi berulang selesai, hasil yang didapatkan adalah ekstrak cair berwarna hijau. Selanjutnya ekstrak diuapkan dengan menggunakan bantuan alat vaccum rotary evaporator. Tujuan penguapan ini dalah untuk memisahkan antara senyawa yang terekstrak dengan pelarutnya sehingga didapatkan ekstrak kental ataupun ekstrak kering. Vaccum rotary evaporator dapat mempercepat proses penguapan pelarut dari ekstrak. Hal ini dikarenakan adanya pompa vakum yang menyebabkan tekanan dalam labu alas bulat pada alat menjadi turun dan titik didih dari pelarut ikut turun sehingga dengan pemanasan yang sedikit saja sudah dapat menguapkan pelarut dari ekstrak. Penguapan pelarut di bawah titik didih dapat mengurangi resiko rusaknya senyawa akibat suhu yang tinggi. Setelah melalui proses penguapan didapat ekstrak kental yang selanjutnya dikeringkan kembali dengan bantuan oven pada suhu 50°C selama satu minggu. Ekstrak kental yang telah dimasukkan kedalam oven selama seminggu berubah menjadi ekstrak kering. Ekstrak kering ini telah bebas dari seluruh pelarut yang ada. Ekstrak kering yang didapat berbentuk padatan hijau yang keras. Ekstrak kering yang didapat memiliki


46

bobot 18,747 g dari 100 g bahan serbuk kering yang digunakkan. Dari hasil perhitungan rendemen yang diperoleh adalah 18,74 %. D. Hasil Fraksinasi Ekstrak Setelah didapat ekstrak etanolik daun jambu mete selanjutnya dilakukan fraksinasi. Tujuan dari fraksinasi adalah untuk memisahkan senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak menjadi senyawa yang jauh lebih spesifik. Pemisahan senyawa menjadi lebih spesifik akan memberikan informasi tentang karakteristik senyawa kimia yang terkandung dalam ekstrak. Namun dalam beberapa kasus fraksinasi dilakukan untuk mendapatkan senyawa tujuan yang telah diketahui informasinya. Fraksinasi dilakukan dengan metode ekstraksi cair-cair. Prinsip pemisahan dengan metode ekstraksi cair-cair adalah pemisahan senyawa berdasarkan kepolaran tersebut dalam dua pelarut yang berbeda kepolarannya yang tidak saling campur. Sebelum masuk kedalam tahap fraksinasi, ekstrak kering daun jambu mete terlebih dahulu dilarutkan dengan air hangat. Namun ekstrak kering sangat susah larut dalam air hangat. Mortir dan stamper digunakan untuk menggerus ekstrak sambil sesekali ditambahkan air hangat sebanyak 100 ml. Terdapat beberapa ekstrak yang masih tidak larut dalam air hangat walaupun telah digerus. Setelah

dilarutkan

air

hangat

selanjutnya

diekstraksi

cair-cair

menggunakan etil asetat. Ekstraksi dilakukan dengan cara kedua pelarut dicampurkan dalam corong pisah, digojog dan dipisahkan. Namun dikarenakan tidak semua ekstrak larut dalam air hangat maka sebelum


47

dipisahkan, kedua larutan yang tidak saling campur yaitu ekstrak etanol daun jambu mete yang dilarutkan dalam air dan etil asetat dimasukan kedalam Erlenmeyer lalu digojog dengan bantuan shaker selama 24 jam, hal ini dilakukan agar kontak antar cairan dan partikel yang belum larut menjadi lebih maksimal sehingga perpindahan senyawa yang memiliki kepolaran berbeda akan menjadi maksimal. Setelah 24 jam selanjutnya dilakukan penyaringan terhadap air dan etil asetat yang ada dalam erlenmeyer dengan bantuan kertas saring, corong Buchner, dan pompa vakum. Penyaringan dilakukan untuk menyaring beberapa partikel ekstrak yang tidak larut dalam air. Selanjutnya filtrat dimasukkan ke dalam corong pisah. Etil asetat akan berada di atas permukaan air dikarenakan berat jenis yang lebih kecil dibandingkan berat jenis air. Senyawa fenolik yang diduga memiliki kemampuan antioksidan dalam daun jambu mete seperti flavonoid dapat berbentuk glikosida atau berikatan dengan gugus gula maupun dapat berbentuk aglikon. Dalam bentuk glikosida, flavonoid akan lebih bersifat polar sedangkan dalam bentuk aglikon maka flavonoid akan lebih bersifat non polar. Senyawa yang diduga menimbulkan aktivitas antioksidan dalam daun jambu mete adalah senyawa fenolik golongan flavonoid dalam bentuk aglikon (Fidrianny, 2012). Flavonoid dalam bentuk aglikon akan masuk dan terlarut dalam fraksi etil asetat sedangkan kemungkinan senyawa flavonoid dalam bentuk glikosida akan tertahan dalam fraksi air.


48

Fraksi etil asetat yang ada dalam corong pisah dikeluarkan dan dipisahkan dari air. Fraksi etil setat yang dihasilkan berupa fraksi cair berwarna hijau pekat. Selanjutnya fraksi yang didapat diuapkan pelarutnya dengan vacuum rotary evaporator. Setelah proses penguapan, fraksi kental yang

didapat

selanjutnya

dikeringkan pada

suhu

60 oC

dengan

menggunakan waterbath. Setelah didapat fraksi kering, selanjutnya fraksi kering disimpan dan ditutup dengan alumunium foil agar tidak terpapar sinar UV yang dapat mendegradasi senyawa yang terkandung dalam fraksi etil asetat tersebut. Fraksi kering yang didapat selanjutnya ditimbang dengan bobot fraksi, yaitu 1,66 g. Setelah dihitung rendemen dari proses fraksinasi, didapat hasil rendemen sebesar 1,66 %. E. Uji Pendahuluan Uji pendahuluan bertujuan untuk mengetahui secara kualitatif apakah didalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete memiliki kandungan senyawa fenolik dan aktivitas antioksidan. Uji pendahuluan dilakukan untuk orientasi kandungan senyawa dalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete. 1. Uji pendahuluan senyawa fenolik Uji pendahuluan senyawa fenolik bertujuan untuk mengetahui apakah terdapat senyawa fenolik dalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete. Uji pendahuluan senyawa fenolik dilakukan dengan metode Folin-Ciocalteu. Metode Folin-Ciocalteu merupakan metode yang


49

paling umum digunakan untuk menentukan kandungan senyawa fenolik total. Uji pendahuluan dilakukan dengan mencampurkan senyawa uji dengan reagen Folin-Ciocalteu dalam suasana basa lalu diamati bagaimana perubahan warna yang terjadi. Prinsip dari uji pendahuluan senyawa dengan metode Folin-Ciocalteu adalah oksidasi gugus fenolik hidroksil. Selama reaksi belangsung, gugus fenolik hidroksil bereaksi dengan pereaksi

Folin-Ciocalteu,

membentuk

kompleks

fosfotungstat-

fosfomolibdat yang akan menghasilkan warna biru. Warna biru yang terbentuk dari hasil reaksi akan semakin pekat setara dengan konsentrasi ion fenolat yang terbentuk dari senyawa fenolik yang ada, jadi semakin besar konsentrasi senyawa fenolik maka semakin banyak ion fenolat yang akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu sehingga warna biru yang dihasilkan semakin pekat (Singleton dan Rossi, 1965). Hasil pengujian menunjukkan setelah direaksikan dengan Folin-Ciocalteu dan natrium karbonat fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete menghasilkan warna biru. Hasil yang didapat dibandingkan dengan larutan blanko ( air:metanol + natrium karbonat + Folin-Ciocalteu), kontrol positif (asam galat + Folin-Ciocalteu + natrium karbonat), larutan asam galat yang tidak direaksikan dengan Folin-Ciocalteu dan natrium karbonat serta fraksi etil asetat tanpa direaksikan dengan Folin-Ciocalteu dan natrium karbonat. Perubahan warna juga terjadi pada kontrol positif menjadi biru sehingga dapat disimpulkan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete memiliki kandungan senyawa fenolik.


50

Gambar 1. Hasil uji pendahuluan fenolik (A = larutan blanko [air:metanol + Folin Ciocalteu + Na2CO3]; B = kontrol positif [asam galat + Folin Ciocalteu + Na2CO3]; C = larutan uji + Folin Ciocalteu + Na2CO3; D = larutan asam galat; E = larutan uji)

2. Uji pendahuluan aktivitas antioksidan Uji pendahuluan adanya aktivitas antioksidan bertujuan untuk melihat secara kualitatif aktivitas antioksidan dari fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete. Uji dilakukan dengan mencampurkan larutan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete dengan reagen fenton, deoksiribosa, dan ditambahkan dengan buffer fosfat. Selanjutnya campuran tersebut diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC. Setelah inkubasi selama 1 jam, campuran ditambahkan dengan TCA dan TBA. Campuran kemudian dipanaskan dengan waterbath selama 30 menit dengan suhu 80o C. Senyawa yang bereaksi sebagai penangkal radikal bebas akan bereaksi dengan radikal OH yang terbentuk dari hasil reaksi pada reagen Fenton sehingga dapat mencegah degradasi dari deoksiribosa.


51

Dengan berkurangnya hasil degradasi dari deoksiribosa yaitu MDA maka makin berkurang juga kompleks MDA-TBA yang terbentuk sehingga menyebabkan warna pink yang dihasilkan oleh kompleks MDA-TBA menjadi lebih pudar. Dari pengujian fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete didapatkan warna merah muda yang dihasilkan menjadi jauh lebih pudar dibandingkan dengan kontrol negatif. Kontrol negatif merupakan campuran reagen Fenton dan deoksiribosa tanpa penambahan senyawa antioksidan. Kontrol negatif berfungsi untuk melihat seberapa pekat warna pink yang dihasilkan bila tanpa ada antioksidan yang menangkal radikal bebas. Selain kontrol negatif, terdapat juga kontrol positif dan fraksi etil asetat tanpa pemberian reagen Fenton dan deoksiribosa. Kontrol positif merupakan campuran reagen fenton dan deoksiribosa dengan penambahan senyawa yang telah diketahui memiliki aktivitas antioksidan, yaitu kuersetin. Hasil kontrol positif menunjukkan hasil yang sama dengan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete yaitu berwarna pink pudar. Dari uji pendahuluan yang dilakukan, diketahui bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete memiliki aktivitas antioksidan.


52

Gambar 2. Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = kontrol negatif; B = kontrol positif; C = larutan uji + deoksiribosa + reagen Fenton; D = larutan uji)

F. Optimasi Metode Uji Fenolik Total Aktivitas antioksidan dari tumbuhan dapat ditimbulkan oleh senyawa-senyawa fenolik yang terkandung di dalamnya. Senyawa fenolik menunjukkan aktivitas penangkapan radikal bebas yang kuat dibandingkan dengan senyawa lainnya (Ou et al, 2002). Tidak semua aktivitas antioksidan ditunjukkan dari seberapa besar nilai fenolik total yang terkandung dikarenakan adanya senyawa aktif lain yang bukan dari golongan senyawa fenolik yang memiliki aktivitas antioksidan juga, seperti beberapa jenis vitamin dan tiol dengan massa molekul kecil seperti glutation (Sochor et al, 2010). Namun banyak penelitian menunjukkan bahwa terdapat korelasi positif antara nilai kandungan fenolik total yang terdapat dalam suatu tanaman dengan kekuatan aktivitas antioksidan yang ditimbulkan (Saeed, 2012; Oliveira,


53

2012). Oleh karena itu perlu ditetapkan kandungan fenolik total dalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete. 1. Penentuan operating time (OT) Tujuan dari penentuan OT pada penetapan fenolik total adalah untuk mendapatkan waktu yang diperlukan agar reaksi antara senyawa fenolik dengan pereaksi Folin-Ciocalteu yang terjadi dapat berlangsung optimal. Hasil reaksi antara senyawa fenolik dengan pereaksi FolinCiocalteu akan menghasilkan warna biru yang selanjutnya diukur dengan spektrofotometer visibel. Reaksi dianggap optimal jika absorbansi dari tiap selang waktu yang diujikan telah stabil. Absorbansi yang stabil terlihat dari makin kecilnya selisih absorbansi antar selang waktu. Pengukuran OT dilakukan selama satu jam dengan waktu pengamatan setiap 5 menit sekali dengan asam galat sebagai baku. Asam galat digunakan sebagai baku dikarenakan asam galat merupakan senyawa fenolik. Operating

time

dilakukan

dengan

menggunakkan

panjang

gelombang teoritis. Panjang gelombang teoritis yang digunakan untuk menentukan operating time dari reaksi pada penentuan fenolik total adalah 750 nm (Katoch, 2011).


54

Absorbansi

Penentuan operating time 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

40,4 μg/mL 60,6 μg/mL 80,8 μg/mL

0

20

40

60

80

Waktu (menit)

Gambar 3. Grafik penentuan OT asam galat (Replikasi 1) Dari hasil penentuan OT yang dapat dilihat dari grafik (gambar 3) maka didapatkan OT dari reaksi antara senyawa fenolik dengan pereaksi Folin-Ciocalteu sebesar 35 menit. Penentuan OT diwakilkan dengan data replikasi satu dikarenakan kedua replikasi lainnya memiliki profil absorbansi yang sama dan stabil pada waktu yang sama yaitu stabil setelah 35 menit. 2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum (λ maks) Tujuan penentuan panjang gelombang serapan maksimum adalah untuk mengetahui panjang gelombang dari hasil reaksi antara senyawa fenolik dengan pereaksi Folin-Ciocalteu yang memberikan serapan maksimum. Pembacaan panjang gelombang dilakukan setelah asam galat direaksikan dengan pereaksi Folin-Ciocalteu dan didiamkan selama 35 menit. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum sangat penting dalam sensitifitas suatu analisis dengan menggunakan spektrofotometer.


55

Perubahan sedikit pada konsentrasi analit bila diukur dalam panjang gelombang serapan maksimum maka akan memberikan perubahan absorbansi yang besar. Penentuan panjang gelombang maksimum menggunakan tiga konsentrasi yang berbeda dari asam galat agar dapat mempresentasikan panjang gelombang pada konsentrasi yang berbedabeda, konsentrasi asam galat yang digunakan adalah 40; 50; dan 60 µg/mL. Pengukuran panjang gelombang maksimum dilakukan dengan membaca absorbansi pada daerah panjang gelombang antara 600-800 nm. Pembacaan pada area panjang gelombang antara 600-800 nm tersebut dikarenakan panjang gelombang maksimum teoritis berada di sekitar area panjang gelombang 600-800 nm. Tabel I. Hasil pembacaan panjang gelombang maksimum asam galat yang direaksikan dengan Folin-Ciocalteu Konsentrasi larutan λ maksimum λ maksimum yang λ asam galat hasil digunakan untuk maksimum pembacaan pengukuran teoritis 40 µg/mL

739 nm

50 µg/mL

739 nm

60 µg/mL

738 nm

739 nm

740 nm

Menurut penelitian Kowalcyzk (2013), panjang gelombang teoritis yang digunakan dalam membaca absorban pada hasil reaksi antara senyawa fenolik dengan pereaksi Folin-Ciocalteu adalah 740 nm. Hasil pengukuran panjang gelombang maksimum yang didapat dari tiga


56

konsentrasi yang berbeda adalah 739 nm (Tabel I) mendekati panjang gelombang maksimum teoritis yaitu 740 nm. G. Estimasi Kandungan Fenolik Total Metode Folin-Ciocalteu merupakan metode yang sudah lama dan sering digunakan dalam mengestimasi kandungan fenolik total dari suatu produk maupun dari suatu bahan alam. Penggunaan metode FolinCiocalteu dalam mengestimasi kandungan fenolik total dalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete dikarenakan metode FolinCiocalteu merupakan metode yang baku dalam menetapkan kandungan fenolik total pada produk alam selain itu metode ini sederhana dan efektif (Prior, 2005). Prinsip penentuan total fenolik menggunakan metode FolinCiocalteau adalah transfer elektron dalam kondisi medium basa dari senyawa fenolik ke asam fosfomolibdat dan fosfotungstat yang terdapat di dalam reagen Folin-Ciocalteau dan akan membentuk kompleks warna biru yang diukur nilai absorbannya. Warna biru yang terbentuk akan semakin pekat setara dengan konsentrasi ion fenolat yang terbentuk, artinya semakin besar konsentrasi senyawa fenolik maka semakin banyak ion fenolat yang akan mereduksi fosfomolibdat dan fosfotungstat sehingga warna biru yang dihasilkan semakin pekat (Singleton dan Rossi, 1965). Asam galat digunakan sebagai standar dalam metode FolinCiocalteu. Penggunaan asam galat sebagai standar dibanding beberapa standar lain seperti asam tanat, tirosin dan katekin dikarenakan asam galat


57

lebih murah dalam bentuk senyawa murni dan memiliki stabilitas yang baik (Waterhouse, 2005).

Kurva Baku Asam Galat 0,7

Absorbansi

0,6 0,5 0,4 0,3

y = 0,007x + 0,0335 R = 0,9994

0,2

0,1 0 0

20

40

60

80

100

Konsentrasi (µg/mL)

Gambar 4. Kurva baku asam galat dalam penetapan fenolik total (Rep. 1) Dilakukan tiga kali replikasi dalam penentuan kurva baku yang akan digunakan dalam penetapan kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete. Dari ketiga hasil replikasi kurva baku didapat tiga persamaan kurva baku. Semakin baik linearitas suatu kurva baku maka absorbansi yang dihasilkan pada pengukuran akan semakin sebanding dengan konsentrasi asam galat yang ada. Dari ketiga persamaan digunakan kurva baku yang memiliki persamaan dengan linearitas paling baik, yaitu persamaan kurva baku replikasi 1 (gambar 4) dengan y = 0,007x + 0,0335 dan r = 0,9994. Semakin tinggi nilai r pada suatu kurva baku, maka semakin baik pula linearitasnya. Nilai yang diperoleh dari


58

hasil penghitungan adalah nilai ekuivalen asam galat yang terkandung dalm fraksi. Tabel II. Hasil penentuan jumlah fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete Replikasi I II III

Fenolik total (mg ekuivalen) 657,6 611,03 629,3

Rata-rata ± SD (mg) 632,6 ± 23,45

Sampel fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete selanjutnya direaksikan dengan pereaksi Folin-Ciocalteu pada suasana basa. Sampel diukur pada λ maksimum yang telah didapat sebesar 739 nm dan setelah waktu operating time tepat pada 35 menit setelah direaksikan. Absorbansi yang didapatkan selanjutnya dihitung secara intrapolasi pada persamaan regresi linier y = 0,007x + 0,0335. Dari hasil perhitungan didapat rata-rata kandungan fenolik total fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete sebesar 632,6 ± 23,45 mg ekuivalen asam galat per g fraksi etil asetat (Tabel II). Dari hasil yang didapat, fraksi etil asetat daun jambu mete memiliki kandungan fenolik total yang tinggi, yaitu sebesar 632,6 ± 23,45 mg ekuivalen asam galat per g fraksi etil asetat. Hal tersebut menandakan bahwa lebih dari 60% senyawa yang terkandung dalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete merupakan senyawa fenolik. Kandungan fenolik pada fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete dari penelitian ini lebih besar jika dibandingkan dengan hasil penelitian dari


59

Nugroho (2013). Penelitian oleh Nugroho (2013) menggunakan ekstrak etanolik daun jambu mete memiliki kandungan fenolik total sebesar 19.78 ± 0.62 g ekuivalen asam galat per 100 g ekstrak. Perbandingan kandungan senyawa fenolik total terhadap penelitian Nugroho (2013) menunjukkan bahwa perbedaan kondisi tumbuh dan persyaratan tumbuh dari suatu tanaman dapat berpengaruh secara signifikan terhadap kandungan senyawa yang ada di dalamnya. Walaupun sudah digunakan secara luas, penggunaan metode FolinCiocalteu dalam mengestimasi kandungan fenolik total dalam bahan alam juga memiliki beberapa kekurangan, salah satunya yaitu kurang spesifik. Hal tersebut dikarenakan tidak hanya senyawa fenolik saja yang dapat bereaksi dengan reagen Folin-Ciocalteu, tetapi senyawa lain juga dapat bereaksi dengan reagen Folin-Ciocalteu seperti vitamin C, gula pereduksi, dan asam amino. Senyawa yang dapat bereaksi dengan reagen FolinCiocalteu selain senyawa fenolik seperti vitamin C, gula pereduksi, dan asam amino tidak terdapat dalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete, hal tersebut dikarenakan senyawa seperti vitamin c dan gula pereduksi larut pada pelarut polar sehingga akan masuk kedalam fraksi air dari ekstrak etanolik daun jambu mete.


60

H. Optimasi Metode Uji Aktivitas Antioksidan 1. Penentuan Operating Time (OT) Tujuan perlu dilakukannya penentuan operating time adalah untuk memperoleh rentang waktu yang diperlukan agar kromogen MDA-TBA menunjukkan absorbansi yang stabil, sehingga pengukuran akan menjadi reprodusibel dan akan meminimalisir kesalahan pada saat analisis. Operating time dihitung sejak reaksi pembentukan komplek MDATBA selesai, yaitu setelah inkubasi 80°C selama 30 menit, kemudian dilanjutkan pendinginan selama 5 menit. Penetapan operating time dilakukan dengan mengukur absorbansi komplek MDA-TBA pada panjang gelombang teoritis 532 nm setiap 5 menit selama 1 jam. Operating time

dilihat berdasarkan waktu dimana absorbansi dari

kompleks MDA-TBA yang terbentuk mulai stabil atau selisih absorbansi mulai kecil antar selang waktu yang diujikan. Hasil dari penetapan operating time terlihat pada gambar 5, yaitu pada menit ke-0 sampai ke-20 masih tejadi peningkatan absorbansi, namun setelah menit ke-20 sudah tidak terjadi peningkatan absorbansi, atau dengan kata lain bahwa pembentukan kompleks MDA-TBA berhenti dan telah stabil setelah 20 menit.


61

Absorbansi

Operating time kompleks MDA-TBA 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0

10

20

30

40

50

60

70

Waktu (menit)

Gambar 5. Grafik penentuan OT kompleks MDA-TBA Pembentukan warna antara TBA dan MDA diawali dengan degradasi deoksiribosa menjadi MDA, lalu MDA yang terbentuk akan bereaksi dengan TBA. Reaksi yang terjadi antara MDA dan TBA membentuk

kompleks

yang

selanjutnya

akan

dibaca

dengan

spektrofotometri pada λ teoritis 532 nm (gambar 6).

Gambar 6. Reaksi Pembentukan kromogen antara MDA-TBA (Nimse, 2015).


62

2. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum (λ maks) Penentuan panjang gelombang maksimum (λ maks) dilakukan untuk mendapatkan daerah serapan maksimum dari kromogen MDA-TBA. Penentuan panjang gelombang maksimum perlu dilakukan untuk menentukan panjang gelombang yang selanjutnya akan digunakan dalam pengukuran

aktivitas

antioksidan.

Pengukuran

absorbansi

dalam

pengukuran aktivitas antioksidan perlu dilakukan pada panjang gelombang maksimum karena dengan sedikit perubahan konsentrasi bila diukur pada panjang gelombang maksimum maka memberikan perubahan absorbansi yang besar sehingga didapatkan kepekaan analisis yang maksimum. Hasil reaksi antara MDA dan TBA dapat memberikan absorbansi dikarenakan adanya reaksi pengkoplingan antara MDA dan TBA yang mengakibatkan adanya perpanjangan gugus kromofor dan penambahan gugus auksokrom sehingga menghasilkan warna yang selanjutnya dapat dibaca dengan spektrofotometer visibel (gambar 7).

Gambar 7. Kromogen MDA-TBA (Rahman, 2000).


63

Penetapan panjang gelombang maksimum dilakukan dengan pembacaan absorbansi terhadap kromogen MDA-TBA dengan konsentrasi 0,086; 0,129; 0,172 mM pada panjang gelombang 400-600 nm. Pemilihan panjang gelombang dengan rentang 400-600 nm dikarenakan warna kromogen yang terbentuk berada pada rentang panjang gelombang 490560 nm. Digunakan tiga konsentrasi yang berbeda agar dapat merepresentasikan panjang gelombang kromogen MDA-TBA pada berbagai tingkat konsentrasi penambahan deoksiribosa yang berbeda. Tabel III. Hasil pembacaan panjang gelombang maksimum kromogen MDA-TBA Konsentrasi λ maksimum λ maksimum λ maksimum Deoksiribosa hasil pembacaan yang digunakan teoritis (nm) (mM) (nm) untuk pengukuran (nm) 0,086 530,5 0,129 530,5 530,5 532 0,172 531

Dari hasil pembacaan panjang gelombang maksimum kromogen MDATBA, didapatkan panjang gelombang maksimum pada 530,5 nm (Tabel III). Panjang gelombang yang didapat mendekati panjang gelombang teoritis yang telah ditentukan Halliwell (1987), yaitu 532 nm. I.

Estimasi Aktivitas Antioksidan dengan Radikal Hidroksil

Uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode penangkapan radikal hidroksil oleh senyawa yang memiliki aktivitas antioksidan sehingga mengurangi degradasi dari deoksiribosa akibat dari penyerangan radikal bebas terhadap deoksiribosa. Berkurangnya degradasi dari deoksiribosa akan mengakibatkan berkurangnya produk hasil degradasi


64

dari deoksiribosa yaitu MDA sehingga akan mengakibatkan berkurangnya kompleks MDA-TBA yang terbentuk. Berkurangnya kompleks MDATBA yang terbentuk ditandai dengan pudarnya warna merah muda yang terbentuk akibat dari sedikitnya kromogen MDA-TBA. Pengujian aktivitas antioksidan pada penelitian ini dilakukan dengan penambahan berbagai seri konsentrasi fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete ke dalam campuran reagen Fenton yang selanjutnya dilakukan penambahan deoksiribosa. Selain penambahan fraksi etil asetat, terdapat juga kontrol negatif yang berisi campuran reagen Fenton dan deoksiribosa tanpa penambahan senyawa antioksidan. Kontrol negatif berfungsi sebagai pembanding untuk mengetahui nilai absorbansi kromogen MDA-TBA apabila dalam campuran tidak terdapat senyawa antioksidan. Kontrol positif dari uji aktivitas antioksidan pada penelitian ini adalah kuersetin. Penggunaan kuersetin sebagai kontrol positif berfungsi sebagai pembanding terhadap senyawa uji untuk mengetahui absorbansi kromogen MDA-TBA bila ditambahkan dengan senyawa yang telah diketahui memiliki aktivitas antioksidan. Berdasarkan penelitian Fidrianny (2012) disebutkan bahwa ekstrak etanolik daun jambu mete dengan metode DPPH memiliki aktivitas antioksidan. Pada penelitian ini aktivitas antioksidan diukur dengan metode deoksiribosa. Penggunaan metode deoksiribosa dalam mengukur aktivitas antioksidan akan memberikan informasi tentang seberapa besar aktivitas antioksidan dalam menangkal radikal OH sehingga dapat


65

melindungi deoksiribosa. Keuntungan dari metode deoksiribosa adalah sederhana dan mudah dilakukan, selain itu metode deoksiribosa dapat merepresentasikan penyerangan radikal hidroksil terhadap deoksiribosa dan bagaimana antioksidan dapat melindungi deoksiribosa dari radikal bebas (Halliwell, 1987). Dari tabel IV dapat dilihat bahwa kontrol negatif memiliki absorbansi yang lebih besar dibandingkan dengan berbagai seri larutan kontrol positif. Tingginya absorbansi pada kontrol negatif disebabkan karena pada kontrol negatif tidak ditambahkan senyawa antioksidan sehingga tidak terdapat senyawa yang menangkal radikal hidroksi yang terbentuk, akibatnya radikal hidroksil akan langsung bereaksi dengan deoksiribosa yang mengakibatkan peningkatan MDA sebagai hasil degradasi dari deoksiribosa.

Peningkatan MDA akibat

degradasi

deoksiribosa juga akan diiringi dengan peningkatan kompleks yang terjadi antara MDA dan TBA sehingga absorbansi meningkat.


66

Tabel IV. Hasil uji aktivitas antioksidan kuersetin dengan metode deoksiribosa

Replikasi

I

II

III

Konsentrasi (μg/mL) 5,05 7,58 10,1 12,63 15,15 5 7,5 10 12,5 15 5 7,5 10 12,5 15

Absorbansi kontrol

0.7378

0.6412

0.3885

Absorbansi kuarsetin 0,7267 0,6967 0,6783 0,6355 0,6138 0,6281 0,6145 0,5825 0,5703 0,5417 0,3788 0,3601 0,3519 0,3389 0,3204

% IC (%) 1,50 5,57 8,06 13,86 16,80 2,04 4,16 9,15 11,06 15,50 2,50 7,31 9,43 12,80 17,52

Persamaan regresi linier y = 1,556x 6,3974 R = 0,9935

y = 1,3537x 5,1497 R = 0,9909

y = 1,4208x 4,3037 R = 0,9922

Pada kontrol positif terdapat penambahan senyawa kuersetin yang memiliki aktivitas antioksidan sehingga dapat melindungi deoksiribosa dari radikal hidroksil, sehingga hasil degradasi dari deoksiribosa menjadi semakin sedikit dan kompleks MDA-TBA yang terbentuk akan sedikit juga yang mengakibatkan absorbansi menjadi menurun. Pada tabel IV juga menunjukkan bahwa peningkatan konsentrasi dari kuersetin pada kontrol positif maka semakin tinggi aktivitas antioksidan yang diberikan. Aktivitas antioksidan terlihat dari % IC yang semakin besar sejalan dengan penambahan konsentrasi dari kuersetin. Pada gambar 8 menunjukkan korelasi linier antara konsentrasi kuersetin yang ditambahkan dengan % IC yang didapat. Aktivitas


67

antioksidan dinyatakan dengan IC50 yaitu konsentrasi yang dibutuhkan dari suatu senyawa antioksidan untuk menghambat radikal hidroksil sebesar 50%. Nilai 50% dari Inhibition Concentration merupakan nilai median dari 100% konsentrasi penghambatan (IC) yang dilakukan antioksidan terhadap radikal bebas. Penggunaan IC50 sebagai nilai dalam pengukuran aktivitas antioksidan agar hasil dari penelitian dapat dibandingkan dengan penelitian lainnya karena IC50 merupakan acuan yang sering dipakai peneliti dalam mengukur aktivitas antioksidan. Nilai IC50 dapat diganti dengan IC15, IC25, maupun IC90 tergantung dengan kondisi dan tujuan dari penelitian (Sweet, 1997). Nilai IC15, IC25, maupun IC90 merupakan nilai 15, 25, dan 90 % penghambatan radikal bebas. Nilai-nilai tersebut juga dapat digunakan sebagai acuan dalam menentukan aktivitas antioksidan karena merupakan titik persentil dari distribusi 100% penghambatan. Nilai IC50 dapat ditentukan dengan persamaan regresi linier yang menyatakan hubungan antara konsentrasi dari senyawa uji dengan % IC. Semakin kecil nilai IC50 maka semakin kuat aktivitas antioksidan dari suatu senyawa dalam menangkap radikal bebas.


68

% IC (%)

Kurva konsentrasi kuersetin vs %IC 18,000 16,000 14,000 12,000 10,000 8,000 6,000 4,000 2,000 0,000

y = 1,556x - 6,3974 R = 0,9935

0

5

10

15

20

Konsentrasi (μg/mL)

Gambar 8. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan kuersetin (Replikasi 1) Grafik liniearitas dari hasil aktivitas antioksidan kuersetin diwakili oleh replikasi satu (Gambar 7), dikarenakan kedua replikasi lainnya menunjukkan hasil yang tidak jauh berbeda. Dalam penelitian ini nilai IC50 tidak dapat diperoleh dikarenakan konsentrasi dari kuersetin yang ditambahkan tidak mencapai 50% penghambatan radikal bebas, hal tersebut akibat dari keterbatasan kelarutan dari kuersetin. Maka dari itu digunakan IC15 dalam menentukan kekuatan aktivitas antioksidan. Pada beberapa penelitian

banyak digunakan nilai aktivitas antioksidan

berdasarkan IC15 dan IC25 dikarenakan keterbatasan kelarutan dari senyawa yang diuji ( Nugroho et al, 2006; Unal, 2014). Dari ketiga replikasi pada pengujian aktivitas antioksidan kuersetin sebagai kontrol positif menunjukkan hasil perhitungan IC15 secara intrapolasi yang berada


69

pada rentang konsentrasi yang digunakan dalam pengukuran seri konsentrasi kontrol positif. Tabel V. Hasil uji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete dengan metode deoksiribosa

Replikasi

I

II

III

Konsentrasi (μg/mL) 10,1 20,2 30,3 40,4 50,5 9,9 19,8 29,7 39,6 49,5 10,1 20,2 30,3 40,4 50,5

Absorbansi kontrol

0,608

0,5132

0,5378

Absorbansi senyawa uji 0,5389 0,5199 0,4681 0,4214 0,3745 0,4489 0,4229 0,3751 0,3408 0,3174 0,4879 0,4691 0,4238 0,3789 0,3403

% IC (%) 11,37 14,49 23,01 30,69 38,40 12,53 17,56 26,91 33,59 38,15 9,28 12,77 21,20 29,55 36,72

Persamaan regresi linier y = 0,7028x + 2,5082 R = 0,9915

y = 0,6724x + 5,5826 R = 0,9903

y = 0,7166x + 0,4054 R = 0,9906

Tabel V menunjukkan absorbansi dari campuran reagen Fenton dan deoksiribosa yang telah diberi senyawa uji lebih kecil dibandingkan dengan absorbansi dari kontrol negatif. Hal tersebut menunjukkan adanya aktivitas antioksidan dalam fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete. Pada tabel V

juga dapat dilihat bahwa dengan penambahan

konsentrasi dari fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete pada campuran reagen Fenton dan deoksiribosa maka aktivitas antioksidan yang ditimbulkan juga semakin besar. Semakin meningkatnya aktivitas


antioksidan terlihat dari

70

nilai %IC yang didapat setelah peningkatan

konsentrasi dari fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete. Dilakukan tiga kali replikasi pada uji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete, dari masing-masing replikasi didapat persamaan regresi linier yang akan digunakan dalam menentukan nilai IC15. Hal tersebut dikarenakan keterbatasan jumlah dan kelarutan fraksi etil asetat dalam penelitian.

Absorbansi

Kurva konsentrasi fraksi vs %IC 40,000 35,000 30,000 25,000 20,000 15,000 10,000 5,000 0,000

y = 0,7166x + 0,4054 R = 0,9926

0

10

20

30

40

50

60

Konsentrasi (μg/mL)

Gambar 9. Kurva persamaan regresi linier aktivitas antioksidan fraksi etil asetat replikasi 3 Dalam kurva pada gambar 8 ditunjukkan bahwa nilai IC15 yang didapat merupakan hasil intrapolasi. Penggunaan IC15 dikarenakan %IC yang dihasilkan dari aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete tidak mencapai 50% penghambatan antioksidan, sehingga bila dihitung untuk mencari IC50 maka akan terjadi ekstrapolasi. Penghambatan yang didapat kurang dari 50% dikarenakan fraksi yang


71

telah habis dan kurangnya kelarutan dari fraksi etil asetat dalam air sehingga konsentrasi dari fraksi yang diujikan tidak dapat mencapai 50%. Gambar 8 merupakan hasil regresi linier dari replikasi tiga yang mewakili replikasi lainnya karena kedua replikasi lainnya menunjukkan hasil perhitungan IC15 secara intrapolasi. Ketiga nilai IC15 dari fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete berada dalam rentang konsentrasi yang digunakan dalam pengukuran seri konsentrasi fraksi etil asetat. Tabel VI. Hasil perhitungan IC15 kuersetin dan fraksi etil asetat Kuersetin Replikasi

IC15

I

13,75

II

14,88

III

13,58

Rerata ± SD (μg/mL)

14,07 ± 0,70

Fraksi etil asetat Replikasi

IC15

I

17,77

II

14,00

III

20,36

Rerata ± SD (μg/mL)

17,38 ± 3,1

Hasil dari uji aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete ini tidak dapat dibandingkan dengan hasil penelitian lain dikarenakan perbedaaan acuan nilai yang digunakan. Pada penelitian lain digunakan nilai IC50 sebagai nilai acuan kekuatan aktivitas antioksidan, sedangkan dikarenakan aktivitas antioksidan pada penelitian ini terkendala


72

keterbatasan bahan dan kelarutan dari senyawa uji maka %IC yang diperoleh tidak dapat mencapai 50% sehingga pada penelitian ini digunakan nilai IC15. Tabel VI menunjukkan hasil dari pengukuran aktivitas antioksidan kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete. Hasil yang didapat berupa nilai IC15, rata-rata IC15 dari kuersetin adalah 14,07±0,70 μg/mL dan rata-rata IC15 fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete adalah 17,38±3,1 μg/mL. Untuk melihat apakah terdapat perbedaan yang bermakna antara IC15 kuarsetin dengan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete, maka data aktivitas antioksidan yang didapat diuji secara statistik. Software yang digunakan dalam uji statistik adalah Minitab®17 trial version. Pertama dilakukan uji normalitas untuk mengetahui apakah data terdistribusi normal atau tidak. Normalitas dari data kuersetin dan fraksi etil asetat diuji dengan menggunakan uji Ryan-Joiner yang memiliki kemiripan dengan uji Saphiro-Wilk (Chantasorn, 2011). Dengan menggunakan taraf kepercayaan 95% maka apabila nilai p > 0,05 maka data telah terdistribusi normal. Hasil perhitungan nilai p untuk data kuersetin adalah 0,100 dan untuk data fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete adalah 0,100. Karena kedua data memiliki nilai p > 0,05 maka data IC15 kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete terdistribusi normal. Setelah uji normalitas selanjutnya dilakukan uji homogenitas dengan Uji F-Dua Variansi. Uji homogenitas dilakukan untuk mengetahui


73

apakah variansi antara kelompok yang diuji berbeda atau tidak (Dahlan, 2009). Nilai p yang diperoleh, yaitu 0,093 atau lebih besar dari 0,05, dari hasil p tersebut dapat disimpulkan bahwa tidak ada perbedaan variansi IC15 dari kuersetin dan fraksi etil asetat. Setelah diketahui homogenitas dari data, selanjutnya dilakukan uji T tidak berpasangan. Uji T tidak berpasangan dilakukan untuk melihat apakah terdapat perbedaan antara rerata IC15 dari kuersetin dan fraksi etil asetat. Dari hasil perhitungan dengan program Minitab®17 trial version didapatkan nilai p sebesar 0,155. Karena nilai p > 0,05 maka dapat disimpulkan bahwa rata-rata IC15 dari kuersetin dan fraksi etil asetat tidak berbeda bermakna pada taraf kepercayaan 95%.


BAB V KESIMPULAN DAN SARAN A. Kesimpulan 1. Kandungan fenolik total pada fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete sebesar (632,6±23,4) mg ekuivalen asam galat per gram fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete. 2. Nilai aktivitas antioksidan fraksi etil asetat ekstrak etanolik jambu mete dengan metode deoksiribosa yang dinyatakan sebagai IC15 sebesar (17,4 ± 3,1) μg/mL, IC15 fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete bila dibandingkan dengan IC15 kuersetin tidak berbeda bermakna, sehingga dapat dikatakan bahwa fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete memiliki aktivitas antioksidan yang tinggi.

B. Saran Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang aktivitas antioksidan dari daun jambu mete dengan metode DPPH agar didapat nilai IC50 dari daun jambu mete.

74


75

DAFTAR PUSTAKA Agoes, G., 2007, Teknologi Bahan Alam, Penerbit ITB, Bandung, pp. 10-20 Ariyani, M., Kusumaningsih T., & Rahardjo, M. B., 2007, Daya Hambat Ekstrak Daun Jambu Mete (Anacardium Occidentale, L) Terhadap Pertumbuhan Streptococcus sanguis, Jurnal PDGI, 57(02), 45-51. Birangane, R. S., Chole .D.G., K. S. P. Reddy, & Shivaji, 2011, A Review of Antioxidants, Journal of Indian Academy of Oral Medicine and Radiology, 23(3), 351-353. Blainski, A., Lopes, G.C., & Mello, J.C.P., 2013, Application and Analysis of the Folin Ciocalteu Method for the Determination of the Total Phenolic Content from Limonium Brasiliense L., Molecules, 18, 6852-6865. Cadenas, E. & Packer, L., 2002, Handbook of Antioxidant, Second Edition, USA, Marcell Dekker Inc, pp. 4. Cindric, I.J., Kunstic, M., Zeiner, M., Stingeder, G., & Rusak, G., 2011, Sample Preparation Methods for the Determination of the Antioxidative Capacity of Apple Juices, Croat. Chem. Acta, 84 (3), 435-438. Dahlan, M.S., 2009, Statistik Untuk Kedokteran, ed. 4, Salemba Medika, Jakarta, pp. 45-111. Dai, J., & Russell, J.M., 2010, Plant Phenolics: Extraction, Analysis and Their Antioxidant and Anticancer Properties, Molecules, (15), 7313-7352. Decker, E.A., Ryan J. Elias, & D. Julian McClements, 2010, Oxidation in Foods and Beverages and Antioxidant Applications, Volume 1, Woodhead Publishing Limited, UK, pp. 273-351. Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan RI, 1995, Farmakope Indonesia, jilid IV, Departemen Kesehatan Republik Indonesia, Jakarta, hal. 1061, 1036,.


76

Droge, W., 2002, Free radicals in the physiological control of cell function, Physiol Rev, 82, 47-95. Edet, E. E, Adewuni, D., & Uti, D. E., 2013, Effect of ethanolic leaf extract of Anacardium occidentale on histoarchitecture of brain and kidney, Journal of pharmaceutical and biomedical sciences (J Pharm Biomed Sci.), (30), 31-35. Fessenden, R. J., & Fessenden, J.S., 1982, Kimia Organik, Edisi Ketiga, Jilid 1, Erlangga, Jakarta, pp. 240. Fessenden, R. J., & Fessenden, J.S., 1982, Kimia Organik, Edisi Ketiga, jilid 2, Erlangga, Jakarta, pp. 436 – 437. Fidrianny, I., Ruslan, K., & Saputra, J., 2012, Aktivitas Antioksidan Berbagai Polaritas Ekstrak Daun Jambu Mente (Anacardium occidentale L.) dan Isolasi Senyawa Antioksidan, Jurnal Medika Planta, 2(1), 1-12. Giao, M. S., Gonzalez-Sanjose, M. L., Muniz, P., Rivero-Perez, M. D., Kosinska, M., Pintado, M. E., et al., (2008), Protection of deoxyribose and DNA from degradation brought about by aqueous extracts of several wild plants, Journal of the Science of Food and Agriculture, 88, 633–640. Guimaraes, C, M., Maria, S. G., Sidonia S. M., Ana I. P., Manuela E. P., et al., 2007, Antioxidant activity of sugar molasses, including protective effect against DNA oxidative damage, J Food Sci, 72(1), 39-43. Gupta, S. D.,2010, Reactive Oxygen Species and Antioxidants in Higher Plants, CRC Press, USA, pp. 305-306. Halliwell, B., Gutteridge, J.M.C., & Aruoma, O.I., 1987, The Deoxyribose Method: A Simple “Test-Tube” Assay for Determination of Rate Constants

for

Reactions

Biochemistry, 165, 215-219.

of

Hydroxyl

Radicals,

Analytical


77

Handa, S.S., Khanuja, S.P.S., Longo, G., Rakesh, D.D., 2008, Extraction Technologies for Medicinal and Aromatic Plants, International Centre For Science And High Technology, Trieste, pp. 22 – 23. Heinrich, Michael., Barnes, J., Gibbons, S., & Williamso, E.M., 2012, Fundamental of Pharmacognosy and Phytotherapi, second edition, Elsevier Churchill Livingstone, UK, pp. 117120. Hemingway, R., & Peter, L., 1991, Plant Polyphenols : Synthesis, Properties, Significance, Vol. 59, Plenum Press, New York, pp. 263-264. Ifesan, B.O.T., Fashakin, J.F., Ebosele, F., & Oyerinde, A.S., 2013, Antioxidant ang Antimicrobial Properties of Selected Plant Leaves, European Journal of Medicinal Plants, 3(3), 465-473. Ito, N., Fukushima S., Hagiwara, A., Shibata M., & Ogiso T., 1983, Carcinogenecity of butylated hydroxyl anisol in F 344 rats, Journal of the National Cancer Institute, 70, 343–352. Jaiswal, Y.S.,Tatke, P.A., Gabhe, S.Y., & Vaidya, A., 2010, Antioxidant Activity of Various Extracts of Leaves of Anacardium Occidentale (Cashew), RJPBJS, 1(4), 112-119. Katoch, R., 2011, Analytical Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Springer, New York, pp. 356-358. Kowalczyk, D., Michal, S., Joanna, C., & Urszula, G. D., 2013, The Phenolic Content

and

Antioxidant

Activity

of

the

Aqueous

and

Hydroalcoholic Extracts of Hops and Their Pellets, J. Inst. Brew., 119: 103-110. Krishnaveni, M., Madhaiyan, P., Durairaj, S., Amsavalli, L., & Chandrasekar, R., 2013, Antioxidant Activity of Plants at Chinnatirupathi, Salem, Tamil Nadu, India, IJPSR, 4(10), 3917-3919.


78

Kurin, E., Mucaji, P., & Nagy, M., 2012, In Vitro Antioxidant Activities of Three Red Wine Polyphenols and Their Mixtures: An Interaction Study, Molecules, 17, 14336-14348. Lestari, F., 2007, Bahaya Kimia : Sampling dan Pengukuran Kontaminan Kimia di Udara, EGC, Jakarta, hal. 189. Mahapatra, A.K., & Nguyen C. N., 2009, Dying Of Medical Plant. ISHS Acta Holticulturae

Internasional

Symposium

on

Medical

and

Neutraceutical Plants, 756. Mudawaroch, E., & Zulfanita, 2012, Kajian Berbagai Macam Antioksidan Alami Dalam Pembuatan Sosis, Surya Agritama Volume I, 1, 71-84. Mujica, M.V., Marisela, G., & Naudy S., 2009, Importance of the Extraction Method in the Quantification of Total Phenolic Compound in Phaseolus vulgaris L., Interciencia Journal, 34, 650-654. Nimse, S. B., &Dilipkumar, P., 2015, Free Radiacls, Natural Antioxidants, and Their Reaction Mechanisms, RSC Adv., 5, 27986-28006. Nonhebel, D.C., & Walton, J.C., 1974, Free-radical Chemistry; Structure and Mechanism, Cambridge University Press, London, pp. 1-6. Nugroho, A. E., Nunung, Y., Enade, P. E., Supardjan, & Lukman, H., 2006, Penetapan

Aktivitas

Antioksidan

Dehidrozingeron

Melalui

Penangkapan Radikal Hidroksi Dengan Metode Deoksiribosa, Majalah Farmasi Indonesia, 17(3), 116-122. Nugroho, A.E., Malik, A., Pramono, S., 2013, Total phenolic and flavonoid contents, and in vitro antihypertension activity of purified extract of Indonesian

cashew

leaves

(Anacardium

occidentale

L.),

International Food Research Journal, 20(1), 299-305. Oliveira, A. M. F., Lilian, S. P., Charlane, Kelly, S. P., Wemerson, N. M., Roosevelt, A. G., Otemberg, S. C., et al., 2012, Total Phenolic


79

Content and Antioxidant Activity of Some Malvaceae Family Species, Antioxidants, (1), 33-43. Otles, S., 2005, Methods of Analysis of Food Components and Additives, Taylor and Francis Group, United States, pp. 229-230. Ou, B.X., Huang, D.J., Hampsch -Woodill, M., Flanagan, J.A., Deemer, E.K., 2002,

Analysis of antioxidant activities of common vegetables employing oxygen radical absorbance capacity (ORAC) and ferric reducing antioxidant power (FRAP) assays: A comparative study. J. Agric. Food Chem. 50, 3122 -3128. Pham-Huy, L. A., He, H., & Pham-Huyc, C., 2008, Free Radicals, Antioxidants in Disease and Health. International Journal of Biomedical Science, 4(2): 89-96. Prior, R. L., Xianji, W., & Karen, S., 2005, Standardized Methods for the Determination of Antioxidant Capacity and Phenolics in Food and Dietary Supplements, J. Agric. Food. Chem. 53, 4290-4302. Rahardjo, M., I. Darwati, & A. Shusena, 2006, Produksi dan Mutu Simplisia Purwoceng Berdasarkan Lingkungan Tumbuh dan Umur Tanaman, Jurnal Bahan Alam Indonesia, vol. 5, 310-316. Rahman, A., 2000, Studies in Natural Products Chemistry, 1st ed, Elsevier, Amsterdam, pp. 329-330. Robinson, J.W., 1996, Atomic Spectroscopy, 2nd edition, Marcel Dekker, Inc., New York, pp. 27-28.

Saeed, N., Khan, M. R., & Maria, S., 2012, Antioxidant activity, total phenolic and total flavonoid contents of whole plant extracts Torilis leptophylla L, BMC Complementary and Alternative Medicine, 12: 221.


80

Saikia, L.R., & Sristisri, U., 2011, Antioxidant Activity, Phenol and Flavonoid Content of Some Less Known Medical Plants of Assam, International Journal of Pharma and Bio Sciences, 2, 383-388. Sambamurthy, K., 2002, Pharmaceutical Engineering, edisi 5, NAI (P) Ltd, Delhi, pp. 176-179. Singleton, V.L., & Rossi J.A., 1965, Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungstic acid reagents, Amer. J. Enol. Viticult. 16:144-58. Sochor, J., Ondrej Z., Helena, S., Dusan, P., Petr, B., Boris, K., Ales, H., et al., 2010, Content of Phenolic Compounds and Antioxidant Capacity in Fruits of Apricot Genotypes, Molecule, 6285-6305. Sudarsono, Gunawan D., Wahyuono S., Donatus I. A., & Purnomo, 2002, Tumbuhan Obat II Hasil Penelitian, Sifat-sifat, dan Penggunaan. PSOT UGM, Jogjakarta, hal. 23-98. Suhadi, O., 2007, Budidaya Jambu Mete, Azka Press, Indonesia, hal. 2-6. Sulistyawati, D., & Mulyati, S., 2009, Uji Aktivitas Antijamur Infusa Daun Jambu Mete (Anacardium occidentale L.) Terhadap Candida albicans, Biomedika, 2(1), 47-51. Suprapti, L., 2003, Teknologi Pengolahan Pangan Manisan Kering Jambu Mete, Kanisius, Indonesia, hal. 12-14. Sweet, D. V., 1997, Registry of Toxic Effects of Chemical Substances (RTECS®) Comprehensive Guide To The RTECS®,

DHHS (NIOSH)

PUBLICATION, 97-119. Tapan, E., 2005, Kanker, Antioksidan, dan Terapi Komplementer, Elex Media Komputindo, Jakarta, hal. 104-110.


81

Trilaksani, W., 2003, Antioksidan: Jenis, Sumber, Mekanisme Kerja dan Peran Terhadap Kesehatan, Institute Pertanian Bogor, Bogor, hal 1-12. Unal, K., Deny, S., & Muhammad, T., Polyphenol Content and Antioxidant Capacity in Organically and Conventionally Grown Vegetables, JCLM, 2(11), 864-871. United States Department of Agriculture NRCS, 2013, Plant profile : Cashew, http://plants.usda.gov/core/profile?symbol=ANOC, diakses tangal 7 Mei 2014. Vermerris, W., & Nicholson, R., 2006, Phenolic Compound Biochemistry, Springer, USA, pp. 1-2. Waterhouse, A. L., 2005, Determination of total phenolics; In: R.E. Wrolstad (ed.), Handbook of food analytical chemistry—pigments, colorants, flavors, texture and bioactive food components, John Wiley and Sons, New York, pp. 463-464. Watson, D. G., 2010, Analisis Farmasi : Buku Ajar Untuk Mahasiswa Farmasi Dan Praktisi Kimia Farmasi, Edisi 2, Jakarta, EGC, pp. 105. Williamson, E. M., David, T. T., & Fred, J. E., 1996, Selecetion, Preparation and Pharmacological Evaluation of Plant Material, Wiley & Sons Ltd, England, pp. 16-17. Winarsi, H., 2007, Antioksidan alami & radikal bebas : potensi dan aplikasinya dalam kesehatan, Penerbit Kanisius, Yogyakarta,. pp.78-189. Yuliarti, N., 2009, Sehat, Cantik, Bugar Dengan Herbal dan Obat Tradisional, Andi Publisher, Indonesia, hal. 65.


LAMPIRAN

82


Lampiran

1. Surat pengesahan determinasi (Anacardium ocidentale L.)

tanaman

83

jambu mete


84

Lampiran 2. Gambar tanaman jambu mete yang diambil di perkebunan jambu mete Desa Mojolegi, Imogiri, Bantul, DIY

a. Gambar pohon jambu mete

b. Gambar daun jambu mete


85

Lampiran 3 . Perhitungan Rendemen Ekstrak Etanol Daun Jambu Mete dan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Etanolik Daun Jambu Mete a. Ekstrak etanol

Bobot cawan Bobot cawan + ekstrak Bobot ekstrak Rerata

R 1 (g) 53,7617

R 2 (g) 39,9705

R 2 (g) 56,5211

71,9783

60,8382

73,6770

18,2176

20,8677 18,7471

17,1559

Bobot daun jambu mete yang digunakan

= 100,0 g

Rendemen ekstrak etanol

= 𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡

𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑑𝑎𝑝𝑎𝑡

=

𝑏𝑎 ℎ𝑎𝑛 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑔𝑢𝑛𝑎𝑘𝑎𝑛

18,7471 100

𝑥 100%

𝑥 100%

= 18,75 %

b. Fraksi etil asetat

Bobot cawan Bobot cawan + fraksi Bobot ekstrak Rerata

R 1 (g) 42,6678

R 2 (g) 39,6810

R 2 (g) 38,6648

45,1015

41,3351

39,5604

2,4337

1,6541 1,66

0,8956

Bobot daun jambu mete yang digunakan

= 100,0 g

Rendemen fraksi etil asetat

= 𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡

𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑑𝑎𝑝𝑎𝑡 𝑏𝑎 ℎ𝑎𝑛 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑔𝑢𝑛𝑎𝑘𝑎𝑛

𝑥 100%


=

1,66 100

𝑥 100%

= 1,66 %

86


87

Lampiran 4. Penimbangan uji kandungan fenolik total a. Penimbangan asam galat

Bobot kertas Bobot kertas + zat Bobot kertas + sisa Bobot zat

Replikasi (g) 0,2501 0,2604

1

Replikasi (g) 0,2430 0,2536

2

Replikasi (g) 0,2497 0,2599

0,2503

0,2434

0,2498

0,0101

0,0102

0,0101

3

b. Penimbangan fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete

Bobot beaker Bobot beaker + zat Bobot zat

Replikasi (g) 34,7474 34,7575 0,0101

1

Replikasi (g) 63,9444 63,9544 0,0100

2

Replikasi (g) 62,0569 62,0570 0,0101

3


Lampiran 5. Optimasi penentuan kandungan fenolik total a. Penentuan Operating Time Asam Galat Absorbansi konsentrasi replikasi I pada λ 750,0 nm 40,4 µg/mL 60,6 µg/mL 80,8 µg/mL 5 0.2631 0.4249 0.5785 10 0.2838 0.4982 0.6763 15 0.2957 0.5254 0.7068 20 0.3025 0.5337 0.7395 25 0.3075 0.5389 0.7469 30 0.309 0.5399 0.7513 35 0.3165 0.5381 0.7507 40 0.3177 0.5389 0.7511 45 0.3198 0.5389 0.7505 50 0.3202 0.5388 0.7487 55 0.3204 0.537 0.7451 60 0.3204 0.5345 0.741 OT yang didapat 35 menit Waktu (menit)

Absorbansi konsentrasi replikasi II pada λ 750,0 nm 40,8 µg/mL 61,2 µg/mL 81,6 µg/mL 5 0.2915 0.3989 0.5486 10 0.3141 0.4554 0.5791 15 0.3280 0.4766 0.6035 20 0.3368 0.4865 0.6167 25 0.3427 0.4927 0.6271 30 0.3472 0.4958 0.6332 35 0.3496 0.4985 0.6371 40 0.3519 0.4999 0.6399 45 0.3533 0.4995 0.6415 50 0.3542 0.4999 0.6431 55 0.3550 0.4991 0.6440 60 0.3553 0.4972 0.6433 OT yang didapat 35 menit Waktu (menit)

88


Absorbansi konsentrasi replikasi III pada λ 750,0 nm 40,4 µg/mL 60,6 µg/mL 80,8 µg/mL 5 0.2820 0.4226 0.5562 10 0.3088 0.4501 0.5948 15 0.3231 0.4656 0.6191 20 0.3317 0.4767 0.6331 25 0.3379 0.4839 0.6422 30 0.3429 0.4894 0.6488 35 0.3457 0.4927 0.6537 40 0.3478 0.4954 0.6569 45 0.3503 0.4972 0.6591 50 0.3507 0.4982 0.6610 55 0.3513 0.4990 0.6620 60 0.3521 0.4996 0.6630 OT yang didapat 35 menit Waktu (menit)

b. Penentuan λ maksimum a. Spektra asam galat 40 µg/mL

89


b. Spektra asam galat 50 µg/mL

c. Spektra asam galat 60 µg/mL

90


91

Lampiran 6. Penentuan kandungan fenolik total a. Asam Galat 1. Konsentrasi larutan induk Replikasi 1

Replikasi 2

Replikasi 3

10,1 𝑚𝑔

10,2 𝑚𝑔

10,1 𝑚𝑔

10 𝑚𝐿

= 1010 µg/mL

10 𝑚𝐿

= 1020 µg/mL

10 𝑚𝐿

= 1010 µg/mL

2. Konsentrasi seri larutan asam galat Seri larutan

Konsentrasi larutan asam galat

asam galat

Replikasi 1

Seri 1

40,4 µg/mL

40,8 µg/mL

40,4 µg/mL

Seri 2

50,5 µg/mL

51,0 µg/mL

50,5 µg/mL

Seri 3

60,6 µg/mL

61,2 µg/mL

60,6 µg/mL

Seri 4

70,7 µg/mL

71,4 µg/mL

70,7 µg/mL

Seri 5

80,8 µg/mL

81,6 µg/mL

80,8 µg/mL

Replikasi 2

Replikasi 3

Contoh perhitungan konsentrasi larutan asam galat (R 1) : Larutan induk

= 1010 µg/mL

Konsentrasi larutan pembanding (seri 1) V1 x C1 = V2 x C2 0,4 mL x 1010 µg/mL = 10 mL x C2 C2 = 40,4 µg/mL


3. Pengukuran seri konsentrasi asam galat Replikasi

I

II

III


Absorbansi asam galat 0,3108 0,3931 0,4652 0,5665 0,6459 0,3674 0,4404 0,5026 0,5731 0,6559 0,3093 0,3889 0,4553 0,5253 0,5916

Persamaan regresi linier y = 0,0084x - 0,0299 R = 0,9988

y = 0,0071x – 0,0821 R = 0,9989

y = 0,007x – 0,0335 R = 0,9994

b. Pengukuran sampel Hasil penentuan jumlah fenolik total fraksi etil asetat ekstrak metanolik daun apel beludru Replikasi Fenolik total Rata-rata SD (mg) (mg (mg) ekuivalen) I 657,6 II 611,03 632,6 23,45 III 629,3 Cara Perhitungan Persamaan y = 0,007x + 0,0335 Sampel replikasi 1 Konsentrasi sampel = 101 µg/mL Volume = 100 mL Bobot sampel = 0,01 g Absorbansi sampel = 0,4984 y = 0,007x + 0,0335 0,4984

=

0,007x + 0,0335

92


x

= =

Kandungan fenolik total 𝑣

93

0,4984 −0,0335 0,007

66,41 µg/mL

= 100

X . 𝑚 = 0,06641 mg/mL . 0,0101 𝑔 = 657,6 mg ekuivalensi asam galat per g fraksi


94

Lampiran 7. Data perhitungan konsentrasi reagen dan fraksi etil asetat aktivitas antioksidan 1. Pembuatan reagen Fenton 

Larutan FeCl3 1 mM FeCl3.6H2O 1 mM BM = 270,2957 Bobot yang ditimbang = 0,0135 g

𝑀=

𝑛 𝑣

=

0,0135 270 ,2957

0,010

= 0,004995

V1 . C1 = V2 . C2 2 . 0,00495 = 10 . C2 C2 = 0,000999 M = 0,999 mM Larutan FeCl3 dengan konsentrasi 1 mM dibuat dengan mengambil larutan FeCl3 sebanyak 2 ml dan diencerkan hingga volume 10 ml. 

Larutan EDTA 1mM EDTA 1 mM BM = 292,24 Bobot yang ditimbang = 0,0146 g

𝑀=

𝑛 𝑣

=

0,0146 292 ,24

0,010

= 0,004996 𝑀

V1 . C1 = V2 . C2


95

2 . 0,004996 = 10 . C2 C2 = 0,000999 M = 0,999 mM Larutan EDTA dengan konsentrasi 1 mM dibuat dengan mengambil larutan EDTA sebanyak 2 ml dan diencerkan hingga volume 10 ml. 

Larutan Vitamin C 1 mM BM = 176,12 Bobot yang ditimbang = 0,0176 g

𝑀=

𝑛 𝑣

=

0,0176 176 ,12

0,010

= 0,009993

V1 . C1 = V2 . C2 1 . 0,009993 = 10 . C2 C2 = 0,000999 M = 0,999 mM Larutan vitamin c dengan konsentrasi 1 mM dibuat dengan mengambil larutan vitamin c sebanyak 1 ml dan diencerkan hingga volume 10 ml. 2. Larutan Deoksiribosa 2,5 mM BM = 134,13 Bobot yang ditimbang = 0,0209 g


𝑀=

𝑛 𝑣

=

0,0209 134 ,13

0,010

96

= 0,015582

V1 . C1 = V2 . C2 4 . 0,015582 = 25 . C2 C2 = 0,002493 M = 2,493 mM Larutan deoksiribosa dengan konsentrasi 2,5 mM dibuat dengan mengambil larutan deoksiribosa sebanyak 4 ml dan diencerkan hingga volume 25 ml. 3. Buffer Fosfat 7,4 

NaH2PO4 20 mM BM = 141,96 Bobot yang ditimbang = 1,4196 g

𝑀= 

𝑛 𝑣

=

1,4196 141 ,96

0,5

= 0,02 𝑀 = 20 𝑚𝑀

KH2PO4 20 mM BM = 136,09 Bobot yang ditimbang = 0,6805 g

𝑀=

𝑛 𝑣

=

0,6805 136 ,09

0,25

= 0,02 𝑀 = 20 𝑚𝑀


97

4. TCA 5% Bobot yang ditimbang = 2,5022 g 𝐾𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 =

2,5022 50

𝑥 100% = 5,004 % 𝑏 𝑣

5. TBA 1% 𝐾𝑜𝑛𝑠𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑠𝑖 =

Bobot yang ditimbang = 0,2512 g 0,2512 25

𝑥 100% = 1,0048 % 𝑏 𝑣

6. Penimbangan fraksi etil asetat

Bobot beaker Bobot beaker + zat Bobot zat

Replikasi 1 (g) 62,5801 62,5902

Replikasi 2 (g) 61,0786 61,0885

Replikasi (g) 62,8321 62,8422

0,0101

0,0099

0,0101

Konsentrasi seri larutan uji fraksi etil asetat Seri larutan uji

Konsentrasi larutan uji fraksi etil asetat

fraksi etil asetat

Replikasi 1

Replikasi 2

Replikasi 3

Seri 1

10,1 µg/mL

9,9 µg/mL

10,1 µg/mL

Seri 2

20,2 µg/mL

19,8 µg/mL

20,2 µg/mL

Seri 3

30,3 µg/mL

29,7 µg/mL

30,3 µg/mL

Seri 4

40,4 µg/mL

39,6 µg/mL

40,4 µg/mL

Seri 5

50,5 µg/mL

49,5 µg/mL

50,5 µg/mL

Contoh perhitungan konsentrasi larutan uji fraksi etil asetat (R 1) : Larutan induk

= 1010 µg/mL

3


98

Intermediet (seri 1) V1 x C1 = V2 x C2 5 mL x 1010 µg/mL = 50 mL x C2 C2 = 101 µg/mL Konsentrasi larutan (seri 1) V1 x C1 = V2 x C2 1 mL x 101 µg/mL = 10 mL x C2 C2 = 10,1 µg/mL

7. Penimbangan Quarsetin

Bobot kertas Bobot kertas + zat Bobot kertas + sisa Bobot zat

Replikasi 1 (g) 0,2592 0,2693

Replikasi 2 (g) 0,2594 0,2694

Replikasi (g) 0,2550 0,2650

0,2692

0,2594

0,2550

0,0101

0,0100

0,0100

Konsentrasi seri larutan kuersetin Seri larutan uji fraksi etil asetat Seri 1 Seri 2 Seri 3 Seri 4 Seri 5

Konsentrasi larutan uji fraksi etil asetat Replikasi 1

Replikasi 2

Replikasi 3

5,05 µg/mL

5 µg/mL

5 µg/mL

7,58 µg/mL

7,5 µg/mL

7,5 µg/mL

10,1 µg/mL

10 µg/mL

10 µg/mL

12,63 µg/mL

12,5 µg/mL

12,5 µg/mL

15,15 µg/mL

15 µg/mL

15 µg/mL

3


Contoh perhitungan konsentrasi larutan kuersetin (R 1) : Larutan induk

= 1010 µg/mL

Intermediet (seri 1) V1 x C1 = V2 x C2 1 mL x 1010 µg/mL = 10 mL x C2 C2 = 101 µg/mL

Konsentrasi larutan pembanding (seri 1) V1 x C1 = V2 x C2 0,5 mL x 101 µg/mL = 10 mL x C2 C2 = 5,05 µg/mL

99


Lampiran 8. Optimasi metode uji aktivitas antioksidan Penentuan Operating Time Waktu 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Absorbansi 0,6267 0,6278 0,6298 0,6295 0,6313 0,6310 0,6318 0,6327 0,6344 0,6327 0,6339 0,6353 0,6360

Operating time kompleks MDA-TBA Absorbansi

a.

0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0

10

20

30

40

Waktu (menit)

50

60

70

100


101

b. Penentuan λ maksimum 1. Pembacaan kompleks MDA-TBA dengan deoksiribosa 2,5 mM 200 ml

2. Pembacaan kompleks MDA-TBA dengan deoksiribosa 2,5 mM 300 ml


102

3. Pembacaan kompleks MDA-TBA dengan deoksiribosa 2,5 mM 400 ml


103

Lampiran 9. Uji aktivitas antioksidan menggunakan radikal hidroksil

% IC =

𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖

𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑎𝑛 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 −𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙 (𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑎𝑛 𝑢𝑗𝑖 ) 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 (𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑎𝑛 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 )

x 100%

1. Kuarsetin

Replikasi

I

II

III

Konsentrasi (μg/mL) 5,05 7,58 10,1 12,63 15,15 5 7,5 10 12,5 15 5 7,5 10 12,5 15

Absorbansi kontrol

0.7378

0.6412

0.3885

Absorbansi kuarsetin 0,7267 0,6967 0,6783 0,6355 0,6138 0,6281 0,6145 0,5825 0,5703 0,5417 0,3788 0,3601 0,3519 0,3389 0,3204

Contoh perhitungan pada replikasi I Konsentrasi 5,05 µg/mL 0,7378 −0,7267

%IC=

0,7378

x100 % =1,50 %

Konsentrasi 7,58 µg/mL 0,7378 −0,6967

%IC=

0,7378

x100 % =5,57 %


%IC=

0,7378

x100 % =8,06 %

Konsentrasi 12,63 µg/mL

% IC (%) 1,50 5,57 8,06 13,86 16,80 2,04 4,16 9,15 11,06 15,50 2,50 7,31 9,43 12,80 17,52

Persamaan regresi linier y = 1,556x 6,3974 R = 0,9935

y = 1,3537x 5,1497 R = 0,9909

y = 1,4208x 4,3037 R = 0,9922


0,7378 −0,6355

%IC=

0,7378

104

x100 % =13,86 %


%IC=

0,7378

x100 % =16,80 %

2. Fraksi etil asetat Replikasi

I

II

III


Absorbansi kontrol

0,608

0,5132

0,5378

Absorbansi senyawa uji 0,5389 0,5199 0,4681 0,4214 0,3745 0,4489 0,4229 0,3751 0,3408 0,3174 0,4879 0,4691 0,4238 0,3789 0,3403

Contoh perhitungan pada replikasi I Konsentrasi 10,1 µg/mL 0,608 −0,5389

%IC=

0,608

x100 % =11,37 %


%IC=

0,608

x100 % =14,49 %


%IC=

0,608

x100 % =23,01 %

% IC (%) 11,37 14,49 23,01 30,69 38,40 12,53 17,56 26,91 33,59 38,15 9,28 12,77 21,20 29,55 36,72

Persamaan regresi linier y = 0,7028x + 2,5082 R = 0,9915

y = 0,6724x + 5,5826 R = 0,9903

y = 0,7166x + 0,4054 R = 0,9906



%IC=

0,608

x100 % =30,69 %


%IC=

0,608

x100 % =38,40 %

105


106

Lampiran 10. Perhitungan nilai IC15 kuersetin dan fraksi etil asetat ekstrak etnolik daun jambu mete a. Kuersetin Replikasi I Persamaan regresi linier : y = 1,556x - 6,3974 (y = aktivitas antioksidan, x = kadar kuersetin dalam µg/mL) IC15 adalah nilai x saat y = 15 15 = 1,556x – 6,3974 X=

15+6,3974 1,556

= 13,75 µg/mL Replikasi II III

Persamaan y = 1,3537x - 5,1497 y = 1,4208x - 4,3037

IC15 (µg/mL) 14,88 13,58

b. Fraksi etil asetat ekstrak etanolik daun jambu mete Replikasi I Persamaan regresi linier : y = 0,7028x + 2,5082 (y = aktivitas antioksidan, x = kadar fraksi etil asetat dalam µg/mL) IC15 adalah nilai x saat y = 15 15 = 0,7028x – 2,5082 X=

15+2,5082 0,7028

= 17,77 µg/mL Replikasi II III

Persamaan y = 0,6724x + 5,5826 y = 0,7166x + 0,4054

IC15 (µg/mL) 14,00 20,36


Lampiran 11. Uji Statistik Uji statistik dalam mengolah data menggunakan program Minitab®17 a. Uji Normalitas (Ryan-Joiner test) 1. Kuarsetin

2. Fraksi

107


b. Uji Homogenitas (Uji F-Dua Variansi)

c. Uji Parametrik (T-test tidak berpasangan)

108


BIOGRAFI PENULIS

Penulis bernama I Putu Abhiseka Pranajaya, merupakan anak pertama dari pasangan Bapak I Ketut Suwirya Jaya dan Ibu Dewa Ayu Putu Murtini. Penulis lahir di Mataram pada tanggal 12 Februari 1994. Penulis mulai menempuh pendidikan Taman Kanak-Kanak Dwijendra pada tahun 1998 sampai 1999 dan melanjutkan pendidikan di Sekolah Dasar Negeri 02 Mataram pada tahun 1999 sampai 2005. Pada

tahun

2005-2008

penulis

mengenyam

pendidikan tingkat menengah pertama di SMP N 1 Mataram. Pendidikan menengah atas dilanjutkan di SMA N 1 Mataram dari tahun 2008 hingga 2011. Selanjutnya penulis melanjutkan pendidikan di Universitas Sanata Dharma Yogyakarta Fakultas Farmasi dari tahun 2011 sampai 2015. Selama menempuh perkuliahan di Universitas Sanata Dharma, penulis aktif dalam kegiatan kemahasiswaan diantaranya sebagai Ketua UKF Basket periode 2013-2014, menjadi koordinator sie Perlengkapan pada kepanitiaan Pelepasan Wisuda tahun 2013, anggota sie Keamanan Temu Alumni tahun 2012 dan anggota sie perlengkapan Tiga Hari Temu Akrab Farmasi tahun 2013 serta menjadi asisten dosen Praktikum Analisis Farmasi dan Validasi Metode pada tahun 2015.

109

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Recommend Documents